WO2006098446A1 - センシングデバイス、センシング装置およびセンシング方法 - Google Patents

センシングデバイス、センシング装置およびセンシング方法 Download PDF

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WO2006098446A1
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sensing device
fine particles
metal fine
sensing
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PCT/JP2006/305447
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Hiroaki Misawa
Kosei Ueno
Yasuyuki Tsuboi
Keiji Sasaki
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National University Corporation Hokkaido University
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    • Y10S977/779—Possessing nanosized particles, powders, flakes, or clusters other than simple atomic impurity doping

Definitions

  • Sensing device sensing device, and sensing method
  • the present invention relates to a sensing device, a sensing apparatus, and a sensing method.
  • the optical response of various detection target forces is enhanced by surface (localized) plasmons to perform microsensitive optical detection. It relates to sensing devices, sensing devices, and sensing methods.
  • Fine metals for example, fine metals with a nanometer-scale surface structure, and nanometer-sized metal fine particles are “localized (surface) plasmon resonance absorption in a specific wavelength region according to their shape and size. Shows a characteristic optical response (light absorption).
  • metal types that exhibit localized plasmon resonance absorption include noble metals such as gold, silver, and platinum, but even if the metal type is the same, the plasmon resonance absorption wavelength may be different for different sizes and shapes. is important. Taking advantage of these properties, it is expected to be applied to various optical devices (for example, optical filters) using the above-mentioned fine metals and metal fine particles.
  • Localized plasmon resonance absorption also has important applications.
  • the intensity of the optical response (for example, fluorescence emission or light scattering (Raman scattering)) of a molecule adsorbed on a metal exhibiting plasmon resonance is remarkably enhanced by the interaction between the molecule and surface plasmon.
  • a metal structure made of a fine metal exhibiting plasmon resonance on a substrate functions as a high-sensitivity sensor device for molecular systems, and application research and development in this direction is being actively conducted.
  • the Raman scattered light is usually a weak optical response, it must be efficiently enhanced in order to be used as a response signal of the sensor. For this reason, it has been difficult to use Raman scattered light as the response signal of the sensor, even if enhanced by plasmons.
  • the detection target substance itself is a fluorescent molecule or is fluorescently labeled. It is an optical response that can be obtained with a molecule, and is usually a signal stronger than light scattering such as Raman scattering. Therefore, the fluorescence emission is enhanced by plasmon resonance and is suitable for use as a response signal of the sensor. Therefore, it is conceivable to detect fluorescent molecules or fluorescently labeled molecules attached to a metal structure having plasmon resonance absorption using fluorescence as a response signal.
  • impurities present in the target system may be excited at the same time even when the detection target substance is excited and irradiated with excitation light.
  • the excited impurity is a fluorescent substance
  • the fluorescent emission from the interfering substance is strong and becomes a background signal (background light), which greatly reduces the detection sensitivity and detection accuracy of the detection target substance.
  • An important application of fluorescence sensing is biological analysis such as immunoassay and gene (DNA) analysis. In such biological analysis, fluorescence emission from interfering substances (such as serum and enzymes) is particularly important. It becomes a background light and becomes a serious problem that causes a decrease in analysis accuracy.
  • Two-photon excitation means that a sample is irradiated with light having a wavelength twice that of the light wavelength corresponding to the electron transition of a fluorescent labeling reagent or a fluorescent substance (that is, the energy per photon is half). This is a phenomenon in which an electronically excited state (that is, a fluorescent state) is generated by absorbing two photons. If this two-photon excitation is applied to a surface plasmon enhancement sensor, the electric field of the excitation light will be strongly localized by the resonance plasmon, and only that part will be selectively excited. For this reason, it is possible to significantly reduce the influence of the background light caused by the interference substances as described above, and to greatly improve the detection sensitivity and the detection accuracy.
  • Patent Document 1 a sample solution containing an antigen is supplied to a metal thin film on which an antibody is immobilized. After binding the antigen and antibody, supply a fluorescent labeling reagent containing a fluorescently labeled antibody and bind it to the antigen! / In a state where a fluorescently labeled antibody is bound to a fluorescent antibody, light having an integer multiple of the light normally absorbed by the fluorescently labeled antibody is irradiated onto a glass prism having a metal thin film to perform two-photon excitation or multiphoton excitation. A fluorescence immunoassay technique that induces excitation and spectrally analyzes the generated fluorescence emission is disclosed.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-0221565
  • the absorption probability (absorption cross section) of a multiphoton transition including a two-photon transition is much lower (several tens of digits) than the absorption probability of a normal one-photon transition. Therefore, it is not easy to generate multi-photon excitation efficiently even with localized plasmon enhancement.
  • the present invention has been made in view of the strong point, can realize efficient multiphoton absorption and local plasmon enhancement, and senses an optical response with high sensitivity and high accuracy. It is an object to provide a sensing device, a sensing device, and a sensing method.
  • the sensing device of the present invention is a sensing device having plasmon resonance absorption, and includes a plurality of fine metal particles having a certain size and arranged at certain intervals and in a certain direction on a substrate. Take.
  • the sensing device of the present invention includes a sensing device having a plurality of fine metal particles having a certain size and arranged on a substrate in a certain interval and in a certain direction, and a detection target attached to the sensing device.
  • a configuration having excitation light irradiating means for irradiating the sensing device with excitation light that causes the substance to emit fluorescence and fluorescence intensity detecting means for detecting the intensity of fluorescence emission of the detection target substance is adopted.
  • the sensing method of the present invention is an excitation that causes a detection target substance attached to a sensing device having a plurality of metal fine particles having a certain size and arranged at a certain interval and in a certain direction on a substrate to emit fluorescence.
  • a sensing device capable of defining the resonant plasmon absorption wavelength of incident light incident on the detection target system by precisely controlling the structure of the metal fine particles formed on the substrate.
  • optical responses such as fluorescence, light scattering (Raman scattering), high long wave emission, sum frequency, and difference frequency due to localized plasmons can be enhanced. If these are used as optical responses, highly sensitive sensing can be realized.
  • the use of the sensing device can improve the excitation light rate of multiphoton absorption in addition to the enhancement of the optical response by the localized plasmon. If fluorescence by photon absorption is used as an optical response, highly sensitive and accurate sensing can be realized.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a method for manufacturing a metal structure (sensing device) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 Cross-sectional views by process for explaining the manufacturing method of FIG.
  • FIG. 3 Diagram showing an example of a calculation method using the plasmon resonance absorption spectrum of the processing resolution of metal fine particles
  • FIG. 4 Diagram showing an example of a method for calculating the interval between metal particles using the plasmon resonance absorption spectrum of the processing resolution of metal particles.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of the overall configuration of a sensing device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of the operation of the sensing device of FIG.
  • FIG. 9 Diagram showing the relationship between the resonant plasmon absorption spectrum of a metal structure and the distance between adjacent metal particles contained in the metal structure
  • FIG. 10 Diagram showing the relationship between the spacing between adjacent metal particles and the maximum wavelength of the resonance plasmon absorption spectrum of the metal structure
  • FIG. 11 Electron micrographs of metal structures integrally formed with fine metal particles with various adjacent distances.
  • FIG. 12 Diagram showing the relationship between the intensity of the excitation laser light irradiated to the metal structure and the multiphoton excitation fluorescence intensity of the dye on the metal structure
  • FIG. 14 Diagram showing the relationship between the resonance plasmon absorption spectrum of a metal structure and the thickness of the metal fine particles
  • the present inventor has determined the size, shape, and arrangement of metal fine particles. It was found that it was necessary to align the direction of the rows and the distance between the metal particles. In addition, in order to align the size and shape of the metal fine particles, the direction of arrangement of the metal fine particles, and the distance between the metal fine particles, the metal fine particles are precisely and regularly arranged on the substrate by applying semiconductor fine processing technology. They found that they need to be arranged.
  • wavelength selectivity means sharpening the absorption maximum (peak) of the plasmon resonance absorption spectrum.
  • the present invention aligns metal fine particles (for example, metal nanorods and metal nanoblocks, etc.) whose size is precisely controlled on a solid substrate such as glass at a uniform minute interval so that the directions thereof are uniaxial.
  • the metal structure is used as a sensing device by attaching a detection target substance to a large number of integrated metal structures and detecting an optical response to the light irradiated to the metal structures.
  • a sensing device that combines excellent wavelength selectivity with respect to incident light and high multiphoton excitation efficiency with respect to plasmon resonance absorption characteristics.
  • fluorescence emission one-photon fluorescence, multi-photon fluorescence
  • a metal structure in which metal fine particles whose size is precisely controlled is regularly arranged at regular intervals is used as a sensing device of a sensing device, so that efficient multiphoton absorption is achieved.
  • Sensitive sensing based on optical response enhancement by plasmons is realized.
  • the present invention controls the optical response (preferably multiphoton, preferably) from the molecule as the detection target adsorbed on the metal structure by controlling the size and interval of the fine metal particles in the metal structure.
  • the present invention relates to a method that enables detection of an object to be detected by excitation emission).
  • the characteristics of the sensing device of the present invention that is, the characteristics of the metal structure used for the sensing device of the sensing device will be described.
  • the characteristics of the material, shape, size, spacing, and direction of a plurality of fine metal particles constructed in a substrate shape are specifically explained. Light up.
  • the substrate on which a plurality of metal fine particles are arranged is not particularly limited, but in order to use the metal structure as an optical response device, a substrate made of a solid material that does not absorb light in the visible region or near infrared region, that is, a substrate.
  • a transparent substrate is preferred. Examples of specific substrate materials include glass, quartz, and sapphire.
  • the metal fine particles arranged and arranged in a substrate form are characterized by having plasmon resonance absorption.
  • the metal fine particles having plasmon resonance absorption include noble metals such as gold, silver, copper and platinum.
  • the metal fine particles may be particles obtained by plating other materials with these noble metals.
  • the metal fine particles of the present invention have a shape in which a cut surface exists such that the two metal fine particles cut when the metal fine particles are cut into two have the same shape.
  • the metal fine particles of the present invention can take the shape of a hexahedron (a rectangular parallelepiped) in which all adjacent surfaces intersect at a right angle. In this case, when the metal fine particles are viewed from the upper surface perpendicular to the substrate, the metal fine particles look rectangular.
  • the vertices of the rectangle do not necessarily need to be viewed at a strict right angle.
  • the vertices may have a rounded shape or may have a shape in which the corners of the vertices are cut off. However, in this case, it is preferable that each vertex of the rectangle has a uniform shape.
  • each metal fine particle may be a metal fine particle having plasmon resonance absorption, and its size (equivalent volume diameter) is Inn! ⁇ LOOOnm is preferred 10 nm ⁇ 500 nm is preferred! / ,.
  • Each metal fine particle has a shape having four vertices having the same shape when viewed from the upper surface perpendicular to the substrate. For example, in the case of a rectangular parallelepiped metal fine particle, each vertex of the rectangle corresponds to four vertices having the same shape. Each of these four vertices is adjacent to one of the other four fine metal particle vertices at regular intervals.
  • the metal fine particles of the present invention are characterized by having a certain size. “Constant size” means that the area, volume, and height of each metal fine particle disposed on the substrate are constant.
  • the “area of the metal fine particle” as defined herein means the area of the metal fine particle when the metal fine particle is viewed from the upper surface perpendicular to the substrate, and the “height of the metal fine particle” is a metal having a surface force of the substrate. It means the thickness of fine particles.
  • the area is constant” means that the variation rate of the area of each metal fine particle is 5% or less, preferably 2% or less. Further, “constant volume” means that the change rate of the volume of each metal fine particle is 5% or less, preferably 3% or less. “Height” means that the fluctuation rate of the height of each metal fine particle is 10% or less, preferably 5% or less.
  • the area of the metal fine particles, the volume of it is preferred instrument metal fine particles is 100nm 2 ⁇ 30000nm 2 about, it forces S has preferably a 1000nm 3 ⁇ 3000000nm 3 about.
  • the height of the metal fine particles can be derived from the area and volume of the metal fine particles, and is preferably 5 nm to 300 nm. More preferably, it is ⁇ lOOnm.
  • each metal fine particle as viewed from the upper surface force perpendicular to the substrate can be confirmed and calculated by an electron microscopic photographic power in which the metal fine particle is copied.
  • the metal fine particles are rectangular parallelepiped
  • the length of the major axis and the length of the minor axis of the metal fine particles are read from an electron micrograph of the metal fine particles viewed from the upper surface perpendicular to the substrate, and these are multiplied.
  • the area of the metal fine particles is calculated.
  • the volume of the metal fine particles is calculated by reading the height of the metal fine particles from an electron micrograph showing the side force parallel to the substrate and multiplying the calculated area by the read height.
  • the metal fine particles of the present invention are characterized by being arranged at regular intervals. “Constant spacing” means that the shortest distance between any one of a plurality of metal fine particles arranged on a substrate and the metal fine particles adjacent thereto is 30 nm or less (preferably lOnm or less), and It means that the variability is less than 5%.
  • the four apexes of the metal fine particles are respectively the apexes of the other four metal fine particles. Since it is adjacent to one of the points at a certain interval, the shortest distance between adjacent metal particles is specifically the distance between any vertex of the metal particle and the vertex of the metal particle closest to this vertex. means.
  • the electric field is enhanced (surface plasmon enhancement) by dipole-dipole interaction.
  • the multiphoton excitation efficiency of the metal structure can be improved.
  • the variability in the length of the major axis and the length of the minor axis of the metal fine particles and the variability in the distance between the metal fine particles are determined by the plasmon resonance absorption of the fabricated metal structure.
  • the processing resolution at the nanoscale is achieved.
  • the variability of each parameter of the metal fine particles can be calculated. Details of the calculation method will be described later.
