CN115917004A - 改变流通池信号 - Google Patents

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CN115917004A CN202180046721.4A CN202180046721A CN115917004A CN 115917004 A CN115917004 A CN 115917004A CN 202180046721 A CN202180046721 A CN 202180046721A CN 115917004 A CN115917004 A CN 115917004A
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Abstract

在示例性方法中，将水凝胶施加到基底的表面，并且将引物接枝到所施加的水凝胶。在接枝引物之前或之后，将等离子体纳米结构引入到所施加的水凝胶。该基底可构成流通池的一个表面。当该流通池用于测序操作时，该等离子体纳米结构可增强产生的荧光信号。

Description

改变流通池信号
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月16日提交的美国临时申请序列号63/114,305的权益，该临时申请的内容全文以引用的方式并入本文。
背景技术
生物或化学研究中的各种方案涉及在局部支撑表面上或预定义的反应室内进行大量受控反应。然后可观察或检测指定的反应，并且随后的分析可有助于识别或揭示反应中所涉及的化学品的特性。在一些示例中，受控反应会改变电荷、导电性或一些其他电特性，并且因此电子系统可用于检测。在其他示例中，受控反应会产生荧光，并且因此光学系统可用于检测。
发明内容
将等离子体纳米结构掺入到流通池基底中。在一些情况下，将等离子体纳米结构引入流通池的水凝胶中，并且因此定位在光学标记的信号增强接近度内。表现出荧光的光学标记是标记核苷酸的组分，该标记核苷酸在流通池基底上测序期间已经掺入到新生核酸链中。因此，等离子体纳米结构能够增强光学标记的荧光，该荧光被读取为光学信号。
在其他情况下，等离子体纳米结构定位在由基底树脂基质材料产生的荧光信号的信号猝灭接近度内。在这些情况下，等离子体纳米结构能够淬灭树脂基质材料的自体荧光。在这些情况下，等离子体纳米结构用作猝灭纳米结构，并且因此减小了来自树脂基质材料的背景噪声。
在另外的其他情况下，等离子体/猝灭纳米结构能够增强光学标记的光学信号并且还能够从树脂基质材料淬灭光学信号。
发明内容
本文公开的第一方面是包括以下各项的方法：将水凝胶施加到基底的表面；将引物接枝到所施加的水凝胶；以及在接枝引物之前或之后，将等离子体纳米结构引入到所施加的水凝胶。
在第一方面的示例中，等离子体纳米结构用炔烃官能化，该炔烃共价附接到水凝胶的游离叠氮基团。
在第一方面的示例中，等离子体纳米结构用叠氮化物官能化，该叠氮化物共价附接到水凝胶的炔烃。
在第一方面的示例中，等离子体纳米结构用结合对的第一成员官能化，该第一成员与结合对的附接到水凝胶的第二成员相互作用。在示例中，第一成员和第二成员包括NiNTA配体和组氨酸标签，或链霉亲和素和生物素，或spytag和spycatcher，或马来酰亚胺和半胱氨酸，或N-羟基琥珀酰亚胺酯和胺，或醛和肼，或胺和活化羧酸盐，或胺和N-羟基琥珀酰亚胺酯，或硫醇和烷基化试剂，或亚磷酰胺和硫醚。
在第一方面的示例中，基底的表面包括由间隙区域分开的凹入部，并且其中该方法还包括在接枝引物之前和引入等离子体纳米结构之前从间隙区域移除水凝胶。
在第一方面的示例中，基底的表面包括被间隙区域围绕的泳道，并且其中该方法还包括在接枝引物之前和引入等离子体纳米结构之前从间隙区域移除水凝胶。
在第一方面的示例中，等离子体纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
在第一方面的示例中，等离子体纳米结构各自具有实心结构、中空结构或芯-壳结构。
应当理解，第一方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起并且/或者可与本文公开的示例中的任何示例组合以实现如本公开中所描述的益处，包括例如增强的荧光，以及因此在对测序方案成像期间增强的信号。
本文所公开的第二方面是一种流通池，该流通池包括：基部支持物；在基部支持物上方的图案化材料，该图案化材料包括树脂基质材料和分散在树脂基质材料的整个表面上或定位在该表面上的猝灭纳米结构，该图案化材料限定活性区的区域，该区域被间隙区域围绕；区域中的水凝胶；以及附接到水凝胶的引物。
在第二方面的示例中，淬灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
在第二方面的示例中，淬灭纳米结构具有实心结构、中空结构或芯-壳结构。
在第二方面的示例中，区域包括泳道，并且间隙区域围绕泳道。
在第二方面的示例中，区域是凹入部；图案化材料限定多个凹入部；并且多个凹入部中的每个凹入部被间隙区域分开。
应当理解，第二方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的示例中的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如在对测序方案成像期间淬灭背景信号。
本文公开的第三方面是一种用于在流通池中的测序期间增加信噪比的方法，该方法包括纳米压印树脂基质材料以形成图案化材料，该图案化材料包括由间隙区域分开的凹入部；将淬灭纳米结构的膜沉积到图案化材料的表面上，该膜的厚度在约1nm至约20nm的范围内；将水凝胶引入到凹入部中；以及将引物接枝到水凝胶。
在第三方面的示例中，淬灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
应当理解，第三方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的示例中的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如在对测序方案成像期间淬灭背景信号。
本文公开的第四方面是一种用于在流通池中的测序期间增加信噪比的方法，该方法包括将猝灭纳米结构掺入到树脂基质材料中；将树脂基质材料图案化以限定被间隙区域围绕的活性区的区域；将水凝胶引入到该区域中；以及将引物接枝到水凝胶。
在第四方面的示例中，淬灭纳米结构以猝灭纳米结构和树脂基质材料的混合物总重量的约0.1重量％至约10重量％范围内的量掺入到树脂基质材料中。
在第四方面的示例中，淬灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
在第四方面的示例中，区域包括泳道，并且间隙区域围绕泳道。
在第四方面的示例中，区域是凹入部；图案化材料限定多个凹入部；并且多个凹入部中的每个凹入部被间隙区域分开。
应当理解，第四方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的示例中的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如在对测序方案成像期间淬灭背景信号。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1A至图1E描绘了本文所公开的方法的两个示例；
图2A是流通池的示例的顶视图；
图2B是沿图2A的2B-2B线截取的放大剖视图，描绘了由图1A至图1E中所示的示例性方法中的任一者形成的流动通道和示例性基底；
图2C是沿图2A的2C-2C线截取的放大剖视图，描绘了由图1A至图1E中所示的示例性方法中的任一者形成的流动通道和其他示例性基底；
图3A至图3D描绘了本文所公开的另一个示例性方法；
图4A至图4C描绘了本文所公开的又一个示例性方法；
图5A至图5C描绘了本文所公开的再一个示例性方法；
图6A是流通池的原始彩色照片的黑白再现，其中颜色指示引入到流通池的一些泳道中的等离子体纳米颗粒溶液的存在，其中泳道1是没有荧光水凝胶(附接有ALEXA
Figure BDA0004027121070000051
545染料的水凝胶)和没有等离子体纳米颗粒溶液的对照泳道，泳道2是涂覆有等离子体纳米颗粒溶液但没有荧光水凝胶的对照泳道，泳道3-7是涂覆有荧光水凝胶和不同浓度的等离子体纳米颗粒溶液的示例性泳道，并且泳道8是涂覆有荧光水凝胶但没有等离子体纳米颗粒溶液的对照泳道；
图6B是在将纳米颗粒溶液从泳道2-7冲洗之后并且在引入缓冲液之后使用532nm绿色激光器(用于激发)和TAMRA过滤器收集的图6A的流通池的荧光扫描仪图像，示出了泳道3-8中的荧光信号滴定并且泳道1或2中无信号；
图6C是描绘与图6B的荧光扫描仪图像相对应的相对强度的曲线图；
图6D是示出对于i)包括荧光水凝胶的图6A的流通池的一个泳道(泳道8)，但在用纳米颗粒溶液处理之前和在引入缓冲液之后，以及对于ii)图6A的流通池的泳道3-7，在将纳米颗粒溶液引入其中并从其冲洗之后以及在引入缓冲液之后，使用532nm绿色激光器收集的荧光强度的图表；并且
图7是示出对于i)涂覆有另一种荧光水凝胶(包括ALEXA
Figure BDA0004027121070000052
488染料)而没有纳米颗粒溶液处理的流通池的一个泳道，并且在引入缓冲液之后，以及对于ii)该流通池的五个其他泳道，在将纳米颗粒溶液引入其中并从其冲洗之后以及在引入缓冲液之后，使用488nm蓝色激光器收集的荧光强度的图表。
具体实施方式
在本文公开的示例中，经由检测来自光学标记的荧光来进行测序期间的核苷酸碱基调用。
在一些示例中，经由等离子体共振的荧光增强是通过等离子体纳米结构实现的，该等离子体纳米结构分散在用于测序的流通池的整个水凝胶中。水凝胶将至少一些等离子体纳米结构定位在光学标记的信号增强接近度内。表现出荧光的光学标记是标记核苷酸的组分，该标记核苷酸在测序期间已经掺入到新生核酸链中。所谓“信号增强接近度”是指等离子体纳米结构和光学标记分开一定距离，该距离i)防止当等离子体纳米结构和光学标记物彼此定位得太靠近时可能发生的猝灭，以及ii)增加可在更大距离处显著下降的等离子体增强。与信号增强接近度相对应的距离可以在大于0nm至约100nm的范围内，但取决于等离子体纳米结构(例如，组成、形状、大小)以及在用光源激发时表现出荧光的光学标记。在一些情况下，与信号增强接近度相对应的距离在约0.1nm至约25nm，例如约1nm至约20nm等的范围内。在一个具体示例中，与信号增强接近度相对应的距离在约3nm至约12nm的范围内。
在其他示例中，自体荧光猝灭通过等离子体纳米结构或淬灭纳米结构来实现。流通池基底中使用的一些树脂基质材料在成像期间表现出自体荧光。在一些情况下，自体荧光可以是树脂基质材料中的光学活性组分在加热期间朝向表面迁移的结果。当对核苷酸的光学标记成像时，来自树脂基质材料的自体荧光可增加背景噪声，该核苷酸在测序期间已被掺入到单个新生链中，并且在用光源激发时表现出荧光。增加的背景噪声会降低信噪比(SNR)，使得在用光源激发时来自单个光学标记的荧光和对应信号在测序期间更难分辨。在这些示例中，等离子体纳米结构分散在树脂基质材料内或作为树脂基质材料上的层施加，并且因此定位在树脂基质材料中的光学活性组分的“信号猝灭接近度”内，吸附在树脂基质材料的表面处，或靠近树脂基质材料的表面的溶液中。所谓“信号猝灭接近度”是指等离子体纳米结构和树脂基质材料彼此足够靠近(例如，对于一些纳米结构和光学活性组分在4nm或更小内)，使得来自树脂基质材料的背景信号被淬灭。淬灭背景信号增加了SNR，并且因此改善了对初级和次级度量进行测序。作为一个示例，较低背景噪声使得能够更准确地调用碱基，这继而实现较长的测序运行。
