CN106062212A - 用于改进光发射检测的结构化基底和关于其的方法 - Google Patents

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Abstract

结构化基底包括：(a)多个纳米颗粒，所述多个纳米颗粒分布于固体支持物上，(b)凝胶材料，所述凝胶材料形成与所述多个纳米颗粒缔合的层，以及(c)在凝胶材料中的靶核酸的文库。

Description

用于改进光发射检测的结构化基底和关于其的方法
本申请要求于2013年12月23日提交的，标题为ENHANCING DNA CLUSTERFLUORSCENCE USING LOCALIZED SURFACE PLASMON RESONANCE的美国临时申请第61/920,244号的权益，其通过引用以其整体并入本文。
背景
本公开内容通常涉及生物或化学分析，且更具体地涉及用于检测来自反应位点的光发射的系统和方法。
生物或化学研究中的多种方案涉及在支持物表面的局部区域或在反应腔内进行大量的受控制的反应。然后，设计的反应可被观察或检测，且后续分析可帮助鉴定或揭示参与反应的化学品的特性。例如，在一些多重测定中，具有可识别的标记物(例如，荧光标记物)的未知的分析物可以在受控制的条件下暴露于成千的已知的探针。每个已知的探针可以被沉积在微孔板的相应孔内。观察在孔内的已知的探针和未知的分析物之间发生的任何化学反应可以帮助鉴定或揭示分析物的特性。
检测来自反应位点阵列的光发射的其他方案包括已知的DNA测序方案，诸如边合成边测序(sequencing-by-synthesis)(SBS)或循环芯片测序(cyclic-arraysequencing)。在SBS中，使用多个荧光标记的核苷酸来测序位于基底表面上的扩增的DNA的许多聚簇(或克隆群体)的核酸。表面可以例如界定在流通池中的通道。不同聚簇中的核酸的序列通过运行其中荧光标记的核苷酸被添加到聚簇的许多循环来确定，并然后被光源激发以提供光发射。
尽管目前使用的测序系统在鉴定核苷酸和确定核酸的序列中是有效的，期望得到更具成本效益和/或实现甚至更小误差率的系统。例如，期望 增加反应位点的密度。但是，测序方法和相应的系统采用复杂的技术集合。在这些技术的一些中的改进已显示提供大幅的成本降低。但是，难以预测，如果有的话，哪个适合于降低成本的改进。鉴于测序系统中技术之间的依赖性，甚至更难以预测哪个可以被修改而对方法或系统的整体性能不具有负面影响。
许多系统和方案面临的一个挑战是用适合的置信度检测产生光发射的设计的反应。当反应位点变得更小并且反应位点的密度变得更大时，该挑战甚至更难。反应位点变得更小的一个结果是产生的光发射的量也变得更小。此外，当反应位点的密度变得更大时，可能更难以辨别哪个反应位点提供了光发射。除了以上的，通常期望减少用于检测光发射的时间(也被称为扫描时间或成像时间)的量。随着扫描时间减少，检测到较少的光子，从而使可靠地检测指示设计的反应发生的光发射甚至更具挑战性。
因此，对产生足量的光用于检测在反应位点阵列内的设计的反应的设备、系统和方法存在需要。
概述
本文提出了结构化基底和用于制造结构化基底的方法，所述结构化基底改进由离散的反应位点提供的光发射的可检测性。例如，结构化基底可以增加生物物质在离散的位点经历的激发光的强度，结构化基底可以增加来自生物物质的光发射的强度，和/或结构化基底可以控制光发射的方向性。本文还提出了检测来自离散的位点的阵列的光发射的方法。离散的位点可以是在基底主体内形成的反应腔，或是沿着装置基底的表面的局部区域。可通过，例如，荧光、化学发光、生物发光、电发光、辐射发光等，来产生光发射。本文还提供了比制造结构化基底的已知系统和方法，具有更大密度的离散位点(或相邻位点之间的更小间距(pitch))的结构化基底。
在一些实施方案中，方法和结构化基底可被配置以增强荧光标记的样品，且更具体地，荧光标记的核酸，的光发射。在特定的实施方案中，本文提出的方法和组合物提供了在涉及染料标记的核苷酸的边合成边反应 边测序中的DNA聚簇的荧光增强。但是，应该理解本文描述的方法和装置还可以适合用于其他应用。
在一些实施方案中，提供了用于在表面上荧光增强的方法和组合物。方法和组合物很好地适合于增强固体支持物上的标记的核酸的荧光强度。在特定的实施方案中，本文提出的方法和组合物提供在涉及染料标记的核苷酸的边合成反应边测序中的DNA聚簇的荧光增强。
因此，本文提出的一个实施方案是基底，所述基底包含：多个纳米颗粒，所述多个纳米颗粒分布于固体支持物上的多个纳米颗粒；凝胶材料，所述凝胶材料形成与所述多个纳米颗粒缔合的层；以及在凝胶材料中的靶核酸的文库。在某些实施方案中，纳米颗粒由等离子体共振材料形成。在某些实施方案中，等离子体共振材料包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、硅(Si)(例如，p型掺杂硅、n型掺杂硅)和砷化镓。在某些实施方案中，凝胶材料覆盖纳米颗粒。在某些实施方案中，固体支持物包含流通池的表面。在某些实施方案中，固体支持物包含具有多个孔(或反应腔)的平坦的表面，纳米颗粒分布在所述多个孔内。
本文还提出了制造基底的方法，所述方法包括：(a)提供包含平坦的表面的固体支持物；(b)将多个纳米颗粒分散在固体支持物的表面上；(c)以及用凝胶材料涂布固体支持物的至少一部分，从而形成覆盖多个纳米颗粒的凝胶层。在某些实施方案中，纳米颗粒由等离子体共振材料形成。在该方法的某些实施方案中，步骤(b)和(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(c)之前进行。在某些实施方案中，方法可进一步包括(d)将靶核酸的文库递送到凝胶材料以产生在凝胶材料中的核酸特征的阵列。在一些实施方案中，每个特征包含不同的核酸种类。在某些实施方案中，等离子体共振材料包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、硅(Si)(例如，p型掺杂硅、n型掺杂硅)和砷化镓。
本文还提出了检测核酸的方法，所述方法包括：提供包含多个纳米颗粒的固体支持物；凝胶材料，该凝胶材料形成覆盖多个纳米颗粒的层；以 及在凝胶材料中的靶核酸的文库；使固体支持物与结合靶核酸的至少一种荧光标记的探针接触；并检测在固体支持物上的荧光信号以辨别与所述至少一个探针结合的靶核酸。在某些实施方案中，纳米颗粒由等离子体共振材料形成。在某些实施方案中，等离子体共振材料包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、硅(Si)(例如，p型掺杂硅、n型掺杂硅)和砷化镓。在某些实施方案中，固体支持物包含流通池的表面。在某些实施方案中，固体支持物包含具有多个孔(或反应腔)的平坦的表面，纳米颗粒分布在所述多个孔中。在某些实施方案中，荧光标记的探针包括荧光标记的核苷酸。在某些实施方案中，荧光标记的探针包括荧光标记的寡核苷酸。在某些实施方案中，检测包括检测寡核苷酸探针与每个特征内的靶核酸的杂交。在某些实施方案中，检测包括检测核苷酸或寡核苷酸探针至每个特征内的靶核酸的掺入。
本文还提出了阵列，所述阵列包含：包含表面的固体支持物，所述表面包含多个孔(或反应腔)，所述孔被间质区域彼此分隔；以及在所述的多个孔的每个中的多个纳米结构。在某些实施方案中，纳米结构是等离子体纳米结构。在某些实施方案中，纳米结构位于孔的底部。在某些实施方案中，纳米结构沿着孔的壁定位。在某些实施方案中，间质区域基本上没有纳米结构。在某些实施方案中，纳米结构包含纳米颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒具有大于1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或大于100nm的直径。在某些实施方案中，纳米颗粒具有小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm或小于1nm的直径。在某些实施方案中，纳米颗粒包含在孔内的二聚体或三聚体。在某些实施方案中，纳米结构包括领结状纳米天线(bowtie nanoantennae)。在某些实施方案中，纳米结构包括纳米棒。在某些实施方案中，纳米结构包括纳米环。在某些实施方案中，纳米结构包括纳米栓。在某些实施方案中，纳米结构包括纳米光栅(nanograting)。在某些实施方案中，孔还包含凝胶材料。在某些实施方案中，凝胶材料包括水凝胶。在某些实施方案中，固体支持物包 含流通池的表面。
本文还提出了一种制备阵列的方法，所述方法包括获得包含平坦的表面的固体支持物，所述表面包含多个孔(或反应腔)，所述孔被间质区域彼此分隔；在固体支持物上涂布金属膜；使金属膜经历热退火过程，从而在所述多个孔的每个中形成多个纳米结构。在某些实施方案中，纳米结构由等离子体共振材料形成。在某些实施方案中，方法还包括磨光平坦的表面以从间质区域基本去除纳米结构且保持孔中的纳米结构。在某些实施方案中，方法还包括用凝胶材料涂布固体支持物的至少一部分，从而在多个孔中沉积凝胶材料。在某些实施方案中，纳米结构包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、硅(Si)(例如，p型掺杂硅、n型掺杂硅)和砷化镓。
本文还提出了一种检测核酸的方法，所述方法包括：提供包含平坦的表面的固体支持物，所述表面包含多个孔，所述孔被间质区域彼此分隔；在所述多个孔的每个中的多个纳米结构；凝胶材料，所述凝胶材料形成覆盖所述多个纳米结构的层；以及在凝胶材料中的靶核酸的文库；使固体支持物与结合靶核酸的至少一种荧光标记的探针接触；并检测在固体支持物上的荧光信号以辨别与所述至少一种探针结合的靶核酸。在某些实施方案中，纳米结构由等离子体共振材料形成。在某些实施方案中，纳米结构包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、硅(Si)(例如，p型掺杂硅、n型掺杂硅)和砷化镓。在某些实施方案中，纳米结构位于孔的底部。在某些实施方案中，纳米结构沿着孔的壁定位。在某些实施方案中，间质区域基本上没有纳米结构。在某些实施方案中，孔还包含凝胶材料。在某些实施方案中，凝胶材料包括水凝胶。在某些实施方案中，固体支持物包含流通池的表面。在某些实施方案中，荧光标记的探针包括荧光标记的核苷酸。在某些实施方案中，荧光标记的探针包括荧光标记的寡核苷酸。在某些实施方案中，检测包括检测寡核苷酸探针与每个特征内的靶核酸的杂交。在某些实施方案中，检测包括检测核苷酸或寡核苷酸探 针至每个特征内的靶核酸的掺入。
在一个实施方案中，提供了结构化基底。结构化基底包括具有活性面的基底主体。基底主体包括沿着活性面开口的反应腔和分隔反应腔的间质区域。结构化基底包括定位在反应腔的每个内的集成放大器。集成放大器包括多个纳米结构，所述集成放大器被配置成放大传送到相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
在一个实施方案中，提供了制造结构化基底的方法。所述方法包括提供具有基础面的基础层和沿着基础层的基础面形成纳米结构。所述方法还包括形成堆叠在基础面之上的腔层。腔层包括多个反应腔，其中每个反应腔包括在其中的多个纳米结构。多个纳米结构形成相应反应腔的集成放大器，集成放大器被配置成放大传送进相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
在一个实施方案中，提供了制造结构化基底的方法。所述方法包括提供具有基础面的基础层和沿着基础层的基础面形成纳米结构。所述方法还包括在纳米结构的阵列上提供纳米压印平板印刷(nanoimprint lithography，NIL)层。所述方法还包括将反应腔的阵列压印到NIL层，其中纳米结构的一个不同的子阵列被定位在每个反应腔下。纳米结构的每个子阵列被NIL层的各自的填充区域包围。所述方法还包括去除NIL层的各自的填充区域以暴露在相应反应腔内的纳米结构的子阵列。每个反应腔内的纳米结构的子阵列形成相应反应腔的集成放大器，集成放大器被配置成放大传送到相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
在一个实施方案中，提供了制造结构化基底的方法。所述方法包括提供具有基础面的基础层和沿着基础面提供纳米压印平板印刷(NIL)层。所述方法还包括压印NIL层以形成基础部分和从所述基础部分突出的纳米主体的阵列。方法还包括沉积覆盖纳米主体的等离子体共振膜以形成多个纳米结构。每个纳米结构包括相应的纳米主体和等离子体共振膜的一部分。方法还包括形成包括多个反应腔的腔层，其中每个反应腔包括在其中的多个纳米结构。多个纳米结构形成相应反应腔的集成放大器，所述集成放大器被配置成放大传送到相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生 的电磁能中的至少一种。
一个或更多个实施方案的细节在以下的附图和说明中被陈述。其他的特征、目标、和优势将由说明书和附图，以及由权利要求而明显。
附图简述
图1是显示用于表面上荧光增强的示例性方法的示意图。
图2是在纳米孔中的等离子体纳米结构的若干实例的图解表示。
图3A示出了纳米颗粒在纳米孔中的沉积的示意图。图3B和图3C是显示纳米颗粒以多种厚度沉积的SEM图。
图4示出了显示纳米孔中的纳米环的形成的示意图和SEM图。
图5是热退火后沉积在纳米孔中的纳米颗粒的SEM图。比例尺是2μm。
图6是一组显示对于四种荧光标记的碱基每循环聚簇强度作为Sn/Au颗粒厚度的函数的图。
图7是对于退火的Sn/Au纳米颗粒膜在循环1和循环26的聚簇强度增强的总结表。
图8A是显示根据一个实施方案Au纳米栓在纳米孔中的形成的示意图。图8B是显示Au纳米栓的形成的SEM图。
图9A是显示根据一个实施方案纳米孔中使用Au纳米栓的第一循环测序强度增强的柱状图。图9B是对于在纳米孔中的退火的Au纳米栓的聚簇强度增强的总结表。
图10示出了根据一个实施方案形成的结构化基底的一部分的横截面。
图11是显示根据一个实施方案制造结构化基底的方法的流程图。
图12是显示根据包括纳米压印平板印刷(NIL)材料的实施方案制造结构化基底的方法的流程图。
图13示出了在图12中显示的方法的不同的步骤。
图14示出了在图12中显示的方法的不同的步骤。
图15是显示根据一个包括NIL材料的实施方案制造结构化基底的方法的流程图。
图16示出了在图15中显示的方法的不同的步骤。
图17A-17E示出了可以用于一个或更多个实施方案的纳米结构的透视图。
图18A-18D示出了可以用于一个或更多个实施方案的纳米结构的横截面。
图19A-19D示出了可以与用于一个或更多个实施方案的纳米结构的设计视图。
详述
本申请的主题还可以适用于在美国专利申请公布第2014/0242334号；美国专利申请公布第2014/0079923号；和美国专利申请公布第2011/0059865号中描述的主题或包括在美国专利申请公布第2014/0242334号；美国专利申请公布第2014/0079923号；和美国专利申请公布第2011/0059865号中描述的主题。这些出版物的每一个通过引用以其整体并入本文。
本文陈述的一个或更多个实施方案被设置成直接地或间接地增强来自反应位点阵列的光发射，使得光发射可通过例如成像系统或成像装置检测。为了这个目的，实施方案可增加生物物质所经历的激发光的强度，增加生物物质产生的光发射的强度的至少一种，和/或控制光发射的方向性，使得光发射可被检测到。强度的增加和/或光发射的方向性的控制可通过定位在相应反应位点处的一个或更多个纳米结构部分地引起。增加的量可相对于存在于无纳米结构的反应位点处的电磁能的量来测量。
反应位点的阵列可被沿着结构化基底安置。结构化基底可以是例如具有通道的流通池，用于将试剂引导向反应位点旁边。光发射可通过成像系 统检测，成像系统可包括例如在结构化基底旁边扫描(scan)或扫频(sweep)以检测来自反应位点的光发射的物镜。本文陈述的能够检测来自结构化基底的光发射的示例性系统被描述于美国申请公布第2012/0270305A1号和第2013/0261028A1号中，其每个通过引用以其整体并入本文。可选地，结构化基底可与成像装置诸如固态成像装置(例如，CMOS)整合。在此类实施方案中，成像装置可具有与反应位点对齐以捕获来自反应位点的光发射的一个或更多个光传感器。此类实施方案在美国临时申请第61/914,275号和国际申请第PCT/US14/69373号中被描述，其每个通过引用以其整体并入本文。
由至少一个实施方案提供的技术效果可包括来自生物物质的发射器的增加的信号强度。信号强度的增加可通过减少发射低强度光的生物物质的数目减少误差率。另一个技术效果可包括减少信噪比，其使更快的扫描速度成为可能并且减少用于进行方案的整体时间。例如，关于边合成边测序技术，期望测序仪更快的扫描速度，但更快的扫描速度导致每聚簇在成像相机上收集较少的光子。由于较少的光子被捕获，信噪比通常减少并且其变得更加难以可信地分配碱基。此外，在一些测序仪上，低NA光学器件产生固有较大和较模糊的信号，潜在地产生较高误差率。本文陈述的实施方案可以增加被捕获的光子的数目。至少一些实施方案的另一个技术效果包括制造结构化基底的方法，其比至少一些已知的方法更可靠，并且比至少一些已知的方法更具成本效益。
本公开内容通常涉及固相分析化学，并且具有对用于高通量基因组学分析的核酸阵列的特定适用性。编目人类遗传变异和使该变异与对疾病的易感性相关的任务势必受益于全基因组测序方法的进步。该编目努力有望鉴定在每个人的基因组中的标志物，其将帮助医学专业人员确定该人对疾病的敏感性、对特定疗法诸如处方药的响应性、对危险药物副作用的敏感性和其他医学可操作的特征。编目努力在顺利地进行中。这在很大程度上归因于具有足够成本效益以允许测试在研究背景中待评价的受试者的商用可得的基因组测序方法。需要测序方法中的改进以加速编目努力。此外，相对高的测序成本已阻碍技术超越研究中心从而进入临床，在临床上医生 可获得在一般人群中的患者的序列。
测序方法和用来进行测序方法的系统采用复杂的技术集合。这些技术中的一些的改进已显示提供大幅降低成本。但是，难以预测，如果有的话，哪个适合于降低成本的改进。鉴于测序系统中技术之间的依赖性，甚至更难以预测哪个可以被修改而对方法或系统的整体性能不具有负面影响。因此，对鉴定可将基因组研究的前景带至临床(其中生命可被改善并且在许多情况下可被挽救)的改进存在需要。本发明满足该需要并且也提供相关的优点。
如本文使用的，“生物物质”或“化学物质”包括生物分子、感兴趣的样品、感兴趣的分析物、和其他化学化合物。生物物质或化学物质可被用来检测、鉴定、或分析其他化学化合物或作为中间体发挥功能以研究或分析其他化学化合物。在特定的实施方案中，生物物质是核酸，或更具体地，具有共同序列的核酸的集落。在特定的实施方案中，生物物质或化学物质包括生物分子。如本文使用的，“生物分子”包括以下的至少一种：生物聚合物、核苷、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、蛋白、酶、多肽、抗体、抗原、配体、受体、多糖、碳水化合物、多磷酸盐、细胞、组织、器官、或其片段或任何其他生物活性化学化合物诸如上述的种类的类似物或模拟物。
