JP4598395B2 - 直接書き込み式ナノリソグラフィーによるナノスケールチップからの核酸の沈着方法 - Google Patents
直接書き込み式ナノリソグラフィーによるナノスケールチップからの核酸の沈着方法 Download PDFInfo
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Description
本願は、全体の開示内容が参照として本明細書に組み入れられている、2001年11月30日出願の仮特許出願第60/337,598号(Mirkinらに付与された「ディップペンナノリソグラフィーによる核酸のパターニング(Patterning of Nucleic Acids by Dip-Pen Nanolithography)」および(Mirkinらに付与された)2002年3月7日出願の仮特許出願第60/362,924号の恩典を主張するものである。
本発明は、 から助成金番号 に基づいた政府の支援により実施された。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
背景
ナノテクノロジーは、生物学、生化学、化学、医学、遺伝学、診断学および治療学にわたって多く適用されている。ナノテクノロジーは、全体的に新規な技術を形成する以外に、既存の技術をサブミクロンレベルまで最小化することができることも期待される。技術がミクロンスケールで限界となることは非常に多い。例えば、核酸マイクロアレイは、遺伝子の発現をゲノムワイドなスケールで証明することを含む生物学的および遺伝学的適用のためにミクロンスケールで市販されている(例えば、「ゲノム科学のプライマー(A Primer of Genome Science)」、G. GibsonおよびS. Muse, 2002, 第3〜4章を参照されたい)。現在のマイクロアレイには、cDNA型およびオリゴヌクレオチド型が挙げられる。しかし、特に横の寸法が約100 nm未満の大変小型のナノメートルスケールのアレイを製造する強力な市場のニーズが今や存在している。言い換えると、1分子、単層および100 nm未満の寸法のサイズに接近する核酸ナノアレイが超高密度試料部位に必要とされている。しかし、マイクロアレイを製造するために使用する製造方法はナノアレイを製造することができない。さらに、現在使用されているこれらのアレイのロボットによるプリント加工では、プリント加工用のピンが高価で、脆弱で、つまりやすく、均一性が乏しく、核酸がチップから拡散するときドーナツ状のスポットを形成する傾向であることに苦労することがある。核酸アレイ以外に、ペプチドアレイも重要であり、核酸とペプチド構造の組み合わせも興味深い。このように、ナノアレイの製造を商業レベルで可能にし、マイクロアレイの限界を引き下げる新規ナノテクノロジーが必要とされている。特に、100 nm未満のバリアを破るとき、1分子および単層の領域に入るときおよび市場に導入するときの困難は、さらに過酷になる。
ナノテクノロジーは、生物学、生化学、化学、医学、遺伝学、診断学および治療学にわたって多く適用されている。ナノテクノロジーは、全体的に新規な技術を形成する以外に、既存の技術をサブミクロンレベルまで最小化することができることも期待される。技術がミクロンスケールで限界となることは非常に多い。例えば、核酸マイクロアレイは、遺伝子の発現をゲノムワイドなスケールで証明することを含む生物学的および遺伝学的適用のためにミクロンスケールで市販されている(例えば、「ゲノム科学のプライマー(A Primer of Genome Science)」、G. GibsonおよびS. Muse, 2002, 第3〜4章を参照されたい)。現在のマイクロアレイには、cDNA型およびオリゴヌクレオチド型が挙げられる。しかし、特に横の寸法が約100 nm未満の大変小型のナノメートルスケールのアレイを製造する強力な市場のニーズが今や存在している。言い換えると、1分子、単層および100 nm未満の寸法のサイズに接近する核酸ナノアレイが超高密度試料部位に必要とされている。しかし、マイクロアレイを製造するために使用する製造方法はナノアレイを製造することができない。さらに、現在使用されているこれらのアレイのロボットによるプリント加工では、プリント加工用のピンが高価で、脆弱で、つまりやすく、均一性が乏しく、核酸がチップから拡散するときドーナツ状のスポットを形成する傾向であることに苦労することがある。核酸アレイ以外に、ペプチドアレイも重要であり、核酸とペプチド構造の組み合わせも興味深い。このように、ナノアレイの製造を商業レベルで可能にし、マイクロアレイの限界を引き下げる新規ナノテクノロジーが必要とされている。特に、100 nm未満のバリアを破るとき、1分子および単層の領域に入るときおよび市場に導入するときの困難は、さらに過酷になる。
走査プローブ電子顕微鏡(scanning probe microscopic：SPM)チップを含むナノスケールのチップは、一般に、ナノスケールの構造を特徴づけるために使用されているが、ナノスケールでの製造における使用はあまり開発されていない。製造における早期の試みは成功していない。例えば、生物学分野および生物学以外の分野での適用を含むナノアレイの製造を含む、ナノスケールの製造においてナノスケールSPMチップをより良く使用する必要性が存在している。SPMチップは、分子レベルにおける基板の直接書き込みおよびパターニングに使用することができれば、特に興味深い。このレベルにおける直接書き込みという課題は、核酸を含む生物学的化合物の直接書き込みに特に重要である。例えば、分子認識およびハイブリダイゼーションの良好な解像、高い再現性、良好な安定性、および良好な保持を提供する改善が必要とされている。特に重要な課題は、単一の核酸鎖の直接書込みであり、分子サイズおよび荷電の影響が重要になることがあり、一般に非荷電小分子の直接書込みにはあまり関連しない因子である。間接的な方法は、例えば、核酸が既存の特徴に吸収される、小スケールの核酸構造の作製について知られている。それにもかかわらず、直接書込みは間接的な経路よりも大きな利点を提供する。
直接書込みナノリソグラフィーの一方法は、以下にさらに記載されており、ノースウェスタン大学のMirkinグループおよびNanaoInk, Inc.(イリノイ州シカゴ)において開発中のディップペンナノリソグラフィー(DIP PEN NANOLITHOGRAPHY)(商標)プリント加工および沈着(すなわち、DPN(商標)プリント加工および沈着)である。DPN(商標)およびディップペンナノリソグラフィー(商標)は、NanoInk, Inc.の商標である。この方法は用途が広く、容易に入手可能な装置で実施することができる。複雑なスタンプおよびレジストは一般に必要とされない。今までのこの技術の成功にもかかわらず、改善がさらに必要とされている。
これらの化合物が必ず相補的な核酸鎖を認識し、結合する(すなわち、ハイブリダイゼーションする)能力により、分子電子素子および光機能素子を含む機能性材料の「ボトムアップした」ナノスケール製造を提供することができると思われる、ナノスケールの核酸形状の製造に対する関心も高まっている。DNAを用いたプログラムされた材料合成は、例えば、Mirkin, Inorganic Chem., 2000, 39, 2258-2272、Mirkin, MRS Bulletin, January, 2000, pgs. 43-54；およびStorhoffら、Chem. Rev., 1999, 99, 1849-1862に記載されている。また、核酸のハイブリダイゼーションは、表面制限(surface-confined)DNAプローブアレイに関連して、例えば、Herneら、J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 8916-8920、Levickyら、J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 9787-9792により考察されている。診断適用も、例えば、Mirkinら(Nanosphere, Inc)に付与された米国特許第6,361,944号に考察されているように重要である。
概要
本セクションでは、本明細書に開示されている本発明が要約されているが、詳細に記載されており以下にさらに主張されている本発明の範囲を限定するものではない。
本セクションでは、本明細書に開示されている本発明が要約されているが、詳細に記載されており以下にさらに主張されている本発明の範囲を限定するものではない。
本発明は、簡単に説明すると、チップが基板に接近するように少なくとも１つのナノスケールチップを基板に対して位置づける段階を含み、核酸がチップから基板に移動されて、相補的な核酸にハイブリダイゼーションすることができる安定な核酸ナノスケールパターンを基板に作製する、直接書込みナノリソグラフィーによって基板に核酸を沈着させる方法を提供する。
簡単に説明すると、本発明はまた、核酸がチップから基板に移動されて、ナノスケールのパターンを形成するように十分に高い相対湿度においてチップを基板に接近するように基板に対して走査型プローブ顕微鏡チップを位置づける段階を含み、移動前に、核酸がチップを濡らすようにチップを修飾し、基板に化学吸着または共有結合するように核酸を修飾する段階を含む、基板に核酸のナノスケールパターンを作製する方法を提供する。
簡単に説明すると、本発明はまた、走査型プローブ顕微鏡チップを修飾核酸で濡らす段階と、基板に核酸を移動させてナノスケールパターンを形成するのに十分基板に接近させて濡らしたチップを位置づける段階とを含み、基板に化学吸着または共有結合を提供する官能基で核酸を修飾し、官能基がスペーサーを介して核酸に結合される、修飾核酸を直接パターニングする方法を提供する。
よりさらに別には、本発明はまた、修飾核酸で濡らした走査型プローブ顕微鏡チップを位置づける段階と、基板に核酸を移動させてナノスケールパターンを形成するのに十分基板に接近させて濡らしたチップを位置づける段階とを含み、基板に共有結合を提供する求電子官能基または求核官能基で核酸を修飾する、修飾核酸を直接パターニングする方法を提供する。
また、本発明は、簡単に説明すると、チップを修飾して正に荷電させる段階を含む、直接書込み式ナノリソグラフィー中に走査型プローブ顕微鏡チップから基板への核酸の移動を改善する方法を提供する。
簡単に説明すると、本発明はまた、核酸のチップへの接着を改善する1種またはそれ以上の組成物でチップを処理する段階を含む、走査型プローブ顕微鏡チップから基板への核酸の直接書込み式沈着を改善する方法を提供する。
本発明はまた、簡単に説明すると、(a)直接書込み式ナノリソグラフィーによって、ナノスケールチップから基板に第１の核酸を沈着させて、横方向のナノスケール形状が約1,000 nmまたはそれ以下の沈着物を形成する段階と、(b)ナノ粒子で核酸沈着物をハイブリダイゼーションする段階であって、ナノ粒子が、(1)第１の核酸に相補的である第2の核酸、または(2)第2の核酸を第１の核酸に結合する結合鎖の核酸に相補的である第2の核酸のいずれかで官能基化される段階とを含む、ナノ粒子を集成してナノスケールパターンを形成する方法を提供する。
さらに、本発明はまた、核酸のナノスケールの沈着物を基板にハイブリダイゼーションする段階であって、沈着物が第１の核酸およびナノ粒子を含み、ナノ粒子が、(1)第１の核酸に相補的である第2の核酸、または(2)第2の核酸を第１の核酸に結合する結合鎖の核酸に相補的である第2の核酸のいずれかで官能基化される段階を含む、ナノ粒子を集成してナノスケールのパターンを形成する方法を提供する。
よりさらに別に、本発明は、基板と、基板上の第１の核酸の少なくとも１つのパターンを含む基板上のナノスケールの核酸パターンであって、第１の核酸のパターンが基板に化学的吸着または共有結合され、1,000 nmまたはそれ以下の横方向の寸法を有し、第１の核酸に相補的な第2の核酸にハイブリダイゼーションすることができる、ナノスケールの核酸パターンを提供する。
本発明は、基板と基板上の複数の核酸パターンを含み、核酸パターンが基板に化学吸着または共有結合されており、約1,000 nmまたはそれ以下の横方向の寸法を有し、互いに1,000 nmまたはそれ以下の距離だけ分離されており、1平方センチメートルあたり少なくとも100,000のパターン密度を有し、相補的な核酸にハイブリダイゼーションすることができる核酸ナノアレイを提供する。
さらに、本発明はまた核酸パターンを有する基板を含む物品、核酸ナノアレイ、核酸でコーティングした走査プローブ顕微鏡(SPM)チップ、SPMチップをコーティングするために使用する溶液、核酸の直接書込み式ナノリソグラフィーのためのキット、およびそのためのコンピュータソフトウェアを含む。
以下に詳細に考察されている本発明の基本的な特徴および新規特徴は多数であり、電子ビームおよびフォトリトグラフィー方法などの高価で、破壊する可能性のある方法を使用することなく、予想したナノスケール形状を直接書き込む能力を含む当技術分野においてすでに確立されているDPNプリント加工の利点を含む。また、構造物は、望ましい場合には、既存の構造物を分解しないで構築することができる。複雑なスタンプおよびレジストは必要とされない。ナノリソグラフィーの一貫性および安定性の改善を観察することができる。
詳細な説明