  • the metal fine particles of the present invention are arranged in a certain direction.
  • Constant direction means that on a straight line connecting an arbitrary vertex of a metal fine particle and a vertex located on the opposite side of the vertex, any vertex of a plurality of adjacent metal fine particles starting from this metal fine particle, It means that the vertex located at the diagonal of the vertex is located.
  • the present inventor has sensed a sensing device using a metal structure that has been precisely processed by controlling the material, shape, size, interval, and direction of a plurality of metal fine particles as described above on a substrate.
  • a metal structure that has been precisely processed by controlling the material, shape, size, interval, and direction of a plurality of metal fine particles as described above on a substrate.
  • the present inventor improves the wavelength selectivity of the metal structure by making the shape and size of each metal fine particle constant, and determines the height of the metal fine particle and the interval between the metal fine particles respectively. It has been found that by making it constant within this range, the plasmon enhancement effect can be greatly increased and the multiphoton excitation efficiency can be dramatically increased.
  • the “metal structure” means an aggregate of metal (metal fine particles) such as a metal nanorod array, and is a substrate on which an aggregate of metal (metal fine particles) is arranged. It is used in the meaning including a certain metal structure device. That is, the metal structure of the present invention can include a plurality of metal fine particles and a substrate on which the plurality of metal fine particles are arranged.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a method for manufacturing a metal structure (sensing device) according to an embodiment of the present invention.
  • 2A to 2E are cross-sectional views by process for explaining the manufacturing method of FIG.
  • step S1 the solid transparent substrate 10 (for example, a glass substrate) is washed and dried (see FIG. 2A). Wash and dry thoroughly. If the surface of the substrate 10 is not sufficiently cleaned, metal fine particles produced on the substrate 10 in a later step may be peeled off from the substrate 10.
  • the solid transparent substrate 10 for example, a glass substrate
  • step S2 after applying a spin-coating (rotating) resist solution for substrate-type electron lithography on the surface of the substrate 10 cleaned in step S100 (process 1), baking (calo heat) is applied. Then, the resist solvent is removed, and a resist thin film 20 is formed on the substrate 10 (see FIG. 2B).
  • the thickness of the resist thin film 20 formed on the substrate 10 is preferably less than a micrometer. Specifically, for example, it is desirable to be about 200 nm or less.
  • the present inventor has found that in order to form a resist thin film having such a thin film thickness, a resist solution obtained by diluting a commercially available resist with a dedicated solvent about twice is used for spin coating.
  • the reason why the thickness of the resist thin film 20 is made 200 nm or less in order to realize the finer metal fine particles is as follows. If the resist film thickness is 200 nm or more, when drawing exposure is performed with an electron beam, the entire thick resist film must be exposed with an electron beam, and the acceleration voltage of the electron beam needs to be extremely high. .
  • the spatial resolution of drawing is a force that can be miniaturized as the acceleration voltage of the electron beam increases. As such, the spatial resolution of drawing is reduced at an extremely high acceleration voltage. Therefore, in order to achieve a spatial resolution for accurately drawing fine metal particles of the size assumed by the present invention, It is not necessary to make the fast voltage extremely high. With the acceleration voltage required in this case, a film thickness of 200 ⁇ m or less is appropriate.
  • a predetermined pattern is drawn on the resist thin film 20 formed in step S2 by, for example, an electron beam exposure apparatus (not shown).
  • the predetermined pattern is a trace of an integrated layout of desired metal structures and metal fine particles.
  • the exposure conditions of this electron beam exposure process are used. Optimization is extremely important. As a result of repeated detailed experiments, the present inventor has found the following optimization conditions. As optimization conditions for exposure, it is preferable to increase the acceleration voltage of the electron beam and at the same time to significantly reduce the exposure dose rate. Specifically, for example, when the acceleration voltage of the electron beam is 100 kV to 200 kV and the exposure dose rate is 2 CZcm 2 or less, fine metal particles can be formed on the substrate. Of particular note is the extremely low dose rate conditions. For example, as a guideline, a dose rate of 1 ⁇ CZcm 2 corresponds to 1 / 100th of the recommended dose rate for the resist used.
  • the reason why the acceleration voltage of the electron beam is increased and the exposure dose rate is significantly reduced as the exposure optimization condition is as follows.
  • the spatial resolution of processing (drawing) can be improved by increasing the acceleration voltage of the electron beam. This is because if the acceleration voltage is increased, the electron beam speed increases and the electron de Broglie wavelength decreases.
  • a large exposure dose rate corresponds to a long exposure time. If the exposure time becomes longer, the vibration of the sample itself during the exposure (for example, air conditioning noise in the laboratory and extremely fine vibration noise of the device itself) cannot be ignored, and “blurred” at the edge of the processed shape, etc. Has occurred! / There is a risk of reducing the processing resolution.
  • step S3 the resist thin film 20 on which the electron beam exposure drawing has been performed is further developed, rinsed, and dried (see FIG. 2C).
  • the development time is also an important parameter, and the development time is preferably longer than the standard time corresponding to the above low and dose rates. It is desirable to be about 30 minutes.
  • step S4 chromium, gold, etc. are then deposited on the substrate 10 that has been covered in step S3.
  • a metal having plasmon resonance absorption is sequentially formed by sputtering (see FIG. 2D).
  • the chromium layer has a thickness of about 2 nm and can improve the adhesion between the solid transparent substrate 10 and a metal such as gold.
  • the film thickness of the metal (such as gold) having plasmon resonance absorption is 10 nm to 100 nm. This thickness corresponds to the thickness (height) of the metal fine particles at the time of completion.
  • symbol 30 indicates a metal film (a chromium layer and a metal layer such as gold) formed by sputtering.
  • step S5 the excess resist material is removed (peeled) from the substrate 10 covered in step S4 to produce the metal structure 100 (see FIG. 2E). Resist removal in this process is called “lift-off”.
  • the substrate 10 processed in step S400 step 4
  • the substrate 10 processed in step S400 step 4
  • a registry mover a chemical solution
  • ultrasonically cleaned to remove excess resist.
  • step S6 the metal fine particles 40 completed in step S5 are evaluated by an electron microscope and optical measurement. Specifically, the fine structure of the completed metal fine particle 40 was clarified using an electron microscope, and the plasmon resonance absorption response to the completed metal structure 100 was evaluated by measuring the absorption spectrum using an optical microscope. To do. Furthermore, the efficiency of multiphoton absorption is also evaluated using a laser as an excitation light source.
  • the size (long-axis direction Z The length and thickness in the minor axis direction can be controlled very well on the nanometer scale. Also, the variability of the size (length in the major axis direction, length in the minor axis direction, thickness) can be suppressed to 5% or less.
  • the adjacent The distance between the fine metal particles 40 can be reduced to 50 nm or less, and the variability can be suppressed to 5% or less.
  • the major axis or minor axis of each metal fine particle 40 can be aligned along one axial direction.
  • the variability (processing resolution) of each parameter of metal fine particles is generally evaluated by directly observing the produced metal fine particles with an electron microscope, but it is difficult to evaluate with a resolution of several nanometers.
  • FIGS. 3A to 3C are diagrams showing an example of a method for calculating the axial length using the plasmon resonance absorption spectrum of the processing resolution of the metal fine particles.
  • the rectangular parallelepiped structure shown in Fig. 3A was designed by changing the length in the minor axis direction to 120nm and the height to 60nm, and changing the length in the major axis direction to 240, 242, 244, 246, 248.
  • the optical properties of the metal fine particles are as shown in Fig. 3B and Fig. 3C.
  • the length of the metal fine particles in the major axis direction can be expressed by 240 + x (nm), and x is an integer satisfying 0 ⁇ 2x ⁇ 8.
  • FIG. 3B shows a plasmon absorption spectrum obtained by irradiating incident light having a polarization parallel to the major axis direction on a metal fine particle whose length in the major axis direction is changed. .
  • the maximum wavelength of the plasmon resonance absorption spectrum of the metal fine particle is shifted to the longer wavelength side as the length of the metal fine particle in the long axis direction becomes longer.
  • the maximum wavelength of the plasmon resonance absorption spectrum is extremely sensitive to the size of the metal fine particles (in this case, the length in the long axis direction).
  • the processing resolution of the metal fine particles can be evaluated with various noirations by changing the polarization direction of incident light incident on the metal fine particles.
  • the processing resolution in the short axis direction can be evaluated from the plasmon absorption spectrum obtained by irradiating incident light having a polarization parallel to the short axis direction.
  • the processing resolution related to the distance (interval) between adjacent metal fine particles is generally observed directly with an electron microscope, but is evaluated with a resolution of several nanometers. Is difficult U ,.
  • the calculation of the distance between the metal fine particles with a resolution of several nanometers is performed by measuring and analyzing the plasmon resonance absorption spectrum of the manufactured metal structure.
  • Nanometer-scale metal fine particles have a property that the plasmon resonance absorption spectrum shifts due to resonance plasmon interaction as the metal fine particles come close to each other. The shift amount is sensitively dependent on the distance between adjacent metal fine particles.
  • absorption spectroscopic measurement is performed on the fabricated metal structure, and the position of the absorption maximum in the obtained plasmon resonance absorption spectrum is compared, so that the distance between adjacent metal fine particles can be measured on a nanometer scale. It can be evaluated with processing resolution. This will be specifically described below with reference to FIGS. 4A to 4C.
  • FIGS. 4A to 4C are diagrams showing an example of a method for calculating the interval between metal fine particles using the plasmon resonance absorption spectrum of the processing resolution of the metal fine particles.
  • the distance (interval) between adjacent metal fine particles means the shortest distance between an arbitrary vertex of the metal fine particles and the vertex of the metal fine particles closest to the vertex.
  • the distance (interval) between the metal fine particles is defined as gap.
  • FIG. 6 is a diagram showing a measurement result of a plasmon resonance absorption spectrum of a metal structure when it is made into a metal.
  • the spectrum in Fig. 4B was measured by irradiating incident light parallel to the dimer direction (arrow direction) in Fig. 4A.
  • a is one 1.8nm
  • b is 0nm
  • c is 0.9nm
  • d is 1.8nm
  • e is 2.7nm
  • f 3.5nm
  • g is 5.3nm
  • the gap is a negative value (for example, the spectrum of a), it indicates that adjacent metal particles overlap each other (overlapping).
  • FIG. 4B shows that the maximum wavelength of the plasmon resonance absorption spectrum of the metal structure shifts sharply depending on the gap. In other words, it can be seen that the spectrum actually shifts greatly according to the change in the distance between the metal particles of about 0.9 nm in design size. Moreover, as the gap increases, the maximum wavelength of the plasmon resonance absorption wavelength is gradually shifted to the longer wavelength side.
  • FIG. 4C is a graph showing the relationship between the shortest distance between metal particles and the maximum wavelength of the plasmon resonance absorption spectrum.
  • FIG. 4C shows an example in which the maximum wavelength of the resonance plasmon resonance absorption spectrum is examined in the gap range from 8.8 nm to 144 nm.
  • the relationship between the shortest distance between the metal fine particles and the maximum wavelength of the plasmon resonance absorption spectrum shows a complicated behavior, but the measurement result is almost the same as the theoretical value with no variation in the measurement result. That is, as described in FIGS. 4A to 4C, a metal structure in which the shortest distance between the metal fine particles is precisely controlled with a design size of 0.9 nm is produced, and the metal structure is processed with a processing resolution of at least 0.9 nm. It can be seen that the shortest distance between particles can be controlled. In the examples described later, it will be explained that the control of the shortest distance between the metal fine particles was accurately performed.
  • the size of the metal structure and metal fine particles produced by the above production method And a function (wavelength selectivity of optical response) having a plasmon absorption characteristic (absorption wavelength position) that greatly depends on the distance between adjacent metal fine particles. It also has an efficient multiphoton absorption function with wavelength selectivity, and can detect fluorescence from the excited adsorbed molecules generated by multiphoton absorption without being quenched.
  • a large number of metal fine particles having almost no size variability are made uniform on the nanometer scale with a distance between the metal fine particles, and the metal fine particles. It is possible to produce a metal structure device by aligning and accumulating on a solid transparent substrate by arranging the same direction in one direction. Thereby, it is possible to realize a fine metal structure having an ideal shape 'structure exhibiting a resonance plasmon optical response characteristic having excellent wavelength selectivity and high multiphoton excitation efficiency.
  • the sensing device of the present invention can be used for any sensing application, preferably applied to a sensing method described later, or used as a member of a sensing device.
  • the sensing method of the present invention is characterized in that the detection target substance is sensed by using the optical response of the detection target substance enhanced by the sensing device as a response signal. Specifically, for example, 1) a step of preparing the sensing device to which the detection target substance is attached, 2) a step of irradiating the prepared sensing device with excitation light, and 3) an optical response from the detection target substance. And sensing (quantitative or qualitative) the substance to be detected.
  • the optical response used as the response signal in the sensing method of the present invention is appropriately selected depending on the type of the substance to be detected. For example, fluorescence, light scattering (including Raman scattering), resonance absorption, harmonic generation, etc. Or the sum (difference) frequency. If the detection target substance is a fluorescent molecule or a molecule labeled with a fluorescent substance, the response signal can be fluorescent. If the detection target substance is a biomolecule such as DNA or enzyme, the response signal is Raman-scattered. It can be In the sensing method of the present invention, fluorescence due to multiphoton absorption can be used as a response signal.
  • the detection target substance attached to the sensing device is not particularly limited.
  • the detection target substance when the response signal is fluorescence, the detection target substance is a fluorescent molecule or a molecule labeled with a fluorescent substance. In the case of man scattering, it can be a biomolecule.
  • the means for attaching the detection target substance to the sensing device For example, a solution containing the detection target substance may be dropped on the device.