定义
应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
术语包含、包括、含有和这些术语的各种形式彼此同义，并且意在是同样宽泛的。
术语顶部、底部、下部、上部、相邻、在……上等在本文中用于描述流通池和/或流通池的各个部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。
术语第一、第二等也并非意在暗示特定的取向或顺序，而是用于将一个部件与另一个部件区分开来。
“丙烯酰胺单体”是具有结构
Figure BDA0004027121070000071
的单体或包含丙烯酰胺基团的单体。包含丙烯酰胺基团的单体的示例包括叠氮基乙酰氨基戊基丙烯酰胺：
Figure BDA0004027121070000072
和N-异丙基丙烯酰胺：
Figure BDA0004027121070000073
可使用其他丙烯酰胺单体。
术语“活性区”是指可以进行反应的基底的区域。在流通池的制造期间，活性区可包括能够附接可以参与核酸模板扩增的引物的水凝胶。在最终流通池中，活性区可以包括与其附接的引物的水凝胶。在一些情况下，活性区还包括分散在整个水凝胶中的等离子体纳米结构。活性区中的引物可用于产生待测序的核酸模板，并且在测序期间，核酸模板使得能够掺入用光学标记标记的核苷酸。光学标记表现出荧光(在用光源激发时)，并且该荧光可通过分散在整个水凝胶中的等离子体纳米结构来增强。
如本文所用，术语“活化”是指在基部支持物或多层结构的最外层或淬灭纳米结构的膜的表面处产生反应性基团的过程。可以使用硅烷化或等离子体灰化来实现活化。应当理解，活化可以在本文公开的任何方法中进行。当进行活化时，存在硅烷化层或-OH基团(来自等离子体灰化)以将水凝胶共价附接到下面的支持物或层或膜上。
如本文所用，“醛”是包含具有结构-CHO的官能团的有机化合物，其包括羰基中心(即，碳以双键键合到氧)，其中碳原子也键合到氢和R基团，诸如烷基或其他侧链。醛的通式结构是：
Figure BDA0004027121070000081
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子。典型的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为示例，名称“C1-C4烷基”指示烷基链中存在一至四个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
如本文所用，“炔烃”或“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、薁基和蒽基。
“氨基”官能团是指-NRaRb基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢(例如
Figure BDA0004027121070000082
)、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7碳环基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所定义。
如本文所用，术语“附接”是指两个事物直接或间接地彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键附接到聚合物水凝胶。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的物理键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N3。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系主链中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基团可具有3至20个碳原子。碳环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。
如本文所用，术语“羧酸”或“羧基”是指-COOH。
如本文所用，“亚环烷基”是指完全饱和的碳环或环系，其通过两个连接点连接到分子的其余部分。
如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。示例包括环己烯基或环己烯以及降冰片烯基或降冰片烯。同样如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。一个示例为环辛炔。另一个示例为双环壬炔。同样如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，术语“凹入部”是指限定在基底中并且具有表面开口的离散凹面特征部，该表面开口至少部分地被基底的间隙区域围绕。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，凹入部可以是一个孔或两个互连的孔。
当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“环氧”(也称为缩水甘油基或环氧乙烷基团)是指
Figure BDA0004027121070000101
如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可进行反应的流动通道、用于将试剂递送到流动通道的入口以及用于从流动通道中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，流通池适于检测在该流通池中发生的反应。例如，流通池可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。
如本文所用，“流动通道”或“通道”可以是限定在两个结合的部件之间的区，该区可以选择性地接收液体样品、试剂等。在一些示例中，流动通道可限定在两个基底之间，并且因此可以与基底中的每个基底的活性区流体连通。在其他示例中，流动通道可限定在基底与盖之间，并且因此可与一个基底的活性区流体连通。
如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可具有5-18个环成员。
如本文所用，“杂环”意指在环主链中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。在环系中，杂原子可存在于非芳族环或芳族环中。杂环基团可具有3至20个环成员(即，构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)。在一些示例中，杂原子是O、N或S。
如本文所用，术语“肼”或“肼基”是指-NHNH2基团。
如本文所用，术语“腙”或“肼基”是指
Figure BDA0004027121070000111
基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7碳环、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环，如本文所定义。
如本文所用，“羟基”是指-OH基团。
如本文所用，术语“间隙区域”是指例如基底的分开凹入部或围绕泳道的区。作为示例，间隙区域可将阵列的一个凹入部与阵列的另一个凹入部分开。作为另一个示例，间隙区域可将流通池的一个泳道与流通池的另一个泳道分开。彼此分开的凹入部和泳道可为离散的，即彼此缺乏物理接触。在许多示例中，间隙区域是连续的，而凹入部或泳道是离散的，例如，如限定在其他连续表面中或其上的多个凹入部或泳道的情况。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与凹入部或泳道的表面材料不同的表面材料。例如，凹入部和泳道可在其中具有聚合物水凝胶和引物，并且间隙区域可以不含聚合物水凝胶和引物。
如本文所用，“腈氧化物”是指“RaC≡N+O-”基团，其中Ra在本文定义。制备腈氧化物的示例包括通过用氯酰胺-T处理或通过碱基在酰亚胺氯[RC(Cl)＝NOH]上的作用或通过羟胺与醛之间的反应由醛肟原位生成。
如本文所用，“硝酮”是指
Figure BDA0004027121070000112
基团，其中R1、R2和R3可以是本文定义的Ra基团和Rb基团中的任一者，不同之处在于R3不是氢(H)。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即在核糖中缺少存在于2'位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可为嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的修饰衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的修饰衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可具有改变的磷酸主链、糖或核碱基中的任一者。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物，诸如肽核酸(PNA)。“标记的核苷酸”是至少具有附接到其的光学标记的核苷酸。光学标记的示例包括能够响应于激发波长而发射荧光的任何染料。
“等离子体纳米结构”包括能够表现出等离子体共振的任何独立结构。
术语“聚合物水凝胶”是指对液体和气体可渗透的半刚性聚合物。聚合物水凝胶在吸收液体(例如，水)时可溶胀，并且在例如通过干燥移除液体时可收缩。虽然水凝胶可吸收水，但其不是水溶性的。
如本文所用，术语“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA)。本文称为扩增引物的一些引物用作模板扩增和簇生成的起点。本文称为测序引物的其他引物用作DNA合成的起点。引物的5’端可被修饰以允许与聚合物水凝胶的官能团进行偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包括多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。
“淬灭纳米结构”是等离子体纳米结构，由于能量传递，当在光学活性组分的淬灭接近度中时，该等离子体纳米结构使光学活性组分发射的波长最小化。例如，如果光学活性组分与在由光学活性组分发射的波长下转移能量的淬灭纳米结构直接接触，则将淬灭荧光。
“硫醇”官能团是指-SH。
如本文所用，术语“四嗪”和“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可为任选取代的。