DPNプリント加工、パターニングおよび沈着方法は、例えば、全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、Mirkinグループの以下の参照文献に開示されている：(1)Pinterら、Science, 283, Jan. 29, 1999, p.661; (2)Hongら、Science, 286, October 15, 1999, p.523; および(3)Hongら、Science, 288, June 9, 2000, p.1808。さらに、Demersら、Science, Vol. 296, June 7, 2002, p.1836-1838による技術的な文献「ディップペン式ナノリソグラフィーによる金属および絶縁体への修飾オリゴヌクレオチドの直接パターニング(Direct Patterning of Modified Oligonucleotides on Metals and Insulators by Dip-PenNanolithography)」も、そこに引用されている裏づけ用のオンラインマテリアルを含めて、全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている。核酸およびナノ粒子核酸プローブのDPNプリント加工およびパターニングは、参照として組み入れられている以下の参照文献に記載されている：(1)C. A. Mirkin, Mater. Res. Soc. Bull., 25, 43(2000); (2)C. A. Mirkin, Inorg. Chem., 39, 2258(2000)。
DPNプリント加工、パターニングおよび沈着方法は、例えば、全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、Mirkinグループの以下の参照文献に開示されている：(1)Pinterら、Science, 283, Jan. 29, 1999, p.661; (2)Hongら、Science, 286, October 15, 1999, p.523; および(3)Hongら、Science, 288, June 9, 2000, p.1808。さらに、Demersら、Science, Vol. 296, June 7, 2002, p.1836-1838による技術的な文献「ディップペン式ナノリソグラフィーによる金属および絶縁体への修飾オリゴヌクレオチドの直接パターニング(Direct Patterning of Modified Oligonucleotides on Metals and Insulators by Dip-PenNanolithography)」も、そこに引用されている裏づけ用のオンラインマテリアルを含めて、全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている。核酸およびナノ粒子核酸プローブのDPNプリント加工およびパターニングは、参照として組み入れられている以下の参照文献に記載されている：(1)C. A. Mirkin, Mater. Res. Soc. Bull., 25, 43(2000); (2)C. A. Mirkin, Inorg. Chem., 39, 2258(2000)。
また、表題「ディップペン式ナノリソグラフィーによる核酸のパターニング(Patterning of Nucleic Acid by Dip Pen Nanolithography)」で2001年11月30日に出願され、Mirkinらに付与された仮特許出願第60/337,598号は全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている。
ノースウェスタン大学、L. M. Demersによる博士論文、2002年6月、「粒子系材料の直接集成のツールとしてのナノリソグラフィーおよび生物分子的認識並びに検討(Nanolithography and Biomolecular Recognition as Tools for the Directed Assembly and Study of Particle-Based Materials)」、第6章、「ディップペン式ナノリソグラフィーによるDNAの直接パターニング(Direct-Patterning of DNA via Dip-Pen Nanolithography)」も参照として全体の内容が組み入れられている。
DPNプリント加工に関連する材料、装置、機器、ソフトウェアおよびハードウェア、物品、ならびにDPNプリント加工に関連する相談は、NanoInk, Inc.(イリノイ州シカゴ)から得ることができる。
SPMプローブおよび核酸沈着に関連し、参照として組み入れられている別の技術文献には、(1)「メニスカスフォースナノグラフティング：DNAのナノスケールパターニング(Meniscus Force Nanografting: Nanoscopic Patterning of DNA)」、Schwartz, Langmuir, 2001, 17, 5971-5977、(2)「原子間力顕微鏡チップからの分子の移動：ディップペン式ナノリソグラフィーの比較検討(Molecular Transport from an Atomic Force Microscope Tip: A Comparative Study of Dip-Pen Nanolithography)」、Schwarta, Langmuir, 2002, 18, 4041-4046；および(3)Mirkin、Schwartzらに付与された2002年6月6日の国際PCT公開日の国際公開公報第02/45215 A2号、「ナノリソグラフィー方法並びにそのための製品およびそれによって製造される製品(Nanolithography Methods and Products Therefor and Produced Thereby)」が挙げられる。例えば、後者のPCT公報は、例えば、核酸と、トリドデシルメチルアミンなどの陽イオンおよびアンモニウム化合物を含む塩とを含むパターニング溶液の使用を開示している。溶液は水性であってもよく、SPMチップをコーティングするために使用することができる。
材料適用における生物分子の役割は、参照として本明細書に組み入れられている以下の参照文献に開示されている：(1)J. J. Storhoff、 C. A. Mirkin、Chem. Rev., 99, 1849(1999)；(2)C. M. Niemeyer, Angew. Chem. Int. Ed. 40, 4128(2001)。
2001年5月24日出願の米国特許第09/866,533号(Mirkinらに付与され、2002年5月30日に公開された対応する米国特許広報US2002/0063212 A1も参照されたい)では、DIP PEN(商標)ナノリソグラフィーによるプリント加工の背景および手法が、例えば、以下を含む多種多様の態様を含めて詳細に記載されている：
-背景技術(1〜3ページ)、
-概要(3〜4ページ)、
-図面の簡単な説明(4〜10ページ)、
-ナノスケールの走査型プローブ顕微鏡チップの使用(10〜12ページ)、
-基板(12〜13ページ)、
-オリゴヌクレオチド、DNAおよびRNAを含むパターニング化合物(13〜17ページ)、
-例えば、コーティングチップを含む実施方法(18〜20ページ)、
-ナノプロッターを含む機器装備(20〜24ページ)、
-多重層並びに関連するプリント加工およびリトグラフ方法(24〜26ページ)、
-解像(26〜27ページ)、
-アレイおよびコンビナトリアルアレイ(27〜30ページ)、
-ソフトウェアおよび較正(30〜35ページ、68〜70ページ)、
-キットおよび他の物品、疎水性化合物でコーティングされたチップ(35〜37ページ)、
-７つの実施例(38〜67ページ)、
-対応する特許請求の範囲および要約書(71〜82ページ)、ならびに
-図1〜28。
-背景技術(1〜3ページ)、
-概要(3〜4ページ)、
-図面の簡単な説明(4〜10ページ)、
-ナノスケールの走査型プローブ顕微鏡チップの使用(10〜12ページ)、
-基板(12〜13ページ)、
-オリゴヌクレオチド、DNAおよびRNAを含むパターニング化合物(13〜17ページ)、
-例えば、コーティングチップを含む実施方法(18〜20ページ)、
-ナノプロッターを含む機器装備(20〜24ページ)、
-多重層並びに関連するプリント加工およびリトグラフ方法(24〜26ページ)、
-解像(26〜27ページ)、
-アレイおよびコンビナトリアルアレイ(27〜30ページ)、
-ソフトウェアおよび較正(30〜35ページ、68〜70ページ)、
-キットおよび他の物品、疎水性化合物でコーティングされたチップ(35〜37ページ)、
-７つの実施例(38〜67ページ)、
-対応する特許請求の範囲および要約書(71〜82ページ)、ならびに
-図1〜28。
図面を含み上記に列挙した種々のサブセクションの各々を含む上記テキストは全て全体の内容が参照として本明細書に組み入れられており、本発明の開示内容の一部を形成し、特許請求の範囲を支持するものである。
また、Mirkinらに付与された米国特許公報20020122873 A1(2002年1月28日出願の出願番号第059,593号)(2002年9月5日公開)も全体の内容が参照として組み入れられている。この特許公報は、例えば、ナノスケール走査型プローブ顕微鏡チップから基板への沈着またはパターニング化合物の移動を制御するための駆動力の使用を開示している。この特許公報はまた、チップから基板への沈着またはパターニング化合物の移動を制限する内部の空洞と開口部を有するチップについても開示している。開口部を通過する沈着またはパターニング化合物の移動の速度および程度は駆動力によって制御することができる。核酸は、例えば、負に荷電した核酸を誘引する正に荷電した基板を使用してこの方法によって沈着またはパターニングすることができる。アパーチャー(Aperature)ペン式ナノリソグラフィー方法および万年筆式ナノリソグラフィー方法を使用して、本明細書に記載するように核酸を沈着またはパターニングすることができる。
ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工並びに上記の手法、機器装備および実施例は、本明細書にさらに記載するように改善された核酸およびDNA物品およびナノアレイを作製するようにも適合することができる。本明細書にさらに記載するように、核酸は多種多様であってもよいが、オリゴヌクレオチドが特に興味深く、特に、修飾されている、すなわち基板表面に共有結合または化学吸着する化学構造を有するオリゴヌクレオチドが特に興味深い。
パターンまたは沈着物としてナノスケールチップから基板へ核酸を移動するために、基板とチップが互いに接近するように互いに対して移動される。チップを基板の方向に移動してもよく、基板をチップの方向に移動してもよく、またはチップおよび基板の両方を互いに対して移動してもよい。
一般に、ナノスケールのミクロスケール以下の量の核酸パターニング化合物をチップから基板に送達、パターニングまたは沈着することができるナノスケールのミクロスケール以下のチップを使用することができる。ナノスケールチップ設計は特に限定されないが、一般に、ナノスケールチップは、マイクロスケール寸法ではなくナノメートルのミクロン以下のレベルの寸法によって特徴づけられる先細のまたは実質的に先細の末端部を有してもよい。例えば、ナノスケールレベルのチップ幅、空洞または開口部寸法であってもよい。一般に、ナノスケール構造物を画像化することができると同時に、ナノスケール構造物を沈着することができるナノスケールチップが好ましい。SPMチップを使用することができ、好ましい種類のSPMは原子間力顕微鏡(AFM)チップである。一般に、例えば、原子間力顕微鏡チップなどの外側面にインクでコーティングすることができるように設計されているチップを使用することができる。または、チップは、中空であってもよく、開口部を有するチップまたはNSOMチップを含む。インクは、望ましい場合には、連続送達することができる。当技術分野上既知であるように、各チップを望ましいように個別に制御することができるか、または望ましいように集合的に操作できるチップアレイを使用することができる。チップはカンチレバーまたは機能的な等価物に取り付けてもよい。
例えば、コンタクトモード、ノンコンタクトモード、タッピングモードおよびラテラルフォースモードを含む既知のSPMおよびAFM方法を使用することができる。
SPMチップから基板への核酸の直接移動を検討する際には、一定の高品質のパターニングで核酸のパターニングを促進するいくつかの因子が重要になることがある。これらの因子は、実施例のセクションにおいてもさらに考察されている。
第一に、例えば、チップに核酸を十分にコーティングすることができる。例えば、従来の窒化シリコンAFMカンチレバーの表面を修飾すると、核酸インクのチップ表面への確実な接着を促進することができる。例えば、図1を参照されたい。チップは、一価の正電荷のアミノ基またはアンモニウム基を含む一価の正電荷を有するようにチップ表面が修飾されうる。一段階または多段階の工程を使用して、核酸沈着用に設計されたチップを作製することができる。例えば、以降の段階においてチップを官能基化することができる前処理段階を実施することができる。例えば、ヒドロキシル化した表面を提供するようにチップを修飾することができ、ヒドロキシ基をさらに官能基化することができる。チップは、例えば、硫酸と過酸化水素を含む強酸と過酸化物で処理することができる。前処理後、アミノシランカップリング剤である3'-アミノプロピルメトキシシランなどのシランカップリング剤でチップを処理することによって(例えば、1%v/vトルエン溶液で1〜2時間)チップの官能基化を実施することができる。