  • the light irradiated to the sensing device is preferably incident in a direction perpendicular to the sensor device substrate.
  • the sensor device exhibits a sufficient function regardless of the polarization direction of incident light, such as non-polarized light, circularly polarized light, elliptically polarized light, or linearly polarized light and its direction.
  • the light applied to the sensing device is preferably light that can excite the detection target substance.
  • excitation include fluorescence excitation that causes fluorescence emission and elementary excitation that causes Raman scattering.
  • fluorescence excitation include one-photon excitation and multi-photon excitation (including two-photon excitation).
  • the light irradiated to the sensing device is appropriately selected according to the type of the substance to be detected and the configuration of the metal structure included in the sensing device.
  • irradiation light excitation light
  • fluorescence when fluorescence is used as an optical response
  • the wavelength of the excitation light is preferably set in accordance with the plasmon resonance absorption wavelength region of the metal structure that is the sensing device.
  • the excitation wavelength of the excitation light is a value that matches the overlapping wavelength region. It is preferable to do. This makes it possible to measure significantly enhanced fluorescence from the detection target substance attached to the metal structure that is a sensing device, and to detect the detection target substance.
  • the optical response is fluorescence based on one-photon absorption
  • the maximum absorption of the plasmon resonance absorption spectrum of the metal structure that is a sensing device and the maximum absorption of the absorption vector of the detection target substance are greatly separated. If it is (for example, 200 nm or more), it is preferable to set the wavelength of the excitation light to a value that matches the absorption wavelength region of the detection target substance. Since the wavelength range of the plasmon resonance absorption spectrum of the metal structure is extremely wide! /, Even if the wavelength of the excitation light is far away from the maximum absorption power of the plasmon resonance absorption spectrum of the metal structure, This is because some of the plasmons in the metal structure can be resonantly excited.
  • the excitation efficiency decreases compared to the case where the absorption spectrum of the detection target substance overlaps with the plasmon resonance absorption spectrum of the metal structure. Fluorescence enhanced by plasmon resonance absorption is measured with sufficient intensity. It is possible to sufficiently sense the detection target substance.
  • the wavelength of the excitation light is preferably set to a value that matches the resonance absorption wavelength region of the plasmon resonance absorption spectrum of the metal structure that is the sensing device.
  • the excitation light is transmitted in picoseconds. Or, by using a femtosecond laser, efficient multiphoton absorption via surface plasmon occurs, and the fluorescence of the substance to be detected is greatly enhanced, and the substance to be detected is sufficiently sensed. can do.
  • the sensing device described above is used in the sensing method of the present invention, highly sensitive sensing can be performed regardless of the absorption spectrum of the substance to be detected.
  • the detection target substance has absorption in any wavelength range (that is, the absorption spectrum of the detection target substance is different from the plasmon resonance absorption spectrum of the metal structure of the sensing device). It has the advantage of being able to sense the target substance efficiently (regardless of the relative relationship on any wavelength).
  • the detection target substance can be quantified or qualitatively. For example, it can be quantified by measuring the intensity of the optical response, and can be qualitative by measuring the vector of the optical response.
  • a calibration curve indicating the relationship between the intensity of the optical response and the amount of the detection target substance may be used.
  • the spectrum of the optical response is substance-specific, when qualifying the detection target substance, compare the measured optical response spectrum with the spectrum of the optical response of the detection target substance confirmed in advance.
  • Sensing device of the present invention Next, a sensing device using the above-described metal structure as a sensing device will be described. In the following, a sensing device using fluorescence as a response signal will be described as an example. Of course, the response signal is not limited to fluorescence.
  • the sensing device of the present invention can be a device that senses a detection target substance by measuring light scattering (Raman scattering), high-wavelength light emission, sum frequency, difference frequency, and the like.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of the overall configuration of the sensing device according to one embodiment of the present invention.
  • a sensing device that performs sensing by irradiating the surface of the metal structure 100 with excitation light on a sample labeled with a fluorescent molecule and detecting the amount of excited fluorescence will be described.
  • the sensing device 200 includes a metal structure 100, a substrate transfer unit 110, a stage 120, a fluorescence intensity measurement unit 130, and a computer 140.
  • the metal structure 100 has a configuration in which metal fine particles whose materials, shapes, sizes, intervals, and directions are precisely controlled are arranged on a substrate. Functions as a device.
  • a sample containing a detection target substance labeled with a fluorescent molecule is attached to the surface of the metal structure 100 and loaded into the substrate transfer unit 110.
  • the fluorescent molecule selectively labels the detection target substance in the sample attached to the surface of the metal structure 100.
  • the substrate transfer unit 110 transfers the loaded metal structure 100 onto the stage 120.
  • the substrate transfer unit 110 can simultaneously transfer a plurality of metal structures 100 onto the stage 120 in order to simultaneously sense a plurality of types of detection target substances.
  • the metal structure 100 transferred from the substrate transfer unit 110 is placed on the stage 120, and the irradiation position on the metal structure 100 of the excitation light irradiated inside the fluorescence intensity measurement unit 130 is changed.
  • Translate the XY plane so that The stage 120 is controlled by the computer 140 and can move in the XY plane with high drive resolution.
  • the fluorescence intensity measuring unit 130 irradiates the metal structure 100 placed on the stage 120 with excitation light, and detects the intensity of the excited fluorescence. Further, the fluorescence intensity measuring unit 130 can quantitatively detect the detection target substance attached to the metal structure 100 based on the excited fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity measurement unit 130 will be described in detail with reference to FIG. FIG. 6 is a functional block diagram showing functions of the fluorescence intensity measuring unit 130.
  • the fluorescence intensity measurement unit 130 includes a light source controller 131, a power source 132, and a light source 133.
  • the light source controller 131 adjusts the output voltage of the power supply 132 under the control of the computer 140. Thereby, the excitation wavelength of the excitation light emitted from the light source 133 is controlled.
  • the power supply 132 supplies a voltage to the light source 133.
  • the light source 133 irradiates the metal structure 100 placed on the stage 120 with excitation light.
  • the excitation wavelength of this excitation light is controlled to a wavelength suitable for being absorbed by the detection target substance attached to the metal structure 100.
  • the control of the excitation wavelength of the excitation light may be different in each case of performing fluorescence sensing based on one-photon absorption and performing fluorescence sensing based on multi-photon absorption.
  • the excitation wavelength of the excitation light emitted from the light source 133 is appropriately controlled according to the absorption spectrum of the detection target substance and the plasmon resonance absorption spectrum of the metal structure 100 as described above.
  • the fluorescence intensity detection unit 134 detects the intensity of fluorescence emitted by the detection target substance by absorbing the excitation light from the light source 133.
  • the detection target substance analyzing unit 135 calculates the detection target substance attached to the metal structure 100 quantitatively by praying for the intensity of the fluorescence detected by the fluorescence intensity detection unit 134.
  • the quantitative calculation of the detection target substance by the detection target substance analysis unit 135 is performed using, for example, a calibration curve indicating the relationship between the fluorescence intensity and the amount of the detection target substance. This calibration curve can be stored for each substance to be detected in a storage means (not shown) held by the fluorescence intensity measurement unit 130.
  • the detection target substance analysis unit 135 outputs the calculation result of the detection target substance to the computer 140.
  • the computer 140 performs various controls of the stage 120 and the fluorescence intensity measuring unit 130.
  • the computer 140 controls the light source controller 131 to adjust the excitation wavelength of the excitation light emitted from the light source 133. Further, the computer 140 displays the calculation result of the detection target substance calculated by the detection target substance analysis unit 135. The operation signal is input to the computer 140 by the user via an interface (not shown).
  • an interface not shown.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of the operation of the sensing device 200 of FIG.
  • a sample containing a detection target substance labeled with a fluorescent molecule is attached to the surface of the metal structure 100, and the metal structure 100 is placed on the stage 120 via the substrate transfer unit 110. (S10).
  • the light source 133 of the fluorescence intensity measurement unit 130 irradiates the metal structure 100 with excitation light for exciting the detection target substance.
  • the stage 120 is controlled by the computer 140 to translate the XY plane, thereby changing the irradiation position of the excitation light on the metal structure 100.
  • the excitation light emitted from the light source 133 is controlled to have a suitable excitation wavelength that emits fluorescence when the detection target substance absorbs.
  • the fluorescence intensity detection unit 134 detects the intensity of fluorescence emitted by the detection target substance by absorbing the excitation light from the light source 133 (S12), and the detection target substance analysis unit 135 The fluorescence intensity detected by the fluorescence intensity detection unit 134 is analyzed to quantitatively calculate the detection target substance attached to the metal structure 100 (S13). The calculated adhesion amount of the detection target substance is displayed by the computer 140.
  • the excitation wavelength of the excitation light emitted from the light source 133 can be different when performing fluorescence sensing based on one-photon absorption and when performing fluorescence sensing based on multi-photon absorption.
  • the use of force metal structure 100 described as a sensing device using metal structure 100 for fluorescence sensing is not limited to this.
  • the metal structure 100 can be applied to a sensing device of a sensing device that senses light scattering (Raman scattering), high-long wave light emission, sum frequency, difference frequency, and the like.
  • the metal structure device is manufactured by aligning and accumulating on the solid transparent substrate, with the arrangement of aligned in one direction.
  • such a metal structure is applied to a sensing device as a sensing device, so that a sensing device such as fluorescence sensing can be realized with high sensitivity.
  • fine metal particles were produced on a glass substrate (Matsunami Glass: 24 mm ⁇ 24 mm) by electron beam lithography Z lift-off. Specifically, the glass substrate is first ultrasonically cleaned with acetone, methanol, and ultrapure water, and then a positive electronic lithography resist (ZEP-520A, made by Nippon Zeon Co., Ltd.) is used on the glass substrate. Spin coating (initial: 10 seconds at lOOOrpm, main: 90 seconds at 4000rpm) and pre-betaring at 180 ° C for 3 minutes on a hot plate.
  • ZMP-520A positive electronic lithography resist
  • a predetermined pattern was drawn at a dose rate of 1.2 CZcm 2 using an electron beam exposure apparatus with an acceleration voltage of lOOkV, and then developed for 30 minutes.
  • lift-off was performed in a registry mover (dimethylformamide) solution.
  • a registry mover dimethylformamide
  • the size of the fabricated metal structure is such that the length in the major axis direction, the length in the minor axis direction, and the thickness (height from the surface of the substrate) are several lOnm to several lOOnm and nanometer
  • the distance between metal particles was designed on the order scale. In this way, various metal structures having different lengths and thicknesses in the major axis Z minor axis direction of metal fine particles and intervals (distances) between adjacent metal fine particles were produced.
  • FIGS. 8A and 8B are electron micrographs of representative metal structures (sensing devices) actually produced. In particular, FIG.
  • FIG. 8A shows the case where the thickness of the metal fine particle is 40 nm, the major axis and the minor axis of the metal fine particle are both lOOnm, and the distance (interval) between adjacent metal fine particles is 4 nm.
  • FIG. 8B shows the case where the thickness of the metal fine particle is 40 nm, the long axis and the short axis of the metal fine particle are both lOOnm, and the distance between adjacent metal fine particles is lOnm! /, The
  • metal particles whose size and shape are precisely controlled are arranged on the substrate in an orderly manner at regular intervals and in a uniform direction. It has been demonstrated that a body (sensing device) can be produced.
  • the electric field is enhanced (surface plasmon enhancement) due to the dipole-dipole interaction as the distance (interval) between the metal fine particles decreases. Therefore, comparing Fig. 8A and Fig. 8B, the distance between adjacent metal fine particles is 4nm and lOnm, respectively, so the metal structure in Fig. 8A is more sensitive than the metal structure in Fig. 8B. It is thought to function as a sensing device.
  • the present inventor performed detailed optical response evaluation of the metal structure (sensing device) manufactured by the above-described process.
  • experiments were conducted focusing on the plasmon resonance absorption characteristics and the distance (interval) between adjacent metal fine particles.
  • multiphoton absorption and fluorescence efficiency were also evaluated.
  • FIG. 9A and FIG. 9B are diagrams showing the relationship between the resonance plasmon absorption spectrum of the metal structure and the distance between adjacent metal fine particles contained in the metal structure.
  • FIG. 9A shows a plasmon resonance absorption spectrum in which the intervals of metal fine particles having a thickness of 40 ⁇ m and the major axis and the minor axis both being lOOnm are changed to Onm, 2 nm, 4 nm, 6 nm, and 8 nm.
  • 9B shows the plasmon resonance absorption spectrum in which the interval of the metal fine particles with a thickness of 40 nm and the major axis and the minor axis both lOOnm are changed to 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, and 50 nm.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the spacing between adjacent metal fine particles and the maximum wavelength of the resonance plasmon absorption spectrum of the metal structure.
  • Fig. 10 shows the distance dependency between adjacent metal fine particles as well as the viewpoint power of the absorption maximum wavelength.
  • the absorption maximum wavelength shifts to the short wavelength side as the distance between metal particles increases, and when the distance between metal particles exceeds approximately 30 nm, the absorption maximum is reached.
  • the wavelength converged to an almost constant value (700 nm).
  • the present inventor also conducted experiments on the multiphoton excitation efficiency and fluorescence enhancement of Sarako, metal structure (sensing device) produced by the method.
  • the present inventor made a metal structure in which the thickness, the length of the major axis, and the length of the minor axis were the same, and only the distance between adjacent metal fine particles was changed. The multiphoton excitation efficiency and fluorescence enhancement of the metal structure were investigated.
  • FIG. 11 is an electron micrograph of a metal structure in which metal fine particles having various adjacent distances are integrally formed.
  • the numbers shown in FIG. 11 are the distances between adjacent metal fine particles.
  • Each metal fine particle has a major axis and a minor axis of lOOnm and a thickness of 40 nm.