作为另一个实例，生物物质或化学物质可包括在偶联的反应中使用以检测另一个反应的产物的酶或试剂，诸如用来在焦磷酸测序反应中检测焦磷酸的酶或试剂。在例如美国专利申请第2005/0244870A 1号中描述了用于焦磷酸检测的酶和试剂，其以其整体并入本文。
生物物质或化学物质可以是天然存在的或合成的且位于指定的区域或空间内。在一些实施方案中，生物或化学物质可与固相或凝胶材料结合。生物分子、样品和生物物质或化学物质还可以包括药物组合物。在一些情况中，感兴趣的生物分子、样品和生物物质或化学物质可被称为靶、探针或分析物。
实施方案可特别适合于增强来自荧光标记的核酸的发射。例如，实施方案可以提供在涉及染料标记的核苷酸的通过合成反应的测序中的DNA聚簇的荧光增强。实施方案可增加在边合成边测序期间来自荧光标记物的 信号强度。信号强度的增加可通过减少由在长测序运行期间的低强度聚簇和聚簇丢失引起的测序误差改进整体测序性能。
本文提出了用于表面上荧光增强的方法和组合物。方法和组合物很好地适合于增强固体支持物(或基底主体)上的标记的核酸的荧光强度。在特定的实施方案中，本文提出的方法和组合物提供在涉及染料标记的核苷酸的边合成反应边测序中的DNA聚簇的荧光增强。另外，本文提供了用于低成本、快速和稳健的制造纳米结构的方法，所述纳米结构诸如在测序基底上能够具有从约350nm到约750nm的广谱荧光增强的等离子体纳米结构。
本公开内容详细描述了这样的出意料的发现：来自聚簇的核酸的增加的强度可通过将等离子体和/或纳米天线与示例性测序基底/平台和SBS化学组合来获得。这通过等离子体纳米结构和纳米天线在测序基底上的自上而下的纳米制造或自下而上的自组装来实现。本文提出了用于在非模式化的基底和模式化的基底二者上制造等离子体纳米结构的多种方法。
不希望受限于理论，所得的聚簇强度的增强归因于局部表面等离子体共振和共振能量转移过程的组合。本文提出的方法和组合物具有若干优势。例如，在边合成边测序期间来自荧光标记物的增加的信号强度通过减少由在长测序运行期间的低强度聚簇和聚簇丢失引起的测序误差改进整体测序性能。此外，信噪比降低，从而使更快的扫描速度成为可能并且减少整体测序运行时间。期望测序仪更快的扫描速度，但更快的扫描速度导致每聚簇在成像相机上收集较少的光子，导致较低的信噪比和较高的误差率。此外，在一些测序仪上，低NA光学器件产生固有较大和较模糊的信号，潜在地产生较高误差率。因此，增加聚簇强度的方法提供许多益处。
因此，本文提出的一个实施方案是基底，所述基底包含：多个纳米颗粒，所述多个纳米颗粒由分布于固体支持物(或基底主体)上的等离子体共振材料形成；凝胶材料，所述凝胶材料形成与所述多个纳米颗粒缔合的层；以及在凝胶材料中的靶核酸的文库。
在某些实施方案中，凝胶材料覆盖纳米颗粒。在某些实施方案中，固体支持物包含流通池的表面。在某些实施方案中，固体支持物包含具有多 个孔(或反应腔)的平坦的表面，纳米颗粒分布在所述多个孔内。
如本文使用的，术语“纳米颗粒”和“纳米结构”可互换使用来指具有在约1nm到约1000nm范围包括在1nm和1000nm之间的任何整数或非整数值，的一个维度的颗粒。在典型的实施方案中，纳米颗粒是金属颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒核心是直径为20-200nm的球形或几乎球形的颗粒。在一些实施方案中，范围是约1nm到约50nm(例如约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、或50nm)。在一些实施方案中，范围是约350nm到约750nm。各向异性纳米颗粒可以具有长度和宽度。在一些实施方案中，各向异性纳米颗粒的长度是与在其中产生纳米颗粒的孔穴的平面平行的维度。在一些实施方案中，各向异性纳米颗粒的长度是与在其中产生纳米颗粒的孔穴的平面垂直的维度。在各向异性纳米颗粒的情况下，在一些实施方案中，纳米颗粒具有在约350nm到约750nm范围内的直径(宽度)。在其他实施方案中，纳米颗粒具有约350nm或更小的直径(宽度)。在其他实施方案中，纳米颗粒具有250nm或更小的直径且在一些实施方案中，100nm或更小的直径。在一些实施方案中，宽度在15nm到300nm之间。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约10-350nm的长度。在一些实施方案中，纳米颗粒具有预选的形状并且可以是例如纳米管、纳米线、纳米球、或包含以上描述的维度的任何形状(例如二维的三角形、正方形、矩形或多边形形状，或三维的长方体、锥体、圆柱体、球体、铁饼状形状或半球形状)。图2是在纳米孔26中的等离子体纳米结构的若干实例的图解表示。纳米结构的一些实例包括，例如，领结状纳米天线28、纳米球34、纳米锥、纳米壳、纳米棒、纳米线、纳米环、纳米栓30、纳米光栅32等等。纳米颗粒的预形成的二聚体36和三聚体28也可以被加载到孔内并且具有精确地控制纳米颗粒间距的优势。
这些纳米结构可以在表面上被制造，或预形成，然后被加载到纳米孔内。此类结构的实例包括在纳米孔的底部制造的等离子体纳米栓、在纳米孔中的领结状和腔状天线、在其上可以形成纳米孔的金属纳米光栅、在纳米孔内回流的纳米颗粒或以上的一些或全部的组合。一个实例将是在纳米孔内的金属纳米栓，所述纳米孔具有通过简单的电子束蒸发过程在壁上形成的纳米颗粒。使用DNA折纸术(origami)或诸如葫芦[n]脲的接头分子形成的纳米颗粒构建体(二聚体、n聚体)对于加载到孔中也是有吸引力的。此类方法允许对纳米颗粒间距的精确亚纳米级控制并且可以使用自下而上的自组装被大规模地形成。这些结构的实例显示于图2中。
表面上的任何两个纳米颗粒之间的间距可以是任何距离。在一些实施方案中，间距可以是入射光能量的波长的倍数，该入射光能量的波长诸如荧光光谱中特定的发射波长或激发波长。间距可以是例如1λ、2λ、3λ、4λ或选择的入射光能量的波长(λ)的另一个倍数。因此，使用532nm的发射波长(λ)作为实例，纳米颗粒之间的间距可以是约532nm(1λ)、约1064nm(2λ)、或发射波长的另一个倍数。在一些实施方案中，间距可以是入射光能量的波长的分数，该入射光能量的波长诸如荧光光谱中特定的发射波长或激发波长。间距可以是例如1λ、1/2λ、1/3λ、1/4λ或选择的入射光能量的波长的另一个倍数。因此，使用532nm的发射波长(λ)作为实例，纳米颗粒之间的间距可以是约532nm(1λ)、266nm(1/2λ)、133nm(1/3λ)或发射波长的另一个分数。
术语“等离子体纳米结构”或“纳米等离子体结构”在本文可互换使用，并且指展示该结构的等离子体共振特征的任何独立的结构，包括(但不限于)纳米结构、纳米颗粒二者以及纳米颗粒的组合或缔合。
如本文使用的术语“纳米天线”指用来放大电磁能，诸如光能，的纳米颗粒或纳米结构。如本文使用的，纳米天线不必须展示等离子体共振特征。在一些实施方案中，纳米天线基本上不包含等离子体共振材料。因此，在一些实施方案中，提出了由非金属材料制成但展示电磁能的放大特征的纳米天线。本文提出的纳米颗粒可以是任何适合的形状和尺寸以便产生期望的能量放大。纳米天线的一些示例性形状包括，例如，领结状纳米天线、 纳米球、纳米锥、纳米壳、纳米棒、纳米线、纳米环、纳米栓、纳米光栅等。将理解，许多已知的方法的任一种可以适合于在固体支持物(或基底主体)上制造和/或沉积纳米天线。用于制造纳米天线的方法在本领域是已知的，并且包括例如，本文描述的用于纳米颗粒制造和沉积的方法。
纳米颗粒可以包括任何适合于在本文描述的方法和组合物中使用的材料，例如，任何类型的展示表面等离子体共振(SPR)的材料。在某些优选的实施方案中，纳米颗粒包括等离子体共振材料。实例包括但不限于金属纳米颗粒。例如，纳米颗粒可以包括金属，诸如以下的一种或更多种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、或任何其他适合的金属。纳米颗粒可以由单一的材料，诸如例如单一的金属形成。另外地或可选地，纳米颗粒可以由两种或更多种不同的材料，诸如，例如，两种或更多种金属，的组合形成。例如，纳米颗粒可以包括金属/金属混合物诸如Sn/Au或Ag/Au。可选地或另外地，可以采用垂直分层的纳米颗粒，诸如金属-绝缘体-金属类型的多层结构。实例包括硅(Si)。例如，纳米颗粒可以包括p型掺杂硅和n型掺杂硅。还可以使用砷化镓。
纳米颗粒在固体支持物上的形成可以使用本领域已知的许多方法的任何一种来进行。纳米颗粒可使用等离子体纳米结构和纳米天线在测序基底上的自下而上的自组装来形成。例如，可以使用用于沉积金属的层的许多方法的任何一种，诸如那些由Gaspar等(Scientific Reports,2013,3,1469)描述的那些，其通过引用并入本文。在本文描述的和在实施例1和图1中示出的示例性实施方案中，纳米颗粒10可以被预形成并且在胶体样组合物中与沉积在固体支持物16的表面14上的凝胶材料12混合。播种(seeding)操作可以发生，在该操作中核酸18(或其他生物分子)被固定到凝胶材料12。可以进行聚簇操作以形成核酸18的聚簇20。聚簇可通过例如桥式扩增产生。可选地或另外地，纳米颗粒可以首先被沉积在表面上，随后凝胶材料沉积在纳米颗粒上。在其他实施方案中，凝胶材料可以被沉积在表面上并且纳米颗粒被沉积在凝胶材料上。
在一些实施方案中，纳米颗粒在固体表面的孔(或凹陷特征(feature)或 反应腔)中形成。如在图3A中示出的，起始材料40诸如Sn/Au的膜可被沉积在含有纳米孔44的固体表面42上，随后热退火。在一些实施方案中，可以使用热退火来促进纳米颗粒46的形成，因为膜凝结成离散的颗粒。如被在图3B和图3C中示出的结果表明的，纳米颗粒的尺寸可以是起始膜厚度的函数。热退火之后进一步的磨光步骤可以导致纳米颗粒46仅在孔中同时使间质区域48基本上没有纳米颗粒。图5是Sn/Au层的沉积之后接热退火的进一步的实例。图5中示出的纳米颗粒的SEM图表明纳米颗粒在每个纳米孔中被观察到。间质区域中的纳米颗粒可通过例如化学和/或机械磨光被去除。在每个纳米孔中观察能够实现广谱荧光增强的纳米颗粒尺寸的分布。
在一些实施方案中，纳米结构诸如纳米环可以沿着表面上的孔(或凹陷特征或反应腔)的壁形成。纳米结构可使用本领域已知的许多方法的任何一种来制造。例如，图4示出了显示纳米环50在纳米孔52中的形成的示意图和SEM图。如在图4中示出的，Au可使用诸如Au的材料的层54的溅射沉积来沉积。在图4中示出的实施方案中，～65nm Au层的保形沉积(conformal deposition)之后是反应离子刻蚀(RIE)过程。剩余Au层沿着纳米孔的壁定位，在每个纳米孔中形成纳米环52。
如本文使用的，术语“表面”意图意指固体支持物或凝胶材料的外部部分或外层。表面可以与另一种材料诸如气体、液体、凝胶、聚合物、有机聚合物、相似的或不同的材料的第二表面、金属、或涂层接触。其表面或区域可以是基本上平坦的。表面可以具有表面特征诸如孔、坑(pit)、通道、脊(ridges)、升高的区域、桩(peg)、柱(post)等等。
如本文使用的，术语“固体支持物”指在含水的液体中不可溶的刚性基底。固体支持物还可以被称为基底主体。固体支持物的基底可以是无孔或多孔的。任选地，基底可以能够吸收液体(例如由于多孔性)，但典型地将是足够刚性的，以使得当吸收液体时基底基本不膨胀且当通过干燥移除液体时基底基本不收缩。无孔的固体支持物通常对于液体或气体是不可渗透的。任选地，固体支持物可以对用来修饰凝胶的化学过程是惰性的。例如，在本文陈述的方法中，固体支持物可以对用来使分析物，诸如核酸，附接 到凝胶的化学过程是惰性的。示例性固体支持物包括但不限于，玻璃和改性的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的硅)、碳、金属、无机玻璃、光学纤维束、和聚合物。
本文提出的方法和组合物的特定的实施方案使用具有模式化或结构化基底的固体支持物。模式化或结构化基底可以包含模式化凝胶阵列，如在美国系列第13/787,396号(美国专利申请公布2014/0243224A1)中描述的，其的全部内容通过引用并入本文。在特定的实施方案中，结构化基底可通过以下被制备：模式化具有孔(例如微孔或纳米孔)的固体支持物材料，用凝胶材料(例如PAZAM、SFA或其化学改性的变体，诸如叠氮化形式的SFA(叠氮-SFA))涂布模式化支持物并磨光凝胶涂布的支持物，例如经由化学或机械磨光，从而将保留在孔中的凝胶但从结构化基底表面上孔间的间质区域去除或灭活基本上所有的凝胶。引物核酸可以被附接到凝胶材料。然后，靶核酸(例如片段化的人类基因组)的溶液可以与磨光的基底接触，以使得单独的靶核酸将经由与附接到凝胶材料的引物的相互作用播种单独的孔；但是，由于凝胶材料不存在或失活，靶核酸将不占据间质区域。由于凝胶在间质区域的不存在或失活防止生长的核酸集落的向外迁移，靶核酸的扩增将被限制于孔。过程是可方便地制造的、可规模化的并使用常规的微米(micro-)或纳米(nano-)制造方法。
在本文陈述的结构化基底中使用的固体支持物可以由本文，例如，在以上定义中，在以下实例或紧接的下文，陈述的多种材料中的任一种制成。特别有用的材料是玻璃。其他适合的基底材料可包括聚合物材料、塑料、硅、石英(熔融石英)、borofloat玻璃、二氧化硅、二氧化硅基材料、碳、金属、光学纤维或光学纤维束、蓝宝石、或塑料材料诸如COC和环氧树脂。特定的材料可基于对于特定用途所期望的特性来选择。例如，可透过期望波长的辐射的材料对将使用期望波长的辐射的分析技术是有用的，诸如本文陈述的一种或更多种技术。相反地，可能期望选择不传递某种波长 的辐射的材料(例如是不可透过的、吸收的或反射的)。这可对掩模(mask)的形成有用，该掩膜：在结构化基底的制造，诸如本文陈述的方法，期间使用；或用于使用结构化基底进行的化学反应或分析检测，诸如本文陈述的那些。可被采用的材料的其他特性是对诸如本文描述的那些在下游处理中使用的某些试剂的惰性或反应性；在诸如本文描述的那些制造过程期间的易于操作或低成本。可在本公开内容的结构化基底或方法中使用的材料的另外的实例，被描述于美国系列第13/661,524号和美国专利申请公布第2012/0316086A1号中，其每个通过引用并入本文。
对于一些实施方案特别地有用的固体支持物位于流通池装置内。示例性流通池、用于其制造的方法和用于其使用的方法在美国专利申请公布第2010/0111768A1号或第2012-0270305A1号；或第WO 05/065814号中被描述，其每一个通过引用并入本文。流通池提供容纳由本公开内容的方法产生的阵列的便利的格式，且经受边合成边测序(SBS)或涉及在循环中重复的试剂递送的其他技术(例如，具有重复的或循环的步骤的合成技术或检测技术)。示例性检测方法在以下被更详细地陈述。
在一些实施方案中，使用具有多表面的流通池或其他容器。可以使用具有多表面的容器，以使得仅单一表面具有包含凝胶的凹陷特征(例如孔)。可选地，存在于容器中的两个或更多个表面可具有包含凝胶的凹陷特征。流通池的一个或更多个表面可被选择性地检测。例如，使用本领域已知的方法诸如共聚焦技术，用聚焦放射可选择性地处理在流通池内部的相对表面。用于选择性地引导放射到容器(例如流通池)的多表面的有用的共聚焦技术和装置被描述于例如美国专利申请公布第2009/0272914A1号或美国专利第8,039,817号中，其每个通过引用并入本文。
如本文使用的，术语“凝胶材料”意图意指可渗透液体和气体的半刚性材料。典型地，当吸收液体时凝胶材料可膨胀并且当通过干燥去除液体时凝胶材料可收缩。示例性凝胶包括但不限于具有以下结构的那些：胶状结构，诸如琼脂糖；聚合物网状结构，诸如明胶；或交联的聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺、SFA(参见，例如，美国申请公布第2011/0059865A1号，其通过引用并入本文)或PAZAM(参见，例如，美国临时专利申请系列第 61/753,833号或美国专利申请公布第2011/0059865A1号，其通过引用并入本文)。特别地有用的凝胶材料将顺应该凝胶材料驻留处的孔或其他凹陷特征的形状。一些有用的凝胶材料可(a)顺应该凝胶材料驻留处的孔或其他凹陷特征的形状且(b)具有基本不超过该凝胶材料驻留处的孔或凹陷特征的容积的体积。
如本文使用的，术语“间质区域”指在基底中或在表面上分隔基底或表面的其他区域的区域。例如，间质区域可将阵列的一个孔(或凹陷特征)与阵列的另一个孔(或凹陷特征)分隔。彼此被分隔的两个区域可以是离散的，缺乏彼此接触。在另一个实例中，间质区域可将特征的第一部分与特征的第二部分分隔。在许多实施方案中，间质区域是连续的而特征是离散的，例如，如在其他部分连续的表面中的孔的阵列的情况。由间质区域提供的分隔可以是部分的或完全的分隔。典型地，间质区域将具有与表面上的特征的表面材料不同的表面材料。例如，阵列的特征可具有超过存在于间质区域的量或浓度的量或浓度的凝胶材料或分析物。在一些实施方案中，凝胶材料或分析物可不存在于间质区域
在许多实施方案中，通过磨光固体支持物，例如经由化学或机械磨光，间质区域可基本上没有纳米结构，从而保留在孔中的纳米结构，但是从结构化基底的表面上孔间的间质区域去除或灭活基本上所有的纳米结构。可通过对固体支持物的表面应用磨蚀力进行机械磨光。示例性方法包括用珠浆磨蚀、用纸张或布擦拭、刮擦等等。将被理解，本文陈述的用于磨光或其他用途的珠可以是，但不必是球形的。更确切地，珠可具有不规则的形状、多边形形状、卵球形形状、细长的形状、圆柱形形状等等。珠的表面可以是光滑的或粗糙的。多种颗粒的任何一种可用作珠，以用于本文陈述的方法和组合物。磨光的一个实例包括使用用3μm硅珠浆(水中10％w/v)涂布的不起毛的(洁净室等级)擦拭物(wipe)去除间质纳米结构。磨光轮/研磨机还可与该浆一起使用。也可以使用流体喷射或气体(例如空气或惰性气体诸如氩气或氮气)喷射实现机械磨光以从间质区域去除凝胶。
如本文使用的，术语“文库”，当提及分析物使用时，指具有不同化学组成的分析物的集合。典型地，文库中的分析物将是不同的物种，其具有 属或纲的共同的特征或特性，但以其他方式在某些方面不同。例如，文库可包括这样的核酸物种，其在核酸序列方面不同，但在具有糖-磷酸主链方面是相似的。