次いで、シラン処理ずみのチップを核酸でコーティングすることができる。コーティングは、核酸と塩とを含む溶液を使用して実施することができる。溶媒は、望ましい場合にはさらに水と混合することができるDMFなどの非プロトン性溶媒であってもよい。一般に、例えば、溶媒の約70重量%〜約90重量%が非プロトン性となりうるように、水より多量の非プロトン性溶媒を使用することができる。塩は、例えば、塩化マグネシウムを含む第II群の塩またはハロゲン化物塩などの無機塩であってもよい。塩の濃度は、例えば、約0.01 M〜約0.4 Mであってもよく、さらに特には約0.1 M〜約0.2 Mであってもよい。核酸に対する塩の比は、良好な沈着条件および良好なナノスケール構造物を提供するように変更することができる。核酸の濃度は、例えば、約0.1 mM〜約10 mMであってもよく、さらに特には約0.5 mM〜約5 mMであってもよい。
チップは、望ましい場合には1分未満、例えば、約20秒間核酸チップコーティング溶液に浸漬し(実施例を参照されたい)、次いで例えば、ジフルオロエタンなどの圧縮ガスで短時間でブロードライすることによって処理することができる。この方法で調製し、核酸をコーティングしたAFMチップは、本明細書において記載するように直接書き込み式実験に数時間使用してから、再コーティングすることができる。また、チップを再コーティングし、同じ核酸配列に再度使用することができる。
第二に、周囲の相対湿度を制御することによって、核酸の一定の高品質の直接書き込み式パターニングを提供することができる。相対湿度は、チップから基板に核酸を移動させるのに十分に高い状態に制御することができる。一般に、少なくとも約25%の相対湿度を使用することができ、さらに特には約25%〜約100%の相対湿度を使用することができ、さらに特には約40%〜約100%の相対湿度を使用することができ、さらに特には約40%〜約50%の相対湿度を使用することができる。例えば、周囲温度におけるパターニングは、相対湿度45±5%で23±3℃において環境が制御されたグローブボックスにおいて実施することができる。相対湿度は、核酸の性質、基板の性質、望ましいパターン(例えば、ドットまたは線)の性質、チップを濡らすために使用する核酸溶液の性質、チップの性質等を含む他の沈着因子に基づいて制御することができる。メニスカスの役割は、SPMチップを使用する直接書き込み式ナノリソグラフィープリント加工では重要となることがあり、メニスカスのサイズは相対湿度に関連することがある。
チップ-コーティングおよび湿度以外に、インク-基板組み合わせの選択が、一定の高品質の形状での核酸の直接書き込みを促進することもできる。例えば、基板に化学吸着または共有結合する官能基を含むように核酸を修飾することができる。種々の方法を使用することができる。例えば、基板に結合するための官能基は核酸に直接結合してもよく、または比較的可動性のスペーサー基によって核酸に結合されてもよい。スペーサー基の例には、例えば、ポリエチレンまたはポリプロピレングリコールのようなアルキレングリコールなどの可動性鎖オリゴマーが挙げられる。これらは、例えば、3〜20アルキレンオキシ反復単位を有してもよい。官能基は、例えば、金表面に化学吸着するように設計されたチオールまたはジスルフィドなどの含硫黄部分であってもよい。この手法を使用して、環状ジスルフィド修飾核酸およびトリチオール修飾核酸をパターニングすることができる。硫黄原子は、例えば、C4-C18アルキル基を含むアルキル基などの炭化水素基に結合することができる。官能基は、例えば、求核面と反応するように設計された求電子基であっても、または求電子表面と反応するように設計された求核基であってもよい。例えば、マイケル付加反応を使用して基板に核酸を結合することができる。
例えば、ヘキサンチオール、PEG修飾オリゴヌクレオチドを使用して、サイズが約50 nm〜数マイクロメートルの範囲の形状を金基板に直接パターニングすることができる。核酸のヘキサンチオール基は、下層のAu表面と化学吸着することができる。基板に結合するための官能基で核酸を修飾することができる他の態様には、(1)ホスホロチオエート基(例えば、米国特許第5,472,881号を参照されたい)、(2)アミノシロキサンおよびメルカプトアルキルシロキサンを含む置換シロキサン、(3)参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第6,361,944号に記載されている態様が挙げられる。核酸の種類および可能な修飾は以下にも詳細に記載されている。
基板は、基板上に核酸および不動態化剤を含むように処理することができる。例えば、基板を核酸でパターニングしてから、不動態化してもよい。不動態化の一態様において、その後の工程中の基板の未パターニング領域の反応性を低下するように、基板の未パターニング領域を不動態化剤で処理することができる。不動態化は、例えば、パターニングした核酸の分析または検出の改善を含む、数多くの理由のために実施することができる。例えば、核酸のハイブリダイゼーションが相補的な核酸によることが望ましい場合には、核酸パターニング領域と未パターニング領域との間の相互作用の選択性を不動態化により改善することができる。不動態化は、金などの基板の未パターニング領域に選択的に吸着するアルカンチオールなどの不動態化剤を含有する溶液にパターニング後の基板を浸漬することによって実施することができる。このように、不動態化剤は、未パターニング基板に化学吸着または共有結合するが、他の官能基を持たない1つの反応性官能基を含むことができる。例えば、不動態化剤は、核酸ハイブリダイゼーションなどのその後の工程に一般的に無反応であるメチル基を吸着の結果、表面に露出する長鎖アルキス基を含むことができる。不動態化は、例えば、基板の残りを疎水性にすることができる。例えば、すでに核酸でパターニングされている金基板を1-オクタデカンチオール(ODT、1 mM)のエタノール溶液に1分間浸漬することができる。この手法は、疎水性単層で未パターニング金表面をコーティングし、その後のハイブリダイゼーション実験におけるDNAまたはDNA修飾ナノ粒子の非特異的な吸着に対して未パターニング金表面を不動態化する。
一般に、核酸が基板に化学吸着または共有結合するように官能基化されていない場合には、不動態化剤はパターニングした核酸を排除することができる。例えば、チオール部分を持たない核酸は、ODT処理中に表面から排除することができる。
不動態化別の態様において、基板を先ず不動態化剤でパターニングし、次に核酸でパターニングする。言い換えると、パターニングする前に基板を不動態化することができる。例えば、基板は、オリゴヌクレオチドおよび他の核酸が結合することができる非吸着性ヒドロゲルなどの不動態化剤で処理することができる。マイクロアレイ技術分野において既知の不動態化剤を使用することができる。
核酸パターンは、例えば、ODT処理による基板の不動態化後に例えば、タッピングモードAFMによって画像化することができる。この画像化は高さに関する測定値を提供することができる。一般に、AFMまたは同様の技法によって測定する核酸パターンの形状高さは、例えば、約100 nmまたはそれ以下、さらに特には約10 nmまたはそれ以下となりうる。オリゴヌクレオチドでは、高さは、例えば、約2 nm〜約5 nmとなりうる。
パターニングし、固定した核酸が特異性の高い認識性を保持ことができ、ハイブリダイゼーションを受けやすいことを証明するために、核酸パターンを使用して、相補的な核酸を含むナノ粒子の集成物を誘導することができる(例えば、図2を参照されたい)。この工程により、ミクロン〜100 nm以下の長さスケールに構造物を製造することができる。このようにして得られる高い解像度により、個々の粒子が予想した構築形態で表面に配置されるのを制御することができる。また、パターンの核酸密度は、ナノ粒子を密に充填した配列で結合するのに十分高くなりうる。
図2に記載し、実施例においてさらに記載するように(以下に使用するC、GおよびLタイプの核酸についてはそこの略語も参照されたい)、粒子集成物では、三成分系を適用することができる：(1)パターニングした核酸、(2)リンカー核酸、および(3)粒子結合核酸。この方法では、リンカーが排除されても、または非相補的な配列で置換されてもよい組み込み制御実験が行われる。このような制御実験では、例えば、15-mer DNA(G1)修飾金ナノ粒子を、最初の15塩基が粒子結合DNAと相補的であった30-merオリゴヌクレオチド、L2にハイブリダイゼーションすることができる。しかし、リンカーの遊離の15塩基セグメントは、パターニング表面、C1のDNAと相補的にならないことがある(4未満の連続塩基重複)。
DNAパターニング表面を、ハイブリダイゼーション条件下(例えば、0.3 M PBS、0.025%SDS、3時間、室温)において非相補的粒子リンカー溶液に露出することができるが、粒子はせいぜいほんの数箇所においてしかパターンに結合しない。ハイブリダイゼーション条件は当技術分野において既知であり、例えば、参照として本明細書に組み入れられている米国特許第6,361,944号に記載されている。微細構造画像ではなくAFM位相画像を使用することができる。その理由は、この画像形成様式を使用すると、ODT単層と、DNAパターンと金ナノ粒子間の良好なコントラストが達成されうるからである。従って、ストリンジェンシー(高温)洗浄を実施しない場合でも、DNAナノパターンとオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子との間の相互作用は選択性が高く、非相補的なDNAで修飾されている粒子の吸着を排除する。一方、適切な相補的リンカーオリゴヌクレオチドが存在する試料では高い粒子密度を観察することができる。
基板にパターニングした核酸ナノ構造物の安定性は、3ヶ月より長い期間にわたって周囲条件下において保存してから、パターニングした表面を使用して粒子集成物について試験することができる。重要なことには、特異的な粒子吸着の程度が高いことは、パターンはほとんどの部分が無傷となりえて、核酸の分解またはチオール修飾核酸の表面からの損失による可能性がある斑点状の領域がいくつかみられることを示す。また、チップのODT単層領域に結合したナノ粒子の数がわずかに増加することがある(新鮮な試料は粒子をほとんど全く含まないバックグラウンドを示す)。チオール-Au結合の空気および／または光酸化を最小にするために、遮光下で不活性大気中に試料を保存すると、粒子バックグラウンドの実質的な低下を得ることができる。
DPNプリント加工の重要な特徴は、広い範囲の長さスケール(100 nm以下〜多数ミクロン)にわたって特異的な化学的機能パターンを作製すると同時に、形状サイズに精密な制御を示す能力である。本明細書に記載する方法を使用すると、核酸およびオリゴヌクレオチドなどの高電荷高分子を、疎水性小分子とまさに同じ方法でSPMチップから基板に移動することができる。
具体的には、本明細書に記載する方法を使用すると、パターンスポットサイズをチップ-表面接触時間の関数として増加することができ、または別の方法として、描画速度を遅くすることによって線幅を広くすることができる。例えば、相対湿度は、一定、例えば、45%に維持することができ、一定の接触時間にわたってAu基板の異なる地点においてC1 DNA-コーティングAFMチップを保持することによって核酸スポットを作製することができる(0.1秒〜100秒の範囲の各接触時間において最低5スポット)。このような条件下では、理論的なシミュレーションによって予測され、小分子について実験的に観察された接触時間の場合には(スポット径〜t1/2)、AFPチップから基板へのDNAの輸送により、パターン面積の同じ線形の増加を取ることができる。速度定数は各インク-基板ペアについて異なることがあるが、小分子および塩から荷電した有機高分子までの範囲の化合物を種々の基板にパターニングするために対照DPNプリント加工を提供することができることをこれは強調している。
また、金基板への核酸パターン形成速度は、本明細書に記載する方法を使用して、注意深い湿度制御により適応することができる。この影響を例示し、定量するために、例えば、約10秒間チップを金基板に接触させて保持しながら、各スポットについてグローブボックス内の相対湿度(RH)を変更することによって一連のドットを形成することができる。湿度は、例えば、水を入れた容器に窒素を通気し、その蒸気をボックク内に流動させることによって増加させることができる。湿度は、別の方法でボックスに流動させた乾燥窒素または水飽和窒素を制御する自動式コントローラによって安定に維持することができる。パターンを形成する前に、ボックスの天井および床に配置した湿度計が同じ値(±0.5%)を読み取ったら、例えば、各ポイントにおいて少なくとも5分間湿度を平衡にすることができる。2つの別個の態様において(別の日に異なる基板を使用するが、同じAFMチップおよびDNA配列を使用する)、(C1)RHを約30%から約46%まで変更することができる。このように、形状サイズは、湿度制御を使用して妥当なタイムスケールで広いダイナミックレンジにわたって変更することができる。例えば、AFMチップを10秒間保持することによって形成されるスポットの径は、RHを50%増加することによって50 nm未満から1000 nmに変更することができる。また、所定の接触時間の間相対湿度がパターンスポットサイズに与える影響を十分に規定することができる。パターン面積は、約30%〜約80%RHの湿度範囲について、おおよそ相対湿度の2乗として変化することができる(またはスポット径〜RH)。なお相対湿度を増加おおび低下する結果観察されるヒステリシスは最小となりうることに留意する。DNAパターニングのこの湿度依存性は、一般に、チップと基板の間に生ずる水のメニスカスに依存する、AFMチップから表面へのDNAの輸送機序を示している。また、湿度に対するスポットサイズのプロットは、約25℃においてDPNプリント加工によりDNAを直接パターニングすることができない最低湿度が室温において存在することを示すことができる(例えば、実施例、図13および図14に示す、〜27%RH、23℃におけるx切片)。最後に、異なる基板で別の日に実施した実験について高湿度条件および低湿度条件下において得られたポイントを通って線形回帰直線を引くことができるという事実は、湿度が提供する制御を強調している。