  • the wavelength force is S800nm and the pulse width is about 100 femtoseconds.
  • the femtosecond pulse laser was irradiated under a microscope. This dye does not absorb one photon at the above laser wavelengths and is all multiphoton excited when excited. As a result of the experiment, it was confirmed that the fluorescence of dye power was actually observed, and that multiphoton excitation was caused by resonance plasmon enhancement. The observed fluorescence spectrum was consistent with the one-photon excitation spectrum.
  • Fig. 12 shows the intensity of the excitation laser beam irradiated on the metal structure and the amount of dye on the metal structure. It is a figure which shows the relationship with photon excitation fluorescence intensity.
  • the horizontal axis represents the square of the intensity of the excitation laser beam
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity of the dye from the metal structure.
  • FIG. 12 also plots the results of a similar experiment performed on the pigment on the glass substrate.
  • the multiphoton excitation fluorescence intensity from the metal structure shows a clear linear relationship with the square of the excitation laser light intensity, and the fluorescence from the metal structure is 2 It is clear that it is based on photon excitation.
  • the efficiency of the enhancement exceeded the maximum by 400 times.
  • the present inventors have found that in such a metal structure, the light emission in the visible region of the metal fine particles themselves is remarkably enhanced.
  • the present inventor examined in detail the dependence of the fluorescence enhancement efficiency of two-photon excitation on the height of metal fine particles (thickness of metal fine particles) in the metal structure of FIG.
  • FIGS. 13A to 13C are diagrams showing two-photon fluorescence mapping images of a metal structure on which a dye is adsorbed.
  • FIG. 13A shows the case where the thickness of the metal fine particle is 40 nm
  • FIG. 13B shows the case where the thickness of the metal fine particle is 60 nm
  • FIG. 13C shows the case where the thickness of the metal fine particle is lOOnm.
  • the present inventor has found the size and shape of the metal fine particles that can maximize the effect and the adjacent distance of the metal fine particles in the two-photon excitation fluorescence detection by the surface-enhanced plasmon. .
  • the thickness of the metal fine particle is an important factor in realizing a sensing device that performs highly sensitive sensing. Therefore, the thickness dependence of the resonance plasmon absorption spectrum was investigated by setting both the major axis and minor axis of the metal fine particle to 120 nm and the adjacent distance of the metal fine particle to 200 nm.
  • Figure 14 shows the relationship between the resonance plasmon absorption spectrum of the metal structure and the thickness of the metal fine particles.
  • FIG. 14 the plasmon resonance absorption spectrum was observed while changing the thickness of the metal fine particles to 20 nm, 40 nm, 60 nm, and ⁇ m.
  • the resonant plasmon absorption wavelength can be controlled by changing the thickness of the metal fine particles.
  • the fluorescence enhancement effect became more prominent as the resonant plasmon absorption wavelength approached the excitation laser wavelength (80 Onm).
  • an enhancement effect as high as 800 times could be obtained with a metal structure (with a metal particle thickness of 40 nm) whose resonance plasmon absorption wavelength is closest to that of the excitation laser beam.
  • metal fine particles were produced on a glass substrate by designing the major and minor axes to be 80 nm and the distance between the metal fine particles to be 4 nm.
  • DNA (lmmolZl) modified with thiol at the 3 ′ end of 40 base pairs was dropped on a glass substrate and allowed to stand for 12 hours in a 37 ° C. incubator to induce binding with gold.
  • the complementary DNA was allowed to stand in a buffer at 37 ° C. and pH 7.4 for 4 hours for hybridization.
  • ssDNA single-stranded DNA
  • dsDNA double-stranded DNA
  • the metal structure manufacturing technology of the present invention is extremely versatile, and it is also possible to provide not only gold but also finely integrated metal structures such as silver and platinum.
  • the shape is not limited to a block shape, and it is also possible to provide a finely integrated structure having various shapes such as a disk shape, a nanorod shape, and a nanostructure shape.
  • the present invention is a fine metal having a plasmon optical response function and a multiphoton absorption function, which are important technologies in the development of current optical devices and high-sensitivity sensors.
  • the present invention provides excellent metal structures (sensing devices), sensing devices, and sensing methods.
  • the sensing device, sensing device, and sensing method according to the present invention have good efficiency, can realize multiphoton absorption and fluorescence sensing based on this by a localized plasmon enhancing action, It has a remarkable effect that it can give a spectral sensitivity function to fluorescence sensing based on this, and is useful as a sensing device, sensing apparatus, and sensing method having a multiphoton absorption Z fluorescence enhancement function and its wavelength selection function.
  • the metal structure (sensing device) capable of controlling the plasmon resonance absorption wavelength according to the present invention is useful as an elemental technology for developing various optical devices and high-sensitivity biosensors.

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Abstract

　効率が良い多光子吸収および局在プラズモン増強作用を実現することができ、光学応答を高感度かつ高精度にセンシングすることができるセンシングデバイス、センシング装置およびセンシング方法。本発明のセンシングデバイスは、基板状に構築された複数の金属微粒子の材質、形状、サイズ、間隔、および方向を精密に制御することにより、高い多光子励起効率と波長選択性とを実現することができる。このセンシングデバイスを蛍光センシングなどの各種センシング装置のセンシングデバイスに適用することにより、検出対象物質の高感度なセンシングを実現することができる。

Description

明 細 書
センシングデバイス、センシング装置およびセンシング方法 技術分野
[0001] 本発明は、センシングデバイス、センシング装置およびセンシング方法に関し、特 に、様々な検出対象物力もの光学応答を、表面 (局在)プラズモンにより増強して、微 量高感度光学的検出を行うセンシングデバイス、センシング装置およびセンシング方 法に関する。
背景技術
[0002] 微細な金属、例えば、ナノメートルスケールの表面構造を有する微細金属や、ナノ メートルサイズの金属微粒子は、その形状やサイズに応じた特定の波長領域に「局 在 (表面)プラズモン共鳴吸収」と呼ばれる特徴的な光学応答 (光吸収)を示す。局在 プラズモン共鳴吸収を示す金属の種類の例には、金や銀、白金などの貴金属類が 含まれるが、金属の種類が同じでも、サイズや形状が異なればプラズモン共鳴吸収 波長が異なることが重要である。このような性質を活かし、上記のような微細金属や金 属微粒子を用いた各種光学デバイス (例えば、光学フィルタなど)への応用が期待さ れている。
[0003] また、局在プラズモン共鳴吸収には重要な応用がある。プラズモン共鳴を示す金属 上に吸着した分子の光学応答 (例えば、蛍光発光や光散乱 (ラマン散乱)など)の強 度は、分子と表面プラズモンとの相互作用により、著しく増強される。すなわち、ブラ ズモン共鳴を示す微細金属を基板上に作製した金属構造体は、分子系に対する高 感度センサ用デバイスとして機能することになり、この方面への応用研究開発も活発 に行われている。
[0004] ラマン散乱光は、通常は弱い光学応答であるため、センサの応答信号として利用 するためには、効率よく増強されなければならない。そのため、これまでは、ブラズモ ンにより増強したとしても、ラマン散乱光をセンサの応答信号として用いることは困難 であった。