如本文使用的，术语“核酸”和“核苷酸”意图与其在本领域的使用一致，并且包括天然地存在的物种或其功能类似物。核酸的特别地有用的功能类似物能够以序列特异的方式与核酸杂交，或能够被用作模板用于复制特定的核苷酸序列。天然地存在的核酸普遍地具有含磷酸二酯键的主链。类似物的结构可具有可选的主链连接，包括本多种领域已知的那些的任何一种。天然地存在的核酸普遍地具有脱氧核糖(deoxyribose sugar)(例如在脱氧核糖核酸(DNA)中发现的)或核糖(ribose sugar)(例如在核糖核酸(RNA)中发现的)。核酸可包含这些本领域已知的糖部分的多种类似物的任何一种的核苷酸。核酸可包括天然的或非天然的核苷酸。在这方面，天然的脱氧核糖核酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或更多个碱基，且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或更多个碱基。可被包括在核酸或核苷酸中的有用的非天然的碱基在本领域是已知的。当提及核酸而使用时，术语“探针”或“靶”意图作为用于在本文陈述的方法或组合物的上下文中的核酸的语义标识符，且不必限制核酸的结构或功能，除非另外明确地指示。类似地，术语“探针”和“靶”可用于其他分析物，诸如蛋白、小分子、细胞等等。
如本文使用的，术语“涂布(coat)”和“涂布(coating)”以及类似的术语当用作动词时，意图意指提供层或覆盖在表面上。至少表面的一部分可具有层或覆盖物。在一些情况下，整个表面可具有膜或覆盖物。在可选的情况下，仅表面的一部分将具有膜或覆盖物。术语“涂布”当用来描述表面和材料间的关系时，意图意指材料作为表面上的层或覆盖物存在。材料可密封表面，例如防止液体或气体与表面接触。但是，材料不必须形成密封。例如，材料对于液体、气体或液体或气体中携带的一种或更多种组分可以是多孔的。可涂布表面的示例性材料包括但不限于凝胶、聚合物、有机聚合物、液体、金属、第二表面、塑料、二氧化硅或气体。
本公开内容的包含核酸阵列的结构化基底可用于多种目的的任何一 种。核酸的一个特别地期望的用途是充当与具有互补序列的靶核酸杂交的捕获探针。靶核酸在与捕获探针杂交后，经由例如招募到捕获探针的标记物，可被检测到。用于经由与捕获探针杂交检测靶核酸的方法在本领域是已知的，并且包括，例如，被描述于美国专利第7,582,420号；第6,890,741号；第6,913,884号或第6,355,431号或美国专利申请公布第2005/0053980A1号；第2009/0186349A1号或第2005/0181440A1号中的那些，其每个通过引用并入本文。例如，标记物可借助于捕获探针与具有标记物的靶探针的杂交被招募到捕获探针。在另一个实例中，标记物可通过使靶探针与捕获探针杂交，以使得捕获探针可通过与标记的寡核苷酸连接(例如经由连接酶活性)或通过添加标记的核苷酸(例如经由聚合酶活性)被延伸，被招募到捕获探针。
核酸阵列还可以在测序过程中使用，测序过程诸如边合成边测序技术。简而言之，可通过使靶核酸与一种或更多种标记的核苷酸、DNA聚合酶等等接触起始SBS。使用靶核酸作为模板延伸引物之处的那些特征将掺入可被检测的标记的核苷酸。任选地，标记的核苷酸还可包括可逆终止特性，在核苷酸已被添加至引物后，终止进一步的引物延伸。例如，具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可被添加至引物，以使得随后的延伸不能发生，直到解阻断剂被递送以去除该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可将解阻断剂递送至流通池(在检测发生之前或之后)。在多个递送步骤之间可进行洗涤。然后可重复循环n次，以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可容易地适合用于由本公开内容的方法产生的阵列的示例性SBS程序、流体系统和检测平台被描述于例如Bentley等Nature456:53-59(2008)；WO 04/018497；WO 91/06678；WO 07/123744；美国专利第7,057,026号第7,329,492号；第7,211,414号；第7,315,019号或第7,405,281号和美国专利申请公布第2008/0108082A1号中，其每个通过引用并入本文。
可利用使用循环反应的其他测序程序，诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测随特定核苷酸被掺入到初期的核酸链释放的无机焦磷酸(PPi)(Ronaghi,等AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1), 3-11(2001)；Ronaghi等Science 281(5375),363(1998)；美国专利第6,210,891号；第6,258,568号和第6,274,320号，通过引用将其每个并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可通过被ATP硫酸化酶转化成腺苷三磷酸(ATP)来检测，并且得到的ATP可经由荧光素酶产生的质子来检测。因此，测序反应可经由发光检测系统来监测。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源对于焦磷酸测序程序不是必需的。可用于对本公开内容的阵列应用焦磷酸测序的有用的流体系统、检测器和程序，被描述在例如，WIPO专利申请系列第PCT/US11/57111号、美国专利申请公布第2005/0191698A1号、美国专利第7,595,883号和美国专利第7,244,559号中，其每个通过引用并入本文。
边连接边测序反应(Sequencing-by-ligation reactions)也是有用的，包括，例如，被描述于Shendure等Science 309:1728-1732(2005)；美国专利第5,599,675号；和美国专利第5,750,341号中的那些，其每个通过引用并入本文。一些实施方案可包括边杂交边测序程序(sequencing-by-hybridization procedures)，如被描述于例如Bains等Journalof Theoretical Biology 135(3),303-7(1988)；Drmanac等Nature Biotechnology 16,54-58(1998)；Fodor等Science 251(4995),767-773(1995)；和WO 1989/10977中的，其每个通过引用并入本文。在边连接边测序和边杂交边测序程序二者中，存在于包含凝胶的孔(或其他凹陷特征)中的核酸经受重复的寡核苷酸递送和检测的循环。用于如本文陈述的SBS方法或在本文引用的参考文献中的流体系统可容易地适用于边连接边测序或边杂交边测序程序的试剂的递送。典型地，寡核苷酸是荧光标记的并且可使用荧光检测器来检测，该荧光检测器与本文关于SBS程序描述的或本文引用的参考文献中的那些相似。
一些实施方案可利用包括DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如，核苷酸掺入可通过载有荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测，或用零模波导来检测。用于基于FRET的测序的技术和试剂被描述于例如Levene等Science 299,682–686(2003)；Lundquist等Opt.Lett.33,1026–1028(2008)；Korlach等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176–1181(2008)，通过引用将其公开内容并入本文。
本公开内容的阵列的另一个有用的应用是基因表达分析。基因表达可使用RNA测序技术，诸如被称为数字化RNA测序的那些来检测或定量。RNA测序技术可使用本领域已知的测序方法诸如以上陈述的那些来进行。基因表达还可使用通过与阵列直接杂交来进行的杂交技术或使用在阵列上检测其产物的多重测定来检测或定量。本公开内容的阵列还可以用来确定来自一个或更多个个体的基因组DNA样品的基因型。用于可对本公开内容的阵列进行的基于阵列的表达和基因型分析的示例性方法被描述于美国专利第7,582,420号；第6,890,741号；第6,913,884号或第6,355,431号或美国专利申请公布第2005/0053980A1号；第2009/0186349A1号或第2005/0181440A1号中，其每个通过引用并入本文。
本公开内容的阵列的若干应用在以上集成检测的背景中已被例证，其中靶核酸的多个拷贝存在于每个特征并且被一起检测。在可选的实施方案中，单个核酸，无论靶核酸还是其扩增子，可在每个特征处被检测。例如，包含凝胶的孔(或其他凹陷特征)可被配置成包含具有待检测的靶核苷酸序列的单个核酸分子。可使用多种单分子检测技术中的任一种，包括，例如，修改以上陈述的集成检测技术以增加的分辨率或使用更灵敏的标记物检测位点。可被使用的单分子检测方法的其他实例被描述于美国专利申请公布第2011/0312529A1号；美国系列第61/578,684号；和美国系列第61/540,714号，其每个通过引用并入本文。
如本文使用的，术语“孔”指在具有完全被表面的间质区域包围的表面开口的固体支持物中的离散的凹陷特征。孔在其表面开口处可具有多种形状中的任何一种，包括但不限于圆的、椭圆的、正方形、多边形、星形(具有任何数目的顶点)等等。与表面垂直截取的孔的横截面可以是弧形的、正方形的、多边形的、双曲线的、圆锥形的、角形的等等。
如本文使用的，当在提及固体支持物中使用时，术语“凹陷特征(concavefeature)”指在固体支持物中的凹处(recess)或凹入(indentation)。示例性凹陷特征包括但不限于孔、坑、洞(hole)、洼地、通道或槽。任选地，凹陷特征可具有弧形的横截面(在与固体支持物的表面垂直的维度)；但是，具有一个或更多个线性部分、角度或转角的横截面也是可能的。具有弧形 的和线性截面的组合的横截面也是可能的。通常，凹陷特征不需完全贯穿通过固体支持物，例如，反而在基底中具有底部表面或底点。
以下陈述的以及权利要求书中列举的实施方案可根据以上的定义来理解。
实施例1
非模式化的表面上的局部的SPR
该实施例描述使用局域表面等离子体共振(SPR)来增加固体表面上扩增的DNA(DNA“聚簇”)的荧光强度。该实施例中，显示在用掺入Au纳米颗粒的无硅烷丙烯酰胺(SFA)涂布的非模式化的玻璃表面上的结果。然后在该表面上扩增DNA聚簇。
示例性工作流程在图1中展示。在第一个图中示出，将掺入Au纳米颗粒10的SFA涂布在玻璃表面14上，并且将扩增引物(未示出)接到SFA。在第二个图中示出，模板DNA 18被播种到表面或凝胶材料上。然后，如在第三个图中示出的，在表面上扩增播种的模板DNA18，形成扩增的DNA的聚簇20，其中一些聚簇直接地在Au纳米颗粒10上形成，同时其他聚簇在不包含Au纳米颗粒的表面的部分上形成。如在第四个图中显示的，在边合成反应边测序期间检测来自每个聚簇的荧光22。相比于从不邻近Au纳米颗粒的聚簇发射出的信号，临近Au纳米颗粒的聚簇产生增强的荧光。
在图1中描述的工作流程在具有8通道的D263玻璃流通池表面上进行。通道1、通道2是对照通道(无纳米颗粒)。通道3-6掺入了50nM浓度的6nm球形Au纳米颗粒。高Au NP浓度防止在这些通道中原位涂布的SFA的聚合作用，防止接枝(grafting)。通道7、通道8用掺入了10nM浓度Au纳米颗粒的SFA涂布。从通道7、通道8观察到相对于对照通道的较高的荧光强度。测序结果表明相对于对照通道对于碱基A的强度增加～27％。相对于对照通道，观察到对于所有4种碱基强度平均增加～24％。
这些数据表明，由于入射光与在下面的Au纳米颗粒的相互作用引发局部的表面等离子体，在Au纳米颗粒附近的聚簇展现增强的荧光。不在 纳米颗粒附近的聚簇不展现该增强的荧光。
实施例2
在具有纳米颗粒的模式化基底上的增强的荧光
等离子体纳米结构还可与模式化的纳米孔基底组合，用于增强的荧光。在该实施例中，使用在纳米孔中的纳米颗粒实现荧光增强。使用新型的Sn/Au回流方法，在纳米孔中形成纳米颗粒。如在图3A中示出的，首先在纳米孔基底上涂布Sn/Au的均匀膜，随后是在400℃的热退火过程，该过程导致膜回流成小纳米颗粒(参见图3B和3C)。通过控制起始膜厚度，操作纳米颗粒尺寸。这样的实施例示于图3B和3C中，图3B和3C分别针对分别产生>50nm直径颗粒和<30nm直径颗粒的6nm和10nm的起始膜厚度的。
在纳米颗粒形成后，使用机械磨光来从间质区域去除纳米颗粒，产生仅在孔中的颗粒。该技术的一个优势是加载效率，其起因于纳米颗粒被加载到每个孔内的事实。该技术的另外的优势是，相比于在小范围的波长的增强，如通常地使用单一纳米颗粒尺寸实现的，纳米颗粒尺寸的广泛的分布产生广谱荧光增强。
在3个相同的流通池上，将以上实验重复3次。在3个独立的实验中，相对于对照D263，在相应于纳米孔中直径～50nm以及大于50nm直径的纳米颗粒的～6nm厚Sn/Au区域观察到对于所有4种碱基的荧光增强。平均而言，相对于在这些实验中的对照，碱基强度增加～37％，C、G、T经历强烈的增强，但A经历较弱的增强。在相应于于较小的<30nm纳米颗粒的～10nm厚Sn/Au区域未观察到荧光增强。
图6和图7示出了示例性结果。图6示出使用等温扩增随后SBS测序的测序结果。将边合成边测序进行26个循环，并且与无Sn/Au沉积的对照区域进行比较。以Sn/Au颗粒厚度的函数测量对于四种荧光标记的碱基的每一种的每循环的聚簇强度。模式化基底具有间距为850nm的～500nm直径孔。不同的Sn/Au厚度在单一流通池的不同区域上沉积，并且然后退火。在各个通道将不同的膜厚度与对照区域组合允许直接比较来自同一流 通池的不同区域的强度，借此消除化学变异。在每个通道的所有的3个区域观察到聚簇，证实多种尺寸的回流的Sn/Au纳米颗粒支持聚簇化。在图7中示出在循环1和循环26这些区域中归一化的聚簇强度增强(相对于对照)的比较。图6中，顶部的线示出对于6nm颗粒在强度和循环数间的关系，中部的线示出对于玻璃在强度和循环数间的关系，且下部的线示出对于10nm颗粒在强度和循环数间的关系。
这些数据表明在模式化表面的孔中纳米颗粒的沉积在边合成反应边测序期间提供荧光强度的增强。
实施例3
在具有金纳米栓的模式化基底上的增强的荧光
在该实验中，使用沉积在孔的底部的金纳米栓增强纳米孔中的荧光强度。在图8A中示出在纳米孔62中的Au纳米栓60的装配。简而言之，跨越模式化流通池64沉积Au，在各个孔62的底部和在各个间质区域68中产生Au的层66。机械磨光去除沉积在间质区域68上的Au，使Au栓60仅留在孔62的底部。图8B示出得到的纳米栓的SEM图像。在孔的底部观察到实体金(Au)栓，且在壁上和在间质区域中观察到Au纳米颗粒。该简单的结构也使聚簇荧光强度的增强成为可能，如通过在以下描述的测序实验中表明的。
在一些通道中具有纳米栓且具有无Au沉积的对照区域的模式化流通池上进行边合成边测序运行。测量对于四种荧光标记的碱基的每一种的每循环的聚簇强度。图9B概括了针对在纳米孔中的退火的Au纳米栓得到的聚簇强度的增强。这些数据表明孔中的纳米栓增强了信号强度。
多种实施方案利用一个或更多个纳米结构来放大在反应位点的电磁能。对于利用多个纳米结构(例如两个或更多个纳米结构)的实施方案，多个纳米结构可被称为集成放大器。如本文使用的，术语“纳米结构”和“纳米颗粒”可互换使用来指具有在约1nm到约1000nm范围(包括在1nm和1000nm之间的任何整数或非整数值)的最大围度(例如，高度、宽度、直径)的结构。在典型的实施方案中，纳米颗粒是金属颗粒或硅颗粒。在一些实 施方案中，纳米颗粒核心是直径为20-200nm的球形或几乎球形颗粒。在一些实施方案中，范围是约1nm到约50nm(例如约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm或50nm)。
各向异性纳米结构(例如，非球形结构)可具有长度和宽度，或对于一些实施方案，具有直径。在一些实施方案中，各向异性纳米结构的长度是纳米结构的最大维度。在一些实施方案中，各向异性纳米颗粒的长度是与其中产生纳米颗粒的孔穴的平面平行的维度。在一些实施方案中，各向异性纳米颗粒的长度是与其中产生纳米颗粒的孔穴的平面垂直的维度。在各向异性纳米结构的情况下，纳米结构可具有在约50nm到约750nm范围的宽度或直径。在其他实施方案中，纳米结构具有约350nm或更小的宽度或直径。在其他实施方案中，纳米颗粒具有250nm或更小的宽度或直径且在一些实施方案中，100nm或更小的宽度或直径。在一些实施方案中，宽度或直径在15nm到300nm之间。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有约10-750nm的长度。在一些实施方案中，纳米结构具有预选的形状并且可以是例如纳米管、纳米线、纳米球、或包含以上描述的维度的任何形状(例如，二维的三角形、正方形、矩形或多边形形状，或三维的长方体、锥体、圆柱体、球体、铁饼状形状或半球形状)。纳米结构的一些实例包括，例如，领结状纳米天线、纳米球、纳米锥、纳米壳、纳米棒、纳米线、纳米环、纳米栓、纳米光栅等等。纳米结构的预形成的二聚体和三聚体也可以被加载到孔内并且具有精确地控制纳米颗粒间距的优势。
纳米结构可在表面上被制造，或预形成，并然后被加载到反应腔内，诸如孔(例如，纳米孔)。此类结构的实例包括在纳米孔的底部制造的等离子体纳米栓、在纳米孔中的领结状和腔状天线、其上可以形成纳米孔的金 属纳米光栅、在纳米孔内回流的纳米结构或以上的一些或全部的组合。一个实例将是在纳米孔中的金属纳米栓，该纳米孔中在壁上具有通过电子束蒸发过程形成的纳米结构。集成放大器或构建体(二聚体、n聚体)还可被定位在反应腔内。此类方法允许对纳米结构间距的精确亚纳米级控制并且可以使用自下而上的自组装被大规模地形成。
表面上的任何两个纳米结构间的间距可以是任何距离。在一些实施方案中，间距可以是入射光能量的波长的倍数，该入射光能量的波长诸如荧光光谱中特定的发射波长或激发波长。间距可以是例如1λ、2λ、3λ、4λ或选择的入射光能量的波长(λ)的另一个倍数。因此，使用532nm的发射波长(λ)作为实例，纳米结构间的间距可以是约532nm(1λ)、约1064nm(2λ)、或发射波长的另一个倍数。在一些实施方案中，间距可以是入射光能量的波长的分数，该入射光能量的波长诸如荧光光谱中特定的发射波长或激发波长。间距可以是，例如，1λ、1/2λ、1/3λ、1/4λ或选择的入射光能量的波长的另一个倍数。因此，使用532nm的发射波长(λ)作为实例，纳米结构间的间距可以是约532nm(1λ)、266nm(1/2λ)、133nm(1/3λ)或发射波长的另一个分数。
在一些实施方案中，纳米结构可被称作“等离子体纳米结构”或“纳米等离子体结构”。这些术语可互换地使用并且指展示该结构的等离子体共振特性的任何独立的结构，包括(但不限于)纳米结构、纳米结构以及纳米结构的组合或缔合二者。