DPNプリント加工に本質的な有利な特性の1つは、湿度計の高い表示で多重インクのナノスケールパターンを作製する能力である。多重核酸インク能力を証明するために、DPNプリント加工を使用して、2成分核酸アレイを作製することができる。交差汚染を生じることなく、2つの異なるチオール修飾DNAインク、C1およびC2のパターンを配列するためには、例えば、チオール16-メルカプトヘキサデカン酸(MHA)を使用したDPNプリント加工により、金基板の2箇所の異なる位置にアライメントマーカーを最初につけることができる。MHAパターンに対するオフセット座標を算出するためには、パターニングの前に、C1コーティングチップを使用して低湿度(RH〜25%、DNAはこのような条件下では輸送されない)においてMHAマーカーを画像化することができる。次に、湿度を例えば、45%に上昇させ、例えば、約2μmの間隔をおいた四角いドットのアレイ(例えば、径〜760 nm)を作製することができる。同様に、低湿度においてコーティングしたチップを用いてMHAアライメントマーカーを再度画像化し、オフセット座標を算出し、次いで湿度を上昇させ、例えば、径100 nmの三角形のドットのアレイをパターニングすることによって、C2を含む第2のパターンを第１のパターンに並べて位置づけることができる。両方の核酸インクをパターニングした後、基板の未パターニング領域をODT処理によって不動態化し、タッピングモードAFMによって画像化することができる。パターンの化学的完全性および活性を証明するために、ハイブリダイゼーション条件化において2時間L1(C1パターンに相補的である)にハイブリダイゼーションした13 nm G1修飾金粒子の溶液にチップを暴露することができる。次いで、0.025% SDSを加えたPBS緩衝液で45℃において基板を洗浄し、L2(C2パターンに相補的である)にハイブリダイゼーションされている30 nm G1修飾粒子に暴露することができる。粒子は選択的に適切なパターンで集成することができ、DNAスポットまたはバックグラウンドに交差汚染の痕跡は見られない。この態様は、AFMに基づいたスクリーニング手法における診断プローブとしてナノ粒子を使用することができる方法を示すだけでなく、直接書き込み式DPNプリント加工方法によって製造したナノ構造をナノ粒子系構造物の集成を制御するために使用することもできる。
DPNプリント加工技法は金基板に実施されることが多いが、電子および光学材料使用の点から望ましくない場合もある。金-チオール系は、DPNプリント加工を使用してオリゴヌクレオチドをパターニングするための有用な方法を提供する。しかし、金基板の導電性は、このような面に集成したナノ構造物の電荷輸送および近接場光学現象の検討を妨害することがあり、さらに表面に結合した任意の蛍光団からの発光を消光することがある。これらの問題に対処し、集成後のナノ構造物の電気的および光学的特徴づけを可能にするために、DPNプリント加工を使用して、例えば、酸化シリコンウェハーなどの電気的絶縁面に核酸をパターニングすることができる。
熱酸化したウェハーの表面は、例えば、3'-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTMS)などの機能的なシランカップリング剤で処理することによって活性化することができる。AFMチップの調製およびインクづけは、金表面へのDNAのパターニングと同様に実施することができるが、5'-末端にアクリルアミド基を有するオリゴヌクレオチド(C3およびC4)を、末端にヘキサンチオール修飾を有するオリゴヌクレオチドの代わりに使用することができる。室温および相対湿度45%のDPNプリント加工条件下において、アクリルアミド部分は、マイケル付加によりMPTMSのチオール側基と反応して、核酸を表面に共有結合することができる。また、酸化シリコン基盤上への核酸パターンの形成は、金基板と同様のチップ-表面接触時間依存性を示す。パターニング後、pH 10の緩衝アクリル酸モノマー(例えば、Apogent Discoveriesチオールクエンチ緩衝液)と反応させることにより基板を不動態化することができる。パターニングしたC3オリゴヌクレオチドの生物活性は、相補的な蛍光団標識DNA(L3F)を含有する溶液に表面を暴露することによって証明することができる。パターンは、その後、エピ蛍光顕微鏡によって特徴づけることができる。この手法を使用して作製されるシリコン上のDNAナノ構造物はまた、相補的なDNA修飾金ナノ粒子(G2で修飾されている)の集成を誘導するためにも使用することができる。この技法を用いると、従来のマイクロアレイのものより約10,000倍小さい(面密度に関して)〜200 nmの径のDNAスポットを酸化シリコン表面上に作製し、検出することができる。
直接書き込み式ナノリソグラフィーに付す対象となる核酸は特に限定されない。例えば、核酸は合成で製造されてもよく、例えば、基板に化学吸着または共有結合するように適合された官能基を含むように修飾されてもよく、並びに天然型であってもよい。それは低分子量、中分子量または高分子量のオリゴマーまたはポリマーであってもよい。それは1本鎖であっても、2本鎖であってもよく、またはさらに3本鎖であってもよい。核酸はデオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸の構造は、一般に、例えば、CalladineおよびDrew、「DNAの理解、分子とその機能(Understanding DNA, The Molecule and How it Works)」, 第2版、1997年に記載されている。
DPNプリント加工によってパターニングすることができる核酸の一般的な種類には、例えば、DNA、RNA、PNA、CNA、RNA、HNA、p-RNA、オリゴヌクレオチド、DNAのオリゴヌクレオチド、RNAのオリゴヌクレオチド、プライマー、A-DNA、B-DNA、Z-DNA、DNAのポリヌクレオチド、RNAのポリヌクレオチド、核酸のT-接合部、非核酸ポリマー-核酸ブロックコポリマーのドメイン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。核酸の別の一般的な種類には、例えば、ウィルスRNAまたはDNA、疾病に関連する遺伝子、細菌DNA、真菌DNA、生物起源の核酸、ポリメラーゼ連鎖反応増幅の産物である核酸、ナノ粒子に接触している核酸、および2本鎖であり、ナノ粒子のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして、3本鎖複合体を形成する核酸が挙げられる。
一般に、核酸は、遺伝情報の保存および複製並びにタンパク質合成を介するこの情報の発現において中心的な役割を果たす、細胞およびウィルスに見られる有機物質群のいずれであってもよい。プリン、ピリミジン、炭水化物、およびリン酸は、一般に、核酸の基本的な有機物質を特徴づける。プリンおよびピリミジンは、2-デオキシ-D-リボースまたはD-リボースの一級ヒドロキシ基がオルトリン酸によってエステル化されているヌクレオシドであるヌクレオチドである。ヌクレオシドは、プリンまたはピリミジン塩基が、N-原子を介してC-1に結合し、2-デオキシ-D-リボースまたはD-リボースのヒドロキシ基と置換するが、リン酸基を含有しない化合物である。生物系において一般的なヌクレオシドはアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジン(リボースを含有する)、並びにデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、およびチミジン(デオキシリボースを含有する)である。従って、プリン塩基は、アデニンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドであってもよい。ピリミジン塩基は、チミンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド、またはウラシルヌクレオチドであってもよい。
核酸の配列はランダムであっても、または望ましいアミノ酸構造をコードするように特異的であってもよい。例えば、3つのヌクレオチド群は1つのコドンを含むことができる。1コドンは1アミノ酸を含む。核酸のコード領域はコドンを含む。
核酸は遊離状態で存在しても、またはペプチドもしくはタンパク質と結合して、例えば、染色体などの別個の束状構造もしくは構造化された形態の核タンパク質を形成してもよい。核酸はまた、1本鎖形態または2本鎖形態で存在してもよい。核酸は直鎖状、環状または高次コイル状であってもよい。核酸は、細胞または細胞小器官から直接単離することができる。プラスミドまたはクローニングベクターも核酸の例である。
核酸は、各々が炭水化物の糖(デオキシリボース)、リン酸基、および窒素性プリンおよびピリミジン塩基の混合物を含有するヌクレオチドから製造されうる。糖は環式であっても、非環式であってもよい。DNAはチミンおよびシトシンピリミジンだけを含み、ウラシルを含まない。DNAはゲノム、核もしくはミトコンドリアDNAとして細胞から単離されてもよく、または合成により、すなわち、化学的方法によって製造されてもよい。
細胞に存在する遺伝子は、典型的には、DNAのエキソンおよびイントロン配列からなるゲノムDNAを含む。エキソン配列は、アミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチドを含むが、DNAのイントロン配列は、アミノ酸をコードするコドンを含まない可能性があるヌクレオチドを含む。プリンおよびピリミジンのヌクレオチド配列は、その遺伝子によって指定されるタンパク質のポリペプチド鎖中のアミノ酸の配列を決定する。
DNAはまた、RNA依存的DNAポリメラーゼの作用によってRNA鋳型から作製される相補的またはコピーDNA(cDNA)としても単離することができる。例えば、cDNAは、PCR増幅の約100〜約800 merの鎖であってもよい。イントロンを除去するようにRNA鋳型が処理されていると、cDNAは、RNAを転写した遺伝子と同一ではない。従って、cDNAは、性質が主にエキソン的であるヌクレオチド配列を含むことができる。
2本鎖形態である場合には、2つのDNA鎖は二重らせん構造を形成する。このらせん構造では、一方の鎖のヌクレオチドは各々他方の鎖の特異的なヌクレオチドに水素結合している。従って、DNAでは、アデニンはチミンと結合し、グアニンはシトシンと結合する。各鎖に存在するヌクレオチドが互いに結合する能力は、鎖が相補的であること、例えば、一方の鎖の全てのアデニンに対して、他方の鎖にチミンが存在することを決定する。
RNAは、一般に、DNAに類似しているが、デオキシリボースの代わりに糖リボース、チミンの代わりに塩基ウラシルを含有する。RNAは1本鎖であっても、2本鎖であってもよく、細胞のDNAから転写される。RNA分子は、ヘアピンループまたは他の2本鎖構造を形成してもよい。RNAは鋳型RNA、メッセンジャーRNA(mRNA)、総RNA、またはトランスファーRNA(tRNA)ポリソームであってもよい。RNA-DNAハイブリッド分子は本発明により沈着することができる。さらに、タンパク質-核酸または「ペプチド核酸」(「PNA」)も本発明により使用することができる。
相補的なヌクレオチド間に示される結合特性により、核酸は他の核酸と結合することができるプローブとして有用となる。核酸を標識して、プローブとして使用することができる。数多くの標準的な標識技法の任意の1つによって、核酸プローブを使用して、ハイブリダイゼーションにより別の核酸を検出することができる。標識が、例えば、蛍光、放射性または酵素標識である場合には、そのハイブリダイゼーションを可視化または検出することができる。従って、蛍光マーカーもしくは標識、金粒子、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、磁気ビーズまたは当業者に既知の他のマーカーのような検出可能な実体を含むように本発明の核酸を標識または修飾することもできる。例えば、参照として本明細書に組み入れられている、Landesに付与された米国特許第4,626,501号(「標識DNA(Labeled DNA)」を参照されたい。
核酸分解から保護されるように、ヌクレオチドおよび核酸を修飾することもできる。例えば、核酸をリポソーム内に封入してもよい。または、ヌクレオチドのリンを含む基と置換することによって、チオール基をRNAまたはDNA分子などのポリヌクレオチドに導入することができる。核酸の「骨格」にも導入すると、チオールはその部位のDNAの切断を防ぐことができ、従って核酸分子の安定性を改善することができる。
Cookらに付与された米国特許第5,965,721号も参照として本明細書に組み入れられており、パターニングすることができ、ヌクレアーゼ抵抗性の改善および細胞取り込みの改善を示すオリゴヌクレオチドを開示している。