如本文所用，“四唑”是指包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可为任选取代的。
等离子体或淬灭纳米结构
如本文所述，等离子体纳米结构包括能够表现出等离子体共振的任何独立结构。等离子体共振是材料表面层中的电子由具有一定入射角的入射光的光子激发并且然后平行于材料表面传播的现象。等离子体纳米结构的表面可以通过其与传播的或局部的表面等离子体的偶联来强烈地限制电磁场。这种相互作用与局部电场的较大增强相关联，这继而可增强激发和发射速率并减少荧光发射器的激发状态的寿命。这导致扩增的荧光信号，并且还可以改善对光漂白的抗性。
同样如本文所述，淬灭纳米结构是这样的纳米结构：由于能量传递，当在光学活性组分的淬灭接近度中时，该纳米结构使光学活性组分发射的波长最小化。因此，当在光学活性组分的淬灭接近度中时，淬灭纳米结构降低来自光学活性组分的噪声的自体荧光强度。
能够进行等离子体共振的任何材料(在本文中称为“等离子体材料”)可用作等离子体纳米结构。能够进行等离子共振的某些纳米结构也能够进行自体荧光猝灭。若干种金属(例如，金、银、锡、铑、钌、钯、锇、铱、铂、铜、铝等)、掺杂的半金属(例如，掺杂硅)、直接带隙半导体(例如，砷化镓)和金属复合材料能够进行等离子体共振。金属复合材料可包括上文列出的金属中的两种或更多种金属。作为示例，双金属复合材料包括银和金，并且三金属复合材料包括银、金和铂。在本文阐述的示例中的任何示例中，等离子体纳米结构或猝灭纳米结构可选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
在示例中，等离子体纳米结构或猝灭纳米结构是球形纳米颗粒。在另一个示例中，等离子体纳米结构或猝灭纳米结构是非球形纳米颗粒，诸如立方体、三棱柱、棒状、片状、笼状(例如，具有多孔壳的非球形中空颗粒)、管等。在再一个示例中，等离子体纳米结构或猝灭纳米结构是不规则形状的纳米颗粒。在本文公开的一些示例中，等离子体纳米结构的形态可以影响荧光增强的量值。例如，球形纳米颗粒、纳米片和纳米立方体可以比纳米管更多地放大荧光增强。
等离子体纳米结构或猝灭纳米结构可各自具有实心结构、中空结构或芯-壳结构。芯-壳结构具有一种材料作为芯，并且具有另一种材料作为至少部分地包封芯的壳。在一些示例中，两种不同的等离子体材料用作芯和壳。在其他示例中，芯是等离子体材料，并且壳是非等离子体材料。合适的壳材料的一些示例包括二氧化硅，金属氧化物，诸如氧化铝、二氧化钛和氧化钽，蛋白质，诸如牛血清白蛋白，以及对测序期间使用的波长透明的有机聚合物，诸如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乳酸)(PLA)和聚(丙烯酸甲酯)(PMA)。非等离子体材料不干扰芯的等离子共振。芯-壳结构的一个具体示例包括至少部分地由二氧化硅芯包封的银和金复合芯。
等离子体纳米结构或淬灭纳米结构的尺寸可以根据其形状而变化。在本文公开的示例中，等离子体纳米结构或猝灭纳米结构的最大尺寸(例如，直径、长度、中值等)是纳米级的，并且因此在约1nm至小于1000nm的范围内。在一些示例中，纳米结构是直径大于或等于1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或大于或等于100nm的纳米颗粒。在本文公开的一些示例中，等离子体纳米结构的大小可以影响荧光增强的量值。更具体地，具有不同大小的等离子体纳米结构在不同的波长共振。为了最大化荧光增强，可以考虑纳米结构共振波长。例如，建模可用于预测给定大小和形状的纳米结构的光学性质，以便以将在期望波长下共振的纳米结构为目标。在示例中，球形纳米颗粒的建模可通过米氏理论，使用光散射的麦克斯韦方程来进行。荧光增强的荧光团的化学结构也可能影响本文公开的一些示例中增强的量值。
在一些示例中，等离子体纳米结构被官能化，使得它们可以附接到水凝胶。
在一个示例中，等离子体纳米结构包括可共价连接到水凝胶的官能团的官能团。作为示例，等离子体纳米结构用炔烃(例如，二苯并环辛炔)官能化，该炔烃共价附接到水凝胶的游离叠氮基团；或者等离子体纳米结构用叠氮化物官能化，该叠氮化物共价附接到水凝胶的炔烃(例如，二炔烃)；或者等离子体纳米结构用环氧树脂官能化，该环氧树脂共价附接到水凝胶的游离胺基团。在等离子体纳米结构和水凝胶之间的其他共价键也是可能的，包括通过亲核取代反应(例如，在亲核基团与离核体基团之间)获得的那些共价键。一些具体示例包括涉及醛和肼、或胺和活化羧酸盐(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)、或硫醇和烷基化试剂、或亚磷酰胺和硫醚的那些。
在其他示例中，等离子体纳米结构能够非共价结合到水凝胶。例如，等离子体纳米结构用结合对的第一成员官能化，该第一成员与结合对的附接到水凝胶的第二成员相互作用。在示例性结合对中，第一成员和第二成员分别包括NiNTA(镍-次氮基三乙酸)配体和组氨酸标签、或链霉亲和素或抗生物素蛋白和生物素，或spytag和spycatcher。
用于等离子体增强的方法和流通池
图1A至图1E描绘了用于制造流通池基底的方法的两个不同示例，该流通池基底可在测序期间增强待读取的荧光作为光学信号。一个示例包括图1A至图1C和图1E。另一个示例包括图1A、图1B、图1D和图1E。在这些示例中的每一者中，将等离子体纳米结构掺入流通池基底的水凝胶中。该方法通常包括将水凝胶施加到基底的表面，将引物接枝到所施加的水凝胶，以及在接枝引物之前或之后，将等离子体纳米结构引入到所施加的水凝胶。
流通池基底是支撑一个或多个活性区的单层结构或多层结构。在图1A中，基底是单层结构12。合适的单层结构12的示例包括：环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的
Figure BDA0004027121070000151
)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的
Figure BDA0004027121070000152
)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融的二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(Ta2O5)或其他氧化钽(TaOx)、氧化铪(HfO2)、碳、金属、无机玻璃等。
在其他示例中，图1A至图1E所示的方法可以利用多层结构12’(也称为多层基底12’)。图2C中示出了多层结构12’的示例。多层结构12’的一些示例包括玻璃或硅，具有五氧化二钽或对光学成像中使用的光透明的另一种氧化物的涂层。多层基底12’的其他示例可包括绝缘体上硅(SOI)基底。具体参考图2C，多层结构12’的另外的其他示例包括其上具有图案化材料16的基础支持物14。
在示例中，图案化材料16可以是无机氧化物，该无机氧化物经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷选择性地施加到支持物14。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta2O5)、氧化铝(例如Al2O3)、氧化硅(例如SiO2)、氧化铪(例如HfO2)等。
作为另一个示例，图案化材料16可以是树脂基质材料，该树脂基质材料被施加到支持物14然后进行图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷的树脂、非多面体低聚倍半硅氧烷环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的
Figure BDA0004027121070000161
)以及它们的组合。
如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”(以商品名“POSS”从Hybrid Plastics商购获得)是指作为二氧化硅(SiO2)与有机硅(R2SiO)之间的杂交中间体(例如，RSiO1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是如Kehagias等人在MicroelectronicEngineering 86(2009)第776-778页中所述的，该文献以引用方式全文并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RSiO3/2]n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。POSS的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。本文所公开的树脂组合物可包括一个或多个不同的笼或芯结构作为单体单元。平均笼含量可在合成期间加以调节，并且/或者通过纯化方法控制，并且单体单元的笼尺寸分布可用于本文所公开的示例中。
在示例中，基底12、12’(无论是单层还是多层)可以是圆形的并且具有在约2mm至约300mm范围内的直径，或者可以是最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材或面板。在示例中，基底12、12’是直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。随后可以切割晶片以形成单独的流通池基底。在另一个示例中，基底12、12’是宽度在约0.1mm至约10mm范围内的管芯。虽然已经提供了示例性尺寸，但应当理解，可使用具有任何合适尺寸的基底12、12’又如，可使用作为矩形支持物的面板，该面板具有比300mm圆形晶片更大的表面积。随后可以切割面板以形成单独的流通池。
在图1A中，基底被描绘为具有平坦表面并且没有任何特定架构的单层结构12。然而，应当理解，基底12或12’包括其中形成活性区的一些架构。在一些示例中，基底12或12’的架构包括其中形成活性区的单个泳道18(参见图2B)。在这些示例中，单个泳道18被间隙区域22围绕。在其他示例中，基底12、12’的架构包括其中形成活性区的凹入部20(参见图2C)。在这些示例中，凹入部20由间隙区域22分开。单个泳道18或凹入部20可以形成在单层基底12中，或者可以形成在多层结构12'的最外层中。单个泳道18或凹入部20可通过蚀刻、压印、纳米压印光刻或另一种合适的技术来限定，这取决于基底12、12’的材料。将参考图2A、图2B和图2C更详细地描述基底12、12’的架构。
如图1B所示，方法的每个示例包括将水凝胶24施加到基底12、12’的表面26。基底12、12’的表面26可包括单个泳道18或凹入部20以及间隙区域22。
水凝胶24可以是任何凝胶材料，当吸收液体时该凝胶材料可溶胀，并且当例如通过干燥移除液体时该凝胶材料可收缩。在示例中，水凝胶24包括丙烯酰胺共聚物，诸如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。PAZAM和丙烯酰胺共聚物的一些其他形式由以下结构(I)表示：
Figure BDA0004027121070000171
其中：
RA选自叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