如本文使用的术语“纳米天线”包括用来放大电磁能诸如光能的一个纳米结构或多个纳米结构(或集成放大器)。如本文使用的，纳米天线(或集成放大器)不必须展示等离子体共振特性。在一些实施方案中，纳米天线基本上不包含等离子体共振材料。因此，在一些实施方案中，提出了由非金属材料制成但展示电磁能的放大特性的纳米天线。本文提出的纳米结构可以是任何合适的形状和尺寸以便产生期望的能量放大。纳米天线的一些示例性形状包括，例如，领结状纳米天线、纳米球、纳米锥、纳米壳、纳米棒、纳米线、纳米环、纳米栓、纳米光栅等等。将理解，许多已知的方法中的任一种可以适合用于在固体支持物上制造和/或沉积纳米天线。用于制造纳 米天线的方法在本领域是已知的，并且包括例如，本文描述的用于纳米颗粒制造和沉积的方法。
纳米结构可以包含任何适合于在本文描述的方法和组合物中使用的材料，例如，任何类型的展示表面等离子体共振(SPR)的材料。在某些优选的实施方案中，纳米颗粒包含等离子体共振材料。实例包括但不限于金属纳米结构。例如，纳米结构可以包含金属，诸如以下的一种或更多种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、或任何其他适合的金属。纳米结构可以从单一的材料，诸如，例如，单一的金属形成。另外地或可选地，纳米结构可以从两种或更多种不同的材料，诸如，例如，两种或更多种金属，的组合形成。例如，纳米结构可以包含金属/金属混合物诸如Sn/Au或Ag/Au。可选地或另外地，可以采用垂直分层的纳米结构，诸如金属-绝缘体-金属类型的多层结构。实例包括p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。在特定的实施方案中，可从等离子体共振材料和/或金属材料涂布的聚合物形成纳米结构。
纳米结构在固体支持物上的形成可以使用本领域已知的许多方法的任何一种来进行。纳米结构可使用等离子体纳米结构和纳米天线在测序基底上的自下而上的自组装来形成。例如，可以使用用于沉积金属层的许多方法的任何一种，诸如由Gaspar等(Scientific Reports,2013,3,1469)描述的那些，其通过引用被并入本文。可被用来形成纳米结构的层制造方法包括光刻、刻蚀、溅射、蒸发、铸造(例如，旋涂)、化学气相沉积、电沉积、外延、热氧化、物理气相沉积等等。在一些实施方案中，可使用阴影技术形成纳米结构。在一些实施方案中，可使用纳米平板印刷技术诸如纳米压印平板印刷术(NIL)形成纳米结构。
在本文描述的示例性实施方案中，纳米结构可以被预形成并且在胶体样组合物中与沉积在表面上的凝胶材料混合。可选地或另外地，纳米结构可以首先被沉积在表面上，随后凝胶材料被沉积在纳米结构上。在其他实施方案中，可以在表面上沉积凝胶材料并且纳米结构被沉积在凝胶材料之上。
在一些实施方案中，纳米结构在固体表面的孔(或凹陷特征)中形成。起始材料诸如Sn/Au的膜可被沉积在含有纳米孔的固体表面上，随后热退火。在一些实施方案中，可以使用热退火以促进纳米结构的形成，因为膜凝结成离散的颗粒。纳米颗粒的尺寸可以是起始膜厚度的函数。热退火之后进一步的磨光步骤可以导致纳米结构仅在孔中同时使间质区域基本上没有纳米结构。基质区域中的纳米结构可通过例如化学和/或机械磨光被去除。在每个纳米孔中观察能够实现广谱荧光增强的纳米颗粒尺寸的分布。
在一些实施方案中，纳米结构诸如纳米环可以沿着表面上的孔(或凹陷特征)的壁形成。纳米结构可以使用本领域已知的许多方法的任何一种来制造。例如，Au可以使用溅射沉积来沉积。在一个实施方案中，～65nm Au层的保形沉积之后可以是反应离子刻蚀(RIE)过程。剩余的Au层沿着纳米孔的壁定位，在每个纳米孔中形成纳米环。
术语“激发光”和“光发射”意味着电磁能，并且被用来区分电磁能的来源。通常从定位于远离反应位点一段距离的光源(例如，激光)提供激发光。例如，对于包括反应腔的实施方案，光源可以定位在反应腔的外部。但是，光发射通常由在反应位点内或反应位点处的发射体产生。发射体可以是例如荧光团。可以配置特定实施方案来放大处于在300nm到750nm间(例如，300nm、301nm、302nm、303nm、304nm、305nm、306nm、307nm、308nm…745nm、746nm、747nm、748nm、749nm、和750nm)的任何波长的电磁能。如本文使用的，术语“波长”将不限于单一波长，除非明确规定了构成“单一波长”或“仅一个波长”。而是术语“波长”将纳入位于约期望的波长或靶波长的窄范围的波长(例如，532nm±10nm、532nm±5nm、660nm±10nm、660nm±5nm)。
每个集成放大器的纳米结构可被相对于彼此配置成以指定的方式来放大电磁能。例如，分隔相应的集成放大器的纳米结构的距离可以基于期望放大的电磁能。集成放大器的纳米结构可被配置用于特定的波长(例如，窄谱带波长)。例如，一个或更多个实施方案可被配置成放大具有532nm的波长的电磁能。一个或更多个实施方案可被配置成放大具有660nm的波长的电磁能。在一些实施方案中，集成放大器可以能够放大多个波长或 较广范围的波长。
在一些实施方案中，集成放大器具有偏振配置以使得来自反应位点的反应基于电磁能的偏振。例如，集成放大器可被配置成优先地响应于具有一个或更多个预定的偏振的电磁能。当集成放大器被具有预定的偏振的电磁能照射时，光发射可以具有大于如果电磁能不具有预定的偏振时的光发射的信号强度的信号强度。例如，当集成放大器被具有预定的偏振的电磁能照射时，光发射可以具有为X的信号强度。在该实施例中，集成放大器可以具有基本上与具有预定的偏振的电磁能平行的偶极矩。如本文使用的，基本平行可以是偏离与偶极矩平行+/-30°。在一些实施方案中，基本平行可以是偏离与偶极矩平行+/-25°或偏离与偶极矩平行+/-20°。在特定的实施方案中，基本平行可以是偏离与偶极矩平行+/-15°或偏离与偶极矩平行+/-10°。在更特定的实施方案中，基本平行可以是偏离与偶极矩平行+/-8°、偏离与偶极矩平行+/-5°、或偏离与偶极矩平行+/-3°。
当集成放大器被不具有预定的偏振的电磁能照射时，光发射可以具有为比当偶极矩基本与电磁能平行时的信号强度0.4X或更少(40％或更少)的信号强度。在该实施例中，集成放大器可具有与具有预定的偏振的电磁能基本垂直的偶极矩。如本文使用的，基本上垂直可以是偏离与偶极矩垂直(90°)+/-30°。在一些实施方案中，基本垂直可以是偏离与偶极矩垂直+/-25°或偏离与偶极矩垂直+/-20°。在一些实施方案中，基本垂直可以是偏离与偶极矩垂直+/-15°或偏离与偶极矩垂直+/-10°。在更特定的实施方案中，基本垂直可以是偏离与偶极矩垂直+/-8°、偏离与偶极矩垂直+/-5°、或偏离与偶极矩垂直+/-3°。
图10是根据一个实施方案形成的结构化基底100的部分的横截面。结构化基底100包括基底主体102，该基底主体102还可被称作固体支持物。基底主体(或固体支持物)102具有活性面104。活性面104包括多个反应位点106和在反应位点106间延伸的侧表面105。如所示的，反应位点106是反应腔或孔(例如，纳米孔)。因此，在下文中反应位点106将被称为反应腔106，但是应当理解，其他实施方案可包括反应位点。反应腔106可具有与本文描述的纳米孔相似的维度。例如，反应腔106可具有沿着横 轴191测量的直径或宽度。反应腔的直径或宽度可以小于5000nm。在一些实施方案中，反应腔的直径或宽度小于4000nm、小于3000nm、小于2000nm、或小于1000nm。在特定的实施方案中，反应腔的直径或宽度小于900nm、小于800nm、小于700nm、或小于600nm。在更特定的实施方案中，反应腔的直径或宽度小于550nm、小于500nm、小于450nm、或小于400nm。还在更特定的实施方案中，反应腔的直径或宽度小于350nm、小于300nm、小于250nm、小于200nm、小于150nm、或小于100nm。本文描述的反应位点可具有相似的直径或宽度。
反应腔106被基底主体102的间质区域118彼此间隔开。间质区域118是沿着活性面104的区域或基底主体102的将反应腔106彼此分隔的区域。侧表面105沿着间质区域118延伸。在一些实施方案中，多个反应腔106形成反应位点106的密集阵列以使得相邻的反应腔106被分隔例如少于1000nm。在更特定的实施方案中，相邻的反应腔106可以被分隔小于900nm、小于800nm、小于700nm、或小于600nm。在更特定的实施方案中，相邻的反应腔106可以被分隔小于500nm、小于400nm、小于300nm、或小于200nm。在更特定的实施方案中，相邻的反应腔106可以被分隔小于150nm、小于100nm、或小于50nm。本文描述的反应位点可具有相似的分隔距离。在一些实施方案中，在相邻反应腔106间的中心-到-中心间距119可以小于1000nm。在更特定的实施方案中，中心-到-中心间距119可以小于700nm、小于600nm、小于500nm、或小于450nm。在更特定的实施方案中，中心-到-中心间距119可以小于400nm、小于350nm、小于300nm、小于250nm、或小于200nm。本文描述的反应位点可具有中心-到-中心间距。
在示出的实施方案中，间质区域118形成连续的、平坦的侧表面105，但是间质区域118在其他实施方案中可以包括非平坦的表面。间质区域118可以包括与反应腔106的材料不同的表面材料，并且可以在功能上使反应腔106彼此隔绝。在示出的实施方案中，仅显示沿着活性面104的两个反应腔106。但是应该理解，反应腔106可以是反应位点的阵列的一部分，反应位点的阵列可以包括上百、上千、或上百万的反应腔(或位点)。
反应腔106通常是沿着活性面104形成洼地或凹陷的凹陷特征。反应腔106可以是，例如，孔、坑、通道、凹处等等。但是，应该理解其他实施方案可包括不定位在腔内的反应位点。例如，反应位点可以沿着平坦的表面分布。此类实施方案被描述于美国临时申请第61/920,244号中，其通过引用以其整体被并入本文。
基底主体102可以从一个或更多个堆叠的层形成。在示出的实施方案中，基底主体102包括基础层112和腔层114。基础层112可以是，例如，玻璃(SiO2)晶片。腔层114可以是聚合物。但是在可选的实施方案中，基底主体102可以包括其他层。
如本文使用的，术语“层”不限于材料的单一连续主体，除非另外指示。例如，每层可以由相同或不同材料的多个子层形成。此外，每层可包括定位在其中或从其延伸的不同材料的一个或更多个特征。可以使用已知的层制造方法，诸如光刻、刻蚀、溅射、蒸发、铸造(例如，旋涂)、化学气相沉积、电沉积、外延、热氧化、物理气相沉积等等形成不同的层。还可使用纳米平板印刷技术诸如纳米压印平板印刷术(NIL)形成一个或更多个层。如本文使用的，术语“工作基底”包括一个或更多个堆叠层，其中至少一个层是正被处理以从工作基底形成结构化基底。工作基底可以形成被配置成接受形成结构化基底的一个或更多个其他元件的固体支持物或基底主体。例如，工作基底可以接受形成结构化基底的纳米颗粒和/或有机材料(例如，凝胶材料)。
如图10中显示的，反应腔具有取自与活性面104垂直的横截面。横截面可以包括扇形截面、线性截面、角度、拐角。通常，反应腔不必完全贯穿通过一个或更多个层。例如，反应腔106中的每个具有至少一个在活性面104和反应腔106的底部表面126间延伸的侧壁124。侧壁124和底部表面126二者被腔层114界定。在可选的实施方案中，基础层112(或其他层)可以界定反应腔106的底部126。
反应腔106开口于活性面104以使得反应腔106沿着活性面104是可进入的。例如，在结构化基底100的制造期间或当结构化基底100在分析期间被使用时，反应腔106可以能够沿着活性面104接收凝胶材料和/或流 体。活性面104还可以接收来自光源(未示出)的激发光108和/或面向检测来自反应腔的光发射110的光学部件(未示出)，诸如物镜。
每个反应腔106可以包括至少一个纳米结构116。间质区域118可以基本没有纳米结构。在图10的示出的实施方案中，每个反应腔106包括多个纳米结构116。但是，应该理解可选的实施方案可以包括仅单个的纳米结构。多个纳米结构116可以形成集成的纳米结构，其在下文中被称作集成放大器120。集成放大器120被定位在每个反应腔106内且被配置成放大传送到相应的反应腔内的电磁能或放大在相应的反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
如本文使用的，“纳米结构的集成”或“集成放大器”包括被配置成放大在离散位点(例如，反应腔)上是入射的电磁能或放大在离散位点处产生的电磁能中的至少一种的多个纳米结构。例如，电磁能可以是从外部环境传送并且进入反应腔106的激发光108，其中激发光被与生物物质缔合的发射体(例如，荧光团)吸收。如另一个实例，电磁能可以是从生物物质发射的光发射110。更具体地，当被激发后，荧光团可以发射电磁能(例如，光发射110)，该电磁能然后被纳米结构的集成120放大。在一些实施方案中，集成放大器120还可以被称为纳米天线，因为纳米结构共同地运作以放大和传输光发射110离开反应位点。
集成放大器可以包括共同运作以放大电磁能的两个或更多个纳米结构。如本文描述的，在一些实施方案中，集成放大器可以被配置成优先地放大一类的电磁能或更具体地，具有预定波长的电磁能。例如，集成放大器对光发射可以具有比对激发光大的放大效应，反之亦然。但是，在一些实施方案中，集成放大器可以放大光发射和激发光二者。
如本文使用的，当集成放大器被“配置成放大电磁能”时，每个纳米结构可以具有一个或更多个特质以使得集成放大器共同地运作以放大电磁能。特质可以包括例如，纳米结构的材料组成、纳米结构的形状、纳米结构的尺寸、和纳米结构相对于集成件中其他纳米结构的位置。例如，相邻的纳米结构116在其间可以具有距离128，距离128被配置成放大被限制在其间的电磁能。不希望受限于特定的理论，在光发射中得到的放大可以 归因于局部的表面等离子体共振和共振能量转移过程的组合。
如在图10中示出的，反应腔106可以包括安置在反应腔106内的有机材料122。有机材料122可以覆盖纳米结构116。在一些实施方案中，有机材料122被配置成在相应的反应腔内保存或固定生物分子。例如，生物分子可以是核酸。
在特定的实施方案中，有机材料122包括凝胶材料，诸如水凝胶。如本文使用的，术语“凝胶材料”意图意指可渗透液体和气体的半刚性材料。典型地，当液体被凝胶材料吸收或被接收时，凝胶材料可以膨胀，且当液体被从凝胶材料去除时(例如，通过干燥)可以收缩。示例性凝胶材料包括但不限于具有以下结构的那些：胶状结构，诸如琼脂糖；聚合物网状结构，诸如明胶；或交联的聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺、SFA(参见，例如，美国专利申请公布第2011/0059865A1号，其通过引用被并入本文)或PAZAM(参见，例如，美国临时专利申请系列第61/753,833号，其通过引用被并入本文)。特别地有用的凝胶材料将顺应该凝胶材料驻留处的反应腔的形状。一些有用的凝胶材料可(a)顺应该凝胶材料驻留处的反应腔的形状且(b)具有基本上不超过该凝胶材料驻留处的反应腔的容积的体积二者。
在特定的实施方案中，有机材料122具有被配置成容纳仅单个生物分子(例如，核酸)的容积，以使得空间排斥阻止多于一个生物分子被捕获或播种反应腔。对于核酸分子，空间排斥可以是特别地有用的。更具体地，反应腔可以暴露具有等于或小于待播种在基底上的靶核酸的排斥体积的直径的区域的有机材料(例如，凝胶材料)的表面。靶核酸的排斥体积和其直径可以被确定，例如，从靶核酸的长度确定。用于确定核酸的排斥体积和排斥体积的直径的方法描述于，例如，美国专利第7,785,790号；Rybenkov等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5307-5311(1993)；Zimmerman等，J.Mol.Biol.222:599-620(1991)；或Sobel等，Biopolymers 31:1559-1564(1991)中，其每个通过引用被并入本文。空间排斥的条件陈述于美国系列第13/661,524号和美国专利第7,785,790号中，其每个通过引用被并入本文，并且可被容易地用于本公开内容的结构化基底。
在一些实施方案中，诸如利用空间排斥的实施方案，靶核酸的文库可 在扩增过程起始之前被递送到包含凝胶材料的反应腔。例如，靶核酸可在用靶核酸播种在基底中的凝胶材料的条件下，被递送到结构化基底。结构化基底可被任选地洗涤以去除未播种到凝胶材料的靶核酸以及对于随后加工或使用结构化基底不需要的任何其他材料。
但是，将被理解在其他实施方案中，暴露的凝胶材料的区域基本上可以大于被运送到扩增位点的靶核酸的排斥体积的直径。因此，特征的区域可以足够大而不发生空间排斥。
回到图10，在一些实施方案中，纳米结构116沿着基础层112形成，以使得纳米结构116从基础层112突出并且进入反应腔106。在一些实施方案中，纳米结构116延伸通过腔层114的一部分。在其他实施方案中，底部表面126可被基础层112的部分界定，以使得纳米结构116不延伸通过腔层114。图10中还示出，流罩135可被安装到基底主体102。
在由检测器检测光发射的方案期间，光发射可响应于激发光108来产生。在可选的实施方案中，不提供激发光108且，反而，激发光108由与生物分子129偶联的发射体产生。在一些实施方案中，增益场(gain field)130沿着纳米结构116的一个或在两个或更多个纳米结构116之间存在。增益场130可代表由纳米结构116响应于激发光和/或光发射产生的高强度电场的空间。对于一些应用，纳米结构116放大激发光108以使得发射体被激发光激发并且提供较大的信号强度用于检测。在其他应用中，纳米结构116不放大激发光108，但放大光发射110以使得光发射110发射提供较大的信号强度用于检测。但是，在一些应用中，纳米结构116可以能够放大激发光108和光发射110二者以使得发射体经历较大强度的激发光108并且由发射体提供较大强度的光发射110。因此，本文陈述的实施方案可以提供较大的信号强度，其与已知的不包括纳米结构或集成放大器的系统相比更容易被成像系统或装置检测。
本申请描述了多种用于制造或制作可用来检测或分析指定的反应的结构化基底的方法。附图中示出了至少一些方法如多个步骤。但是，应该理解实施方案不限于附图中示出的步骤。可以省略步骤、可以修改步骤、和/或添加其他步骤。通过实例的方式，虽然本文描述的一些实施方案可以 包括仅两层，其他的实施方案可以包3层、四层、或更多层。此外，本文描述的步骤可被组合，步骤可被同时(simultaneously)进行，步骤可被并行(concurrently)进行，步骤可被分成多个子步骤，步骤可被以不同的顺序进行，或步骤(或一系列的步骤)可以以迭代的方式再次进行。另外，尽管本文陈述了不同的方法，应该理解在其他实施方案中不同的方法(或不同方法的步骤)可被组合。