従って、インビボにおける核酸処理のバイオアベイラビリティは、記載するように核酸を修飾することによって改善することができる。例えば、修飾核酸の製剤は、未修飾核酸と比較して半減期が長く、および／または血漿中に長期間保持される。例えば、核酸とポリエチレングリコールの製剤も、任意の既知の徐放性核酸製剤と同様に、インビボにおいて核酸の半減期を延長することができる。従って、核酸を修飾すると、インビボにおける核酸の有効性および／またはバイオアベイラビリティを増加することができる。
核酸のサイズは、数ヌクレオチドのサイズから、オリゴヌクレオチドまたはプローブ、ポリヌクレオチド、遺伝子、染色体断片、染色体全体、およびゲノムまでかなり範囲でありうる。例えば、1本鎖または2本鎖核酸は、鎖長が少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90もしくは100ヌクレオチドまたは塩基対(bp)であってもよい。さらに大きい場合には、核酸は、サイズが少なくとも0.2 kb、0.3 kb、0.4 kb、0.5 kb、0.6 kb、0.7 kb、0.8 kb、0.9 kbまたは1.0 kbであってもよい。実際、本発明に使用する核酸は、サイズが少なくとも1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb、7 kb、8 kb、9 kbまたは10 kbまたはそれ以上であってもよい。好ましいサイズ範囲は1〜2 kbである。核酸は、種々の差長のヌクレオチドの鎖であってもよく、典型的にはポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、一般に鎖状のヌクレオチド配列から生じるオリゴマーである。オリゴヌクレオチドは、例えば、約2〜約100ヌクレオチド、約2〜約20ヌクレオチド、約10〜約90ヌクレオチド、または約15〜約35ヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドアレイでは、約25 merのオリゴヌクレオチドを使用することができる。別の特定の範囲は約60〜約80 merであり、比較的長いオリゴヌクレオチドである。
核酸の選択、プロービング、標識化、および検出を含むマイクロアレイ方法は、米国特許第6,379,932号および同第6,410,231号(Incyte Genomics)に記載されており、使用することができる。これらの特許は全体の内容が参照として組み入れられている。これらの参照文献はディップペン式ナノリソグラフィー方法について記載しているが、それらは、本明細書に記載されている改善されたナノアレイを製造するためにディップペン式ナノリソグラフィー方法を使用することができる方法を示していないか、またはその方法に関するガイダンスを提供していない。
1つのヌクレオチドを含む化合物をインクとして使用することもできる。核酸の混合物を使用することができ、アレイ上の異なるスポットは異なる核酸を含んでもよい。
基板表面への直接書き込み式沈着の前または後に、本発明による沈着のための核酸を他の要素と調製または混合することができる。従って、本発明の「インク」は、望ましい核酸試料以外に、基板表面への沈着のための他の化学物質、化合物、または組成物を含んでもよい。上記のように、溶媒および塩を使用して、核酸をチップに適用することができる。界面活性剤を使用してもよい。例えば、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドは、望ましい核酸と共に基板表面に沈着することができる。
核酸アレイおよびそれに使用する核酸の種類は、参照として本明細書に組み入れられている、「ゲノム科学のプライマー(A Primer of Genome Science)」、G. GibsonおよびS. Muse, 2002, 3〜4章(123〜181ページ)に記載されている。この参照文献は、例えば、cDNAマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイ、標識化、ハイブリダイゼーション並びに統計分析について記載している。cDNAアレイは、数千の遺伝子の相対的な発現量を同時にモニターするために使用することができる。PCR増幅したcDNA断片(EST)をスポッティングし、蛍光または放射性標識したcDNAをプロービングすることができる。観察されるシグナル強度は、検討対象のRNA集団に存在する転写物の量に比例すると考えることができる。強度の差は、処理間の転写物レベルの差を反映する。次いで、通常は確立されている分子生物学的方法を用いて試験することができる仮説を立てることを目標として、統計分析およびバイオインフォマティクス分析を実施することができる。しかし、現在のcDNAマイクロアレイは上限が15,000要素であり、高等な真核生物ゲノムに存在する完全な遺伝子セットを表すことができない。オリゴヌクレオチドおよびcDNAマイクロアレイの利点および欠点は上記の「ゲノム科学のプライマー(A Primer of Genome Science)」に記載されており、本明細書に記載する核酸ナノアレイを構築する際に使用することができる。
ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工、特に平行式ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工は、核酸ナノアレイ、特にコンビナトリアルナノアレイの作製に有用である。アレイは、複数の別個の試料領域またはパターン単位の配列であり、基板により大きいパターンを形成する。試料領域またはパターンは任意の形状(例えば、ドット、線、円、四角形または三角形)であってもよく、より大きい任意のパターン(例えば、別個の試料領域の横列および縦列、格子、グリッド等)に配列されてもよい。パターンは個々の単位をいっても、または個々の単位のより大きな集合をいってもよい。各試料領域は、アレイの他の試料領域に含有されるものと同じまたは異なる試料を含有してもよい。「コンビナトリアルアレイ」は、各試料領域または反復試料領域(通常2〜4)の小さいグループが、アレイの他の試料領域に見られるものと異なる試料を含有するアレイである。「試料」は、検討、同定、反応等の対象となる材料または材料の組み合わせである。
ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工、特に平行式ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工は、マイクロメートル以下のスケールのナノアレイおよびコンビナトリアルナノアレイを作製するのに特に有用である。ミクロン以下のスケールすなわち、ナノスケールのアレイは、深さを除いた、試料領域の横方向の寸法(例えば、長さ、幅または径)の少なくとも1つが1μm未満であることを意味する。これらの寸法は、一般に、基板面の横方向の寸法である。例えば、ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工を使用して、径が約10 nmのドットを作製することができる。チップが改善されると(例えば、チップを尖らせる)、径が1 nmに近いドットを作製することができる。ミクロン以下のスケールのアレイは、現在使用されているマイクロスケール(すなわち、深さ以外の寸法が1〜999μmである)の大きいアレイと比較して反応時間を速くすることができ、使用する試薬の量を少なくすることができる。また、単位領域あたり多くの情報を得ることができる(すなわち、アレイは、現在使用されているマイクロメートルスケールのアレイより密度が濃い)。最後に、マイクロメートル以下のアレイの使用は、新たなスクリーニングの機会を提供する。例えば、このようなアレイは、パターンの物理的変化(例えば、形状、粘着性、高さ)を探求するため、および／または核酸の配列決定を含む、試料領域に存在する化学物質を同定するために、SPMを用いてスクリーニングすることができる。
アレイの各試料領域は単一の試料または単一の沈着物を含有することができる。例えば、試料は、上記に広範に記載されている核酸(例えば、オリゴヌクレオチド、DNAまたはRNA)、タンパク質もしくはペプチド(例えば、抗体または酵素)、リガンド(例えば、抗原、酵素基質、受容体または受容体のリガンド)などの生物材料または生物材料の組み合わせまたは混合物(例えば、タンパク質または核酸の混合物)であってもよい。
本発明は、特に、核酸、オリゴヌクレオチドおよびDNAナノアレイに焦点を絞っている。アレイおよびアレイを使用する方法は当技術分野において既知である。例えば、このようなアレイは、生物材料または化学材料(例えば、イムノアッセイ、酵素活性アッセイ、ゲノミクスおよびプロテオミクス)を同定および／または定量する生物スクリーニングおよび化学スクリーニングに使用することができる。天然型または合成化合物並びに細胞を含む他の材料の生物学的および化学的ライブラリーは、例えば、ゲノミクスおよびプロテオミクスにおいて薬剤候補、酵素阻害剤、受容体のリガンドおよびリガンドの受容体の同定および設計または絞り込みに使用することができる。マイクロ粒子およびナノ粒子のアレイは種々の目的に使用することができる(例えば、米国特許公報第2002/0063212 A1の実施例7を参照されたい)。アレイはまた、結晶化、エッチング(米国特許公報第2002/0063212 A1の実施例5を参照されたい)等の検討にも使用することができる。コンビナトリアルアレイおよび他のアレイ並びにそれらの使用を記載している参照文献には、全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、国際公開公報第96/31625号、国際公開公報第99/31267号、国際公開公報第00/04382号、国際公開公報第00/04389号、国際公開公報第00/04390号、国際公開公報第00/36136号および国際公開公報第00/46406号が挙げられる。最後に、本発明のアレイに実施した実験の結果は従来の手段によって検出することができる(例えば、蛍光、化学発光、生物発光および放射能)。または、SPMをスクリーニングアレイに使用することができる。例えば、AFMは、化学的または生物分子学的識別子でコーティングしたSPMチップを使用することにより、化学分子および生物分子の画像形成および同定を含む、分子の定量的画像形成および同定に使用することができる。例えば、開示内容全体が参照として本明細書に組み入れられている、Frisbieら、Science, 265, 2071-2074(1994)、Wilburら、Langmuir, 11, 825-831(1995)、Noyら、J. Am. Chem. Soc., 117, 7943-7951(1995)、Noyら、Langmuir, 14, 1508-1511(1998)、並びに米国特許第5,363,697号、同第5,372,93号、同第5,472,881号、および同第5,874,668号を参照されたい。
直接書き込み式ナノリソグラフィープリント加工は、複数のドットまたは複数の線を基板に形成することができる、ナノスケールの形状を有するマイクロメートル以下のスケールのアレイである核酸ナノアレイの作製に特に有用である。複数のドットは当技術分野において既知である六角形または四角形の格子を含む格子状のドットであってもよい。複数の線は、線の垂直および平行な配列を含むグリッドを形成してもよい。
ドット径および線幅を含む個々のパターンの横方向の寸法は、例えば、約1,000 nmまたはそれ以下、約500 nmまたはそれ以下、約300 nmまたはそれ以下、約200 nmまたはそれ以下、さらに特に約100 nmまたはそれ以下のナノスケールであってもよい。寸法の範囲は、例えば、約1 nm〜約750 nm、約10 nm〜約500 nm、さらに特には約100 nm〜約350 nmであってもよい。約10 nm〜約100 nmの狭い範囲を使用することができる。
複数のパターン内のパターン数は1つの基板について特に制限されず、一般に高いパターン密度が望ましい。それは、例えば、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、さらに少なくとも100,000であってもよい。例えば、10 X 10アレイなどの四角形の配列も可能である。より高い密度のアレイが好ましく、一般に1平方センチメートルあたり少なくとも100の別個の要素、好ましくは1平方センチメートルあたり少なくとも1,000の別個の要素、さらに好ましくは1平方センチメートルあたり少なくとも10,000の別個の要素、よりさらに好ましくは1平方センチメートルあたり少なくとも100,000の別個の要素である。顕著には、本明細書に記載するナノテクノロジーは、パターン密度として1平方センチメートルあたり百万を超える別個の要素、1平方センチメートルあたり100,000,000の別個の要素、さらに特には1平方センチメートルあたり10億を超える別個の要素を含む超高密度ナノアレイを作製するために使用することができる。
ナノアレイ上の個々のパターン間の距離は異なってもよく、特に制限されない。例えば、パターンは、1ミクロン未満の距離または1ミクロンを超える距離だけ分離することができる。距離は、例えば、約300 〜約1,500ミクロン、または約500ミクロン〜約1,000ミクロンであってもよい。離れているパターン間の距離は、ドットの中心または線の中央などのパターンの中心から測定することができる。
特定のスポットまたは沈着物中の核酸の量は制限されないが、例えば、約0.1 ng〜約100 ng、さらに特には約1 ng〜約50 ngを含む、例えば、pgまたはngレベルであってもよい。核酸マイクロアレイ技術に使用されるスポッティング溶液方法を、ナノアレイ技術においても適宜使用することができる。