[0005] 一方、蛍光発光は、検出対象物質自体が蛍光性分子であるか、または蛍光標識さ れた分子であれば得られる光学応答であって、通常はラマン散乱などの光散乱よりも 強い信号である。したがって、蛍光発光は、プラズモン共鳴により増強されることによ り、センサの応答信号として利用されるのに適している。そのため、プラズモン共鳴吸 収を有する金属構造体に付着した蛍光性分子または蛍光標識された分子を、蛍光 を応答信号として検出することが考えられる。しかしながら、前記金属構造体に付着 した蛍光性分子などからの蛍光発光 (励起光）は、プラズモンにより増強されたとして も、蛍光性分子などに隣接する微細金属 (金属微粒子）自身によるエネルギ移動によ り消光されて、応答信号として利用することが困難であることが多い。
[0006] さらに、蛍光センシングでは、検出対象物質を励起しょうとして励起光を照射しても 、対象系に存在する不純物 (妨害物質)が同時に励起されてしまう場合がある。励起 された不純物が蛍光性の物質である場合には、妨害物質からの蛍光発光は強 、バ ックグラウンド信号 (背景光)となり、検出対象物質の検出感度および検出精度を大 幅に低下させる。蛍光センシングの重要な応用例は、免疫分析や遺伝子 (DNA)分 析などの生体系分析であるが、このような生体系分析では、特に、妨害物質 (血清や 酵素など)からの蛍光発光が背景光となり、分析精度の低下を引き起こす深刻な問 題となる。
[0007] このような背景光の問題を回避するための技術として、 2光子励起を利用する検出 方法が提案されている。 2光子励起とは、蛍光標識試薬や蛍光性物質の電子遷移に 相当する光波長の 2倍の波長を有する光（つまり、 1光子あたりのエネルギは半分)を 試料に照射し、 1つの分子に 2つの光子を吸収させることにより、電子励起状態 (つま り、蛍光状態）が生成される現象である。この 2光子励起を表面プラズモン増強センサ に応用すれば、共鳴プラズモンにより励起光の電場が強く局在化して 、る箇所のみ が選択的に励起されることになる。このため、上記のような妨害物質に起因する背景 光の影響を著しく低減することができ、検出感度および検出精度を大幅に向上するこ とがでさる。
[0008] 2光子励起を利用して光学応答を検出する技術として、例えば、特許文献 1に記載 されている技術がある。
[0009] 特許文献 1には、抗原を含む試料溶液を、抗体が固定された金属薄膜に供給して 抗原と抗体とを結合させた後、蛍光標識抗体を含む蛍光標識試薬を供給して抗原に 結合して！/ヽる抗体に蛍光標識抗体を結合させた状態で、蛍光標識抗体が通常吸収 する光の整数倍の波長を有する光を、金属薄膜を持つガラスプリズムに照射して 2光 子励起または多光子励起を誘起させ、発生した蛍光発光をスペクトル分析する蛍光 免疫分析技術が開示されている。
特許文献 1 :特開 2001— 021565号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 一般的に、 2光子遷移をはじめとする多光子遷移の吸収確率（吸収断面積）は、通 常の 1光子遷移の吸収確率に比べ、格段に (数 10桁)低い。したがって、局在プラズ モン増強作用を持ってしても、多光子励起を効率良く生起させることは容易ではない
[0011] 特許文献 1記載の技術においては、金属薄膜とガラスプリズムとの組み合わせによ つて多光子吸収を生起させている力 その励起効率は開示されていない。また、多 光子吸収と局在プラズモン増強作用とを併用することは、高感度な光センシングにお いて優れた発想ということはできる力 実際には、上記のように、多光子励起における 励起効率を向上させることは非常に困難である。すなわち、多光子吸収とプラズモン 増強作用とを高効率に実現するために行われてきたこれまでのアプローチでは、そ の効果に一定の限界がある。これは、検出対象系の 1つの要素となる金属構造体 (具 体的には、金属構造体上に配置されたプラズモン共鳴吸収を有する金属微粒子)の 最適構造に関する知見がほとんど欠落していることに基づく。
[0012] このため、励起光源の波長や検出対象物質に応じた光学応答センサの設計指針 は、ほとんど存在しな力 たといえる。例えば、光学応答センサ自身に分光感度機能 を付与することができれば、使用する励起光源の波長を選択することにより、センシン グの大幅な感度の向上が見込まれるが、そのような機能を付与することは実際には 困難であった。また、総じて高感度センシングも困難であった。
[0013] また、前述の通り、非常に弱い光学応答であるラマン散乱を応答信号として用いる センシング技術も十分に開発されて 、なかった。 [0014] 本発明は、力かる点に鑑みてなされたものであり、効率が良い多光子吸収および局 在プラズモン増強作用を実現することができ、光学応答を高感度かつ高精度にセン シングすることができるセンシングデバイス、センシング装置およびセンシング方法を 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明のセンシングデバイスは、プラズモン共鳴吸収を有するセンシングデバイス であって、基板上に、一定の間隔かつ一定の方向で配置された、一定のサイズを有 する複数の金属微粒子を有する構成を採る。
[0016] 本発明のセンシング装置は、基板上に、一定の間隔かつ一定の方向で配置された 、一定のサイズを有する複数の金属微粒子を有するセンシングデバイスと、前記セン シングデバイスに付着した検出対象物質を蛍光発光させる励起光を、前記センシン グデバイスに対して照射する励起光照射手段と、前記検出対象物質の蛍光発光の 強度を検出する蛍光強度検出手段と、を有する構成を採る。
[0017] 本発明のセンシング方法は、基板上に、一定の間隔かつ一定の方向で配置された 、一定のサイズを有する複数の金属微粒子を有するセンシングデバイスに付着した 検出対象物質を蛍光発光させる励起光を、前記センシングデバイスに対して照射す るステップと、前記検出対象物質の蛍光発光の強度を検出するステップと、を有する よつにした。
発明の効果
[0018] 本発明によれば、基板上に形成する金属微粒子の構造を精密に制御することによ り、検出対象系に入射する入射光の共鳴プラズモン吸収波長を規定することができ るセンシングデバイスが提供される。
[0019] さらに本発明によれば、前記センシングデバイスを用いることにより、局在ブラズモ ンによる蛍光、光散乱 (ラマン散乱)や高長波発光、和周波、差周波などの光学応答 が増強されうるので、これらを光学応答として利用すれば、高感度なセンシングが実 現される。
[0020] さらに本発明によれば、前記センシングデバイスを用いることにより、局在ブラズモ ンによる光学応答の増強に加えて、多光子吸収の励起光率が向上されうるので、多 光子吸収による蛍光を光学応答として利用すれば、高感度かつ高精度なセンシング が実現される。
図面の簡単な説明
[0021] [図 1]本発明の一実施の形態に係る金属構造体 (センシングデバイス)の製造方法を 示すフローチャート
[図 2]図 1の製造方法を説明するための工程別断面図
[図 3]金属微粒子の加工分解能のプラズモン共鳴吸収スペクトルを用いた算出方法 の一例を示す図
[図 4]金属微粒子の加工分解能のプラズモン共鳴吸収スペクトルを用いた金属微粒 子の間隔の算出方法の一例を示す図
[図 5]本発明の一実施の形態に係るセンシング装置の全体構成の一例を示す図
[図 6]蛍光強度測定部の機能を示す機能ブロック図
[図 7]図 5のセンシング装置の動作の一例を示すフローチャート
[図 8]実際に作製した代表的な金属構造体 (センシングデバイス)の電子顕微鏡写真
[図 9]金属構造体の共鳴プラズモン吸収スペクトルと金属構造体に含まれる金属微粒 子の隣接間距離との関係を示す図
[図 10]隣接する金属微粒子の間隔と金属構造体の共鳴プラズモン吸収スペクトルの 極大波長との関係を示す図
[図 11]様々な隣接間距離を有する金属微粒子を一体形成した金属構造体の電子顕 微鏡写真
[図 12]金属構造体に照射した励起レーザ光の強度と金属構造体上の色素の多光子 励起蛍光強度との関係を示す図
[図 13]色素を吸着させた金属構造体の 2光子蛍光マッピング像を示す図
[図 14]金属構造体の共鳴プラズモン吸収スペクトルと金属微粒子の厚さとの関係を 示す図
発明を実施するための最良の形態
[0022] 本発明者は、プラズモン増強作用、多光子励起効率、および入射光に対する波長 選択性を向上させるためには、金属微粒子のサイズ、形状、および金属微粒子の配 列の方向性、ならびに金属微粒子間の距離をそれぞれそろえることが必要であること を見出した。また、金属微粒子のサイズ、形状、および金属微粒子の配列の方向性、 ならびに金属微粒子間の距離をそれぞれそろえるためには、半導体微細加工技術 を応用することにより、基板上に金属微粒子を精密に規則正しく配列する必要がある ことを見出したのである。
[0023] ここで、「波長選択性」とは、プラズモン共鳴吸収スペクトルの吸収極大 (ピーク）を 鋭利にすることを意味する。高い波長選択性を有する金属構造体をセンシングデバ イスに適用することにより、検出対象物質を高感度にセンシングすることができる。
[0024] 本発明は、ガラスなどの固体基板上にサイズが精密に制御された金属微粒子 (例 えば、金属ナノロッドや金属ナノブロックなど）を一定の微小な間隔でその方向を一軸 方向にそろえて多数集積化した金属構造体に、検出対象物質を付着させて、当該 金属構造体に照射した光に対する光学応答を検出することにより、当該金属構造体 をセンシングデバイスとして利用するものである。これにより、プラズモン共鳴吸収特 性にお 1ヽて、入射光に対する優れた波長選択性と高!ヽ多光子励起効率とを併せも つセンシング装置を実現することができる。さらに、このような金属構造体に吸着した 分子の蛍光発光（1光子蛍光、多光子蛍光）は、金属によるエネルギ移動によって消 光されないので、高感度検出を可能とする。
[0025] 要するに、本発明によれば、サイズが精密に制御された金属微粒子を一定の間隔 で規則正しく整列させた金属構造体をセンシング装置のセンシングデバイスとして用 いることにより、効率が良い多光子吸収およびプラズモンによる光学応答の増強に基 づぐ高感度なセンシングが実現される。このように、本発明は、金属構造体における 微細な金属微粒子のサイズと間隔とを制御することにより、金属構造体に吸着した検 出対象物である分子からの光学応答 (好ましくは、多光子励起発光）により、検出対 象物の検出を可能にする方法に関する。
[0026] 1.本発明のセンシングデバイスについて
以下、本発明のセンシング装置の特徴、つまり、センシング装置のセンシングデバ イスに用いる金属構造体の特徴について説明する。特に、基板状に構築された複数 の金属微粒子の材質、形状、サイズ、間隔、および方向の特徴について具体的に説 明する。
[0027] (基板の材質）
複数の金属微粒子を配置する基板は、特に限定されないが、金属構造体を光学応 答デバイスとして用いるためには、可視領域力 近赤外領域に光吸収を有しない固 体材料からなる基板、すなわち透明基板であることが好ましい。具体的な基板材料の 例には、ガラスや石英、サファイアなどが含まれる。
[0028] (金属微粒子の材質）
基板状に整列配置する金属微粒子は、プラズモン共鳴吸収を有することを特徴と する。プラズモン共鳴吸収を有する金属微粒子としては、金や銀、銅、白金などの貴 金属類が挙げられる。また、金属微粒子は、他の材料をこれらの貴金属でメツキした 粒子であってもよい。
[0029] (金属微粒子の形状）
本発明の金属微粒子は、金属微粒子を 2つに切断したときに切断した 2つの金属 微粒子がそれぞれ同一の形状をとるような切断面が存在する形状を有する。例えば 、本発明の金属微粒子は、相隣る面がすべて直角に交わる 6面体 (直方体)の形状 をとりうる。この場合、金属微粒子を基板に垂直な上面から見た場合、該金属微粒子 は矩形状に見える。なお、この矩形の各頂点は、必ずしも厳格な直角に見える必要 はなぐ例えば、各頂点が丸みを帯びた形状であってもよいし、頂点の角が削られた 形状であってもよい。ただし、この場合、矩形の各頂点は、すべて一様な形状を帯び ていることが好ましい。
[0030] また、各金属微粒子は、上記のように、プラズモン共鳴吸収を有する金属微粒子で あればよいが、その大きさ（体積相当径）が Inn！〜 lOOOnmであることが好ましぐ 10 nm〜500nmであることが好まし!/、。
[0031] また、各金属微粒子は、基板に垂直な上面から見たときに、同一の形状を有する 4 つの頂点を有する形状をとる。例えば、直方体状の金属微粒子であれば、矩形の各 頂点が、同一の形状を有する 4つの頂点に相当する。この 4つの頂点は、それぞれ、 他の 4つの金属微粒子の頂点の 1つと一定の間隔で隣接している。
[0032] (金属微粒子のサイズ） 本発明の金属微粒子は、一定のサイズを有することを特徴とする。「サイズが一定」 とは、基板上に配置された各金属微粒子の面積、体積、および高さがそれぞれ一定 であることを意味する。ここで規定する「金属微粒子の面積」とは、金属微粒子を基板 に垂直な上面から見たときの金属微粒子の面積を意味し、「金属微粒子の高さ」とは 、基板の表面力もの金属微粒子の厚さを意味する。
[0033] ここで、「面積が一定」とは、各金属微粒子の面積の変動率が 5%以下、好ましくは 2%以下であることを意味する。また、「体積が一定」とは、各金属微粒子の体積の変 動率が 5%以下、好ましくは 3%以下であることを意味する。また、「高さ」が一定とは、 各金属微粒子の高さの変動率が 10%以下、好ましくは 5%以下であることを意味す る。
[0034] 具体的な値として、金属微粒子の面積は、 100nm2〜30000nm2程度であることが 好ましぐ金属微粒子の体積は、 1000nm3〜3000000nm3程度であること力 S好まし い。また、金属微粒子の高さ（基板の表面力もの厚さ）は、金属微粒子の面積および 体積から導出することができ、 5nm〜300nmであることが好ましぐ ΙΟηπ！〜 lOOnm であることがより好ましい。
[0035] 基板に垂直な上面力 見たときの各金属微粒子の面積および体積は、金属微粒子 が写された電子顕微鏡写真力 確認および算出されうる。例えば、金属微粒子が直 方体状である場合、金属微粒子を基板に垂直な上面カゝら見た電子顕微鏡写真より 金属微粒子の長軸の長さと短軸の長さとを読取り、これらを乗算することで金属微粒 子の面積が算出される。また、金属微粒子を基板に平行な側面力 見た電子顕微鏡 写真より、金属微粒子の高さを読みとり、算出した面積と読取った高さとを乗算するこ とにより金属微粒子の体積が算出される。
[0036] (金属微粒子の間隔）
本発明の金属微粒子は、一定の間隔で配置されていることを特徴とする。「間隔が 一定」とは、基板上に配置された複数の金属微粒子の任意の 1つと、これに隣接する 金属微粒子との最短距離が 30nm以下 (好ましくは、 lOnm以下）であって、かつ、そ の変動性が 5%以下であることを意味する。
[0037] 上記のように、金属微粒子の 4つの頂点は、それぞれ、他の 4つの金属微粒子の頂 点の 1つと一定の間隔で隣接しているので、隣接する金属微粒子間の最短距離は、 具体的には、金属微粒子の任意の頂点と、この頂点に最も近い金属微粒子の頂点と の距離を意味する。
[0038] この金属微粒子の間隔が小さくなるように複数の金属微粒子を配置することにより、 双極子-双極子相互作用により電場が増強 (表面プラズモン増強)される。また、金 属構造体の多光子励起効率を向上させることができる。