结构化基底可以使用可被用来例如在微制造期间制造集成电路和/或制造纳米技术的一种或更多种方法来形成。平板印刷(例如，光刻)是一种可被用来制造本文描述的结构化基底的技术或方法。在特定的实施方案中，使用纳米压印平板印刷技术(NIL)形成一个或更多个层。示例性平板印刷技术或方法在Marc J.Madou,Fundamentals of Microfabrication and Nanotechnology: Manufacturing Techniques for Microfabrication and Nanotechnology，卷II，第3版，第I部分(2-145页)中被更详细地描述，其通过引用以其整体被并入本文。
用于制造结构化基底的一种或更多种方法还可以包括其中从工作基底去除材料的消减技术。此类方法包括化学技术，诸如干化学蚀刻、物理/化学蚀刻、气相蚀刻、化学加工(CM)、各向异性湿化学蚀刻、湿光刻法；电化学技术，诸如电化学蚀刻(ECM)、电化学磨削(ECG)、光电化学蚀刻；热技术，诸如激光加工、电子束加工、电子放电加工(EDM)；和机械技术，诸如物理干蚀刻、溅射蚀刻、离子铣削、喷水加工(WJM)、磨料喷水加工(AWJM)、磨料喷射加工(AJM)、磨料磨削、在线电解修整(electrolytic in-process dressing,ELID)磨削、超声波钻探、聚焦离子束(FIB)铣削等等。以上的列表不意图限制，并且可以使用其他消减技术或方法。示例性消减技术或方法在Marc J.Madou,Fundamentals of Microfabrication and Nanotechnology:Manufacturing Techniques for Microfabrication and Nanotechnology，卷II，第3版，第II部分(148-384页)中被更详细地描述，其通过引用以其整体被并入本文。
用于制造结构化基底的一种或更多种方法还可以包括其中向工作基底添加材料的添加技术。此类方法包括物理气相沉积(PVD)、蒸发(例如， 热蒸发)、溅射、离子镀、离子簇束沉积、脉冲激光沉积、激光烧蚀沉积、分子束外延、化学气相沉积(CVD)(例如，大气压力CVD(APCVD)、低压CVD(LPCVD)、极低压CVD(VLPCVD)、超高真空CVD(UHVCVD)、金属有机CVD(MOCVD)、激光辅助化学气相沉积(LCVD)、等离子体增强CVD(PECVD)、原子层沉积(ALD))、外延(例如，液相外延、固相外延)、阳极化处理、热喷涂沉积、电镀、植入、扩散、在熔体中掺入、热氧化、激光溅射沉积、反应注射成型(RIM)、自组装单层(SAM)、溶胶-凝胶添加、旋涂、聚合物喷涂、聚合物干膜层压、铸造、等离子体聚合、丝网印刷、喷墨印刷、机械微点、微接触印刷、立体平板印刷或微光形成、电化学形成过程、电沉积、喷雾热解法、激光束沉积、电子束沉积、等离子体喷涂沉积、微成型、LIGA(x-射线平板印刷、电沉积和成型的德文首字母缩写)、压缩成型等等。以上的列表不意图限制，并且可以使用其他添加技术或方法。示例性添加技术或方法在Marc J.Madou，Fundamentals of Microfabrication and Nanotechnology:Manufacturing Techniques for Microfabrication and Nanotechnology，卷II，第3版，第III部分(384-642页)中被更详细地描述，其通过引用以其整体被并入本文。如本文使用的，术语“示例性实施方案”意指作为一个实例的实施方案。该术语不指示该实施方案比其他实施方案更优选。
图11是显示制造结构化基底的方法200的流程图。方法200包括在202提供具有基础面的基础层(或工作基底)。基础层可以是材料的仅单一层或包括一个或更多个子层。基础面可以具有被配置成具有直接地沉积于其上的另一层的平坦的表面。但是，构思了基础面可在与其他层合并之前包括非平面特征。在特定的实施方案中，基础层包括玻璃(SiO2)晶片，但可以使用其他材料。
方法200还可以包括在204沿着基础层的基础面形成纳米结构的阵列。在204，形成可以包括多个加工步骤。例如，在204，形成可以包括提供(例如，通过沉积、生长、或另一种添加技术)沿着基础层的基础面的特征层。在204，形成可包括塑造(例如，通过蚀刻或另一种消减技术)基础层的子层以形成纳米结构。子层还可以被称为特征层因为纳米结构可从子 层形成。特征层可以包括能够被塑造成可至少部分地形成纳米结构的基础的单独特征的材料。材料可以包括纯材料(例如，金)或材料的合金。特征层还可以包括在彼此旁边堆叠的材料(例如，金和铬)的多个子层。任选地，一个或更多个材料是等离子体共振材料。
在特定的实施方案中，在204，形成包括蚀刻特征层以形成纳米主体。纳米主体可被排列在子阵列或集合中，其中每个子阵列(或集合)可以变成集成放大器。在一些实施方案中，从蚀刻过程形成的纳米主体可以构成能够放大电磁能的纳米结构，不需进一步修饰。但是，在其他实施方案中，进一步的加工步骤可以是形成纳米结构必需的。例如，特征层可以包括可以被塑造以形成用于构建纳米结构的纳米主体的聚合物(或不是等离子体共振材料的其他材料)。一薄层或薄膜随后可以被添加到纳米主体的外表面以形成纳米结构。又还在其他实施方案中，纳米结构可以被局部地放置在选择的位置。
在一些实施方案中，纳米结构可以与如以下参考文件中描述的方式类似，和/或以如以下参考文件中描述的类似的方式形成。Li,Zhipeng，等“Multiple-particlenanoantennas for enormous enhancement and polarization control of lightemission.”Acs Nano 3.3(2009):637-642；Bharadwaj,Palash，等“Optical Antennas”Advances in Optics and Photonics 1,438–483(2009)；Boltasseva,Alexandra.“Plasmonic components fabrication via nanoimprint.”Journal of Optics A:Pureand Applied Optics 11.11(2009):Kinkhabwala,Anika，等“Large single-moleculefluorescence enhancements produced by a bowtie nanoantenna.”Nature Photonics3.11(2009):654-657；Bakker,Reuben M.，等“Nanoantenna array-induced fluorescenceenhancement and reduced lifetimes.”New Journal of Physics 10.12(2008)；Liang,Chia-Ching，等“Plasmonic metallic nanostructures by direct nanoimprinting ofgold nanoparticles.”Optics express 19.5(2011):4768-4776；Olmon,Robert L.，和Markus B.Raschke.“Antenna–load interactions at optical frequencies:impedancematching to quantum systems.”Nanotechnology 23.44(2012)；Krasnok,Aleksandr E.，等“Optical nanoantennas.”Physics-Uspekhi 56.6 (2013)，以上的每一个参考文件通过引用以其整体被并入本文。
方法200还包括在206沿着基础层的基础面形成腔层。腔层被配置成包括反应腔。对于不包括反应腔的实施方案，腔层可以被称为位点层。如本文使用的，措辞“沿着基础面”或“沿着基础层”包括腔层与基础层直接接触或包括腔层与基础层被一个或更多个中间层分隔。如本文使用的，空间地相对术语，诸如“上部”、“之上(above)”、“之下”等等在本文用于方便描述以将一个元件或特征与另一个区分开。空间地相对术语在使用或操作期间，不需要结构化基底具有相对于重力的特定的方向。例如，在一些实施方案中，结构化基底的活性面可以面向与重力方向相反的方向。可选地，在其他实施方案中，结构化基底的活性面可以面向与重力方向相同的方向。最上面的表面诸如在操作期间液体沿着其流过的侧面可被称作上表面，不管结构化基底相对于重力的方向如何。
在206，形成可以包括提供被配置成具有反应腔的阵列的腔层。在206，形成可包括多个步骤。在一些实施方案中，腔层包括预形成的反应腔。每个反应腔可以与纳米结构的相应的子阵列或集合(例如，两个或更多个纳米结构)对齐。任选地，腔层可以被蚀刻以去除腔层的一部分并且暴露在相应反应腔内的纳米结构。
在其他实施方案中，当腔层被定位在基础层之上并且与基础层偶联时，反应腔可以被塑造。例如，在纳米结构形成后，NIL材料可沿着基础层的基础面沉积并且覆盖纳米结构。可使用例如旋涂技术或通过沿着基础面沉积液滴沉积NIL材料。NIL材料可以包含能够使用NIL技术被压印的材料。例如，NIL材料可以包含聚合物。然后，NIL材料可用具有形成在NIL材料中的反应腔的特征的模式的模具(也被称为模板)压印或模压。在一些实施方案中，模具是透明的以允许紫外光(UV)或可见光穿过其传播。在此类实施方案中，NIL材料可以包含当模具被压入NIL材料时被UV或可见光固化的光固化材料。因此，NIL材料可以固化(cure)(例如，硬化(harden))以形成反应腔。该过程可以与步进和闪光压印平板印刷(SFIL)相同或类似。在其他实施方案中，可通过应用热能和/或压力NIL固化材料。NIL技术和相似的方法在Marc J.Madou,Fundamentals of Microfabrication and Nanotechnology:Manufacturing Techniques for Microfabrication and Nanotechnology，卷II，第3版，第I部分(113-116页)和Lucas等“Nanoimprint LithographyBased Approach for the Fabrication of Large-Area,Uniformly Oriented PlasmonicArrays”Adv.Mater.2008,20,1129–1134中描述，其每个通过引用以其整体并入本文。
每个反应腔可以与纳米结构的相应的子阵列对齐。NIL材料可被优选地蚀刻以暴露在相应反应腔内的多个纳米结构。不管制造的方法如何，纳米结构的子阵列可以形成相应反应腔的集成放大器。集成放大器被配置成放大传送到相应的反应腔内的电磁能或放大在相应的反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
任选地，方法200还可以包括在208在反应腔内提供有机材料。有机材料可以覆盖纳米结构。在一些实施方案中，有机材料跨越包括间质区域在内的活性面被提供。然后，通过磨光活性面有机材料可被去除。当活性面被磨光后，每个反应腔可以包括与其他反应腔的其他有机材料分隔的相应的有机材料。在特定的实施方案中，有机材料是凝胶材料诸如本文描述的那些(例如，PAZAM、SFA或其化学修饰的变体，诸如叠氮化形式的SFA(azido-SFA)。
方法200还可以包括另外的步骤，诸如制备与指定方案的流体和样品相互作用的结构化基底的表面。作为另一实施例，方法200可以包括，在210，将流罩安装至腔层的活性面。流罩可以界定在流罩和活性面间的流体通道。包括流罩的实施方案在美国临时申请第61/914,275号和国际申请第PCT/US14/69373号中被描述，其每个通过引用以其整体被并入本文。
图12示出了制造结构化基底280(在图14中示出)的方法220的流程图。方法220参考图13和图14来描述。方法220可以包括一个或更多个与方法200的步骤(图11)相似或相同的步骤。方法220包括在222提供具有基础面242的基础层(或工作基底)240。方法220还包括在224沿着基础面242形成纳米结构246的阵列244。例如，特征层245可以被提供至基础层240的基础面242(例如，通过沉积过程)。特征层245可以被蚀刻以形成纳米结构246的阵列244。阵列244可以包括纳米结构246的子阵列248。 图13中还示出，相邻的子阵列248沿着基础面242被间距250分隔。
每个子阵列248可以包括当结构化基底280(图14)完全形成时，共同地形成集成放大器的多个纳米结构246。例如，每个子阵列248的纳米结构246可被按大小排列、塑造和相对于彼此定位以使得纳米结构246放大电磁能。在示出的实施方案中，纳米结构246被示出为具有共同的形状和尺寸的垂直的柱。但是，应该理解纳米结构246在其他实施方案中可以具有不同的形状。在一些实施方案中，集成放大器可以具有纳米结构246的基本相同的排列。如本文使用的“基本相同”意指如果没有制造公差(manufacturing tolerances)，排列将是相同的。但是，在其他实施方案中，单个子阵列248的纳米结构246不需要具有相同的形状和/或相同的尺寸。
在226，NIL材料252可沿着基础层240的基础面242来提供。NIL材料252可以覆盖纳米结构246的阵列244。NIL材料252可以是粘性材料以使得NIL材料252包围并且填充在纳米结构246之间的空的空间。NIL材料252可以包含例如聚合物。在示出的实施方案中，NIL材料252作为沿着基础面242的NIL层来提供。在其他实施方案中，当在压印操作期间被压缩时，NIL材料可以作为大量的离散液滴来提供，以有效地覆盖至少部分的基础面242。
在228，反应腔256的阵列254可以被压印入NIL材料252。在228，压印可以包括将模具258NIL应用至材料252。模具258可以具有包括特征的模式的非平面的面260。特征被按大小排列、塑造和相对于彼此定位来以预定的方式塑造NIL材料252，以使得反应腔256被形成。当模具258被应用于NIL材料252时，形成包括模具258、NIL材料252、纳米结构246和基础层240的堆叠的组合件262。
在228，压印还可以包括固化NIL材料252以凝固(solidify)NIL材料252的形状。例如，固化过程可以包括将UV光或可见光264应用至堆叠的组合件262。NIL材料252可以包含在被暴露于UV或可见光264后能够凝固的光聚合物。但是，可以使用凝固或固化NIL材料252的可选方法。例如，可应用热能(例如，加热)或压力于NIL材料252以凝固NIL材料252并且形成反应腔256。
关于图14，在固化过程后，NIL材料变成具有反应腔256的阵列254的凝固的NIL层253。凝固的NIL材料253可以构成腔层，诸如包括反应腔256的腔层114(图10)。每个反应腔256可以与纳米结构246的相应的子阵列248对齐，以使得反应腔256在相应的子阵列248之上被定位。如图13中示出的，纳米结构246可被定位在凝固的NIL层253的填充区域266内。填充区域266包括被NIL层253的凝固的材料包围的纳米结构246。在此阶段，填充区域266可以界定反应腔256的底部表面268。在此阶段，还示出反应腔256可被在反应腔256间延伸的间质区域270分隔。
方法220还可以包括在230去除填充区域266以暴露在相应的反应腔256内的至少部分的纳米结构246。例如，一个优选的蚀刻方法可被应用以去除包围纳米结构246的NIL层253的材料，而基本不损害或去除纳米结构246。在230，在去除期间，每个反应腔256的底部表面268可被降低以使得底部表面268接近基础层240。在一些实施方案中，在填充区域266内的NIL层253可被完全蚀刻，以使得基础层240形成底部表面268的至少一部分。在其他实施方案中，与图10的结构化基底100相似，在蚀刻过程后，NIL层253的一部分可以保留。在此类实施方案中，纳米结构246可以延伸通过NIL层253(或腔层)。在去除期间，在230，如所示的，间质区域270也可被蚀刻以使得间质区域270相对于基础层240的高度被降低。高度从271A降低到271B。
如以上描述的，在每个反应腔256内的纳米结构246可以形成相应的反应腔256的集成放大器272。集成放大器272被配置以放大传送到相应的反应腔内的电磁能或放大在相应的反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
结构化基底280在图14的底部示出。结构化基底280包括活性面282，并且具有反应腔256和分隔反应腔256的间质区域270。任选地，方法200可以包括在232在反应腔256内提供有机材料274。在提供机材料274前，工作基底可被加工用于接收有机材料274。例如，钝化层(例如，氧化钽等等)并且硅烷层可被提供到钝化层上。钝化层和硅烷层二者可覆盖纳米结构246。在232，提供可以包括将有机材料旋涂到工作基底上。但是，还可以 使用其他添加技术。任选地，具有钝化层、硅烷层和有机材料的工作基底可被孵育。
如在图14中示出的，有机材料274可以覆盖在反应腔256内的纳米结构246。在一些实施方案中，有机材料274跨越整个活性面282来提供，以使得有机材料274覆盖间质区域270的表面。然后，可通过磨光活性面282去除有机材料274。在活性面282被磨光后，每个反应腔256可以在其中包括与在相邻反应腔256中的有机材料274分离的有机材料274。在每个反应腔256内的有机材料274包围集成放大器272的纳米结构246。有机材料274可被配置成支撑和/或保存能够提供光发射的生物或化学物质，诸如染料标记的核酸。
图15是显示制造或制作结构化基底的方法300的流程图。在一些实施方案中，方法300包括与方法200(图11)和220(图12)的步骤相似或相同的步骤。方法300的不同阶段在图16中示出。方法300可以包括在302提供具有基础面322的基础层(或工作基底)320，以及在304，沿着基础层320的基础面322提供NIL材料324。在一些实施方案中，NIL材料324可作为NIL层被提供。在其他实施方案中，NIL材料324可作为沿着基础面322的独立的液滴来提供。
方法300还可以包括在306压印NIL材料324。压印之后，NIL材料324可以是具有基础部分326(由虚线指示)和从基础部分326突出的纳米主体330的阵列328的凝固的NIL材料324。阵列328可以包括多个子阵列329。基础部分326在相邻的纳米主体330间延伸。如此，纳米主体330中的每个可以是同一模式化层的部分。纳米主体330可具有多种形状。在示出的实施方案中，纳米主体330是远离NIL层324的基础部分326突出的细长的柱。在可选的实施方案中，压印之后不形成基础部分326。反而，压印之后可以形成仅纳米主体330。任选地，基础部分326可被蚀刻。