本明細書に記載する方法により、基板と基板上の複数の核酸パターンを含み、核酸パターンが基板に化学吸着または共有結合されており、約1,000 nmまたはそれ以下の横方向の寸法を有し、互いに1,000 nmまたはそれ以下の距離だけ分離されており、相補的な核酸にハイブリダイゼーションすることができる核酸ナノアレイを作製することができる。好ましい態様において、核酸ナノアレイは少なくとも1,000の核酸パターンを含み、パターンの横方向の寸法は約500 nmまたはそれ以下であり、パターンは500 nmまたはそれ以下の距離だけ互いに分離されており、パターンはドット形態である。別の好ましい態様において、核酸ナノアレイは少なくとも10,000の核酸パターンを含み、パターンの横方向の寸法は約200 nmまたはそれ以下であり、パターンは500 nmまたはそれ以下の距離だけ互いに分離されており、パターンはドット形態である。
直接書き込み式ナノリソグラフィーおよび核酸マイクロアレイに使用することが既知の、ガラスを含む従来の基板を使用することができる。上記のもの以外に、基板には、膜、プラスチックまたはポリマーゲル、マイクロウェル、電極、ナノギャップおよびセンサーデバイスが挙げられる。膜には、ニトロセルロースおよびナイロン膜を含む、現在の核酸マイクロアレイ技術に使用されるものが挙げられる。例えば、核酸を基板に沈着する前に、基板を単層または下塗り層で処理することができる。下塗り層は、核酸を共有結合により固定するように設計することができる。例えば、5'-アミノアクリルPCRプライマーを使用してESTを増幅する場合には、核酸分子の末端に結合するアルデヒド系コーティングを使用することができる。多層構造物を作製することができる。
生物結合したナノ粒子標識および基礎的要素の迅速な増殖を考慮すると、本明細書に記載する方法により、金属基板および絶縁基板上に多種多様の金属、半導体、磁気および絶縁ナノ構造物をDPNおよび核酸鋳型式により集成することができるはずである。例示的な参照文献には、(1)M. Bruchezら、Science, 281, 2013(1998)、(2)S. R. Nicewarner-Penaら、Science, 294, 137(2001)、(3)Y. Cuiら、Science, 293, 1289(2001)が挙げられる。これらの構造物は、分子電子工学、フォトニクス、高密度情報記憶、およびバイオセンシングの問題に対処するために使用することができる。本発明の方法はまた、マイクロアレイの小型化の基本的な限界を検討するための新規経路を示唆している。本明細書に証明する解像度により、〜100,000の核酸またはオリゴヌクレオチドスポットのアレイを、従来のロボット式スポッティング方法に匹敵するタイムスケールで典型的なAFMスキャナー(100μm×100μm)のサイズである領域に作製でき、それによってナノアレイおよびマイクロアレイ製造および読み出しの走査式プローブ方法の検討を可能にすると思われる。例えば、ロボット式の方法は、1秒あたりわずか数沈着物というスポッティング速度に制限されることがあり、これは、少なくとも5000クローンを含有する100マイクロアレイをロボットが作製するのに2日かかる可能性があることを意味している。
本発明を実施する際に有用なナノ粒子には、金属(例えば、金、銀、銅および白金)、半導体(例えば、CdSe、CdSおよびZnSをコーティングしたCdSeまたはCdS)、および磁石(例えば、フェロマグネタイト)、コロイド材料が挙げられる。本発明を実施する際に有用な他のナノ粒子には、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd2As2、InAsおよびGaAsが挙げられる。ナノ粒子のサイズは、好ましくは、約5 nm〜約150 nm(平均径)であり、さらに好ましくは約5 nm〜約50 nmであり、さらに好ましくは約10 nm〜約30 nmである。核酸に結合したナノ粒子を製造する方法およびそれを使用する方法は、参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第6,361,944号に記載されている。
本発明は、上記に詳細に記載し、以下に主張している本発明を範囲を限定しない以下の実施例によってさらに例示される。
実施例
本発明は、以下の限定するのもではない実験の部および実施例によってさらに例示される。Mirkinらに付与された米国特許公報2002/0063212 A1の実施例1〜7はDIP PEN(商標)ナノリソグラフィープリント加工の種々の態様を例示しており、参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、以下の限定するのもではない実験の部および実施例によってさらに例示される。Mirkinらに付与された米国特許公報2002/0063212 A1の実施例1〜7はDIP PEN(商標)ナノリソグラフィープリント加工の種々の態様を例示しており、参照として本明細書に組み入れられる。
実験の部
一般的な方法と材料
1-オクタデカンチオールはAldrich（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。アンカー基とDNAの間に18原子に相当するポリエチレングリコールスペーサー(PEG6)を有するチオール修飾15-mer DNA(C1、C2、表1を参照されたい)はIDT(アイオワ州コーラルビル、PAGE精製)から購入し、さらなる精製をすることなく使用した。金基板パターニング実験に使用したリンキングDNA(L1およびL2)および金ナノ粒子結合DNA(G1)は以前に報告されているように合成した(例えば、J. J. Storhoffら、J. Am. Chem. Soc., 120, 1959(1998)；およびMirkinらに付与された米国特許第6,417,340号および同第6,361,944号を参照されたい)。
一般的な方法と材料
1-オクタデカンチオールはAldrich（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。アンカー基とDNAの間に18原子に相当するポリエチレングリコールスペーサー(PEG6)を有するチオール修飾15-mer DNA(C1、C2、表1を参照されたい)はIDT(アイオワ州コーラルビル、PAGE精製)から購入し、さらなる精製をすることなく使用した。金基板パターニング実験に使用したリンキングDNA(L1およびL2)および金ナノ粒子結合DNA(G1)は以前に報告されているように合成した(例えば、J. J. Storhoffら、J. Am. Chem. Soc., 120, 1959(1998)；およびMirkinらに付与された米国特許第6,417,340号および同第6,361,944号を参照されたい)。
アクリルアミド修飾(Acrydite(商標))12-および15-mer DNA(C3およびC4)はIDTから購入した(RP HPLC精製)。酸化シリコンパターニング実験に使用したリンキングDNA(L3およびL4)およびナノ粒子結合DNA(G2およびG3)は既知の方法で合成した(例えば、J. J. Storhoffら、J. Am. Chem. Soc., 120, 1959(1998)；およびMirkinらに付与された米国特許第6,417,340号および同第6,361,944号を参照されたい)。
（表１）DPNパターニング、ナノ粒子修飾および粒子のDNA-パターニング表面への結合に使用するオリゴヌクレオチド配列
単結晶シリコンウェハー上の金薄膜は、以前に報告されている手法(L. M. Demersら、Anal. Chem. 72, 5535(2000)を参照されたい)により作製した。酸化シリコン基板はピラニア溶液(硫酸:30%過酸化水素3:1)で洗浄してから、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTMS)で2時間蒸気輸送によってシラン化し(例えば、D. G. Kurthら、Langmuir, 9: 2965(1993)を参照されたい)、その後それらをエタノールですすぎ、80℃においてN2気流下において10分間硬化した。
AFMチップ作製
先ず、従来の窒化シリコンプローブチップ(ばね定数〜0.3 Nm-1、熱顕微鏡、カリフォルニア州サニーベール)をピラニア溶液(1 H2O2 : 3 H2SO4)で10分間洗浄し、DI水、エタノールおよびトルエンですすぎ、次いでガラス製のペトリ皿内で3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APS)の1% vol/volトルエン溶液に1〜2時間浸漬した。シラン化の後、チップをトルエンで洗浄し、次いで窒素気流下で乾燥した。典型的な手法では、チップコーティング溶液(1 mM DNA 、90%ジメチルホルムアミド(dmf)、10%水、0.3 M MgCl2)に20秒間浸漬し、その後、圧縮ジフルオロエタンで乾燥することによってチップをチオール修飾DNAで即座にコーティングした。シラン化後即座に溶液に浸漬する場合には、アミンコーティングチップはジメチルホルムアミド(DMF)溶液で十分にコーティングされたが、一般に〜12時間後では、おそらくチップ表面の汚染によりコーティングは不良であった。
先ず、従来の窒化シリコンプローブチップ(ばね定数〜0.3 Nm-1、熱顕微鏡、カリフォルニア州サニーベール)をピラニア溶液(1 H2O2 : 3 H2SO4)で10分間洗浄し、DI水、エタノールおよびトルエンですすぎ、次いでガラス製のペトリ皿内で3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APS)の1% vol/volトルエン溶液に1〜2時間浸漬した。シラン化の後、チップをトルエンで洗浄し、次いで窒素気流下で乾燥した。典型的な手法では、チップコーティング溶液(1 mM DNA 、90%ジメチルホルムアミド(dmf)、10%水、0.3 M MgCl2)に20秒間浸漬し、その後、圧縮ジフルオロエタンで乾燥することによってチップをチオール修飾DNAで即座にコーティングした。シラン化後即座に溶液に浸漬する場合には、アミンコーティングチップはジメチルホルムアミド(DMF)溶液で十分にコーティングされたが、一般に〜12時間後では、おそらくチップ表面の汚染によりコーティングは不良であった。
ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工実験
ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工は、雰囲気制御型グローブボックス内でDNAコーティングAFMチップ(接触力〜2.5 nN)を使用して実施した。グローブボックスは、±5℃および相対湿度±5%に温度および湿度を制御することができる。DPNプリント加工実験は全て、特注のDPNプリント加工ソフトウェアインターフェースを備えたPark Scientific Instruments Autoprobe CP AFMを使用して実施した。
ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工は、雰囲気制御型グローブボックス内でDNAコーティングAFMチップ(接触力〜2.5 nN)を使用して実施した。グローブボックスは、±5℃および相対湿度±5%に温度および湿度を制御することができる。DPNプリント加工実験は全て、特注のDPNプリント加工ソフトウェアインターフェースを備えたPark Scientific Instruments Autoprobe CP AFMを使用して実施した。
金ナノ粒子集生物
金ナノ粒子は、既知の方法によってチオール官能性DNAで修飾した(例えば、J. J. Storhoffら、J. Am. Chem. Soc., 120, 1959(1998)；およびMirkinらに付与された米国特許第6,417,340号および同第6,361,944号を参照されたい)。パターニングした金基板に集成するためには、チオール修飾したDNAで修飾したナノ粒子(20μl、径13 nm、5 nM)を、ハイブリダイゼーション溶液(最終濃度0.1μM DNA、0.3 M PBS(0.01 M リン酸緩衝液 pH 7、0.3 M NaCl)、0.025%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))中で少なくとも12時間リンキングDNAに一晩ハイブリダイゼーションした。次いで、パターニングした水平の基板に粒子-DNA溶液を液滴として配置し、室温において3時間インキュベーションした。インキュベーション後、スライドをポリプロピレンチューブに入れ、室温において緩衝液の流動下ですすぎ(0.3 M PBS、0.025% SDS)、次に0.3 M 酢酸アンモニウム、pH 7ですすいで、表面から塩を除去し、AFM画像形成用のスライドを作製した。DNAパターニングしたSiOx基板に粒子を集成するためには、60℃まで5分間加熱し、次いで30分間冷却させることによって、リンカーDNAをDNA修飾ナノ粒子にハイブリダイゼーションした(0.5μMリンカー、10 nM粒子、総容量0.2ml)。その後、溶液を0.3 M PBS 0.025% SDSで総容量1 mlに希釈し、上記のパターニングした基板にハイブリダイゼーションするために使用した。