RB为H或任选地取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自H和任选地取代的烷基；
-(CH2)p-中的每一者可任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；并且
m为在1至100,000范围内的整数。
本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM的分子量可在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可为约312kDa。
在一些示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为直链聚合物。在一些其它示例中，丙烯酰胺共聚物的PAZAM和其它形式为轻度交联的聚合物。
在其他示例中，水凝胶24可为结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺
Figure BDA0004027121070000181
替换。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用
Figure BDA0004027121070000182
替换，其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基(而不是H，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括
Figure BDA0004027121070000191
其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。
作为水凝胶24的另一个示例，结构(I)中反复出现的“n”特征可用包括具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替换：
Figure BDA0004027121070000192
其中R1为H或C1-C6烷基；R2为H或C1-C6烷基；L为包括直链的连接基，其具有2至20个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有附接到N上的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个含碳环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。
利用本文先前描述的水凝胶24示例，RA、NH2和/或N3中的任一者可附接到等离子体纳米结构10(参见图1D)，这取决于等离子体纳米结构10的表面处的官能化。RA和/或N3中的一些可替代地附接寡核苷酸引物28A、28B(参见图1C)。另外，可以将用于等离子体纳米结构10附接的结合对成员或另一官能团引入到水凝胶24中，例如作为聚合中使用的单体的一部分，或在水凝胶24形成之后的接枝过程中，或在化学改性反应中。
应当理解，可以使用其他水凝胶24，只要它们被官能化以将寡核苷酸引物28A、28B接枝到其上，并且将等离子体纳米结构10附接到其上。合适的水凝胶24的一些示例包括官能化聚硅烷，诸如降冰片烯硅烷、叠氮基硅烷、炔烃官能化硅烷、胺官能化硅烷、马来酰亚胺硅烷或具有可以附接期望的等离子体纳米结构10和寡核苷酸引物28A、28B的官能团的任何其他聚硅烷。合适的水凝胶24的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的聚合物水凝胶的另外其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括星型聚合物、星形或星型嵌段聚合物、树枝状体等。例如，可将单体(例如，丙烯酰胺、包含催化剂的丙烯酰胺等)无规或以嵌段掺入星形形状聚合物的支链(臂)中。
水凝胶24可使用任何合适的共聚过程形成。为了将水凝胶24引入表面26中，可生成水凝胶24的混合物，并且然后将其施加到基底12或12’。在一个示例中，水凝胶24可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂或者浸渍或浸涂或者正压或负压下材料流或者另一种合适的技术将混合物施加到基底表面26。这些类型的技术在基底12或12’上(例如，在泳道18中、在凹入部20中、在间隙区域22上)毯覆式地沉积水凝胶24。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将水凝胶24特定地沉积在泳道18中，或凹入部20中而不是沉积在间隙区域22上。
根据聚合物水凝胶24的化学性质，可将所施加的混合物暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。
水凝胶24与基底12或12’的附接可以通过共价键合来进行。在一些情况下，可以首先例如通过硅烷化或等离子体灰化来激活下面的基底12或12’。在一个示例中，硅烷化涉及将降冰片烯硅烷引入到基底12或12’表面。水凝胶24与基底12或12’的共价连接有助于在多种用途期间在流通池的整个使用寿命内将引物28A、28B和等离子纳米颗粒10保持在活性区中。
当水凝胶24沉积在泳道18中或凹入部20中以及间隙区域22上时，该方法还可包括在接枝引物28A、28B之前和引入等离子体纳米颗粒10之前从间隙区域22移除水凝胶24。移除水凝胶24可涉及抛光过程。抛光过程可以用化学浆料执行，该化学浆料可以从间隙区域22中移除聚合物水凝胶24而不会有害地影响那些区域22处的下面的基底，并且同时使聚合物水凝胶24至少基本上完整地留在泳道18中或凹入部20中。化学浆料的示例可包括研磨颗粒、缓冲液、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂。另选地，可利用不包括磨料颗粒的溶液执行抛光。化学浆料或溶液可用于化学机械抛光系统以抛光间隙区域22的表面。作为一个示例，抛光头可为Strasbaugh ViPRR II抛光头。
该方法的一个示例进行到图1C，其中引物28A、28B在引入等离子体纳米颗粒10之前接枝到水凝胶24。接枝可涉及通过沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配或将引物28A、28B附接到聚合物水凝胶24的另一种合适方法的流动。这些示例性技术中的每一者可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包含引物28A、28B、水、缓冲液和催化剂。利用接枝方法中的任一种接枝方法，引物28A、28B与聚合物水凝胶24的反应性基团反应并且对周围基底12、12’(例如，间隙区域22)没有亲和力。因此，引物28A、28B选择性地接枝到聚合物水凝胶24。
在示例中，引物28A、28B可以通过引物28A、28B的5'末端处或其附近的单点共价附接固定到聚合物水凝胶24。该附接使i)引物28A、28B的衔接子特异性部分自由地退火至其同源测序就绪核酸片段，以及ii)3'羟基基团自由地用于引物延伸。任何合适的共价附接均可用于此目的。可使用的封端的引物的示例包括炔烃封端的引物(例如，其可附接到聚合物水凝胶24的叠氮化物表面部分)、或叠氮化物封端的引物(例如，其可附接到聚合物水凝胶24的炔烃表面部分)。
合适的引物28A、28B的具体示例包括在Illumina Inc.销售的商业流通池的表面上使用的P5和P7引物，以在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、GENOME ANALYZERTM、ISEQTM和其他仪器平台上进行测序。
在接枝引物28A、28B之后(如图1C所示)，该方法的该示例继续将等离子体纳米颗粒10引入水凝胶24。这在图1E中示出。
可以将等离子体纳米颗粒10分散在水中，并且然后可以用分散体冲洗基底12、12’(在该示例中，其上有水凝胶24和引物28A、28B)。冲洗可涉及通过沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、搅打分配或将等离子体纳米颗粒10引入到聚合物水凝胶24的另一种合适方法的流动。可以允许纳米颗粒分散体在基底12、12’上温育，使得等离子体纳米颗粒10可附接到水凝胶24。温育时间和附接机制将取决于等离子体纳米颗粒10和水凝胶24的官能化、等离子体纳米颗粒10和水凝胶24的浓度等。在示例中，温育时间可在2分钟至12小时的范围内。在一些示例中，在室温(例如约25℃)下温育的时间范围为约5分钟至约1小时，例如约5分钟至约30分钟，或约1分钟至约10分钟等。
作为图1A至图1C和图1E所示的方法的结果，水凝胶24包括引物28A、28B和附接到其的等离子纳米颗粒10。
返回参考图1B，在施加水凝胶24之后，该方法的另一个示例进行到图1D，其中在引物28A、28B被接枝之前将等离子体纳米颗粒10引入水凝胶24。可以将等离子体纳米颗粒10分散在水中，并且然后基底12、12’(在该示例中，其上有水凝胶24)可用如本文所述的分散体冲洗。
在引入等离子体纳米颗粒10之后(如图1D所示)，该方法的该示例继续将引物28A、28B接枝到其上附接有等离子体纳米颗粒10的水凝胶24。这在图1E中示出。引物28A、28B可以如参考图1C所述的那样接枝。
作为图1A、图1B、图1D和图1E所示的方法的结果，水凝胶24包括引物28A、28B和附接到其的等离子纳米颗粒10。
图1E中所示的结构描绘了流通池的活性区的一个示例。活性区的该示例包括具有引物28A、28B的水凝胶24和附接到其的等离子体纳米颗粒10。如上所述，活性区可位于流通池的单个泳道18中(参见图2B)或可以位于流通池的凹入部20中(参见图2C)。现在将描述流通池的这些示例中的每个示例。
流通池30的示例的顶视图在图2A中示出。如将参考图2B所讨论的，流通池30A的一些示例包括两个相对的基底12和12A，每个基底包括支撑其中可进行测序的活性区32和32A的泳道18、18A。在这些示例中的每个示例中，在基底12和12A之间限定流动通道34。如将参考图2C所讨论的，流通池30B的其他示例包括两个相对的基底12’和12”，每个基底包括支撑其中可进行测序的活性区32’和32”的凹入部20、20’。在这些示例中的每个示例中，流动通道34限定在基底12’和12”之间。在其他示例中，流通池30包括一个基底12或12’(支撑一个或多个活性区32或32’)以及附接到基底12或12’的盖。在这些示例中，流动通道34限定在基底12或12’与盖之间。
在图2A中所示的示例中，流通池30包括多个流动通道34。虽然示出了八个通道34，但是应当理解，流通池30中可以包括任何数量的通道34(例如，单个通道34、四个通道34，等等)。每个流动通道34可与流通池30中的每个其他流动通道34分离，使得引入任何特定流动通道34中的流体不流到任何相邻的流动通道34中。用于扩增、成簇、测序、去封端等的试剂可以分别通过输入端口和输出端口引入到流动通道34中并从其移除。