[0039] ここで、金属微粒子の長軸の長さや短軸の長さの変動性、および金属微粒子の間 隔 (頂点間の最短距離)の変動性は、作製した金属構造体のプラズモン共鳴吸収ス ベクトルの測定および解析をすることにより、確認および算出されうる。すなわち、金 属構造体に対して、所定の方向への偏光を有する入射光を照射し、得られたプラズ モン共鳴吸収スペクトルの吸収極大の波長位置を比較することにより、ナノスケール での加工分解能を実現でき、金属微粒子の各パラメータの変動性を算出することが できる。算出方法の詳細については後述する。
[0040] (金属微粒子の方向）
本発明の金属微粒子は、一定の方向で配置されていることを特徴とする。「方向が 一定」とは、金属微粒子の任意の頂点と該頂点の対角に位置する頂点とを結んだ直 線上に、この金属微粒子を起点として隣接する複数の金属微粒子の任意の頂点、お よび該頂点の対角に位置する頂点が位置することを意味する。
[0041] 以上まとめると、本発明者は、基板状に複数の金属微粒子の材質、形状、サイズ、 間隔、および方向を上述のように制御して精密加工した金属構造体をセンシング装 置のセンシングデバイスとして用いることにより、入射光に対する波長選択性および 多光子励起効率が向上された高感度センシングが実現可能であることを見出した。 特に、本発明者は、各金属微粒子の形状およびサイズをそれぞれ一定にすることに より、金属構造体の波長選択性が向上され、金属微粒子の高さ、および各金属微粒 子の間隔をそれぞれ所定の範囲内で一定にすることにより、プラズモン増強作用を 極めて大きぐかつ、多光子励起効率を飛躍的に高めることができることを見出した。
[0042] なお、本明細書において、「金属構造体」とは、金属ナノロッドアレイのような金属（ 金属微粒子)の集合体を意味し、金属 (金属微粒子)の集合体が配置された基板で ある金属構造体デバイスをも含めた意味で使用する。すなわち、本発明の金属構造 体は、複数の金属微粒子、および複数の金属微粒子が配置された基板を含みうる。
[0043] 本発明のセンシング装置に用いる金属構造体 (センシングデバイス）の製造方法に ついて、図 1および図 2を用いて説明する。
[0044] 図 1は、本発明の一実施の形態に係る金属構造体 (センシングデバイス）の製造方 法を示すフローチャートである。また、図 2A〜図 2Eは、図 1の製造方法を説明する ための工程別断面図である。
[0045] まず、ステップ S1では、固体透明基板 10 (例えば、ガラス基板)を洗浄し、乾燥させ る（図 2A参照)。洗浄および乾燥は十分に行う。基板 10の表面を十分に清浄にしな ければ、後の工程で基板 10上に作製する金属微粒子が基板 10から剥離するおそ れが生じる。
[0046] そして、ステップ S2では、ステップ S 100 (工程 1)で清浄にした基板 10の表面にポ ジ型電子リソグラフィ用レジスト溶液をスピンコート（回転)塗布した後、べィキング (カロ 熱)を行い、レジスト溶剤を除去し、レジスト薄膜 20を基板 10上に形成する（図 2B参 照)。
[0047] このとき、後の工程で形成する金属微粒子の微細化を実現するためには、基板 10 上に形成するレジスト薄膜 20の膜厚は、マイクロメートル以下の膜厚であることが好 ましぐ具体的には、例えば、 200nm程度またはそれ以下であることが望ましい。本 発明者は、このような薄い膜厚のレジスト薄膜を形成するためには、市販のレジストを 専用溶媒で 2倍程度に希釈したレジスト溶液をスピンコート塗布に用いればょ ヽこと を見出した。
[0048] ここで、金属微粒子の微細化を実現するためにレジスト薄膜 20の膜厚を 200nm以 下にする理由は、次の通りである。レジストの膜厚を 200nm以上にすると、電子ビー ムで描画露光を行う際に、厚いレジスト膜全体を電子線で露光しなければならず、電 子線の加速電圧を極端に高くする必要がある。一般に描画の空間分解能は電子ビ ームの加速電圧の増大に従って微細化することができる力 そのように極端に高 、加 速電圧では、描画の空間分解能がかえって低下してしまう。そのため、本発明が想 定するサイズの金属微粒子を精密に描画する空間分解能を達成するためには、カロ 速電圧を極端に高くする必要はなぐこの場合に必要とされる加速電圧では、 200η m以下の膜厚が適当となる。
[0049] そして、ステップ S3では、ステップ S2で形成したレジスト薄膜 20に、例えば、電子ビ ーム露光装置（図示せず)で、所定のパターンを描画する。ここで、所定のパターンと は、所望する金属構造体および金属微粒子の集積配置図をトレースしたものである。
[0050] このとき、後の工程で所定の金属微粒子の微細化形成 (長軸方向および短軸方向 の長さが共に lOOnm以下）を達成するためには、この電子ビーム露光工程の露光条 件の最適化が極めて重要になる。本発明者は、詳細な実験を重ねた結果、次のよう な最適化条件を見出した。露光の最適化条件としては、電子ビームの加速電圧を大 きくし、同時に露光のドーズレートを大幅に小さくすることが好ましい。具体的には、 例えば、電子ビームの加速電圧が 100kV〜200kVで、かつ、露光のドーズレートが 2 CZcm2以下である場合に、基板上に微細な金属微粒子を形成することができた 。特筆すべきは、著しく低いドーズレートの条件であり、例えば、一つの目安として、 1 μ CZcm2のドーズレートは、使用したレジストで推奨されているドーズレートの 100 分の 1に相当する。
[0051] ここで、露光の最適化条件として、電子ビームの加速電圧を大きくし、露光のドーズ レートを大幅に小さくする理由は、次の通りである。上記のように、加工 (描画）の空間 分解能は電子ビームの加速電圧を大きくすれば向上する。加速電圧を大きくすれば 、電子ビームの速度が速くなり、電子のドブロイ波長が短くなるためである。一方、露 光のドーズレートが大きいということは、露光時間を長くするということに対応する。露 光時間が長くなれば、露光の最中の試料自身の振動（例えば、実験室の空調ノイズ や装置自身の極めて微細な振動ノイズなど）が無視できなくなり、加工形状端の「ぼ やけ」などが発生してしま！/、、加工分解能の低下につながるおそれがある。
[0052] また、ステップ S3では、さらに、電子線露光描画を行ったレジスト薄膜 20の現像、リ ンス、乾燥を行う（図 2C参照)。本製造方法においては、現像の時間も重要なパラメ ータであり、上記の低 、ドーズレートに対応して現像時間は標準的な時間よりも長 ヽ 方が好ましぐ具体的には、例えば、 30分程度であることが望ましい。
[0053] そして、ステップ S4では、ステップ S3でカ卩ェした基板 10上にクロム、次に金などの プラズモン共鳴吸収を有する金属を順にスパッタリングにより成膜する（図 2D参照)。 クロム層は、厚さが 2nm程度であり、固体透明基板 10と金などの金属との付着性を 高めうる。プラズモン共鳴吸収を有する金属（金など）の膜厚は 10nm〜100nmであ る。この厚さが、完成時の金属微粒子の厚さ（高さ）に相当する。なお、図 2D中、符 号 30は、スパッタリングにより形成された金属膜 (クロム層と金などの金属層）を示して いる。
[0054] そして、ステップ S5では、ステップ S4でカ卩ェした基板 10上から余分なレジスト材料 を除去 (剥離)して、金属構造体 100を作製する（図 2E参照)。この工程におけるレジ スト除去は、「リフトオフ」と呼ばれる。このリフトオフでは、例えば、ステップ S400 (ェ 程 4)で加工した基板 10をレジストリムーバと呼ばれる薬液に浸透し、超音波洗浄す ることにより、余分なレジストを除去する。これにより、基板 10上に金属微粒子 40が形 成された金属構造体 100が完成する。
[0055] 常温 (室温)でこの超音波洗浄を行っても、余分なレジストが除去しきれな 、場合が あるので、 65°C〜70°Cに加熱しながらこの超音波洗浄を行うことにより、余分なレジ ストを完全に除去することが好ましい。すなわち、本発明者は、リフトオフ工程におい ては、超音波洗浄に加えて、加熱を行うことが必要であることを見出した。本工程に おいてレジストがより完全に除去されるのは、超音波洗浄に加えて加熱を行うことによ り、レジスト材料が溶剤により溶け易くなるためであると考えられる。
[0056] そして、ステップ S6では、ステップ S5で完成した金属微粒子 40に対して、電子顕 微鏡および光学計測による評価を実施する。具体的には、電子顕微鏡により、完成 した金属微粒子 40の微細構造を明らかにし、さらに、光学顕微鏡を用いた吸収スぺ タトルの測定により、完成した金属構造体 100に対するプラズモン共鳴吸収応答を評 価する。さらに、レーザを励起光源として、多光子吸収の効率も評価する。
[0057] このステップ S6における実際の評価の結果をまとめると、まず構造的には、本実施 の形態に係る金属構造体の製造方法によれば、作製した金属微粒子 40のサイズ（ 長軸方向 Z短軸方向の長さ、厚さ）をナノメートルスケールで極めて良好に制御する ことができる。し力も、サイズ (長軸方向 Z短軸方向の長さ、厚さ）の変動性をそれぞ れ 5%以下に抑えることができる。また、作製した金属構造体 100において、隣接す る金属微粒子 40間の距離を 50nm以下にまで小さくすることができ、その変動性も 5 %以下に抑えることができる。さらに、各金属微粒子 40の長軸または短軸を一つの 軸方向に沿って整列させることもできる。これらのデザイン (サイズ、形状、方向性、間 隔）は、電子線露光描画のパターンユングにより任意にデザインすることができる。
[0058] ここで、金属微粒子の長軸の長さや短軸の長さの変動性、および金属微粒子間の 間隔の変動性の算出方法について説明する。金属微粒子の各パラメータの変動性（ 加工分解能）は、作製した金属微粒子を直接電子顕微鏡観察して評価するのがー 般的であるが、数ナノメートルの分解能で評価するのは難 、。
[0059] そこで、数ナノメートルの分解能での変動性の算出は、作製した金属構造体のブラ ズモン共鳴吸収スペクトルの測定および解析をすることにより行われる。すなわち、金 属構造体に対して、所定の方向への偏光を有する入射光を照射し、得られたプラズ モン共鳴吸収スペクトルの吸収極大の波長位置を比較することにより、ナノスケール での加工分解能を実現でき、金属微粒子の各パラメータの変動性を算出することが できる。以下、図 3A〜図 3Cを用いて具体的に説明する。
[0060] 図 3A〜図 3Cは、金属微粒子の加工分解能のプラズモン共鳴吸収スペクトルを用 いた軸長さの算出方法の一例を示す図である。
[0061] 図 3Aに示す短軸方向の長さを 120nmに、高さを 60nmにそれぞれ統一し、長軸 方向の長さを 240、 242、 244、 246、 248と変化させて設計した直方体構造の金属 微粒子の光学特性は、図 3B、図 3Cのようになる。ここで、金属微粒子の長軸方向の 長さは、 240+x (nm)で表すことができ、 xは 0≤2x≤8を満たす整数である。
[0062] 図 3Bには、長軸方向の長さを変化させた金属微粒子に対して、長軸方向と平行な 偏光を有する入射光を照射して得られたプラズモン吸収スペクトルが示されている。 金属微粒子のプラズモン共鳴吸収のスペクトルの極大波長は、金属微粒子の長軸 方向の長さが長くなるにつれて、長波長側にシフトしている。プラズモン共鳴吸収の スペクトルの極大波長は、金属微粒子のサイズ (この場合は長軸方向の長さ）に極め て敏感である。したがって、プラズモン共鳴吸収のスペクトルの極大波長より、この場 合は金属微粒子の長軸方向の長さ、つまり、長軸方向の加工分解能を評価すること ができる。 [0063] このことは、プラズモン共鳴吸収スペクトルの極大波長を構造体の長軸の長さに対 してプロットした図 3Cからも確認することができる。すなわち、 2nmの加工分解能で、 実際に金属微粒子のサイズを設計して加工することができる。図 3A〜図 3Cは、少な くとも 2nm以下の加工分解能で、金属微粒子の各種パラメータの変動性を制御可能 であることを示している。
[0064] 金属微粒子の加工分解能の評価は、金属微粒子に入射する入射光の偏光方向を 変えることにより、様々なノリエーシヨンで行うことができる。例えば、短軸方向と平行 な偏光を有する入射光を照射して得られたプラズモン吸収スペクトルからは、短軸方 向の加工分解能を評価することができる。
[0065] 次に、本発明の金属構造体において極めて重要なパラメータである隣接する金属 微粒子間の距離 (間隔)の計測法について説明する。上記のように、隣接する金属微 粒子間の距離 (間隔）に関する加工分解能は、作製した金属微粒子を直接電子顕微 鏡で観察するのが一般的であるが、数ナノメートルの分解能で評価するのは難 U、。
[0066] そこで、数ナノメートルの分解能での金属微粒子間の距離の算出は、作製した金属 構造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルを測定および解析することにより行われる。 ナノメートルスケールの金属微粒子は、金属微粒子同士が近接するに従って、共鳴 プラズモン相互作用により、プラズモン共鳴吸収スペクトルがシフトする性質を有する 。そして、そのシフト量は、隣接する金属微粒子間の距離に鋭敏に依存する。すなわ ち、作製した金属構造体に対して吸収分光計測を行い、得られたプラズモン共鳴吸 収スペクトルの吸収極大の位置を比較することにより、隣接する金属微粒子間の距離 を、ナノメートルスケールの加工分解能で評価することができる。以下、図 4A〜図 4C を用いて具体的に説明する。
[0067] 図 4A〜図 4Cは、金属微粒子の加工分解能のプラズモン共鳴吸収スペクトルを用 いた金属微粒子の間隔の算出方法の一例を示す図である。
[0068] 上記のように、隣接する金属微粒子間の距離 (間隔）は、金属微粒子の任意の頂点 と、この頂点に最も近い金属微粒子の頂点との最短距離を意味する。図 4Aにおいて 、この金属微粒子間の距離 (間隔)を gapと定義する。
[0069] 図 4Bは、 gapを、 1.8nm、 Onm、 0.9nm、 1.8nm、 2.7nm、 3.5nm、 5.3nmと変 化させた場合の金属構造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルの測定結果を示す図で ある。図 4Bのスペクトルは、図 4Aの 2量体方向（矢印の方向）に平行な入射光を照 射して測定したものである。図 4Bにおける各スペクトルのうち、 aは一 1.8nmに、 bは 0 nmに、 cは 0.9nmに、 dは 1.8nmに、 eは 2.7nmに、 fは 3.5nmに、 gは 5.3nmにそ れぞれ対応している。なお、 gapが負の値の場合 (例えば aのスペクトル）は、隣接す る金属微粒子が互いにオーバーラップして 、る（重なって 、る）ことを示して 、る。
[0070] 図 4Bより、金属構造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルの極大波長は、 gapに依存 して鋭敏にシフトしていることが分かる。すなわち、設計サイズで約 0.9nmの金属微 粒子間の距離の変化に応じて、スペクトルが実際に大きくシフトしていることが分かる 。また、 gapが増加するにつれて、プラズモン共鳴吸収波長の極大波長は、長波長側 に徐々にシフトしている。
[0071] 本発明者は、このようなプラズモン共鳴吸収スペクトルの極大波長の gap依存性を、 より広範囲な gapに対して詳細に調べた。図 4Cは、金属微粒子間の最短距離とブラ ズモン共鳴吸収スペクトルの極大波長との関係を示す図である。図 4Cは、 gapを 8 .8nmから 144nmまでの範囲で共鳴プラズモン共鳴吸収スペクトルの極大波長を調 ベた例を示している。