金ナノ粒子は、既知の方法によってチオール官能性DNAで修飾した(例えば、J. J. Storhoffら、J. Am. Chem. Soc., 120, 1959(1998)；およびMirkinらに付与された米国特許第6,417,340号および同第6,361,944号を参照されたい)。パターニングした金基板に集成するためには、チオール修飾したDNAで修飾したナノ粒子(20μl、径13 nm、5 nM)を、ハイブリダイゼーション溶液(最終濃度0.1μM DNA、0.3 M PBS(0.01 M リン酸緩衝液 pH 7、0.3 M NaCl)、0.025%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))中で少なくとも12時間リンキングDNAに一晩ハイブリダイゼーションした。次いで、パターニングした水平の基板に粒子-DNA溶液を液滴として配置し、室温において3時間インキュベーションした。インキュベーション後、スライドをポリプロピレンチューブに入れ、室温において緩衝液の流動下ですすぎ(0.3 M PBS、0.025% SDS)、次に0.3 M 酢酸アンモニウム、pH 7ですすいで、表面から塩を除去し、AFM画像形成用のスライドを作製した。DNAパターニングしたSiOx基板に粒子を集成するためには、60℃まで5分間加熱し、次いで30分間冷却させることによって、リンカーDNAをDNA修飾ナノ粒子にハイブリダイゼーションした(0.5μMリンカー、10 nM粒子、総容量0.2ml)。その後、溶液を0.3 M PBS 0.025% SDSで総容量1 mlに希釈し、上記のパターニングした基板にハイブリダイゼーションするために使用した。
画像形成実験
Digital Instruments製のシリコンカンチレバー、ばね定数〜40 Nm-1を備えたDigital Instruments(カルフォルニア州サンタバーバラ)ナノスコープIIIaを使用してDNAパターンおよびナノ粒子のタッピングモードトポグラフィーおよび位相AFM画像を得た。AFM画像は全て、一次または二次平坦化関数を適用するだけで処理した。蛍光画像形成のためには、パターニングした基板に、2X SSPE緩衝液(2μM DNA，0.3 M NaCl，0.02 M リン酸ナトリウム、0.002M EDTA、0.2% SDS、pH 7.4)中で蛍光団標識相補的DNAを室温において30分間ハイブリダイゼーションし、2X SSPE 0.2% SDSですすぎ、次いで2X SSPE 0.2% SDSに10分間浸漬した。基板を0.3 M酢酸アンモニウムですすぎ、N2気流で乾燥してから、Hgランプ白色光励起光源を備えたZeiss Axiovert 100顕微鏡で蛍光画像形成した。
Digital Instruments製のシリコンカンチレバー、ばね定数〜40 Nm-1を備えたDigital Instruments(カルフォルニア州サンタバーバラ)ナノスコープIIIaを使用してDNAパターンおよびナノ粒子のタッピングモードトポグラフィーおよび位相AFM画像を得た。AFM画像は全て、一次または二次平坦化関数を適用するだけで処理した。蛍光画像形成のためには、パターニングした基板に、2X SSPE緩衝液(2μM DNA，0.3 M NaCl，0.02 M リン酸ナトリウム、0.002M EDTA、0.2% SDS、pH 7.4)中で蛍光団標識相補的DNAを室温において30分間ハイブリダイゼーションし、2X SSPE 0.2% SDSですすぎ、次いで2X SSPE 0.2% SDSに10分間浸漬した。基板を0.3 M酢酸アンモニウムですすぎ、N2気流で乾燥してから、Hgランプ白色光励起光源を備えたZeiss Axiovert 100顕微鏡で蛍光画像形成した。
実施例1:
ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工による核酸のパターニング
この実施例は、基板表面へのチップコーティング拡散の改善および工程後の段階におけるパターンの安定性を提供するDPNプリント加工により核酸をパターニングする方法を記載する。この方法は、アミノシラン修飾窒化シリコンAFMカンチレバー-チップ集成物と、環状ジスルフィドおよびポリエチレングリコール修飾合成核酸を使用し、例えば、ナノ粒子プローブを含むプローブでハイブリダイゼーションすることができる、安定なオリゴヌクレオチドパターンを金基板に形成する。プリント加工中の相対湿度を慎重に選択すると、プリント加工した形状のサイズを制御することができる。
ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工による核酸のパターニング
この実施例は、基板表面へのチップコーティング拡散の改善および工程後の段階におけるパターンの安定性を提供するDPNプリント加工により核酸をパターニングする方法を記載する。この方法は、アミノシラン修飾窒化シリコンAFMカンチレバー-チップ集成物と、環状ジスルフィドおよびポリエチレングリコール修飾合成核酸を使用し、例えば、ナノ粒子プローブを含むプローブでハイブリダイゼーションすることができる、安定なオリゴヌクレオチドパターンを金基板に形成する。プリント加工中の相対湿度を慎重に選択すると、プリント加工した形状のサイズを制御することができる。
1. AFMチップ前処理手法
先ず、従来の窒化シリコンAFMチップをトリメトキシアミノプロピルシラン(APS)で修飾する。カンチレバーをピラニアエッチング溶液(濃硫酸/30%過酸化水素、3:1)中で10分間洗浄し、次いでナノピュア(Nanopure)水およびエタノールですすぎ、窒素気流下で乾燥した。チップを、APSの1%トルエン溶液に1時間浸漬することによって共有結合により修飾し、次いでトルエンですすいだ。この手法により、負に荷電した核酸が接着する正に荷電した表面が作製された。
先ず、従来の窒化シリコンAFMチップをトリメトキシアミノプロピルシラン(APS)で修飾する。カンチレバーをピラニアエッチング溶液(濃硫酸/30%過酸化水素、3:1)中で10分間洗浄し、次いでナノピュア(Nanopure)水およびエタノールですすぎ、窒素気流下で乾燥した。チップを、APSの1%トルエン溶液に1時間浸漬することによって共有結合により修飾し、次いでトルエンですすいだ。この手法により、負に荷電した核酸が接着する正に荷電した表面が作製された。
2. AFMチップコーティング
(a)1つのヘキサンチオール部分または環状ジスルフィドエピアンドロステロンリンカーおよび(b)ポリエチレングリコール(PEG)スペーサーを含有する修飾合成DNAの1 mM溶液(図1および図3を参照されたい)を、20マイクロリッターのジメチルホルムアミド(DMF)と1マイクロリッターの1.5 M MgCl2の水溶液中で調製した。チップを溶液に20〜60秒間浸漬し、圧縮空気または窒素気流で乾燥することによって、前処理したAFMチップにDNAをコーティングした。一般に、DMFはDNAを溶解する際になんらかの役割を果たし、AFMチップをコーティング溶液で濡らすことを可能にする。一般に、DNA鎖間の反発作用をスクリーンすることによって、表面に高密度DNAパターンを達成するために低濃度のMgCl2を使用した。一般に、PEGスペーサーは、基板にDNAを拡散させる際に重要になることがある。
(a)1つのヘキサンチオール部分または環状ジスルフィドエピアンドロステロンリンカーおよび(b)ポリエチレングリコール(PEG)スペーサーを含有する修飾合成DNAの1 mM溶液(図1および図3を参照されたい)を、20マイクロリッターのジメチルホルムアミド(DMF)と1マイクロリッターの1.5 M MgCl2の水溶液中で調製した。チップを溶液に20〜60秒間浸漬し、圧縮空気または窒素気流で乾燥することによって、前処理したAFMチップにDNAをコーティングした。一般に、DMFはDNAを溶解する際になんらかの役割を果たし、AFMチップをコーティング溶液で濡らすことを可能にする。一般に、DNA鎖間の反発作用をスクリーンすることによって、表面に高密度DNAパターンを達成するために低濃度のMgCl2を使用した。一般に、PEGスペーサーは、基板にDNAを拡散させる際に重要になることがある。
3. DPNプリント加工によるDNAの直接パターニング
金基板にDNAを移動するために、DNAコーティングしたAFMチップを基板に対して位置づけ、基板に接触しているように基板に密接させた(図3を参照されたい)。表面のチップの動きは、DPNプリント加工ソフトウェアで制御した。パターンサイズの制御は、雰囲気制御型チャンバー内の相対湿度を変更することによって実施した。例えば、ドットパターンの径は、相対湿度約88%における約780 nmから相対湿度約50%における約430 nmまで変わってもよい(下の矢印、図4を参照されたい-ドットは全て、AFMチップをその場に20秒間保持することによって作製した)。ジスルフィドリンカーは、金表面へのキレート結合を形成し、表面へのDNA結合の安定性を増加する。このように結合されたDNAは、周囲の未パターニング金の不動態化に使用する(1-オクタデカンチオールなどの)アルカンチオールによる置換を受けない。DNAパターンは、相補的なDNA配列で修飾されている金ナノ粒子プローブにハイブリダイゼーションすることによって生物作用を有することが示された(図5並びに例えば、Letsinger, R. L, Elghanian, R.、Viswanadham, G.、Mirkin, C. A. Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, 289-291および国際公開公報第98/04740号を参照されたい)。
金基板にDNAを移動するために、DNAコーティングしたAFMチップを基板に対して位置づけ、基板に接触しているように基板に密接させた(図3を参照されたい)。表面のチップの動きは、DPNプリント加工ソフトウェアで制御した。パターンサイズの制御は、雰囲気制御型チャンバー内の相対湿度を変更することによって実施した。例えば、ドットパターンの径は、相対湿度約88%における約780 nmから相対湿度約50%における約430 nmまで変わってもよい(下の矢印、図4を参照されたい-ドットは全て、AFMチップをその場に20秒間保持することによって作製した)。ジスルフィドリンカーは、金表面へのキレート結合を形成し、表面へのDNA結合の安定性を増加する。このように結合されたDNAは、周囲の未パターニング金の不動態化に使用する(1-オクタデカンチオールなどの)アルカンチオールによる置換を受けない。DNAパターンは、相補的なDNA配列で修飾されている金ナノ粒子プローブにハイブリダイゼーションすることによって生物作用を有することが示された(図5並びに例えば、Letsinger, R. L, Elghanian, R.、Viswanadham, G.、Mirkin, C. A. Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, 289-291および国際公開公報第98/04740号を参照されたい)。
実施例2および3:
金(実施例2)などの金属の導電性基板および絶縁基板(実施例3)にオリゴヌクレオチドの共有結合により固定したナノスケールパターンを作製するために直接書き込み式ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工(例えば、DPNプリント加工)を使用した。ヘキサンチオール基によるDNAの修飾を金上のパターニングに提供し(実施例2)、5'-末端アクリルアミド基を保有するオリゴヌクレオチドを誘導体化したシリカにパターニングした(実施例3)。多数マイクロメートルから100ナノメートル未満までの範囲の形状サイズがこれらの実施例において達成され、生じたパターンは、含まれるDNAの配列特異的な結合特性を示した。このパターンを使用して、表面に個々のオリゴヌクレオチド修飾粒子の集成を誘導し、1つのアレイへの多数のDNA配列の沈着が証明された。
金(実施例2)などの金属の導電性基板および絶縁基板(実施例3)にオリゴヌクレオチドの共有結合により固定したナノスケールパターンを作製するために直接書き込み式ディップペン式ナノリソグラフィープリント加工(例えば、DPNプリント加工)を使用した。ヘキサンチオール基によるDNAの修飾を金上のパターニングに提供し(実施例2)、5'-末端アクリルアミド基を保有するオリゴヌクレオチドを誘導体化したシリカにパターニングした(実施例3)。多数マイクロメートルから100ナノメートル未満までの範囲の形状サイズがこれらの実施例において達成され、生じたパターンは、含まれるDNAの配列特異的な結合特性を示した。このパターンを使用して、表面に個々のオリゴヌクレオチド修飾粒子の集成を誘導し、1つのアレイへの多数のDNA配列の沈着が証明された。
DPNプリント加工を使用して、金(実施例2)および酸化シリコン(実施例3)表面にオリゴヌクレオチドをパターニングした。DNAパターニングを促進するいくつかの主要点が同定された。先ず、AFMチップをDNAで十分にコーティングした。未修飾窒化シリコンカンチレバーを使用して、DPNにより種々の疎水性分子を沈着したが、このようなカンチレバーは、制御が困難になることがある形状サイズおよび形状のDNAパターンを生ずることがある。DNAパターニングの制御の改善は、3'-アミノプロピルトリメトキシシランによる窒化シリコンAFMカンチレバーの表面修飾(1%v/vトルエン溶液中で1時間)により、達成され、チップ表面へのDNAインクの高信頼度の接着を促進した。
1 mM DNAおよび0.3 M MgCl2を含有する90%ジメチルホルムアミド/10%水溶液に10秒間浸漬することによってシラン化したチップにDNAをコーティングし、次いで圧縮ジフルオロエタン気流でチップを乾燥した。正に荷電した親水性チップ表面はこのDNAインク溶液で容易に濡れ、これらのAFMチップを数時間DPNプリント加工実験に使用してから、それらを再コーティングした。チップはまた、金蒸着層およびシステアミンの自己集成式単層をコーティングすることによっても首尾よく使用した。さらに、周囲湿度を制御することによりオリゴヌクレオチドの高信頼度のDPNパターニングが可能になることが見出された。特に明記しない限り、パターニングは全て、23±3℃、相対湿度45±5%において環境制御型グローブボックス内で実施した。