可使用部分地取决于基底12和12A或12’和12”的材料的任何合适的技术将流动通道34的一部分限定在基底12和12A或12’和12”中。在一个示例中，将流动通道34的一部分蚀刻到玻璃基底(例如，12和12A)中。在另一个示例中，可使用光刻、纳米压印光刻等将流动通道34的一部分图案化成多层基底12’的材料16。可将单独材料36施加到基底12或12’，使得单独材料36限定流动通道34的壁的至少一部分。
在示例中，流动通道34具有带圆形端部的大致矩形构型。流动通道34的长度和宽度可分别小于基底12或12’的长度和宽度，使得基底表面的围绕流动通道34的部分可用于附接到另一基底12A或12”或附接到盖。在一些情况下，每个流动通道34的宽度可以为至少约1mm、至少约2.5mm、至少约5mm、至少约7mm、至少约10mm或更大。在一些情况下，每个流动通道34的长度可以为至少约10mm、至少约25mm、至少约50mm、至少约100mm或更大。每个流动通道34的宽度和/或长度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。在另一个示例中，流动通道34是正方形(例如，10mm×10mm)。
例如，当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积至少部分地限定流动通道壁的单独材料36时，每个流动通道34的深度可以小至几个单层厚。在其他示例中，每个流动通道34的深度可以为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，每个流动通道34的深度也可大于、小于上文指定的值或介于它们之间。例如，当包括凹入部20时，流动通道34的深度也可沿着流通池30B的长度和宽度变化。
图2B示出了包括泳道18、18A的流通池30A的剖视图。在该示例中，流动通道34的一部分限定在单层基底12、12A中的每一者中。例如，泳道18、18A内未被活性区32、32A的部件占据的空间可以被认为是流动通道34的一部分。
相应基底12、12A的泳道18、18A内的活性区32、32A包括表面26或26A上的水凝胶24或24A，附接到水凝胶24或24A的引物28A、28B，以及附接到水凝胶24或24A的等离子体纳米颗粒10、10A。这些活性区32、32A中的每一者可根据参考图1A至图1E描述的方法中的任一种方法在基底12、12A上制备，并且然后基底12、12A可以彼此附接以形成流通池30A的示例。可以使用任何合适的单独材料36(诸如粘合剂、有助于粘结的辐射吸收材料等)将基底12、12A粘结在一起。
图2C示出了流通池30B的剖视图，该流通池包括在多层基底12’、12”的图案化材料16、16’中限定的凹入部20、20’。如图2C中所示，图案化材料16、16’包括分别限定于其中的凹入部20、20’以及将相邻凹入部20、20’分开的间隙区域22、22’。
可设想凹入部20、20’的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在示例中，凹入部20、20’设置在六边形网格中，以便紧密堆积和改善密度。其他布局可包括例如直线(矩形)布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以为呈行和列形式的凹入部20、20’的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以为凹入部20、20’和/或间隙区域22、22’的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可以是凹入部20、20’和/或间隙区域22、22’的随机布置。图案可包括条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、格纹、对角线、箭头和/或正方形。
凹入部20、20’的布局或图案可相对于限定区域中的凹入部20、20’的密度(例如，凹入部20、20’的数量)来表征。例如，凹入部20、20’可以大约2百万个/mm2的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm2、约1,000个/mm2、约100,000个/mm2、约1百万个/mm2、约2百万个/mm2、约5百万个/mm2、约1千万个/mm2、约5千万个/mm2或更大或更小的密度。还应当理解，图案化材料16、16’中的凹入部20、20’的密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。例如，高密度阵列可被表征为具有间隔小于约100nm的凹入部20、20’，中密度阵列可被表征为具有间隔约400nm至约1μm的凹入部20、20’，并且低密度阵列可被表征为具有间隔大于约1μm的凹入部20、20’。虽然已提供示例性密度，但应当理解，可使用任何合适的密度。凹入部20、20’的密度可部分地取决于凹入部20、20’的深度。在一些情况下，可能期望凹入部20、20’之间的间距甚至大于本文所列的示例。
凹入部20、20’的布局或图案也可根据或另选地根据从凹入部20、20’的中心到相邻凹入部20、20’的中心的平均节距或间距(中心到中心间距)或从一个凹入部20、20’的左边缘到相邻凹入部20、20’的右边缘的平均节距或间距(边缘到边缘间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。凹入部20、20’的特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在示例中，凹入部20、20'具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。
每个凹入部20、20’的尺寸可通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。
每个凹入部20、20’可具有能够限制引入流通池30B中的至少一些流体的任何体积。可以选择最小或最大体积，例如以适应流通池30B下游使用所期望的通量(例如，复用度)、分辨率、核苷酸或分析物反应性。例如，体积可为至少约1×10-3μm3、至少约1×10-2μm3、至少约0.1μm3、至少约1μm3、至少约10μm3、至少约100μm3或更大。另选地或除此之外，体积可为至多约1×104μm3、至多约1×103μm3、至多约100μm3、至多约10μm3、至多约1μm3、至多约0.1μm3或更小。
每个凹入部开口所占据的面积可基于与上文针对体积所述的标准类似的标准来选择。例如，每个凹入部开口的面积可为至少约1×10-3μm2、至少约1×10-2μm2、至少约0.1μm2、至少约1μm2、至少约10μm2、至少约100μm2或更大。另选地或除此之外，面积可为至多约1×103μm2、至多约100μm2、至多约10μm2、至多约1μm2、至多约0.1μm2、至多约1×10-2μm2或更小。每个凹入部开口所占据的面积可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
每个凹入部20、20’的深度可大到足以容纳一部分聚合物水凝胶24、24A。在一个示例中，深度可以为至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可以为至多约1×103μm、至多约100μm、至多约10μm或更小。在一些示例中，深度为约0.4μm。每个凹入部20、20’的深度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
在一些情况下，每个凹入部20、20’的直径或长度和宽度可以为至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，直径或长度和宽度可以为至多约1×103μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。在一些示例中，直径或长度和宽度为约0.4μm。每个凹入部20、20’的直径或长度和宽度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
在图2C中所示的示例中，流动通道34的一部分限定在多层基底12’、12”中的每一者中。例如，凹入部20、20’内未被活性区32’、32”的部件占据的空间可以被认为是流动通道34的一部分。
相应基底12’、12”的活性区32’、32”包括每个凹入部20、20’的表面上的水凝胶24或24’，附接到水凝胶24或24’的引物28A、28B，以及附接到水凝胶24或24’的等离子体纳米颗粒10、10’。这些活性区32’、32”中的每一者可根据参考图1A至图1E描述的方法中的任一种方法在基底12’、12”上制备，并且然后基底12’、12”可以彼此附接以形成流通池30B的另一个示例。可以使用任何合适的单独材料36(诸如粘合剂、有助于粘结的辐射吸收材料等)将基底12’、12”粘结在一起。
当流通池30A或30B的示例用于测序时，待测序的模板链(未示出)可以使用附接到水凝胶24、24A的引物28A、28B在活性区32、32A或32’、32”中形成。在模板链形成开始时，可由任何核酸样品(例如，DNA样品或RNA样品)制备文库模板。DNA核酸样品可被片段化成单链的、大小相似(例如，小于1000bp)的DNA片段。RNA核酸样品可用于合成互补DNA(cDNA)，并且cDNA可被片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的cDNA片段。在制备期间，可将衔接子添加到片段中的任一个片段的末端。通过减少循环扩增，可在衔接子中引入不同的基序，诸如测序引物结合位点、索引，以及与活性区32、32A或32’、32”中的引物28A、28B互补的区域。在一些示例中，来自单个核酸样品的片段具有添加至其的相同衔接子。最终文库模板包括DNA或cDNA片段和两端的衔接子。DNA或cDNA片段代表最终文库模板的待测序部分。
可将多个文库模板引入流通池30A、30B。将多个文库模板与例如固定在活性区32、32A或32’、32”中的两种类型的引物28A、28B中的一者杂交。
然后可执行簇生成。在簇生成的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶通过3'延伸从杂交引物复制文库模板。使初始文库模板变性，保留固定在活性区32、32A或32’、32”中的拷贝。等温桥扩增或一些其他形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物杂交，并且聚合酶复制所复制的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在示例中，通过特异性碱基裂解移除反义链，留下正向模板链。成簇导致形成固定在活性区32、32A或32’、32”中的若干模板链(例如，跨如图2B所示的泳道18、18A或在如图2C所示的凹入部20、20’中)。成簇的该示例被称为桥扩增，并且是可执行的扩增的一个示例。应当理解，可使用其他扩增技术，诸如排除扩增(ExAmp)工作流程(IlluminaInc.)。
可以引入与模板链的序列的互补部分杂交的测序引物(未示出)。此测序引物使得模板链准备好用于测序。