方法300还可以包括在308沿着NIL材料324提供等离子体共振层334，且特别的纳米主体330。在308，提供还可以被称为沉积或生长。在一些实施方案中，等离子体共振层334可以是薄膜或涂层。在308，可使用一种或更多种技术执行提供。例如，在308，提供可以包括PECVD、 ALD、蒸发、溅射、旋涂等等中的至少一种。等离子体共振层334包括覆盖纳米主体330的等离子体共振材料(例如，金、银、硅等等)。等离子体共振层334可以覆盖整个NIL层324。在其他实施方案中，等离子体共振层334可在子阵列329之上被选择性地沉积。因此，可形成纳米结构322，其中每个纳米结构322包括单独的纳米主体330和等离子体共振层334的覆盖或包围单独的纳米主体330的部分。
任选地，方法300可以包括在310，提供钝化层336。钝化层336被配置成保护在下面的层，诸如等离子体共振层334免受在使用结构化基底期间的损害。钝化层336可与在美国临时申请第61/914,275号和国际申请第PCT/US14/69373号中描述的钝化层的一个或更多个类似，其每个通过引用以其整体被并入本文。
还任选地，方法300可包括在312提供固定层，在下文称作硅烷层(未示出)。硅烷层(或固定层)可被配置成有利于在有机材料和/或生物物质或化学物质间的偶联。举例而言，在312提供可以通过蒸汽沉积完成。在一些实施方案中，硅烷层可在其他加工步骤后被提供。在该阶段，基础层320、NIL324、等离子体共振材料334、钝化层336和任选的硅烷层可以形成具有操作面341的工作基底339。
在314，方法300可以包括沿着操作面341形成包括多个反应腔340的腔层338。在一些实施方案中，腔层338可使用例如NIL技术形成，其中NIL材料被压印并且固化以形成反应腔340。但是，可使用其他添加技术提供腔层338。图16中示出仅单个反应腔340，但是应该理解可以形成反应腔340的阵列。
如果使用NIL方法形成腔层338，纳米结构332间的空的空间可用NIL材料324填充。如以上关于方法220描述的，NIL材料324可通过优选的蚀刻被去除。任选地，硅烷层可在沿着工作基底339形成腔层338和反应腔340之后来提供。在NIL材料被去除后，纳米结构332的集成放大器342可在相应的反应腔340内形成。在316，可将有机材料提供至反应腔340。
在示出的实施方案中，使用NIL方法形成腔层338。但是，应该理解可以使用其他添加和任选地消减方法(诸如以上描述的那些)来形成腔层 338。
图17-19示出了可以与用一个或更多个实施方案实施的不同的纳米结构。但是，在图17-19中示出的纳米结构仅是示例的，并且不意图限制。可在可选的实施方案中使用其他纳米结构。在图17A-17D中，纳米结构定位在相应的圆柱形反应腔内。在其他实施方案中，反应腔可具有不同的形状。例如，反应腔的横截面可以是椭圆形、正方形、矩形、其他多边形的形状等等。又在其他实施方案中，纳米结构可以沿着平坦的表面被定位。
图17A是还可被称作纳米孔的反应腔404中纳米栓402的透视图。纳米栓402可包含金(Au)。在示出的实施方案中，纳米栓402在反应腔404中在中间定位，但是其在其他实施方案中可具有其他的位置。图17B是可在一个或更多个实施方案中使用的领结状天线406的透视图。领结状天线406包括两个单独的纳米结构408，其在形状上是三角形的并且指向彼此其间具有小间隙。领结状天线406可以形成集成放大器。图17C示出反应腔412中包括一系列空间上分离的横梁(beam)的411的纳米光栅410。纳米光栅410可在较低的层形成，并且随后当在纳米光栅410之上形成反应腔412时，纳米光栅410被暴露。如示出的，纳米光栅410未被限制在反应腔412内，且延伸超过反应腔412的壁。图17D示出安置在反应腔416内的多个纳米颗粒414。纳米颗粒414可分布在反应腔416内的随机位置。纳米颗粒414可通过例如回流或沉积方法来形成。图17E示出二聚体420和三聚体422。二聚体420和三聚体422可被单独安置在无其他纳米结构安置在其内的单个反应腔内(未示出)。可选地，二聚体420和三聚体422可共享共同的反应腔。任选地，二聚体420和三聚体422不被安置在反应腔内，并且反而沿着平坦的表面分布(未示出)。
图18A-18D示出具有安置在其内的纳米结构的反应腔的侧截面。反应腔可以是例如圆柱形或矩形。图18A中，显示包括多个纳米结构432的反应腔430。纳米结构432可以是圆柱形或正方形的柱。图18B中，显示包括多个纳米结构436的反应腔434。纳米结构436可以是圆锥形或锥体。图18C中，显示包括多个纳米结构440的反应腔438。纳米结构440中的每一个可以是圆锥形或锥体并且具有安置在纳米结构440的顶部的颗粒部 分442(例如，金颗粒)。图18D中，显示包括多个纳米结构446的反应腔444。纳米结构446构成面向彼此的侧壁。
图19A-19D示出具有安置在其内的一个或更多个纳米结构的反应腔的设计图。更具体地，图19A示出包围中心轴452的纳米环450。纳米环450在图19A中是圆形的，但在其他实施方案中可具有其他形状(例如，多边形的)。图19B图解了相对于彼此安置的五个柱454。图19C和19D分别示出领结状天线456、458。领结状天线456、458被配置成优先地响应不同的光偏振。
在图17A-7C、18A-18D和19B-19D的每一个中，纳米结构可被配置成形成相应的方向依赖的集成放大器以使得集成放大器优先地响应指定方向的偏振光。此类集成放大器可被称作偏振放大器。例如，集成放大器可被配置成具有基本与指定偏振的激发光平行的偶极矩。由具有此类偏振放大器的反应腔提供的光发射的量取决于激发光的偏振。
在其他实施方案中，集成放大器可被配置成优先地响应预定波长的光发射。例如，如果发射体提供等于或接近预定的波长的光发射，集成放大器可以放大光发射。但是，如果发射体提供不等于或不接近预定的波长的光发射，集成放大器可仅部分地放大光发射或以可忽略的量放大光发射。
因此，本申请描述了多种实施方案和可与实施方案一起使用的一个或更多个方面(例如，特征)。应该理解多个方面在特定的实施方案中可被组合和/或进一步修改。
多个实施方案包括纳米结构。在一些实施方案中，纳米颗粒可包括在孔内的二聚体或三聚体。在一些实施方案中，纳米结构可包括领结状纳米天线。在一些实施方案中，纳米结构可包括纳米棒。在一些实施方案中，纳米结构可包括纳米环。在一些实施方案中，纳米结构可包括纳米栓。在一些实施方案中，纳米结构可包括纳米光栅。
任选地，纳米结构可包含等离子体共振材料。在特定的实施方案中，纳米结构可包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、 铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
在一个实施方案中，提供了结构化基底，所述结构化基底包括：(a)多个纳米颗粒，所述多个纳米颗粒分布于固体支持物上；(b)凝胶材料，所述凝胶材料形成与多个纳米颗粒缔合的层；以及(c)在凝胶材料中的靶核酸的文库。
在另一个方面，凝胶材料可以覆盖纳米颗粒。
在另一个方面，固体支持物可以包括流通池的表面。
在另一个方面，固体支持物可以包括具有多个孔的平坦的表面，纳米颗粒分布所述多个孔内。
在一个实施方案中，提供了制造结构化基底的方法。方法包括：(a)提供包含平坦的表面的固体支持物；(b)将多个纳米颗粒分散在固体支持物的表面上；以及(c)用凝胶材料涂布固体支持物的至少一部分，从而形成覆盖多个纳米颗粒的凝胶层。
在该实施方案的一个方面，纳米颗粒可以由等离子体共振材料形成。
在另一个方面，步骤(b)和步骤(c)可以同时进行。
在另一个方面，步骤(b)可在步骤(c)之前进行。
在另一个方面，方法还包括(d)将靶核酸的文库递送到凝胶材料以产生在凝胶材料中的核酸特征的阵列。任选地，每个特征可以包括不同的核酸种类。
在一个实施方案中，提供了检测核酸的方法。方法包括：(a)提供包含多个纳米颗粒的固体支持物；凝胶材料，所述凝胶材料形成覆盖多个纳米颗粒的层；和在凝胶材料中的靶核酸的文库；(b)使固体支持物与结合靶核酸的至少一种荧光标记的探针接触；以及(c)检测在固体支持物上的荧光信号以辨别结合至少一种探针的靶核酸。
在该实施方案的一个方面，纳米颗粒可以由等离子体共振材料形成。例如，纳米颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：银、金、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
在另一个方面，固体支持物可以包括流通池的表面。
在另一个方面，固体支持物可以包括具有多个孔的平坦的表面。纳米颗粒可以在多个孔中分布。
在另一个方面，荧光标记的探针可以包括荧光标记的核苷酸。
在另一个方面，荧光标记的探针可以包括荧光标记的寡核苷酸。
在另一个方面，检测操作(即，检测)包括检测寡核苷酸探针与每个特征内的靶核酸的杂交。
在另一个方面，检测操作(即，检测)包括检测核苷酸或寡核苷酸探针至每个特征内的靶核酸的掺入。
在一个实施方案，提供了包括具有表面的固体支持物的阵列。表面包括多个孔。孔被间质区域彼此分隔。阵列还包括在所述多个孔的每一个中的多个纳米结构。
在该实施方案的一个方面，纳米结构可以是等离子体纳米结构。
在另一个方面，纳米结构可以位于孔的底部。
在另一个方面，纳米结构可以沿着孔的壁定位。
在另一个方面，间质区域可以基本上没有纳米结构。
在另一个方面，纳米结构可包括纳米颗粒。
在另一个方面，纳米颗粒可具有大于10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或大于100nm的直径。在另一个方面，纳米颗粒可具有小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或小于10nm的直径。
在另一个方面，孔可以包括凝胶材料。任选地，凝胶材料包括水凝胶。
在另一个方面，固体支持物可以包括流通池的表面。
在一个实施方案中，提供了一种制造阵列的方法。方法包括获得包含平坦的表面的固体支持物。表面包括多个孔。孔被间质区域彼此分隔。方法还可以包括在固体支持物上涂布金属膜并且使金属膜经历热退火过程， 从而在所述多个孔中的每一个中形成多个等离子体纳米结构。
在该实施方案的一个方面，方法还可以包括磨光平坦的表面以从间质区域基本去除纳米结构且保持在孔中的纳米结构。
在另一个方面，方法还可以包括用凝胶材料涂布固体支持物的至少一部分，从而在多个孔中沉积凝胶材料。
在一个实施方案中，提供了一种检测核酸的方法，所述方法包括(a)提供包含平坦的表面的固体支持物，表面包含多个孔，孔被间质区域彼此分隔；在所述多个孔的每一个中的多个纳米结构；凝胶材料，所述凝胶材料形成覆盖所述多个纳米结构的层；和在凝胶材料中的靶核酸的文库；所述方法还包括(b)使固体支持物与结合靶核酸的至少一种荧光标记的探针接触以及(c)检测在固体支持物上的荧光信号以辨别结合至少一种探针的靶核酸。
在该实施方案的一个方面，纳米结构可以是等离子体纳米结构。
在另一个方面，纳米结构可以位于孔的底部。
在另一个方面，纳米结构可以沿着孔的壁定位。
在另一个方面，间质区域可以基本上没有纳米结构。
在另一个方面，纳米结构可以包括纳米颗粒。
在另一个方面，纳米颗粒可具有大于10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或大于100nm的直径。
在另一个方面，纳米颗粒可具有小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或小于10nm的直径。
在另一个方面，凝胶材料可以包括水凝胶。
在另一个方面，平坦的表面可以包括流通池的表面。
在另一个方面，荧光标记的探针可以包括荧光标记的核苷酸。
在另一个方面，荧光标记的探针可以包括荧光标记的寡核苷酸。
在另一个方面，检测可以包括检测寡核苷酸探针与每个特征中的靶核 酸的杂交。
在另一个方面，检测可以包括检测核苷酸或寡核苷酸探针至每个特征中的靶核酸的掺入。
在一个实施方案中，提供了包括具有活性面的基底主体的结构化基底。基底主体包括沿着活性面开口的反应腔和分隔反应腔的间质区域。结构化基底还包括定位在每个反应腔内的集成放大器。集成放大器包括多个纳米结构，所述集成放大器被配置成放大传送到相应的反应腔内的电磁能或放大在相应的反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
在该实施方案的一个方面，对于每个集成放大器的纳米结构具有相对于相应集成放大器的其他纳米结构的预定位置。任选地，集成放大器具有基本相同排列的纳米结构。
在另一个方面，活性面可以包括沿着间质区域延伸的侧表面。侧表面可以是基本平坦的。反应腔开口于侧表面。
在另一个方面，结构化基底可以包括安置在反应腔内并且覆盖纳米结构的有机材料。有机材料可被配置成在相应的反应腔内保存生物分子。
任选地，有机材料包括凝胶材料。任选地，有机材料包括水凝胶。
任选地，有机材料具有被配置成容纳仅单个生物分子的容积，以使得空间排斥阻止多于一个生物分子被捕获或播种反应腔。
任选地，有机材料对于液体是可渗透的，并且被配置成附接核酸。
在另一个方面，基底主体可包括具有从其突出的纳米结构的基础层。基底主体还可以包括相对于基础层堆叠的腔层。腔层被塑造成包括反应腔。
任选地，纳米结构从基础层延伸，通过腔层的一部分，并且进入相应的反应腔。
在另一个方面，在集成放大器中的纳米结构具有放大传送入相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种的材料组成、形状和相对于集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
在另一个方面，集成放大器中的纳米结构具有放大在相应反应腔内产生的电磁能的材料组成、形状和相对于集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
任选地，电磁能包括荧光发射。
在另一个方面，集成放大器中的纳米结构具有放大传送到相应反应腔内的电磁能的材料组成、形状和相对于集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
任选地，激发光或光发射的波长在300纳米(nm)和750nm之间。
在另一个方面，每个纳米结构可包括包含纳米压印平板印刷(NIL)材料的纳米主体和包围纳米主体的外层。在一些实施方案中，外层可包括等离子体共振材料。在特定的实施方案中，外层可包括以下的至少一种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
任选地，钝化层可在纳米主体上延伸。
在另一个方面，结构化基底还包括与基底主体偶联的装置罩以在基底主体的活性面和装置罩之间形成流体通道，流体通道被配置成引导通过其液体的流流入反应腔内。
在另一个方面，反应腔具有相应的底部表面。纳米结构从相应反应腔的底部表面突出朝向活性面。
在另一个方面，每个反应腔被在活性面和反应腔的底部表面间延伸的至少一个侧壁界定。纳米结构形成至少一个侧壁的至少一部分。任选地，纳米结构从相应反应腔的底部表面突出。
在另一个方面，间质区域基本上没有纳米结构。
在另一个方面，纳米结构可具有沿着纵轴(elevation axis)朝向活性面延伸的高度，高度是至少10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。
在另一个方面，纳米结构可具有沿着纵轴向活性面延伸的高度，纳米 结构具有取自与纵轴横切的横截面维度，横截面维度是至少10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。
在另一个方面，纳米结构可具有沿着纵轴朝向活性面延伸的高度，纳米结构具有取自与纵轴横切的横截面维度，横截面维度小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或10nm。
任选地，横截面维度可以是直径。
任选地，横截面维度可以代表可通过纳米结构取得的最大横截面维度。
在另一个方面，集成放大器包含在反应腔内的二聚体或三聚体。
在另一个方面，集成放大器形成领结状纳米天线。
在一个实施方案中，提供了一种制造结构化基底的方法。方法包括提供具有基础面的基础层及沿着基础层的基础面形成纳米结构。方法还包括形成在基础面之上堆叠的腔层。腔层包括多个反应腔，其中每个反应腔包括在其中的多个纳米结构。多个纳米结构形成相应反应腔的集成放大器，集成放大器被配置成放大传送到相应的反应腔内的电磁能或放大在相应的反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
在该实施方案的一个方面，每个集成放大器的纳米结构具有相对于相应集成放大器的其他纳米结构的预定位置。任选地，集成放大器具有基本相同排列的纳米结构。
在另一个方面，集成放大器具有偏振配置以使得来自集成放大器的反应基于电磁能的偏振。
在另一个方面，活性面包括沿着间质区域延伸的侧表面，侧表面是基本平坦的。
在另一个方面，方法还可以包括在反应腔内提供有机材料，以使得有机材料覆盖纳米结构。有机材料可被配置成在相应的反应腔内固定生物分子。任选地，有机材料包括凝胶材料。任选地，有机材料包括水凝胶。
任选地，方法还可以包括磨光活性面以从间质区域去除有机材料。
任选地，有机材料具有被配置成容纳仅单个生物分子的容积，以使得空间排斥阻止多于一个生物分子被捕获或播种反应腔。
任选地，有机材料对于液体是可渗透的，并且被配置成附接核酸。
在另一个方面，纳米结构可以从基础层延伸，通过腔层的一部分，并且进入相应的反应腔。
在另一个方面，集成放大器中的纳米结构具有放大传送入相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种的材料组成、形状和相对于集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
在特定的实施方案中，集成放大器中的纳米结构可以具有放大在相应反应腔内产生的电磁能的材料组成、形状和相对于集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
任选地，电磁能包括荧光发射。
在另一个方面，集成放大器中的纳米结构可以具有放大传送到相应反应腔内的电磁能的材料组成、形状和相对于集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
任选地，激发光或光发射的波长在300纳米(nm)和750nm之间。
在另一个方面，每个纳米结构可包括包含纳米压印平板印刷(NIL)材料的纳米主体和包围纳米主体的外层。任选地，外层包括以下的至少一种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