[0072] 図 4Cより、 gapが— 8.8nmから 5nmまでの範囲では、 gapが増加するにつれてプラ ズモン共鳴吸収波長の極大波長は長波長側にシフトし、 gapが 5nm以上の範囲では 、 gapが増加するにつれてプラズモン共鳴吸収波長の極大波長は短波長側にシフト していることが分かる。この依存性は、理論計算が予見する測定結果と合致する。
[0073] このように、金属微粒子間の最短距離とプラズモン共鳴吸収スペクトルの極大波長 との関係は、複雑な挙動を示すものの、測定結果にばらつきがなぐほぼ理論値通り の測定結果が得られる。すなわち、図 4A〜図 4Cで説明したように、 0.9nmの設計サ ィズで精密に金属微粒子間の最短距離が制御された金属構造体が作製されており 、少なくとも 0.9nmの加工分解能で金属微粒子間の最短距離を制御可能であること が分かる。なお、後述する実施例において、金属微粒子間の最短距離の制御が正 確に行われたことを説明する。
[0074] また、機能的には、上記製造方法により作製した金属構造体、金属微粒子のサイズ と隣接する金属微粒子間の距離に大きく依存するプラズモン吸収特性 (吸収波長位 置)を有する機能 (光学応答の波長選択性)を発現することができる。そして、波長選 択性を備えた効率の良い多光子吸収機能をも有し、多光子吸収により生じた励起吸 着分子からの蛍光も消光されることなく検出することができる。
[0075] 以上、図 1〜図 4を用いて説明したように、サイズの変動性がほとんどない多数の金 属微粒子を、金属微粒子間の距離をナノメートルスケールで均一にし、かつ、金属微 粒子の方向を一方向にそろえた配置にして、固体透明基板上に整列 '集積して金属 構造体デバイスを作製することができる。これにより、優れた波長選択性と高い多光 子励起効率とを有する共鳴プラズモン光学応答特性を示す理想的な形状'構造を持 つ微細な金属構造体を実現することができる。
[0076] 本発明のセンシングデバイスは、任意のセンシング用途に用いられうる力 好ましく は後述のセンシング方法に適用されたり、センシング装置の部材として用いられる。
[0077] 2.本発明のセンシング方法について
本発明のセンシング方法は、前述のセンシングデバイスにより増強された検出対象 物質の光学応答を応答信号として検出対象物質をセンシングすることを特徴とする。 具体的には、例えば、 1)検出対象物質が付着した前述のセンシングデバイスを用意 するステップ、 2)用意されたセンシングデバイスに励起光を照射するステップ、 3)前 記検出対象物質からの光学応答を測定し、前記検出対象物質をセンシング (定量ま たは定性)するステップを含む。
[0078] 本発明のセンシング方法において応答信号として用いられる光学応答は、検出対 象物質の種類により適宜選択されるが、例えば、蛍光、光散乱 (ラマン散乱を含む)、 共鳴吸収、高調波発、または和 (差)周波などでありうる。検出対象物質が蛍光分子 または蛍光物質で標識された分子であれば、応答信号を蛍光とすることができ、検出 対象物質が DNAや酵素などの生体分子である場合には、応答信号をラマン散乱と することができる。本発明のセンシング方法においては、多光子吸収による蛍光を応 答信号とすることちできる。
[0079] センシングデバイスに付着される検出対象物質は特に制限されないが、例えば、応 答信号を蛍光とする場合には蛍光分子または蛍光物質で標識された分子であり、ラ マン散乱とする場合には生体分子でありうる。センシングデバイスに検出対象物質を 付着させる手段に制限はなぐ例えば検出対象物質を含む溶液をデバイス上に滴下 すればよい。
[0080] センシングデバイスに照射される光は、センサデバイス基板に対して垂直の方向に 入射されることが好ましい。また、入射する光の偏光方向は、無偏光、円偏光、楕円 偏光、あるいは直線偏光とその方向などの偏光の種類に関わらず、当該センサデバ イスは十分な機能を発揮する。
[0081] センシングデバイスに照射される光は、検出対象物質を励起することができる光で あることが好ましい。励起の例には、蛍光発光を生じさせる蛍光励起や、ラマン散乱 を生じさせる素励起などが含まれる。蛍光励起の例には、一光子励起および多光子 励起 (二光子励起を含む)が含まれる。
[0082] センシングデバイスに照射される光は、検出対象物質の種類、およびセンシングデ バイスに含まれる金属構造体の構成に応じて適宜選択される。以下において、蛍光 を光学応答として用いた場合の照射光 (励起光）につ 、て説明する。
[0083] まず、光学応答を一光子吸収に基づく蛍光とした場合について説明する。
[0084] この場合は、励起光の波長は、センシングデバイスである金属構造体のプラズモン 共鳴吸収波長域に合わせて設定されることが好ましい。特に、検出対象物質の吸収 スペクトルと金属構造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルとの間に、少なくとも部分的 に重なりがある場合には、励起光の励起波長は、その重なった波長領域に合わせた 値とすることが好ましい。これにより、センシングデバイスである金属構造体に付着し た検出対象物質から、著しく増強された蛍光を測定することができ、検出対象物質を センシングすることができる。
[0085] また、光学応答を一光子吸収に基づく蛍光とした場合に、センシングデバイスであ る金属構造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルの極大吸収と検出対象物質の吸収ス ベクトルの極大吸収とが大きく離れている場合 (例えば、 200nm以上）には、励起光 の波長を、検出対象物質の吸収波長域に合わせた値とすることが好ましい。金属構 造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルの波長域は極めて幅広!/、ので、励起光の波長 が金属構造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルの極大吸収力 大きく離れていても、 金属構造体のプラズモンを若干は共鳴励起することができるからである。この場合に は、検出対象物質の吸収スペクトルと金属構造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルと が重なりを有する場合に比べて励起効率は低下する力 プラズモン共鳴吸収により 増強された蛍光を十分な強度で測定することができ、検出対象物質を十分にセンシ ングすることができる。
[0086] 次に、光学応答を多光子吸収に基づく蛍光とした場合について説明する。
[0087] この場合は、励起光の波長を、センシングデバイスである金属構造体のプラズモン 共鳴吸収スペクトルの共鳴吸収波長域に合わせた値とすることが好ましい。また、多 光子吸収に基づく蛍光センシングにお 、て、金属構造体のプラズモン共鳴吸収スぺ タトルの極大吸収と検出対象物質の吸収スペクトルの極大吸収とが大きく離れていて も、励起光をピコ秒またはフェムト秒のノ ルスレーザとすることにより、表面プラズモン を介した効率のよい多光子吸収が生起され、検出対象物質力 著しく増強された蛍 光を測定することができ、検出対象物質を十分にセンシングすることができる。
[0088] このように、本発明のセンシング方法においては前述のセンシングデバイスを用い ているので、検出対象物質の吸収スペクトルに係わらず、高感度なセンシングを行う ことができる。換言すれば、本発明のセンシング方法は、検出対象物質がどのような 波長域に吸収を有していても（つまり、検出対象物質の吸収スペクトルがセンシング デバイスの金属構造体のプラズモン共鳴吸収スペクトルとどのような波長上の相対関 係にあっても）、検出対象物質を効率よくセンシングすることができる優位性を有して いる。
[0089] 本発明のセンシング方法により、検出対象物質の定量または定性を行うことができ る。例えば、光学応答の強度を測定することにより定量が可能であり、光学応答のス ベクトルを測定することによって定性することが可能である。検出対象物質を定量す る場合には、光学応答の強度と検出対象物質の量との関係を示す検量線を用いても よい。また、光学応答のスペクトルは物質固有であるので、検出対象物質を定性する 場合には、あらかじめ確認した検出対象物質の光学応答のスペクトルと、測定された スペクトルを比較すればょ 、。
[0090] 3.本発明のセンシング装置について 次に、上述した金属構造体をセンシングデバイスとして用いたセンシング装置につ いて説明する。以下において、応答信号として蛍光を用いるセンシング装置を例とし て説明するが、もちろん応答信号が蛍光に限定されることはない。例えば、本発明の センシング装置は、光散乱 (ラマン散乱)、高長波発光、和周波や差周波などを測定 して、検出対象物質をセンシングする装置でありうる。
[0091] 図 5は、本発明の一実施の形態に係るセンシング装置の全体構成の一例を示す図 である。図 5の例では、金属構造体 100の表面に蛍光性分子で標識された試料に励 起光を照射し、励起された蛍光の量を検出してセンシングを行うセンシング装置につ いて説明する。
[0092] 図 5において、センシング装置 200は、金属構造体 100、基板転送部 110、ステー ジ 120、蛍光強度測定部 130、およびコンピュータ 140を有する。
[0093] 金属構造体 100は、上記のように、基板上に、材質、形状、サイズ、間隔、および方 向を精密に制御された金属微粒子を配置した構成であり、センシング装置 200のセ ンシングデバイスとして機能する。金属構造体 100の表面には、蛍光性分子で標識 された検出対象物質を含む試料が付着され、基板転送部 110に装填される。ここで 、蛍光性分子は、金属構造体 100の表面に付着した試料のうち、検出対象物質を選 択的に標識する。
[0094] 基板転送部 110は、装填した金属構造体 100をステージ 120上に転送する。また、 基板転送部 110は、複数の種類の検出対象物質を同時にセンシングするために、複 数の金属構造体 100を同時にステージ 120上に転送することができる。
[0095] ステージ 120には、基板転送部 110から転送された金属構造体 100が載置され、 蛍光強度測定部 130の内部で照射される励起光の金属構造体 100への照射位置を 変化させるように、 XY平面を平行移動する。ステージ 120は、コンピュータ 140により 制御されて高い駆動分解能で XY平面を移動することができる。
[0096] 蛍光強度測定部 130は、ステージ 120上に載置された金属構造体 100に対して励 起光を照射し、励起された蛍光の強度を検出する。また、蛍光強度測定部 130は、 励起された蛍光の強度により、金属構造体 100に付着した検出対象物質を定量的に 検出することができる。 [0097] ここで、蛍光強度測定部 130について、図 6を用いて詳細に説明する。図 6は、蛍 光強度測定部 130の機能を示す機能ブロック図である。
[0098] 図 6において、蛍光強度測定部 130は、光源コントローラ 131、電源 132、光源 133
、蛍光強度検出部 134、および検出対象物質解析部 135を有している。
[0099] 光源コントローラ 131は、コンピュータ 140に制御されて、電源 132の出力電圧を調 整する。これにより、光源 133から照射される励起光の励起波長が制御される。
[0100] 電源 132は、光源 133に電圧を供給する。
[0101] 光源 133は、ステージ 120上に載置された金属構造体 100に対して励起光を照射 する。この励起光の励起波長は、金属構造体 100に付着した検出対象物質に吸収さ れるために好適な波長に制御される。また、励起光の励起波長の制御は、一光子吸 収に基づく蛍光センシングを行う場合、および多光子吸収に基づく蛍光センシングを 行う場合のそれぞれにおいて異なりうる。光源 133から照射する励起光の励起波長 は、前述の通り、検出対象物質の吸収スペクトルと、金属構造体 100のプラズモン共 鳴吸収スペクトルに応じて適宜制御される。
[0102] 蛍光強度検出部 134は、検出対象物質が光源 133からの励起光を吸収して発した 蛍光発光の蛍光の強度を検出する。
[0103] 検出対象物質解析部 135は、蛍光強度検出部 134で検出された蛍光の強度を解 祈して、金属構造体 100に付着した検出対象物質を定量的に算出する。検出対象 物質解析部 135による検出対象物質の定量的な算出は、例えば、蛍光の強度と検 出対象物質の量との関係を示す検量線を用いて行われる。この検量線は、蛍光強度 測定部 130が保持する記憶手段（図示せず）に、検出対象物質毎に格納されうる。ま た、検出対象物質解析部 135は、検出対象物質の算出結果をコンピュータ 140に出 力する。
[0104] コンピュータ 140は、ステージ 120および蛍光強度測定部 130の各種制御を行う。
具体的には、コンピュータ 140は、光源コントローラ 131を制御して光源 133から照射 される励起光の励起波長を調整する。また、コンピュータ 140は、検出対象物質解析 部 135で算出された検出対象物質の算出結果を表示する。なお、コンピュータ 140 への操作信号の入力は、インターフェース（図示せず)を介してユーザにより行われる [0105] 以下、上述のように構成されたセンシング装置 200の動作について、図 7を用いて 詳細に説明する。
[0106] 図 7は、図 5のセンシング装置 200の動作の一例を示すフローチャートである。
[0107] まず、金属構造体 100の表面に蛍光性分子で標識された検出対象物質を含む試 料を付着させ、この金属構造体 100を、基板転送部 110を介してステージ 120上に 載置する（S10)。
[0108] 金属構造体 100がステージ 120上に載置されると、蛍光強度測定部 130の光源 13 3から、金属構造体 100に対して、検出対象物質を励起させるための励起光が照射 される（Sl l)。このとき、ステージ 120は、コンピュータ 140に制御されて XY平面を 平行移動することにより、励起光の金属構造体 100への照射位置を変化させる。光 源 133から照射される励起光は、検出対象物質が吸収すると蛍光を発するような好 適な励起波長になるように制御されて 、る。
[0109] 次に、蛍光強度検出部 134は、検出対象物質が光源 133からの励起光を吸収して 発した蛍光発光の蛍光の強度を検出し (S12)、検出対象物質解析部 135は、蛍光 強度検出部 134で検出された蛍光の強度を解析して、金属構造体 100に付着した 検出対象物質を定量的に算出する (S13)。算出された検出対象物質の付着量は、 コンピュータ 140により表示される。
[0110] 前述の通り、光源 133から照射される励起光の励起波長は、一光子吸収に基づく 蛍光センシングを行う場合、および多光子吸収に基づく蛍光センシングを行う場合の それぞれにおいて異なりうる。
[0111] なお、本実施の形態では、金属構造体 100を、蛍光センシングに用いるセンシング デバイスとして説明した力 金属構造体 100の用途は、これに限定されない。例えば 、金属構造体 100を、光散乱 (ラマン散乱)や高長波発光、和周波、差周波などを検 出してセンシングを行うセンシング装置のセンシングデバイスに適用することも可能で ある。
[0112] このように、本実施の形態によれば、サイズの変動性がほとんどない多数の金属微 粒子を、金属微粒子間の距離をナノメートルスケールで均一にし、かつ、金属微粒子 の方向を一方向にそろえた配置にして、固体透明基板上に整列'集積して金属構造 体デバイスを作製するので、