然后可经由输入端口将包含标记核苷酸的掺入混合物引入流通池30A、30B中。除了标记核苷酸之外，掺入混合物还可包括水、缓冲液和聚合酶。当将掺入混合物引入到流通池30A、30B中时，混合物进入流动通道34并且接触其中存在模板链的活性区32、32A或32’、32”。
允许掺入混合物在流通池30A、30B中温育，并且标记核苷酸通过相应聚合酶沿着模板链掺入新生链中。在掺入期间，通过相应的聚合酶将标记核苷酸之一掺入一条新生链中，该新生链延伸一个测序引物并与模板链中的一条模板链互补。掺入以模板链依赖性方式进行，并且因此添加到新生链的标记核苷酸类型的荧光检测可用于确定模板链的序列。在单个测序循环期间跨活性区32、32A或32’、32”在模板链中的至少一些模板链中进行掺入。
由于存在3’OH封端基团，掺入的标记核苷酸可包括可逆终止特性，一旦添加标记核苷酸，该可逆终止特性就终止进一步的测序引物延伸。在温育和掺入期望的时间之后，可以在洗涤循环期间从流通池30A、30B中移除包括未掺入的标记的核苷酸的掺入混合物。洗涤循环可以涉及流通技术，其中洗涤溶液(例如，缓冲液)被引导到流动通道中、通过流动通道和然后流出流动通道，例如通过泵或其他合适的机构。
等离子体纳米颗粒10、10A存在于活性区32、32A或32'、32”中，其中模板链被固定，并且其中定位最近掺入的标记核苷酸。因此，在核苷酸掺入后，至少一些等离子体纳米结构10、10A保持在光学标记的信号增强接近度内。
在不进行进一步掺入的情况下，可通过成像事件检测最近掺入的光学标记的核苷酸。在成像事件期间，照明系统(未示出)可向活性区32、32A或32'、32”提供激发光。掺入的标记核苷酸的光学(例如，染料)标记响应于激发光而发射荧光。另外，因为至少一些等离子体纳米结构10、10A在相应染料标记的信号增强接近度内，因此来自染料标记的信号可通过等离子体共振增强。
在进行成像之后，然后可将裂解混合物引入流通池30A、30B中。在示例中，裂解混合物能够i)从掺入的核苷酸移除3'OH封端基团，并且ii)从掺入的核苷酸裂解染料标记。裂解混合物中3'OH封端基团和合适的解封剂/组分的示例可包括：可通过碱水解移除的酯部分；可用Nal、三甲基氯硅烷和Na2S2O3或用Hg(II)的丙酮/水溶液移除的烯丙基部分；可用膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))裂解的叠氮甲基；可用酸性条件裂解的缩醛，诸如叔丁氧基-乙氧基；可用LiBF4和CH3CN/H2O裂解的MOM(—CH2OCH3)部分；可用亲核试剂诸如苯硫酚和硫代硫酸盐裂解的2,4-二硝基苯亚磺酰基；可用Ag(I)或Hg(II)裂解的四氢呋喃基醚；以及可被磷酸酶(例如，多核苷酸激酶)裂解的3’磷酸。裂解混合物中合适的染料标记裂解剂/组分的示例可包括：高碘酸钠，其可裂解邻二醇；可以裂解叠氮甲基键的膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))；可以裂解烯丙基的钯和THP；可以裂解酯部分的碱基；或任何其他合适的裂解剂。
然后可以进行另外的测序循环直到对模板链进行测序。
用于淬灭的方法和流通池
本文公开的流通池30的其他示例包括淬灭纳米结构40。这些流通池中的每个流通池的部分分别在图3D中的附图标记30C、图4C中的附图标记30D和图5C中的附图标记30E处示出。在这些示例中，淬灭纳米结构40定位在如流通池30C中所示的图案化材料16的表面上，或者分散在整个图案化材料16中，如流通池30D和30E中所示。在这些示例中，流通池30C、30D、30E，等离子体纳米结构10、10A不附接到水凝胶24。
如图3D、图4C和图5C中所描绘的，流通池30C、30D、30E的每个部分包括基部支持物14；基部支持物14上方的图案化材料16，包括树脂基质材料42、42’的图案化材料16和分散在树脂基质材料42、42’的整个表面上并定位在该表面上的猝灭纳米结构40，图案化材料16限定活性区(例如，32B、32C、32D)的区域(例如，泳道18或凹入部20)，该区域被间隙区域22围绕；区域中的水凝胶24；以及附接到水凝胶24的引物28A、28B。因此，图3D、图4C和图5C中的每一者描绘了多层基底12’、12’-1、12’-2的一个示例，其中活性区32B、32C、32D形成于其上。应当理解，最终流通池30C、30D、30E包括第二多层基底12’、12’-1、12’-2，或粘结到多层基底12’、12’-1、12’-2的盖，以及限定在基底12’、12’-1、12’-2或基底12’、12’-1、12’-2和盖之间的流动通道34。
一些图案化材料16在感兴趣的激发波长(例如，在约380nm至约450nm范围内的紫色激发波长、或在约450nm至约495nm范围内的蓝色激发波长、或在约495nm至约570nm范围内的绿色激发波长)下展现出不期望的自体荧光水平。当对已经掺入到测序期间形成于凹入部20中的单独的新生链中的核苷酸的光学标记进行成像时，来自图案化材料16的自体荧光可能会增加背景噪声。流通池30C、30D、30E中的淬灭纳米结构40被定位成从图案化材料16淬灭自体荧光。这些纳米结构40可被选择为淬灭例如呈红色、绿色、蓝色、紫色或它们的组合的目标波长。因此，猝灭纳米结构40降低背景噪声，并且因此增加信噪比(SNR)，使得来自单独凹入部20内的单独簇的荧光在测序期间容易分辨。
现在参考图3A至图3D，描绘了用于制造流通池30C的示例性方法。该方法通常包括纳米压印树脂基质材料42以形成包括由间隙区域22分开的凹入部20的图案化材料16；将淬灭纳米结构40的膜46沉积到图案化材料16的表面上，膜46的厚度在约1nm至约20nm的范围内；将水凝胶24引入到凹入部20中；以及将引物28A、28B接枝到水凝胶24。
如图3A中所描绘的，该示例性方法利用材料叠堆，包括设置在基部支持物14上的树脂基质材料42。树脂基质材料42和基部支持物14可以是本文提供的示例中的任何示例。树脂基质材料42被图案化以形成图案化材料16(图3B)，以及多层基底12’的一个示例(类似于图2C中所示的)。
在图3A所示的示例中，树脂基质材料42被施加到基部支持物14。树脂基质材料42可被稀释到适于施加的粘度。合适的液体载体的示例包括丙二醇单甲基醚乙酸酯(PGMEA)、甲苯、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)等。稀释的树脂基质材料42然后可使用任何合适的施加技术施加到基部支持物14上，该施加技术可以是手动的或自动的。作为示例，树脂基质材料42的施加可以使用气相沉积技术、涂覆技术等来执行。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。在一个示例中，使用旋涂。
用于施加树脂基质材料42的技术可以使液体载体中的至少一些蒸发。在将树脂基质材料42施加到基部支持物14的表面之后，它可以被软烘烤以移除多余的液体载体。当执行时，软烘烤可以在沉积树脂基质材料42之后并且在工作印模38定位在其中之前进行。软烘烤可以在低于用于固化的温度(例如，范围为约50℃至约150℃)下进行并且持续范围为大于0秒至约3分钟的时间。在一个示例中，软烘烤时间在约30秒至约2.5分钟的范围内。
然后使用任何合适的图案化技术对树脂基质材料42进行图案化。在图3A和图3B所示的示例中，使用纳米压印光刻来对树脂基质材料42进行图案化。将纳米压印光刻模具或工作印模38压靠在树脂基质材料42的层上，以在树脂基质材料42中产生压痕。换句话讲，树脂基质材料42通过工作印模38的突出部(纳米特征部44)而凹进或穿孔。然后可在工作印模38处于适当位置的情况下将树脂基质材料42固化。
固化可以通过将施加的和纳米压印的树脂基质材料42暴露于光化辐射(诸如紫外线(UV)辐射)来实现。在一个示例中，所发射的大部分UV辐射可具有约365nm的波长。固化过程可包括单个UV暴露阶段或多个UV暴露阶段。固化后，释放工作印模38。所得固化树脂基质材料42’和多层基底12’在图3B中示出。固化树脂基质材料42’具有限定在其中的形貌特征部，并且因此被称为图案化材料16。如图3B所示，图案化材料16具有限定于其中的凹入部20，并且每个凹入部20由间隙区域22分开。
如图3C所示，该方法然后涉及将淬灭纳米结构40的膜46沉积到图案化材料16的表面上。淬灭纳米结构40可以是本文阐述的示例中的任何示例，并且可使用任何合适的技术沉积。作为示例，可以使用电沉积、喷涂或化学气相沉积来沉积淬灭纳米结构40。
淬灭纳米结构40可以沉积以形成厚度在约1nm至约20nm范围内的膜46。该厚度将淬灭纳米结构40置于在固化树脂基质材料42’中荧光团的信号猝灭接近度内。
如图3D所示，该方法然后包括将水凝胶24引入到凹入部20中，以及将引物28A、28B接枝到水凝胶24。水凝胶24施加可以如参考图1B所述来进行，并且引物28A、28B接枝可以如参考图1E所述来进行。在其他示例中，水凝胶24可用引物28A、28B预接枝，并且因此可以不进行附加接枝过程。
在水凝胶24施加之前，膜46可以被活化，例如用硫化物降冰片烯衍生物，或可附接到猝灭纳米结构40的另一种降冰片烯衍生物活化。对于硫化物降冰片烯衍生物，硫化物可附接到膜46中的猝灭纳米结构40，并且降冰片烯可附接到随后沉积的水凝胶24。
应当理解，当在(预接枝)水凝胶24施加期间执行抛光时，膜46中的淬灭纳米结构40可能不从间隙区域22移除。
该示例性方法在凹入部20中的每一者中生成活性区32b的另一个示例。该活性区32B包括在每个凹入部20的表面上的水凝胶24以及附接到水凝胶24的引物28A、28B。淬灭纳米结构40可以或可以不被认为是活性区32b的一部分。如本文所述，淬灭纳米结构40定位成从固化树脂基质材料42’淬灭信号。膜46中的一些淬灭纳米结构40也可以定位在在测序期间引入到凹入部20中的光学标记的信号增强接近度内。这些淬灭纳米结构40可以具有淬灭固化树脂背景信号和增强光学标记信号的双重功能。
图3D中所示的具有膜46和活性区32B的多层基底12’形成流通池30C的一部分，并且可以附接(例如，经由单独的材料36)到另一个多层基底12’(具有膜46和活性区32B)或附接到盖以形成最终的流通池30C。最终流通池30C的架构可类似于图2C中所示的架构。
图4A至图4C和图5A至图5C示出用于制造流通池30D和30E的其他示例性方法。该示例性方法通常包括将淬灭纳米结构40掺入到树脂基质材料42中；图案化树脂基质材料42以限定被间隙区域22围绕的活性区的区域48；将水凝胶24引入到区域48中；以及将引物28A、28B接枝到水凝胶24。
现在参考图4A至图4C，描绘了用于制造流通池30D的示例性方法。如图4A中所描绘的，该示例性方法利用材料叠堆，包括基部支持物14以及在基部支持物14上方的树脂基质材料42，其中树脂基质材料42包括分散在其中的淬灭纳米结构40。
基部支持物14可以是本文提供的示例中的任何示例。
树脂基质材料42和淬灭纳米结构40也可以是本文提供的示例中的任何示例。在该示例中，淬灭纳米结构40分散在整个树脂基质材料42中。在将树脂基质材料42施加到基部支持物14上之前，该方法可涉及将猝灭纳米结构40掺入到树脂基质材料42中。在示例中，淬灭纳米结构40以猝灭纳米结构40和树脂基质材料42的混合物总重量的约0.1重量％至约10重量％范围内的量掺入到树脂基质材料42中。淬灭纳米结构40可被添加到树脂基质材料42中以形成混合物，并且可以搅拌或以其他方式搅动混合物以分散淬灭纳米结构40。