任选地，钝化层可在纳米主体上延伸。
在另一个方面，方法包括将装置罩安装至基底主体以在基底主体的活性面和装置罩之间形成流体通道，流体通道被配置成引导通过其液体的流流入反应腔内。
在另一个方面，反应腔可以具有相应的底部表面。纳米结构可以从相应反应腔的底部表面突出朝向活性面。
在另一个方面，每个反应腔可以被在活性面和反应腔的底部表面间延 伸的至少一个侧壁界定。纳米结构可以形成至少一个侧壁的至少一部分。任选地，纳米结构从相应反应腔的底部表面突出。
任选地，间质区域基本上没有纳米结构。
在一个实施方案中，提供了一种制造结构化基底的方法。方法可以包括提供具有基础面的基础层，沿着基础层的基础面形成纳米结构，以及在纳米结构的阵列之上提供纳米压印平板印刷(NIL)层。方法还可以包括压印反应腔的阵列到NIL层，其中纳米结构的一个不同的子阵列定位在每个反应腔下。纳米结构的每个子阵列可以被NIL层的各自的填充区域包围。方法还可以包括去除NIL层的各自的填充区域以暴露在相应反应腔内的纳米结构的子阵列。在每个反应腔内的纳米结构的子阵列可以形成相应反应腔的集成放大器，集成放大器被配置以放大传送到相应的反应腔内的电磁能或放大在相应的反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
在该实施方案的一个方面，NIL层是顶部NIL层，其中形成纳米结构包括提供底部NIL层和压印纳米结构。
在另一个方面，每个集成放大器的纳米结构具有相对于相应集成放大器的其他纳米结构的预定位置，其中集成放大器具有基本相同排列的纳米结构。
在另一个方面，集成放大器具有偏振配置以使得来自集成放大器的反应基于电磁能的偏振。
在另一个方面，活性面包括沿着间质区域延伸的侧表面，侧表面是基本平坦的。
在另一个方面，方法还可以包括在反应腔内提供有机材料，以使得有机材料覆盖纳米结构，有机材料被配置成在相应的反应腔内固定生物分子。任选地，有机材料包括凝胶材料。任选地，有机材料包括水凝胶。
在另一个方面，方法还可以包括磨光活性面以从间质区域去除有机材料。
在一个实施方案中，提供了一种制造结构化基底的方法。方法包括提供具有基础面的基础层和沿着基础面提供纳米压印平板印刷(NIL)层。方法 还可包括压印NIL层以形成基础部分和从基础部分突出的纳米主体的阵列。方法还可以包括沉积覆盖纳米主体的等离子体共振膜(或层)以形成多个纳米结构。每个纳米结构包括相应的纳米主体和等离子体共振膜的一部分。方法还包括形成包括多个反应腔的腔层，其中每个反应腔包括在其中的多个纳米结构。多个纳米结构形成相应反应腔的集成放大器，集成放大器被配置以放大传送到相应的反应腔内的电磁能或放大在相应的反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
在该实施方案的一个方面，腔层可以包含NIL材料。形成腔层可以包括压印腔层的NIL材料以形成反应腔。
在另一个方面，每个集成放大器的纳米结构可以具有相对于相应集成放大器的其他纳米结构的预定位置。任选地，集成放大器具有基本相同排列的纳米结构。
在另一个方面，集成放大器具有偏振配置以使得来自集成放大器的反应基于电磁能的偏振。
在另一个方面，方法还可以包括在反应腔内提供有机材料，以使得有机材料覆盖纳米结构，有机材料被配置成在相应的反应腔内固定生物分子。任选地，方法可以包括磨光活性面以从间质区域去除有机材料。
在另一个方面，方法包括将装置罩安装到基底主体以在基底主体的活性面和装置罩之间形成流体通道，流体通道被配置成引导通过其的液体的流流入反应腔内。
在整个本申请中，已引用多个出版物、专利和/或专利申请。通过引用以其全文将这些出版物的公开内容在此并入本申请。
如本文使用的，术语“包括(comprising)”、“包括(including)”和“具有(having)”等等意图是开放式的，不仅包括列举的要素，还可能涵盖另外的要素。
应该理解，以上的描述意图说明性的，而非限制性的。例如，以上描述的实施方案(和/或其方面)可与彼此组合使用。另外，可对本发明的教导做出许多修改以适应特定的情况或材料而不偏离其范围。本文描述的维 度、材料的类型、多种部件的方向以及多种部件的数目和位置意图限定某些实施方案的参数，并且绝不是限制性的，而仅是示例性的实施方案。在查看以上描述后，在权利要求的精神和范围内的许多其他实施方案和修改，对本领域技术人员将是明显的。因此，本发明的范围应该参考所附的权利要求连同所述权利要求被授权的等同物的全部范围被确定。
如在说明书中使用的，措辞“在示例性实施方案中”、“在一些实施方案中”、“在特定的实施方案中”等等意味着描述的实施方案是可根据本申请形成或执行的实施方案的实例。措辞不意图将发明的主题限制到实施方案的主题。更具体地，发明主题的其他实施方案可以不包括特定的实施方案描述的列举的特征或结构。
在所附的权利要求中，术语“包括(including)”和“其中(in which)”被用作各自术语“包括(comprising)”和“其中(wherein)”的普通英语同义词。此外，在以下权利要求中，术语“第一”、“第二”和“第三”等等仅作为标号使用，并不意图对其客体施加数值要求。此外，以下权利要求的限制未以方法加功能形式(means–plus-function format)来书写，并且不意图基于35U.S.C.§112(f)来理解，除非且直到此类权利要求限制明确使用措辞“用于……的方法(means for)”随后陈述功能而没有进一步的结构。
本申请的主题还可以适用或包括在美国专利申请公布第2014/0242334号；第2014/0079923号；和第2011/0059865号中描述的相似的主题。这些出版物的每一个通过引用以其整体被并入本文。
以下权利要求列举本申请的一个或更多个实施方案，并且在此被并入本申请的说明书中。

Claims (167)

1.一种结构化基底，所述结构化基底包含：
(a)多个纳米颗粒，所述多个纳米颗粒分布于固体支持物上；
(b)凝胶材料，所述凝胶材料形成与所述多个纳米颗粒缔合的层；和
(c)在所述凝胶材料中的靶核酸的文库。
2.根据权利要求1所述的结构化基底，其中所述纳米颗粒由等离子体共振材料形成。
3.根据权利要求2所述的结构化基底，其中所述等离子体共振材料包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的结构化基底，其中所述凝胶材料覆盖所述纳米颗粒。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的结构化基底，其中所述固体支持物包含流通池的表面。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的结构化基底，其中所述固体支持物包含具有多个孔的平坦的表面，所述纳米颗粒分布在所述多个孔内。
7.一种制造结构化基底的方法，所述方法包括：
(a)提供包含平坦的表面的固体支持物；
(b)将多个纳米颗粒分散在所述固体支持物的表面上；以及
(c)用凝胶材料涂布所述固体支持物的至少一部分，从而形成覆盖所述多个纳米颗粒的凝胶层。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述纳米颗粒由等离子体共振材料形成。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中步骤(b)和步骤(c)同时进行。
10.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中步骤(b)在步骤(c)之前进行。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，所述方法还包括：
(d)将靶核酸的文库递送到所述凝胶材料以产生在所述凝胶材料中的核酸特征的阵列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中每个特征包含不同的核酸种类。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
14.一种检测核酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含多个纳米颗粒的固体支持物；凝胶材料，所述凝胶材料形成覆盖所述多个纳米颗粒的层；和在所述凝胶材料中的靶核酸的文库；
(b)使所述固体支持物与结合所述靶核酸的至少一种荧光标记的探针接触；以及
(c)检测在所述固体支持物上的荧光信号以辨别结合所述至少一种探针的靶核酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述纳米颗粒由等离子体共振材料形成。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述纳米颗粒包含选自由以下组成的组的材料：银、金、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含流通池的表面。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含具有多个孔的平坦的表面，所述纳米颗粒分布在所述多个孔中。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的探针包括荧光标记的核苷酸。
20.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的探针包括荧光标记的寡核苷酸。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，其中检测包括检测寡核苷酸探针与每个特征内的靶核酸的杂交。
22.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，其中检测包括检测核苷酸或寡核苷酸探针至每个特征内的靶核酸的掺入。
23.一种阵列，所述阵列包含：
包含表面的固体支持物，所述表面包含多个孔，所述孔被间质区域彼此分隔；以及
在所述多个孔的每个中的多个纳米结构。
24.根据权利要求23所述的阵列，其中所述纳米结构是等离子体纳米结构。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的阵列，其中所述纳米结构位于所述孔的底部。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的阵列，其中所述纳米结构沿着所述孔的壁定位。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的阵列，其中所述间质区域基本没有纳米结构。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的阵列，其中所述纳米结构包括纳米颗粒。
29.根据权利要求28所述的阵列，其中所述纳米颗粒具有大于10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或大于100nm的直径。
30.根据权利要求28所述的阵列，其中所述纳米颗粒具有小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或小于10nm的直径。
31.根据权利要求28所述的阵列，其中所述纳米颗粒包含在所述孔内的二聚体或三聚体。
32.根据权利要求23-27中任一项所述的阵列，其中所述纳米结构包括领结状纳米天线。
33.根据权利要求23-27中任一项所述的阵列，其中所述纳米结构包括纳米棒。
34.根据权利要求23-27中任一项所述的阵列，其中所述纳米结构包括纳米环。
35.根据权利要求23-27中任一项所述的阵列，其中所述纳米结构包括纳米栓。
36.根据权利要求23-27中任一项所述的阵列，其中所述纳米结构包括纳米光栅。
37.根据权利要求23-36中任一项所述的阵列，其中所述孔还包含凝胶材料。
38.根据权利要求37所述的阵列，其中所述凝胶材料包括水凝胶。
39.根据权利要求23-38中任一项所述的阵列，其中所述固体支持物包含流通池的表面。
40.一种制造阵列的方法，所述方法包括：
获得包含平坦的表面的固体支持物，所述表面包含多个孔，所述孔被间质区域彼此分隔；
在所述固体支持物上涂布金属膜；
使所述金属膜经历热退火过程，从而在所述多个孔的每个中形成多个等离子体纳米结构。
41.根据权利要求40所述的方法，所述方法还包括磨光所述平坦的表面以从所述间质区域基本去除纳米结构且保持所述孔中的纳米结构。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，所述方法还包括用凝胶材料涂布所述固体支持物的至少一部分，从而在多个所述孔中沉积所述凝胶材料。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
44.一种检测核酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含平坦的表面的固体支持物，所述表面包含多个孔，所述孔被间质区域彼此分隔；在所述多个孔的每个中的多个纳米结构；凝胶材料，所述凝胶材料形成覆盖所述多个纳米结构的层；和在所述凝胶材料中的靶核酸的文库。
(b)使所述固体支持物与结合所述靶核酸的至少一种荧光标记的探针接触；以及
(c)检测在所述固体支持物上的荧光信号以辨别结合所述至少一种探针的靶核酸。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述纳米结构是等离子体纳米结构。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的方法，其中所述纳米颗粒包括选自由以下组成的组的材料：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)和铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述纳米结构位于所述孔的底部。
48.根据权利要求44-47的任一项所述的方法，其中所述纳米结构沿着所述孔的壁定位。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述间质区域基本没有纳米结构。
50.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括纳米颗粒。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述纳米颗粒具有大于10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或大于100nm的直径。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述纳米颗粒具有小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或小于10nm的直径。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述纳米颗粒包含在所述孔内的二聚体或三聚体。
54.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括领结状天线。
55.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括纳米棒。
56.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括纳米环。
57.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括纳米栓。
58.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括纳米光栅。
59.根据权利要求44-58中任一项所述的方法，其中所述凝胶材料包括水凝胶。
60.根据权利要求44-59中任一项所述的方法，其中所述平坦的表面包含流通池的表面。
61.根据权利要求44-60中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的探针包括荧光标记的核苷酸。
62.根据权利要求44-60中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的探针包括荧光标记的寡核苷酸。
63.根据权利要求44-60中任一项所述的方法，其中检测包括检测寡核苷酸探针与每个特征内的靶核酸的杂交。
64.根据权利要求44-60中任一项所述的方法，其中检测包括检测核苷酸或寡核苷酸探针至每个特征内的靶核酸的掺入。
65.一种结构化基底，所述结构化基底包含：
具有活性面的基底主体，所述基底主体包括沿着所述活性面开口的反应腔和分隔所述反应腔的间质区域；以及
定位在所述反应腔的每个内的集成放大器，所述集成放大器包括多个纳米结构，所述集成放大器被配置成放大传送进相应反应腔内的电磁能，或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
66.根据权利要求65所述的结构化基底，其中所述集成放大器的每个的纳米结构具有相对于相应集成放大器的其他纳米结构的预定位置，其中所述集成放大器具有基本相同排列的纳米结构。
67.根据权利要求65或权利要求66所述的结构化基底，其中所述活性面包括沿着所述间质区域延伸的侧表面，所述侧表面是基本平坦的，所述反应腔开口于所述侧表面。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的结构化基底，所述结构化基底还包含安置在所述反应腔内并覆盖所述纳米结构的有机材料，所述有机材料被配置成在相应反应腔内保持生物分子。
69.根据权利要求68所述的结构化基底，其中所述有机材料包括凝胶材料。
70.根据权利要求68所述的结构化基底，其中所述有机材料包括水凝胶。
71.根据权利要求68所述的结构化基底，其中所述有机材料具有被配置成容纳仅单个生物分子的容积，以使得空间排斥阻止多于一个生物分子被捕获或播种所述反应腔。
72.根据权利要求68所述的结构化基底，其中所述有机材料对于液体是可渗透的，并且被配置成附接核酸。
73.根据权利要求65-72中任一项所述的结构化基底，其中所述基底主体包括具有所述纳米结构从其突出的基础层，所述基底主体还包含相对于所述基础层堆叠的腔层，所述腔层被塑造以包括所述反应腔。
74.根据权利要求73所述的结构化基底，其中所述纳米结构从所述基础层延伸，通过所述腔层的一部分，并且进入相应反应腔。
75.根据权利要求65-74中任一项所述的结构化基底，其中所述纳米结构由等离子体共振材料形成。