インク-基板組み合わせを慎重に選択することによっても、DPNプリント加工工程が促進された。例えば、実施例2において、ヘキサンチオール修飾オリゴヌクレオチドを使用して、サイズが50 nm〜数マイクロメートルの範囲の形状を金基板に直接パターニングした(図6〜図10)。DNAのヘキサンチオール基が下層のAu表面に化学吸着すると一般に考えられている(例えば、T. M. Herneら、J. Am. Chem. Soc., 119, 8916(1997)を参照されたい)。基板にオリゴヌクレオチドをパターニングした後、基板を1-オクタデカンチオール(ODT、1 mM)のエタノール溶液に1分間浸漬した。この手法は、未パターニング金表面に疎水性単層をコーティングし、その後のハイブリダイゼーション実験におけるDNAまたはDNA修飾ナノ粒子の非特異的な吸着に対して不動態化した。基板のODT処理後、タッピングモードAFMによってオリゴヌクレオチドパターンを画像化し、形状高さが2〜5 nmであることを示した(図6A)。R. Levickyら、J. Am. Chem. Soc., 120, 9787(1998)を参照されたい。固定したDNAは高い特異的認識特性を保持し、13-mer-径のオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の集成を誘導するために使用することができた(図6B)。多数マイクロメートルから100 nmまたはそれ以下の長さスケールの構造物がこの方法で製造され、所定の構造形態の個々の粒子を表面に配置した(図6〜9)。DNAナノパターンとオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子の相互作用は選択性が高く、相補的な結合鎖が存在しない場合、非特異的な結合はほとんどなかった(図7)。
金-チオール系は、DPNプリント加工を使用してオリゴヌクレオチドをパターニングするすぐれた方法を提供しているが、金基板の電気伝導性は、このような表面に集成したナノ構造物における電荷輸送および近接場光学現象の検討を妨害し、表面に結合した任意の蛍光団からの発光も消光する。従って、酸化シリコンウェハーにDNAパターンを作製するためにDPNプリント加工方法を開発した(図10)。熱酸化したウェハーの表面を3'-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTMS)で処理して活性化した。D. G. Kruthら、Langmuir, 9, 2965(1993)を参照されたい。AFMチップの作製およびインク付けは、金表面へのDNAのパターニングと実質的に同じように実施したが、この場合には、5'-末端アクリルアミド基を有するオリゴヌクレオチドを使用した。M. Kenney, Biotechniques, 25, 516(1998)を参照されたい。室温および相対湿度45%というDPNプリント加工条件下では、アクリルアミド部分は、マイケル付加によってMPTMSのチオール側基と反応して、DNAを表面に共有結合する(図11を参照されたい)。パターニング後、pH 10の緩衝アクリル酸モノマーと反応させることによって基板を不動態化した(アポジェントディスカバリーズクエンチ溶液(Apogent Discoveries Quench Solution)、30mm)。全てのDNAスポットおよび配列をパターニングしたら、典型的には基板を終夜放置して、チオエーテル付加物を形成させ、その後基板を洗浄し、未パターニング領域の未反応のチオール基をクエンチする。パターニングしたオリゴヌクレオチドの生物作用は、相補的および非相補的蛍光団標識DNAを含有する溶液に表面を暴露することによって証明した。その後、エピ蛍光顕微鏡によってパターンを特徴づけた(図10A)。全ての場合において、相補的な標的およびパターニングされた領域に対応する蛍光だけが検出された。同じDNAナノ構造物[脱イオン(DI)水ですすぐことによって1本鎖相補鎖をデハイブリダイゼーションした後]を使用して、相補的なDNA修飾金ナノ粒子の集成を誘導した（図10B）。この技法を使用して、従来のマイクロアレイと比較して約160,000倍小さい(面積密度に関して)径〜50 nmのDNAスポットを作製し、検出した。
実施例4:
DPNプリント加工の重要な特徴は、長さスケールの広い範囲にわたって特異的な化学的機能を有するパターンを作製すると同時に、所定の方法で形状サイズに制御を示すことができることである。驚くべきことに、オリゴヌクレオチドなどの電荷の大きい高分子のパターンを、小分子と同じ方法で基板に移動することができる。金およびMPTMS修飾酸化シリコン基板では、AFMチップから表面へのDNAの移動は、理論的に予測され(J. Jangら、J. Chem. Phys., 115, 2721(2001)を参照されたい)、金上のアルカンチオール(D. A. Weinbergerら、Adv. Mater., 12, 1600(2000)を参照されたい)、並びにシリコンおよびヒ化ガリウム上のシラザン(Maynorら、Langmuir, 17, 2575(2001)を参照されたい)について観察される接触時間で、パターン領域の同じ線形の増加をとった（図12および図13A、B）。速度定数は各インク-基板ペアについて異なることもあるが、制御式DPNプリント加工は、小分子および塩から有機高分子の範囲の化合物を種々の基板にパターニングすることをこの結果は強調している。
DPNプリント加工の重要な特徴は、長さスケールの広い範囲にわたって特異的な化学的機能を有するパターンを作製すると同時に、所定の方法で形状サイズに制御を示すことができることである。驚くべきことに、オリゴヌクレオチドなどの電荷の大きい高分子のパターンを、小分子と同じ方法で基板に移動することができる。金およびMPTMS修飾酸化シリコン基板では、AFMチップから表面へのDNAの移動は、理論的に予測され(J. Jangら、J. Chem. Phys., 115, 2721(2001)を参照されたい)、金上のアルカンチオール(D. A. Weinbergerら、Adv. Mater., 12, 1600(2000)を参照されたい)、並びにシリコンおよびヒ化ガリウム上のシラザン(Maynorら、Langmuir, 17, 2575(2001)を参照されたい)について観察される接触時間で、パターン領域の同じ線形の増加をとった（図12および図13A、B）。速度定数は各インク-基板ペアについて異なることもあるが、制御式DPNプリント加工は、小分子および塩から有機高分子の範囲の化合物を種々の基板にパターニングすることをこの結果は強調している。
実施例5
金および酸化シリコン上では、DNAの輸送速度およびパターンサイズは慎重な湿度制御によって適合することができる。従って、適当なタイムスケールで広いダイナミックレンジにわたって形状サイズを変更することが可能である。例えば、金上では、AFMチップを10秒間保持することによって作製されるスポットの径は、相対湿度を15%変化させると、50〜300 nm変化する(図13C、図14も参照されたい)。この湿度依存性は、一般に、チップと基板の間の水のメニスカスに一般に依存する、AFMチップから表面へのDNAの輸送機序を指摘している。例えば、Pinterら、Langmuir, 14, 5457(1999)を参照されたい。
金および酸化シリコン上では、DNAの輸送速度およびパターンサイズは慎重な湿度制御によって適合することができる。従って、適当なタイムスケールで広いダイナミックレンジにわたって形状サイズを変更することが可能である。例えば、金上では、AFMチップを10秒間保持することによって作製されるスポットの径は、相対湿度を15%変化させると、50〜300 nm変化する(図13C、図14も参照されたい)。この湿度依存性は、一般に、チップと基板の間の水のメニスカスに一般に依存する、AFMチップから表面へのDNAの輸送機序を指摘している。例えば、Pinterら、Langmuir, 14, 5457(1999)を参照されたい。
実施例6
多重DNAインク能力を証明するために、DPNプリント加工を使用して、酸化シリコン基板上に2成分DNAアレイを作製し、相補的な蛍光団標識プローブを用いたハイブリダイゼーションによって配列特異性を証明した(図15および図16)。パターンの化学的完全性を証明するために、同じチップをDI水で処理して、蛍光団標識DNAを除去し、次いで5-および13-nm-径の金ナノ粒子の混合物を含有する溶液に暴露した。大型粒子および小型粒子を、それぞれ、第１および第2のパターンに相補的なDNAで修飾した。適当なハイブリダイゼーション条件下において、粒子は適切なパターンで選択的に集成した。この実験は、AFMに基づいたスクリーニング手法においてナノ粒子を診断用プローブとして使用することができる方法だけでなく、ナノ粒子系構造物の集成を制御し、製造するために直接書き込み式DPN方法によってナノ構造物を作製することができる方法を示す。
多重DNAインク能力を証明するために、DPNプリント加工を使用して、酸化シリコン基板上に2成分DNAアレイを作製し、相補的な蛍光団標識プローブを用いたハイブリダイゼーションによって配列特異性を証明した(図15および図16)。パターンの化学的完全性を証明するために、同じチップをDI水で処理して、蛍光団標識DNAを除去し、次いで5-および13-nm-径の金ナノ粒子の混合物を含有する溶液に暴露した。大型粒子および小型粒子を、それぞれ、第１および第2のパターンに相補的なDNAで修飾した。適当なハイブリダイゼーション条件下において、粒子は適切なパターンで選択的に集成した。この実験は、AFMに基づいたスクリーニング手法においてナノ粒子を診断用プローブとして使用することができる方法だけでなく、ナノ粒子系構造物の集成を制御し、製造するために直接書き込み式DPN方法によってナノ構造物を作製することができる方法を示す。
Claims (22)
- 基板上に核酸のナノスケールパターンを作製する方法であって、
正電荷を有するように走査型プローブ顕微鏡チップを修飾し、修飾したチップを形成する工程と、
修飾したチップを溶媒、核酸及び無機塩を含むインク組成物でコーティングする工程と、
修飾し、且つコーティングした走査型プローブ顕微鏡チップから基板に核酸が移動し、基板上に安定なナノスケールパターンを形成するのに十分に高い相対湿度で、該チップと基板とが互いに接近するように、該チップを基板に対して位置づける工程と、
を含み、前記核酸のナノスケールパターンが相補的な核酸にハイブリダイズすることができるものである、前記方法。 - 前記チップが原子間力顕微鏡チップである、請求項１記載の方法。
- 前記チップが中空チップである、請求項１記載の方法。
- 正に荷電したアミノ基を有するように前記チップを修飾する、請求項１記載の方法。
- 前記相対湿度が少なくとも25％である、請求項１記載の方法。
- 前記相対湿度が40％〜100％である、請求項１記載の方法。
- 前記核酸がデオキシリボース核酸である、請求項１記載の方法。
- 前記核酸が一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
- 前記基板に対する化学吸着又は共有結合を提供するスペーサー基及び末端基を含むように、前記核酸が修飾されている、請求項１記載の方法。
- 前記基板が電気伝導体である、請求項１記載の方法。
- 前記基板が電気絶縁体である、請求項１記載の方法。
- 前記パターンの横方向の寸法が500nm以下である、請求項１記載の方法。
- 前記パターンの横方向の寸法が200nm以下である、請求項１記載の方法。
- 前記パターンの横方向の寸法が10nm〜100nmである、請求項１記載の方法。
- 前記相補的な核酸はプローブの一部である、請求項１記載の方法。
- 前記相補的な核酸は前記核酸パターンをプローブに連結するリンカーの一部である、請求項１記載の方法。
- 前記基板をさらに不動態化する、請求項１記載の方法。
- 前記チップが原子間力顕微鏡チップであり、前記基板が電気伝導体であり、前記核酸がデオキシリボース核酸であり、且つ前記相対湿度が少なくとも25％である、請求項１記載の方法。
- 前記チップが原子間力顕微鏡チップであり、前記基板が電気伝導体であり、前記核酸がデオキシリボース核酸であり、前記相対湿度が少なくとも25％であり、且つ前記基板をさらに不動態化する、請求項１記載の方法。
- 前記チップが正電荷を含有するように処理された原子間力顕微鏡チップであり、前記核酸がデオキシリボース核酸であり、且つ前記相対湿度が25％〜100％である、請求項１記載の方法。
- 前記チップが正に荷電するように修飾された原子間力顕微鏡チップであり、前記基板が電気伝導体又は電気絶縁体であり、前記核酸が該基板表面に対する共有結合又は化学吸着用の官能基を含有するデオキシリボース核酸であり、前記相対湿度が40％〜50％であり、且つ前記基板をさらに不動態化する、請求項１記載の方法。
- 前記チップが原子間力顕微鏡チップ又は中空チップであり、前記基板が電気伝導体又は電気絶縁体であり、前記核酸が該基板表面に対する共有結合又は化学吸着用の官能基を含有するデオキシリボース核酸であり、前記相対湿度が少なくとも25％であり、且つ前記基板をさらに不動態化する、請求項１記載の方法。
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