在图4A所示的示例中，将具有分散在其中的猝灭纳米结构40的树脂基质材料42施加到基部支持物14。具有分散在其中的淬灭纳米结构40的树脂基质材料42可用液体载体的任何示例稀释到适于施加的粘度。然后可以使用任何合适的施加技术将具有分散在其中的淬灭纳米结构40的稀释树脂基质材料42施加在基部支持物14上。在施加之后，具有分散在其中的淬灭纳米结构40的树脂基质材料42可以被软烘烤以移除多余的液体载体，如参考图3A和图3B所述。
然后，例如使用纳米压印光刻将具有分散在其中的猝灭纳米结构40的树脂基质材料42图案化，以限定被间隙区域22围绕的区域48，如图4B所示。在该示例中，区域48是泳道18，并且间隙区域22围绕泳道18。如图4A中所描绘，在该示例性方法中，工作印模38包括一个或多个纳米特征部44，该纳米特征部是要形成的泳道18的负复制品。当工作印模38被压入具有分散在其中的猝灭纳米结构40的树脂基质材料42中时，可以如参考图3A和图3B所述固化树脂。所得固化树脂基质材料42’(图案化材料16)和多层基底12’-1在图4B中示出。如图4B所示，图案化材料16具有限定在其中的泳道18，并且泳道18被间隙区域22围绕。
如图4C所示，该方法然后涉及将水凝胶24引入到区域48(在这种情况下为泳道18)中，以及将引物28A、28B接枝到水凝胶24。水凝胶24施加可以如参考图1B所述来进行，并且引物28A、28B接枝可以如参考图1E所述来进行。在其他示例中，水凝胶24可用引物28A、28B预接枝，并且因此可以不进行附加接枝过程。
该示例性方法在泳道18中生成活性区32C的另一个示例。该活性区32C包括在泳道18的表面上的水凝胶24以及附接到水凝胶24的引物28A、28B。在该示例中，淬灭纳米结构40不被认为是活性区32C的一部分。
图4C中所示的具有活性区32C的多层基底12’-1形成流通池30D的一部分，并且可以附接(例如，经由单独的材料36)到另一个多层基底12’-1或附接到盖以形成最终的流通池30D。最终流通池30D的架构可类似于图2B中所示的架构。
现在参考图5A至图5C，描绘了用于制造流通池30E的示例性方法。如图5A中所描绘的，该示例性方法利用材料叠堆，包括基部支持物14以及在基部支持物14上方的树脂基质材料42，其中树脂基质材料42包括分散在其中的淬灭纳米结构40。
基部支持物14可以是本文提供的示例中的任何示例。
树脂基质材料42和淬灭纳米结构40也可以是本文提供的示例中的任何示例。在该示例中，淬灭纳米结构40分散在整个树脂基质材料42中，如参考图4A至图4C所述。
然后，例如使用纳米压印光刻将具有分散在其中的猝灭纳米结构40的树脂基质材料42图案化，以限定被间隙区域22围绕的区域48，如图5B所示。在该示例中，每个区域48是凹入部20，并且间隙区域22围绕凹入部20。如图4A中所描绘，在该示例性方法中，工作印模38包括一个或多个纳米特征部44，该纳米特征部是要形成的凹入部20的负复制品。当工作印模38被压入具有分散在其中的猝灭纳米结构40的树脂基质材料42中时，可以如参考图3A和图3B所述固化树脂。所得固化树脂基质材料42’(图案化材料16)和多层基底12’-2在图5B中示出。如图5B所示，图案化材料16具有限定于其中的多个凹入部20，并且每个凹入部20由间隙区域22分开。
如图5C所示，该方法然后涉及将水凝胶24引入到区域48(在这种情况下为凹入部20)中，以及将引物28A、28B接枝到水凝胶24。水凝胶24施加可以如参考图1B所述来进行，并且引物28A、28B接枝可以如参考图1E所述来进行。在其他示例中，水凝胶24可用引物28A、28B预接枝，并且因此可以不进行附加接枝过程。
该示例性方法在每个凹入部20中生成活性区32D的另一个示例。该活性区32D包括在每个凹入部20的表面上的水凝胶24以及附接到水凝胶24的引物28A、28B。在该示例中，淬灭纳米结构40不被认为是活性区32D的一部分。
图5C中所示的具有活性区32D的多层基底12’-2形成流通池30E的一部分，并且可以附接(例如，经由单独的材料36)到另一个多层基底12’-2或附接到盖以形成最终的流通池30E。最终流通池30E的架构可类似于图2C中所示的架构。
流通池30C、30D和30E的示例可用于如本文对于流通池30A和30B所述的测序方法中。由于存在猝灭纳米结构40，因此可以在测序期间增加信噪比。对于流通池30C、30D和30E，参考流通池30A和30B描述的等离子体增强可以发生或可以不发生，并且将部分地取决于在成像期间淬灭纳米结构40距每个掺入的标记核苷酸的光学标记的距离。
用于等离子体增强和用于淬灭的流通池
本文公开的流通池30的另外的其他示例是杂合物。一个示例是图2C所示的流通池30B和图3D所示的流通池30C的杂合物。该示例包括水凝胶24中的等离子体纳米结构10和在图案化材料16上形成的膜46中的猝灭纳米结构40。另一个示例是图2B所示的流通池30A和图4C所示的流通池30D的杂合物。再一个示例是图2C所示的流通池30B和图5C所示的流通池30E的杂合物。这些示例包括水凝胶24中的等离子体纳米结构10和图案化材料16中的猝灭纳米结构40。
杂合物示例可用于如本文对于流通池30A和30B所述的测序方法中。由于等离子体纳米结构10和猝灭纳米结构40两者的存在，来自每个掺入的标记核苷酸的光学标记的信号可增强并且来自固化树脂基质材料42’的信号可被淬灭。因此，在测序期间可以增加信噪比。
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供这些实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。
非限制性工作示例
实施例1
进行此示例以证明从掺入流通池的水凝胶中的等离子体纳米颗粒的荧光增强。
在该示例中，使用具有八个流动通道(长8cm)的图案化流通池。在该示例中，流动通道被称为泳道1-8。每个流动通道包括在图案化树脂材料中形成的凹入部。
第一流动通道和第二流动通道(泳道1和2)是对照流动通道，并且不涂覆有任何水凝胶。第三流动通道至第八流动通道(泳道3-8)涂覆有荧光PAZAM(即，
Figure BDA0004027121070000361
545染料接枝到其的PAZAM)。
用银纳米立方体(约75nm)在水中制备了具有不同纳米颗粒浓度的五种不同的等离子体纳米颗粒溶液。溶液的浓度示于表1中。
表1
纳米颗粒溶液ID 纳米颗粒浓度
NPS 1 1mg/mL
NPS 2 0.75mg/mL
NPS 3 0.5mg/mL
NPS 4 0.25mg/mL
NPS 5 0.1mg/mL
将100μL的每种溶液、NPS 1-NPS 5分别在泳道3-7(涂覆有荧光PAZAM)中冲洗。100μL的NPS 1(1mg/mL)也在对照泳道2(未涂覆有荧光PAZAM)中冲洗。没有纳米颗粒溶液被引入到对照泳道1(未涂覆有荧光PAZAM)或对照泳道8(涂覆有荧光PAZAM)中。拍摄引入纳米颗粒溶液后的流通池的照片，并在本文中再现在图6A中。在原始彩色照片中，涂覆有纳米颗粒溶液的泳道为绿色，并且随着纳米颗粒浓度增加，颜色更亮。因此，对照泳道2和泳道3(各自涂覆有NPS 1以及因此最高浓度的纳米颗粒)表现出最明亮的绿色。这些颜色证实了不同纳米颗粒溶液NPS 1-NPS 5的存在。
用泳道2-7中的纳米颗粒溶液在
Figure BDA0004027121070000362
扫描仪(Amersham)上进行流通池的荧光扫描(532nm激发)。虽然本文没有再现结果，在泳道3-7(其中分别具有NPS 1-NPS 5)和对照泳道8(荧光PAZAM，但没有纳米颗粒溶液)中观察到荧光信号，但在对照泳道1或2中没有观察到荧光信号。对照泳道2的结果证实没有荧光信号从纳米颗粒本身发出。
然后将纳米颗粒溶液NPS 1-NPS 5冲洗出泳道2-7。将柠檬酸钠缓冲液引入到泳道1-8中的每一者中，并且在
Figure BDA0004027121070000371
扫描仪(Amersham)上进行流通池的另一荧光扫描(532nm激发)。来自该扫描的图像在图6B中再现，泳道8在左侧，并且泳道1在右侧。对应于图6B的图像的相对强度在图6C的曲线图中示出。如图6B和图6C所示，在没有荧光PAZAM的对照泳道1和2中没有观察到荧光信号。这些结果证实，当NPS 1从对照泳道2中被冲洗掉时，已被引入到该对照泳道中的纳米颗粒被移除。相比之下，在泳道8中观察到荧光信号，该泳道包括荧光PAZAM但没有纳米颗粒溶液，并且在泳道3-7中的每一者中观察到荧光信号，该泳道包括荧光PAZAM并且已经涂覆有NPS 1-NPS 5。这些结果表明，在相应纳米颗粒溶液从泳道3-7中冲洗掉之前，等离子体纳米颗粒确实被截留在这些泳道中的水凝胶中，因为泳道3-7中的荧光信号随着浓度的增加而增加(即，泳道3具有最强信号，而泳道7具有最弱信号)。这些结果表明纳米颗粒增强荧光信号，并且浓度可以影响增强的量值。
在将荧光PAZAM引入到泳道3-8中并且在引入纳米颗粒溶液之前，在
Figure BDA0004027121070000372
扫描仪上进行流通池的荧光扫描(532nm激发)。泳道8的扫描在用NSP 1至NSP 5中的一者进行处理之前提供经涂覆泳道的基线荧光强度测量。该基线测量在图6D的图表中示出。
在纳米颗粒溶液引入、温育和移除之后，以及在柠檬酸钠缓冲液引入之后，在
Figure BDA0004027121070000373
扫描仪(Amersham)上进行流通池的另一荧光扫描(532nm激发)。在图6D中还示出了在纳米颗粒溶液引入、温育和移除之后以及在柠檬酸钠缓冲液引入之后进行的荧光扫描(532nm激发)的泳道3-7的荧光强度。
图6D中的结果表明，引入到水凝胶中的溶液中等离子体纳米结构的浓度越大，荧光增强就越大。例如，与基线测量相比，暴露于最高浓度的纳米颗粒(1mg/mL)的泳道3在绿色(532nm)信号中达到4.5倍增强。
实施例2
为了进一步研究纳米颗粒浓度可能对等离子体纳米颗粒增强的量值的影响，制备并测试具有不同荧光水凝胶的另一流通池。
在该示例中，使用具有八个流动通道(长8cm)的图案化流通池。每个流动通道包括在图案化树脂材料中形成的凹入部。所有泳道都涂覆有第二荧光PAZAM，该第二荧光PAZAM在该示例中为ALEXA
Figure BDA0004027121070000381
488染料接枝到其的PAZAM。
在将第二荧光PAZAM引入到泳道中之后，在
Figure BDA0004027121070000382
扫描仪上进行流通池的荧光扫描(488nm激发)。泳道8的扫描在用实施例1的NSP 1至NSP 5中的一者进行处理之前提供经涂覆泳道的基线荧光强度测量。该基线测量在图7的图表中示出。
将100μL的来自实施例1的每种纳米颗粒溶液、NPS 1-NPS 5分别在泳道3-7(涂覆有第二荧光PAZAM)中冲洗。使溶液在室温下温育5分钟，然后冲洗出流通池。将柠檬酸钠缓冲液引入到泳道1-8中的每一者中，并且在
Figure BDA0004027121070000383
扫描仪(Amersham)上进行流通池的另一荧光扫描(488nm激发)。泳道3-7的荧光强度也在图7中示出。