76.根据权利要求65-74中任一项所述的结构化基底，其中所述纳米结构包括以下的至少一种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
77.根据权利要求65-76中任一项所述的结构化基底，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大传送入相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
78.根据权利要求65-76中任一项所述的结构化基底，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大在相应反应腔内产生的电磁能的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
79.根据权利要求78所述的结构化基底，其中所述电磁能包括荧光发射。
80.根据权利要求65-76中任一项所述的结构化基底，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大传送到相应反应腔内的电磁能的组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
81.根据权利要求65-80中任一项所述的结构化基底，其中所述激发光或所述光发射的波长在300纳米(nm)和750nm之间。
82.根据权利要求65-81中任一项所述的结构化基底，其中每个所述纳米结构包括包含纳米压印平板印刷(NIL)材料的纳米主体和包围所述纳米主体的外层。
83.根据权利要求82所述的结构化基底，其中所述外层包含以下的至少一种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
84.根据权利要求82或权利要求83所述的结构化基底，其中钝化层在所述纳米主体上延伸。
85.根据权利要求65-84中任一项所述的结构化基底，所述结构化基底还包含与所述基底主体偶联的装置罩以在所述基底主体的所述活性面和所述装置罩之间形成流体通道，所述流体通道被配置成引导通过其的液体的流流入所述反应腔内。
86.根据权利要求65-85中任一项所述的结构化基底，其中所述反应腔具有相应的底部表面，所述纳米结构从相应反应腔的底部表面突出朝向所述活性面。
87.根据权利要求65-85中任一项所述的结构化基底，其中所述反应腔的每个被在所述活性面和所述反应腔的底部表面之间延伸的至少一个侧壁界定，所述纳米结构形成所述至少一个侧壁的至少一部分。
88.根据权利要求87所述的结构化基底，其中所述纳米结构从相应反应腔的所述底部表面突出。
89.根据权利要求65-88中任一项所述的结构化基底，其中所述间质区域基本没有所述纳米结构。
90.根据权利要求65-89中任一项所述的结构化基底，其中所述纳米结构具有朝向所述活性面沿着纵轴延伸的高度，所述高度是至少10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。
91.根据权利要求65-89中任一项所述的结构化基底，其中所述纳米结构具有朝向所述活性面沿着纵轴延伸的高度，所述纳米结构具有取自与所述纵轴横切的横截面维度，所述横截面维度是至少10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。
92.根据权利要求65-89中任一项所述的结构化基底，其中所述纳米结构具有朝向所述活性面沿着纵轴延伸的高度，所述纳米结构具有取自与所述纵轴横切的横截面维度，所述横截面维度小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或10nm。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的结构化基底，其中所述横截面维度是直径。
94.根据权利要求91-93中任一项所述的结构化基底，其中所述横截面维度代表能够通过所述纳米结构取得的最大横截面维度。
95.根据权利要求65-94中任一项所述的结构化基底，其中所述集成放大器包含在所述反应腔内的二聚体或三聚体。
96.根据权利要求65-94中任一项所述的结构化基底，其中所述集成放大器形成领结状纳米天线。
97.根据权利要求65-94中任一项所述的结构化基底，其中所述纳米结构包括纳米棒。
98.根据权利要求65-94中任一项所述的结构化基底，其中所述纳米结构包括纳米环。
99.根据权利要求65-94中任一项所述的结构化基底，其中所述纳米结构包括纳米栓。
100.一种制造结构化基底的方法，所述方法包括：
提供具有基础面的基础层；
沿着所述基础层的所述基础面形成纳米结构；
形成在所述基础面之上堆叠的腔层，所述腔层包括多个反应腔，其中每个反应腔包括在其内的多个纳米结构，所述多个纳米结构形成相应反应腔的集成放大器，所述集成放大器被配置成放大传送进相应反应腔的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述纳米结构对于所述集成放大器的每个具有相对于相应集成放大器的其他纳米结构的预定位置，其中所述集成放大器具有基本相同排列的纳米结构。
102.根据权利要求100或权利要求101所述的方法，其中所述集成放大器具有偏振配置以使得来自所述集成放大器的反应基于所述电磁能的偏振。
103.根据权利要求100-102中任一项所述的方法，其中所述活性面包括沿着所述间质区域延伸的侧表面，所述侧表面是基本平坦的。
104.根据权利要求100-103中任一项所述的方法，所述方法在所述反应腔内提供有机材料，以使得所述有机材料覆盖所述纳米结构，所述有机材料被配置成固定在相应反应腔内的生物分子。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述有机材料包括凝胶材料。
106.根据权利要求104所述的方法，其中所述有机材料包括水凝胶。
107.根据权利要求104所述的方法，所述方法还包括磨光所述活性面以从间质区域去除所述有机材料。
108.根据权利要求104所述的方法，其中所述有机材料具有被配置以容纳仅单个生物分子的容积，以使得空间排斥阻止多于一个生物分子被捕获或播种所述反应腔。
109.根据权利要求104所述的方法，其中所述有机材料对于液体是可渗透的，并且被配置成附接核酸。
110.根据权利要求100-109中任一项所述的方法，其中所述纳米结构从所述基础层延伸，通过所述腔层的一部分，并且进入相应的反应腔内。
111.根据权利要求100-110中任一项所述的方法，其中所述纳米结构由等离子体共振材料形成。
112.根据权利要求100-110中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括以下的至少一种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
113.根据权利要求100-112中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大传送进相应反应腔内的电磁能或放大在所述相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
114.根据权利要求100-113中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大在相应反应腔内产生的电磁能的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述电磁能包括荧光发射。
116.根据权利要求100-112中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大传送进相应反应腔内的电磁能的组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
117.根据权利要求100-116中任一项所述的方法，其中所述激发光或所述光发射的波长在300纳米(nm)和750nm之间。
118.根据权利要求100-117中任一项所述的方法，其中所述纳米结构的每个包括包含纳米压印平板印刷(NIL)材料的纳米主体和包围所述纳米主体的外层。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述外层包括以下的至少一种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
120.根据权利要求118所述的方法，其中钝化层在所述纳米主体上延伸。
121.根据权利要求100-120中任一项所述的方法，所述方法还包括将装置罩安装至所述基底主体以在所述基底主体的所述活性面和所述装置罩之间形成流体通道，所述流体通道被配置成引导通过其的液体的流流入所述反应腔内。
122.根据权利要求100-121中任一项所述的方法，其中所述反应腔具有相应的底部表面，所述纳米结构从相应反应腔的所述底部表面突出朝向所述活性面。
123.根据权利要求100-121中任一项所述的方法，其中所述反应腔的每个被在所述活性面和所述反应腔的底部表面间延伸的至少一个侧壁界定，所述纳米结构形成所述至少一个侧壁的至少一部分。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述纳米结构从相应反应腔的所述底部表面突出。
125.根据权利要求100-124中任一项所述的方法，其中所述间质区域基本没有所述纳米结构。
126.根据权利要求100-125中任一项所述的方法，其中所述纳米结构具有朝向所述活性面沿着纵轴延伸的高度，所述高度是至少10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。
127.根据权利要求100-126中任一项所述的方法，其中所述纳米结构具有朝向所述活性面沿着纵轴延伸的高度，所述纳米结构具有取自与所述纵轴横切的横截面维度，所述横截面维度是至少10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。
128.根据权利要求100-126中任一项所述的方法，其中所述纳米结构具有朝向所述活性面沿着纵轴延伸的高度，所述纳米结构具有取自与所述纵轴横切的横截面维度，所述横截面维度小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或10nm。
129.根据权利要求127或权利要求128所述的方法，其中所述横截面维度是直径。
130.根据权利要求127或权利要求128所述的方法，其中所述横截面维度代表能够通过所述纳米结构取得的最大横截面维度。
131.一种制造结构化基底的方法，所述方法包括：
提供具有基础面的基础层；
沿着所述基础层的所述基础面形成纳米结构；
在所述纳米结构的阵列上提供纳米压印平板印刷(NIL)层；
将反应腔阵列压印进所述NIL层，其中所述纳米结构的不同子阵列被定位在每个反应腔下，纳米结构的每个子阵列被所述NIL层的各自填充区域包围；以及
去除所述NIL层的各自填充区域以暴露在相应反应腔内的所述纳米结构的子阵列，每个反应腔内的纳米结构的子阵列形成相应反应腔的集成放大器，所述集成放大器被配置成放大传送进相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述NIL层是顶部NIL层，其中形成所述纳米结构包括提供底部NIL层和压印所述纳米结构。
133.根据权利要求131或权利要求132所述的方法，其中每个所述集成放大器的所述纳米结构具有相对于相应集成放大器的其他纳米结构的预定位置，其中所述集成放大器具有基本相同排列的纳米结构。
134.根据权利要求131-133中任一项所述的方法，其中所述集成放大器具有偏振配置以使得来自所述集成放大器的反应基于所述电磁能的偏振。
135.根据权利要求131-134中任一项所述的方法，其中所述活性面包括沿着间质区域延伸的侧表面，所述侧表面是基本平坦的。
136.根据权利要求131-135中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述反应腔内提供有机材料，以使得所述有机材料覆盖所述纳米结构，所述有机材料被配置成固定在相应反应腔内的生物分子。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述有机材料包括凝胶材料。
138.根据权利要求136所述的方法，其中所述有机材料包括水凝胶。
139.根据权利要求136所述的方法，所述方法还包括磨光所述活性面以从间质区域去除所述有机材料。
140.根据权利要求136所述的方法，其中所述有机材料具有被配置成容纳仅单个生物分子的容积，以使得空间排斥阻止多于一个生物分子被捕获或播种所述反应腔。
141.根据权利要求136所述的方法，其中所述有机材料对于液体是可渗透的，并且被配置成附接核酸。
142.根据权利要求131-141中任一项所述的方法，其中所述纳米结构由等离子体共振材料形成。
143.根据权利要求131-141中任一项所述的方法，其中所述纳米结构包括以下的至少一种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
144.根据权利要求131-143中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大传送到相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
145.根据权利要求131-144中任一项所述的方法，其中所述激发光或所述光发射的波长在300纳米(nm)和750nm之间。
146.根据权利要求131-145中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大在相应反应腔内产生的电磁能的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述电磁能包括荧光发射。
148.根据权利要求131-145中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大传送到相应反应腔内的电磁能的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
149.根据权利要求131-148中任一项所述的方法，所述方法还包括将装置罩安装至所述基底主体以在所述基底主体的所述活性面和所述装置罩之间形成流体通道，所述流体通道被配置成引导通过其的液体的流流入所述反应腔内。
150.一种制造结构化基底的方法，所述方法包括：
提供具有基础面的基础层；
沿着所述基础面提供纳米压印平板印刷(NIL)层；
压印所述NIL层以形成基础部分和从所述基础部分突出的纳米主体的阵列。
沉积覆盖所述纳米主体的等离子体共振膜以形成多个纳米结构，每个纳米结构包括相应的纳米主体和所述等离子体共振膜的一部分；以及
形成包括多个反应腔的腔层，其中每个反应腔包括在其内的多个纳米结构，所述多个纳米结构形成相应反应腔的集成放大器，所述集成放大器被配置成放大传送到相应反应腔的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述腔层包含NIL材料，并且其中形成所述腔层包括压印所述腔层的所述NIL材料以形成所述反应腔。
152.根据权利要求150或权利要求151所述的方法，其中每个所述集成放大器的所述纳米结构具有相对于相应集成放大器的其他纳米结构的预定位置，其中所述集成放大器具有基本相同排列的纳米结构。
153.根据权利要求150-152中任一项所述的方法，其中所述集成放大器具有偏振配置以使得来自所述集成放大器的反应基于所述电磁能的偏振。
154.根据权利要求150-153中任一项所述的方法，其中所述活性面包括沿着所述间质区域延伸的侧表面，所述侧表面是基本平坦的。
155.根据权利要求150-154中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述反应腔内提供有机材料，以使得所述有机材料覆盖所述纳米结构，所述有机材料被配置成固定在所述相应反应腔内的生物分子。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述有机材料包括凝胶材料。
157.根据权利要求155所述的方法，其中所述有机材料包括水凝胶。
158.根据权利要求155所述的方法，所述方法还包括磨光所述活性面以从间质区域去除所述有机材料。
159.根据权利要求155所述的方法，其中所述有机材料具有被配置成容纳仅单个分析物的容积，以使得空间排斥阻止多于一个分析物被捕获或播种所述反应腔。
160.根据权利要求155所述的方法，其中所述有机材料对于液体是可渗透的，并且被配置成附接核酸。
161.根据权利要求150-160中任一项所述的方法，其中所述等离子体共振膜包括以下的至少一种：金(Au)、银(Ag)、锡(Sn)、铑(Rh)、钌(Ru)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、钛(Ti)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、p型掺杂硅、n型掺杂硅和砷化镓。
162.根据权利要求150-161中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大传送到相应反应腔内的电磁能或放大在相应反应腔内产生的电磁能中的至少一种的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
163.根据权利要求150-162中任一项所述的方法，其中所述激发光或所述光发射的波长在300纳米(nm)和750nm之间。
164.根据权利要求150-161中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大在相应反应腔内产生的电磁能的材料组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述电磁能包括荧光发射。
166.根据权利要求150-161中任一项所述的方法，其中在所述集成放大器中的纳米结构具有放大传送到相应反应腔内的电磁能的组成、形状和相对于所述集成放大器的其他纳米结构的相对位置。
167.根据权利要求150-166中任一项所述的方法，所述方法还包括将装置罩安装至所述基底主体以在所述基底主体的所述活性面和所述装置罩之间形成流体通道，所述流体通道被配置成引导通过其的液体的流流入所述反应腔内。
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