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、多光子励起効率とを有する共 鳴プラズモン光学応答特性を示す理想的な形状 ·構造を持つ微細な金属構造体を 実現することができる。
[0113] また、本実施の形態によれば、このような金属構造体をセンシングデバイスとしてセ ンシング装置に適用するので、蛍光センシングなどのセンシング装置を高感度に実 現することができる。
実施例
[0114] 以下において、本発明のより具体的な実施の形態 (実施例）について説明する。な お、本発明は、以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
[0115] (実施例 1)
本実施例では、ガラス基板上（Matsunami Glass： 24mm X 24mm)に電子線リソグ ラフィ Zリフトオフにより金属微粒子を作製した。具体的には、まず、ガラス基板をァセ トン、メタノール、超純水で順に超音波洗浄した後、ガラス基板上にポジ型電子リソグ ラフィ用レジスト（日本ゼオン株式会社製の ZEP— 520A、専用シンナで 2倍希釈）を スピンコート（初期： lOOOrpmで 10sec、メイン： 4000rpmで 90sec)し、ホットプレー ト上でプリベータを 180°Cで 3分間行った。次いで、加速電圧 lOOkVの電子ビーム露 光装置により、 1.2 CZcm2のドーズレートで所定のパターンを描画した後、 30分 現像した。次いで、現像'リンスした基板上にクロム 2nmと金 ΙΟηπ！〜 lOOnmをスパ ッタリングにより成膜した後、レジストリムーバ（ジメチルフオルムアミド)溶液中でリフト オフを行った。このとき、レジストリムーバを 65°C〜70°Cと高温にしながら超音波を 5 分かけることにより、レジストが残らな 、きれ!/、な微細金属構造体 (センシングデバイ ス)を作製することに成功した。
[0116] 作製した金属構造体のサイズは、長軸方向の長さ、短軸方向の長さ、および厚さ（ 基板の表面からの高さ）がそれぞれ数 lOnm〜数 lOOnmで、ナノメートルのオーダ のスケールで金属微粒子間の距離の設計を行った。このようにして、金属微粒子の 長軸 Z短軸方向の長さ、厚さ、および隣接する金属微粒子間の間隔 (距離)がそれ ぞれ異なる多様な金属構造体を作製した。 [0117] 図 8Aおよび図 8Bは、実際に作製した代表的な金属構造体 (センシングデバイス） の電子顕微鏡写真である。特に、図 8Aは、金属微粒子の厚さが 40nmであり、金属 微粒子の長軸および短軸がともに lOOnmであり、かつ、隣接する金属微粒子間の距 離（間隔）が 4nmである場合を示し、図 8Bは、金属微粒子の厚さが 40nmであり、金 属微粒子の長軸および短軸がともに lOOnmであり、かつ、隣接する金属微粒子間の 距離が lOnmである場合を示して!/、る。
[0118] 図 8Aおよび図 8Bより、基板上に、サイズおよび形状が精密に制御された金属微粒 子が、一定の間隔かつ一定の方向に秩序よく集積されており、本発明によって優れ た金属構造体 (センシングデバイス)を作製可能であることが実証されて 、る。
[0119] ここで、上述した本発明の理論によれば、金属微粒子間の距離 (間隔)が小さくなる ことにより、双極子一双極子相互作用により電場が増強 (表面プラズモン増強)される 。したがって、図 8Aと図 8Bとを比較すると、隣接する金属微粒子間の距離がそれぞ れ 4nm、 lOnmとなっているので、図 8Aの金属構造体は、図 8Bの金属構造体よりも 高感度のセンシングデバイスとして機能すると考えられる。
[0120] そこで、本発明者は、上記の工程により作製した金属構造体 (センシングデバイス） の光学応答評価を詳細に行った。特に、プラズモン共鳴吸収特性および隣接する金 属微粒子間の距離 (間隔）に着目して実験を行った。さらに、多光子吸収 ·蛍光効率 についても評価を行った。
[0121] 図 9Aおよび図 9Bは、金属構造体の共鳴プラズモン吸収スペクトルと金属構造体 に含まれる金属微粒子の隣接間距離との関係を示す図である。図 9Aは、厚さが 40η m、長軸および短軸がともに lOOnmの金属微粒子の間隔を、 Onm、 2nm、 4nm、 6 nm、 8nmと変化させたプラズモン共鳴吸収スペクトルを示している。また、図 9Bは、 厚さが 40nm、長軸および短軸がともに lOOnmの金属微粒子の間隔を、 10nm、 20 nm、 30nm、 40nm、 50nmと変化させたプラズモン共鳴吸収スペクトルを示している
[0122] 図 10は、隣接する金属微粒子の間隔と金属構造体の共鳴プラズモン吸収スぺタト ルの極大波長との関係を示す図である。すなわち、図 10は、隣接する金属微粒子間 の距離依存性を吸収の極大波長の観点力も調べたものである。 [0123] 図 9A、図 9B、および図 10より、金属微粒子間の距離が lOnm未満の場合、広い 波長領域において著しい電場の増強が確認された。また、この領域においては、金 属微粒子間の距離が長くなるに従って吸収極大波長は長波長側にシフトした。また、 金属微粒子間の距離が lOnm以上の場合、金属微粒子間の距離が大きくなるに従 つて吸収極大波長は短波長側にシフトし、金属微粒子間の距離がおよそ 30nmを超 えると、吸収極大波長はほぼ一定の値（700nm)に収束することがわ力つた。このよう に、本発明者は、隣接する金属微粒子間の距離 (間隔)を規定することにより、共鳴 プラズモン吸収波長を制御することに成功した。
[0124] (実施例 2)
本発明者は、さら〖こ、当該方法により作製した金属構造体 (センシングデバイス)の 多光子励起効率および蛍光増強に関しても実験を行った。
[0125] 本発明者は、厚さ、長軸の長さ、および短軸の長さをそれぞれ同一として、隣接す る金属微粒子間の距離のみを変化させた金属構造体を作製し、これらの金属構造体 の多光子励起効率および蛍光増強を調べた。
[0126] 図 11は、様々な隣接間距離を有する金属微粒子を一体形成した金属構造体の電 子顕微鏡写真である。図 11中に示す数字（Onm、 2nm、 4nm、 6nm、 8nm、 lOnm 、 20nm、 30nm、 40nm)は、隣接する金属微粒子間の距離である。各金属微粒子 の長軸および短軸は lOOnmであり、厚さは 40nmである。
[0127] 図 11に示す金属構造体に色素（1,4- Bis(bis(d¾utylamino)styryl)- 2,5- dimethoxybe nzene)を付着させた後、波長力 S800nm、パルス幅が約 100フェムト秒のフェムト秒パ ルスレーザを顕微鏡下で照射した。この色素は、上記のレーザ波長では 1光子の吸 収を持たず、励起される場合はすべて多光子励起である。実験の結果、実際に色素 力 の蛍光が観測され、共鳴プラズモン増強による多光子励起が生起されていること を確認できた。なお、観測された蛍光のスペクトルは、 1光子励起の場合のスペクトル と一致した。
[0128] このようにして得られた多光子励起の蛍光強度の励起レーザ光強度依存性を検討 したところ、図 12に示す結果が得られた。
[0129] 図 12は、金属構造体に照射した励起レーザ光の強度と金属構造体上の色素の多 光子励起蛍光強度との関係を示す図である。図 12において、横軸は励起レーザ光 の強度の 2乗を、縦軸は金属構造体からの色素の蛍光強度である。なお、図 12には 、比較検討のため、ガラス基板上の色素に対して同様の実験を行った場合の結果も プロットしてある。
[0130] 図 12に示すように、金属構造体からの多光子励起蛍光強度は、励起レーザ光強度 の 2乗に対して明確な直線関係を示しており、当該金属構造体からの蛍光は 2光子 励起に基づくことが明らかとなった。増強の効率は、最大 400倍を上回っていた。さら に、このような金属構造体においては、金属微粒子自身の可視域の発光も著しく増 強されることを本発明者は見出した。
[0131] さらに、本発明者は、図 11の金属構造体において、二光子励起の蛍光増強効率 の金属微粒子の高さ (金属微粒子の厚さ)への依存性を詳細に検討した。
[0132] 図 13A〜図 13Cは、色素を吸着させた金属構造体の 2光子蛍光マッピング像を示 す図である。図 13Aは、金属微粒子の厚さが 40nmの場合であり、図 13Bは、金属 微粒子の厚さが 60nmの場合であり、図 13Cは、金属微粒子の厚さが lOOnmの場 合である。
[0133] 図 13A〜図 13Cより、厚さが 40nmの金属微粒子では、明確な蛍光増強が観察さ れている。一方、金属微粒子の厚さが 60nm、 lOOnmと大きくなるにつれて、蛍光の 増強作用は観測されに《なっている。さらに、最も増強効果が顕著な図 13Aの場合 (金属微粒子の厚さ =40nm)においては、隣接する金属微粒子間の距離が 2nm、 4 nm、 6nmと極めて小さい場合においても、著しい増強効果が明確に見られた。
[0134] このように、本発明者は、表面増強プラズモンによる 2光子励起蛍光検出において 、その効果を最大にすることができる金属微粒子のサイズおよび形状、ならびに金属 微粒子の隣接距離を見出したのである。
[0135] このように、金属微粒子の厚さは、高感度センシングを行うセンシングデバイスを実 現する上で重要な因子であることがわ力つた。そこで、金属微粒子の長軸および短 軸をともに 120nmとし、金属微粒子の隣接距離を 200nmとして、共鳴プラズモン吸 収スペクトルの金属微粒子の厚さ依存性を調べた。
[0136] 図 14は、金属構造体の共鳴プラズモン吸収スペクトルと金属微粒子の厚さとの関 係を示す図である。図 14では、金属微粒子の厚さを 20nm、 40nm、 60nm、 ΙΟΟη mと変化させてプラズモン共鳴吸収スペクトルを観察した。
[0137] 図 14より、金属微粒子の厚さを変化させることにより、共鳴プラズモン吸収波長を制 御できることがわ力 た。また、その共鳴プラズモン吸収波長が励起レーザ波長（80 Onm)に近づくほど蛍光の増強効果は顕著になった。実際、共鳴プラズモン吸収波 長が最も励起レーザ光に近い金属構造体 (金属微粒子の厚さは 40nm)では、 800 倍もの増強効果を得ることができた。
[0138] (実施例 3)
本実施例では、ガラス基板上に、長軸および短軸をともに 80nm、かつ金属微粒子 間の距離を 4nmと設計して金属微粒子の作製を行った。まず、ガラス基板上に 40塩 基対の 3'末端にチオールを修飾した DNA(lmmolZl)を滴下し、 37°Cのインキュ ベータ中で 12時間静置して金との結合を誘起した。次いで、相補的な DNAを 37°C 、 pH7.4のバッファ中で 4時間静置して、ハイブリダィゼーシヨンを行った。そして、金 属構造体を界面活性剤溶液 (ドデシル硫酸ナトリウム、 SDS溶液)で、 5分 3セットゆ つくり攪拌して洗浄後、 SYBR Green I (Molecular Probe社）をジメチルスルホキシド溶 媒 (DMSO)で 1000倍に希釈して金属構造体上に滴下し、 10分後、上記と同様に 界面活性剤溶液で洗浄を行った。測定システムは上記と同様である。
[0139] そして、作製した試料に対し、一本鎖 DNA (ssDNA)および 2本鎖 DNA (dsDNA )の蛍光強度マッピングを行った。 SYBR Green I色素は、 DNAにインター力レートす ると強 、蛍光を発し、 dsDNAへの吸着の方が ssDNAに比べて強 、蛍光強度となる 。実際、測定した結果において、 dsDNAの構造体の方が強い蛍光強度を示した。こ のように、本手法は、 DNAの高感度検出にも適用することができる。
[0140] 本発明の金属構造体の製造技術は、極めて汎用性の高い技術であり、金のみなら ず銀や白金などの微細集積ィ匕構造物を提供することも可能である。また、その形状も ブロック状に限定されるわけではなぐ例えば、円盤ディスク状やナノロッド状、ナノヮ ィャ状など多種多様な形状力 なる微細集積ィ匕構造物を提供することも可能である。
[0141] このように、本発明は、現在の光デバイス開発や高感度センサ開発において重要 な技術であるプラズモン光学応答機能および多光子吸収機能を有する微細な金属 構造体の開発において、優れた金属構造体 (センシングデバイス）、センシング装置 、およびセンシング方法を提供するものである。
[0142] 本願は、 2005年 3月 18日出願の特願 2005— 080579に基づく優先権を主張す る。当該出願明細書に記載された内容はすべて、本願明細書に援用される。
産業上の利用可能性
[0143] 本発明に係るセンシングデバイス、センシング装置およびセンシング方法は、効率 が良 、多光子吸収およびこれに基づく蛍光センシングを局在プラズモン増強作用に より実現することができ、また、多光子吸収およびこれに基づく蛍光センシングに分光 感度機能を付与することができるという顕著な効果を有し、多光子吸収 Z蛍光増強 機能およびその波長選択機能を有するセンシングデバイス、センシング装置および センシング方法として有用である。特に、本発明に係るプラズモン共鳴吸収波長を制 御することができる金属構造体 (センシングデバイス）は、種々の光学デバイスゃ高感 度バイオセンサなどを開発する要素技術として有用である。

Claims

請求の範囲
[1] プラズモン共鳴吸収を有するセンシングデバイスであって、
基板上に、一定の間隔かつ一定の方向で配置された、一定のサイズを有する複数 の金属微粒子を有する、センシングデバイス。
[2] 前記複数の金属微粒子は、それぞれ、隣接する金属微粒子との最短距離が 30nm 以下となるように配置されて 、る、
請求項 1記載のセンシングデバイス。
[3] 前記複数の金属微粒子は、高さが ΙΟηπ！〜 lOOnmであり、高さの変動性が 10% 以下である、
請求項 1記載のセンシングデバイス。
[4] 前記複数の金属微粒子は、サイズがナノメートルスケールで制御され、サイズの変 動'性が 5%以下である、
請求項 1記載のセンシングデバイス。
[5] 前記基板は、固体透明基板である、
請求項 1記載のセンシングデバイス。
[6] 基板上に、一定の間隔かつ一定の方向で配置された、一定のサイズを有する複数 の金属微粒子を有するセンシングデバイスと、
前記センシングデバイスに付着した検出対象物質を蛍光発光させる励起光を、前 記センシングデバイスに対して照射する励起光照射手段と、
前記検出対象物質の蛍光発光の強度を検出する蛍光強度検出手段と、 を有するセンシング装置。
[7] 前記蛍光発光の強度を解析して、前記センシングデバイスに付着した前記検出対 象物質の量を定量的に算出する検出対象物質解析手段をさらに有する、
請求項 6記載のセンシング装置。
[8] 前記複数の金属微粒子は、それぞれ、隣接する金属微粒子との最短距離が 30nm 以下となるように配置されて 、る、
請求項 6記載のセンシング装置。
[9] 前記複数の金属微粒子は、高さが ΙΟηπ！〜 lOOnmであり、高さの変動性が 10% 以下である、
請求項 6記載のセンシング装置。
基板上に、一定の間隔かつ一定の方向で配置された、一定のサイズを有する複数 の金属微粒子を有するセンシングデバイスに付着した検出対象物質を蛍光発光させ る励起光を、前記センシングデバイスに対して照射するステップと、
前記検出対象物質の蛍光発光の強度を検出するステップと、
を有するセンシング方法。
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