图7中的结果表明，引入到水凝胶中的溶液中等离子体纳米结构的浓度越大，荧光增强就越大。例如，与在纳米颗粒处理之前扫描的相同流通池上获得的标准强度相比，暴露于最高浓度的纳米颗粒(1mg/mL)的泳道3在蓝色(488nm)信号中均达到4.5倍增强。这些结果与图6D所示的绿色(532nm)的结果一致。
实施例3
使用来自实施例1的相同类型的流通池。在该示例中，如下处理3个泳道：泳道1用PAZAM涂覆并用P5和P7引物接枝；泳道2用PAZAM涂覆，在室温下用来自实施例1的NPS 1(1mg/ml)处理5分钟，然后移除NPS 1，然后用P5和P7引物接枝；并且泳道3用PAZAM涂覆，用P5和P7引物接枝，并且然后在室温下用来自实施例1的NPS 1(1mg/ml)处理5分钟，然后移除NPS 1。
然后将泳道1-3中的每一者暴露于ALEXA FLUORTM 545-P5补体，该补体与泳道中的P5引物杂交并且因此被标记。在
Figure BDA0004027121070000384
扫描仪(Amersham)上进行流通池的荧光扫描(532nm激发)。虽然本文未再现结果，但在泳道1中未观察到荧光增强，但在泳道2和3(这两者均用等离子体纳米颗粒处理)中观察到荧光增强。这些结果表明，可以在引物接枝之前或之后将等离子体纳米颗粒引入水凝胶。
附加说明
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“一种示例”等意指结合该示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同此类值或子范围被明确列举一样。例如，约2mm至约300mm的范围应被解释为不仅包括明确列举的约2mm至约300mm的限值，而且还包括单个值，诸如约40mm、约250.5mm等，以及子范围，诸如约25mm至约175mm等。
此外，当利用“约”和/或“基本上”来描述值时，它们意在涵盖与所述值的微小变化(高达+/-10％)。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。
代表性特征。
代表性特征在以下编号的条款中阐述，该条款独立于说明书的文本和/或附图中公开的一个或多个特征或可与说明书的文本和/或附图中公开的一个或多个特征以任何组合的方式组合：
1.一种方法，包括：
将水凝胶施加到基底的表面；
将引物接枝到所施加的水凝胶；以及
在接枝该引物之前或之后，将等离子体纳米结构引入到所施加的水凝胶。
2.根据条款1所述的方法，其中该等离子体纳米结构用炔烃官能化，该炔烃共价附接到该水凝胶的游离叠氮基团。
3.根据条款1或条款2所述的方法，其中该等离子体纳米结构用叠氮化物官能化，该叠氮化物共价附接到该水凝胶的炔烃。
4.根据前述条款中任一项所述的方法，其中该等离子体纳米结构用结合对的第一成员官能化，该第一成员与该结合对的附接到该水凝胶的第二成员相互作用。
5.根据条款4所述的方法，其中该第一成员和该第二成员包括NiNTA配体和组氨酸标签，或链霉亲和素和生物素，或spytag和spycatcher，或马来酰亚胺和半胱氨酸，或N-羟基琥珀酰亚胺酯和胺，或醛和肼，或胺和活化羧酸盐，或胺和N-羟基琥珀酰亚胺酯，或硫醇和烷基化试剂，或亚磷酰胺和硫醚。
6.根据前述条款中任一项所述的方法，其中该基底的该表面包括由间隙区域分开的凹入部，并且其中该方法还包括在接枝该引物之前和引入该等离子体纳米结构之前从该间隙区域移除该水凝胶。
7.根据前述条款中任一项所述的方法，其中该基底的该表面包括被间隙区域围绕的泳道，并且其中该方法还包括在接枝该引物之前和引入该等离子体纳米结构之前从该间隙区域移除该水凝胶。
8.根据前述条款中任一项所述的方法，其中该等离子体纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
9.根据前述条款中任一项所述的方法，其中该等离子体纳米结构各自具有实心结构、中空结构或芯-壳结构。
10.一种流通池，该流通池包括：
基部支持物；
在该基部支持物上方的图案化材料，该图案化材料包括：
树脂基质材料；以及
淬灭纳米结构，该淬灭纳米结构分散在该树脂基质材料的整个表面上或定位在该表面上，
该图案化材料限定活性区的区域，该区域被间隙区域围绕；
该区域中的水凝胶；以及
附接到该水凝胶的引物。
11.根据条款10所述的流通池，其中该淬灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
12.根据条款10或条款11所述的流通池，其中该猝灭纳米结构具有实心结构、中空结构或芯-壳结构。
13.根据条款10至12中任一项所述的流通池，其中该区域包括泳道，并且该间隙区域围绕该泳道。
14.根据条款10至13中任一项所述的流通池，其中：
该区域是凹入部；
该图案化材料限定多个凹入部；并且
该多个凹入部中的每个凹入部被该间隙区域分开。
15.一种用于在流通池中测序期间增加信噪比的方法，该方法包括：
纳米压印树脂基质材料以形成图案化材料，该图案化材料包括由间隙区域分开的凹入部；
将淬灭纳米结构的膜沉积到该图案化材料的表面上，该膜的厚度在约1nm至约20nm的范围内；
将水凝胶引入到该凹入部中；以及
将引物接枝到该水凝胶。
16.根据条款15所述的方法，其中该猝灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
17.一种用于在流通池中测序期间增加信噪比的方法，该方法包括：
将淬灭纳米结构掺入到树脂基质材料中；
将该树脂基质材料图案化以限定被间隙区域围绕的活性区的区域；
将水凝胶引入到该区域中；以及
将引物接枝到该水凝胶。
18.根据条款17所述的方法，其中该淬灭纳米结构以该猝灭纳米结构和该树脂基质材料的混合物总重量的约0.1重量％至约10重量％范围内的量掺入到该树脂基质材料中。
19.根据条款17或条款18所述的方法，其中该猝灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
20.根据条款17至19中任一项所述的方法，其中该区域包括泳道，并且该间隙区域围绕该泳道。
21.根据条款17至20中任一项所述的方法，其中：
该区域是凹入部；
该图案化材料限定多个凹入部；并且
该多个凹入部中的每个凹入部被该间隙区域分开。

Claims (21)

1.一种方法，包括：
将水凝胶施加到基底的表面；
将引物接枝到所施加的水凝胶；以及
在接枝所述引物之前或之后，将等离子体纳米结构引入到所施加的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述等离子体纳米结构用炔烃官能化，所述炔烃共价附接到所述水凝胶的游离叠氮基团。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述等离子体纳米结构用叠氮化物官能化，所述叠氮化物共价附接到所述水凝胶的炔烃。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述等离子体纳米结构用结合对的第一成员官能化，所述第一成员与所述结合对的附接到所述水凝胶的第二成员相互作用。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一成员和所述第二成员包括NiNTA配体和组氨酸标签，或链霉亲和素和生物素，或spytag和spycatcher，或马来酰亚胺和半胱氨酸，或N-羟基琥珀酰亚胺酯和胺，或醛和肼，或胺和活化羧酸盐，或胺和N-羟基琥珀酰亚胺酯，或硫醇和烷基化试剂，或亚磷酰胺和硫醚。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述基底的所述表面包括由间隙区域分开的凹入部，并且其中所述方法还包括在接枝所述引物之前和引入所述等离子体纳米结构之前从所述间隙区域移除所述水凝胶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述基底的所述表面包括被间隙区域围绕的泳道，并且其中所述方法还包括在接枝所述引物之前和引入所述等离子体纳米结构之前从所述间隙区域移除所述水凝胶。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述等离子体纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述等离子体纳米结构各自具有实心结构、中空结构或芯-壳结构。
10.一种流通池，所述流通池包括：
基部支持物；
在所述基部支持物上方的图案化材料，所述图案化材料包括：
树脂基质材料；以及
淬灭纳米结构，所述淬灭纳米结构分散在所述树脂基质材料的整个表面上或定位在所述表面上，
所述图案化材料限定活性区的区域，所述区域被间隙区域围绕；
所述区域中的水凝胶；以及
附接到所述水凝胶的引物。
11.根据权利要求10所述的流通池，其中所述淬灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
12.根据权利要求10所述的流通池，其中所述猝灭纳米结构具有实心结构、中空结构或芯-壳结构。
13.根据权利要求10所述的流通池，其中所述区域包括泳道，并且所述间隙区域围绕所述泳道。
14.根据权利要求10所述的流通池，其中：
所述区域是凹入部；
所述图案化材料限定多个凹入部；并且
所述多个凹入部中的每个凹入部被所述间隙区域分开。
15.一种用于在流通池中测序期间增加信噪比的方法，所述方法包括：
纳米压印树脂基质材料以形成图案化材料，所述图案化材料包括由间隙区域分开的凹入部；
将淬灭纳米结构的膜沉积到所述图案化材料的表面上，所述膜的厚度在约1nm至约20nm的范围内；
将水凝胶引入到所述凹入部中；以及
将引物接枝到所述水凝胶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述猝灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
17.一种用于在流通池中测序期间增加信噪比的方法，所述方法包括：
将淬灭纳米结构掺入到树脂基质材料中；
将所述树脂基质材料图案化以限定被间隙区域围绕的活性区的区域；
将水凝胶引入到所述区域中；以及
将引物接枝到所述水凝胶。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述淬灭纳米结构以所述猝灭纳米结构和所述树脂基质材料的混合物总重量的约0.1重量％至约10重量％范围内的量掺入到所述树脂基质材料中。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述猝灭纳米结构选自由以下组成的组：金纳米结构、银纳米结构、锡纳米结构、铑纳米结构、钌纳米结构、钯纳米结构、锇纳米结构、铱纳米结构、铂纳米结构、铬纳米结构、铜纳米结构、砷化镓纳米结构、掺杂硅纳米结构、铝纳米结构、镁纳米结构、银和金复合纳米结构以及它们的组合。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述区域包括泳道，并且所述间隙区域围绕所述泳道。
21.根据权利要求17所述的方法，其中：
所述区域是凹入部；
所述图案化材料限定多个凹入部；以及
所述多个凹入部中的每个凹入部被所述间隙区域分开。
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