CN108531593A - 特异甲基化位点作为乳腺癌复发诊断标志物的应用 - Google Patents

特异甲基化位点作为乳腺癌复发诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异甲基化位点作为乳腺癌复发诊断标志物的应用。其中，特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。本发明确立了筛选疾病相关的特异甲基化位点的方法和标准，并以乳腺癌为例筛选到与乳腺癌的复发诊断相关的十个特异甲基化位点，所筛选到的特异甲基化位点作为乳腺癌的复发诊断标志物可以用于疾病的快速诊断。

Description

特异甲基化位点作为乳腺癌复发诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种特异甲基化位点作为乳腺癌复发诊断标志物的应用。
背景技术
液体活检技术被MIT technology评为2015十大科技进展，为肿瘤耐药生物标志物研究提供了新的思路。液体活检相较于组织活检优势众多，如非介入性、可重复性地获得肿瘤样本，副作用小、操作简便、成本较低、检测速度快。
循环肿瘤DNA(cfDNA)携带了肿瘤DNA的突变和甲基化信息，利用cfDNA作为肿瘤标志物，检测结果的假阳性率低，灵敏度高，准确度高。大多数蛋白质肿瘤标志物能在血液中存在数周，cfDNA的半衰期只有不到两个小时，因此可以利用cfDNA实时监控肿瘤的发展。cfDNA逐渐成为肿瘤液体活检的经典检测对象之一。但由于cfDNA含量极低(纳克级别)、降解严重，液体活检发展遭遇瓶颈，正面临巨大的挑战。
癌症，又被称为恶性肿瘤，是由控制细胞生长增殖机制的失常而引起的疾病。未复发情况下，细胞的生长增殖由包括癌基因和抑癌基因在内的一些调控生长发育的基因严密调控，保持未复发的生理状态；在受到辐射，损伤，化学污染，病毒感染以及内分泌失衡等多种因素的影响下，导致体内癌基因的激活以及抑癌基因的失活，从而导致的癌症的发生。除了基因突变之外，表观遗传如组蛋白修饰、DNA甲基化等异常调节也在癌基因的激活、抑癌基因的失活以及后续肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用，在多种癌症中均有发现表观修饰的异常。总之，肿瘤的发生时一个极其复杂的过程，是由于体内癌基因、抑癌基因以及表观修饰等异常调节并积累的结果。
DNA甲基化是一种常见的表观遗传(epigenetic)修饰，在DNA甲基转移酶催化下，利用S－腺苷甲硫氨酸提供的甲基，将胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，从而使胞嘧啶转化为5－甲基胞嘧啶，其对基因的表达调控有着至关重要的作用。
DNA甲基化与癌症的发生有着密切的关系，在许多癌症中都发现存在DNA甲基化异常的现象。DNA甲基化具有一定的稳定性，它是癌症发生中的复发事件。近年来许多研究证明，DNA的甲基化异常可以作为一种癌症诊断的生物标志物。
目前乳腺癌的主要诊断方法是影像学、超声诊断、核磁共振、血清抗原CA153，CA125，CEA，组织免疫切片等，其中组织免疫切片是乳腺癌的黄金诊断方法，但是由于其要首先获得病人的乳腺组织，给病人带来较大的痛苦。目前，复发诊断主要依据肿瘤的转移和肿瘤体积的增大，因而存在一定的滞后性。所以寻找一种能够早于影像学判断癌症复发的生物标志物对于乳腺癌的复发诊断十分迫切。
发明内容
本发明旨在提供一种特异甲基化位点作为乳腺癌复发诊断标志物的应用，以解决现有技术中的标记物并不能方便准确地诊断复发乳腺癌的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途。其中，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备试剂盒用于选自以下用途中的一项或多项：乳腺癌的复发诊断、乳腺癌患病风险的评估、乳腺癌治疗效果的评估和乳腺癌治疗药物的筛选；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
进一步地，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
进一步地，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
进一步地，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
进一步地，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸(SNUPE)、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的试剂盒。该试剂盒中包含检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平的试剂，试剂盒用于选自以下用途中的一项或多项：乳腺癌的复发诊断、乳腺癌患病风险的评估、乳腺癌癌治疗效果的评估和乳腺癌治疗药物的筛选；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
进一步地，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
进一步地，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
进一步地，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
进一步地，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平的试剂为用于焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸(SNUPE)、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱检测的试剂。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于治疗乳腺癌的药物筛选的方法。该方法包括检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的步骤；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
进一步地，当与使用筛选药物前相比，选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平升高，表明受试者用于筛选的药物有效；当与使用筛选药物前相比，甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平降低时，表明受试者用于筛选的药物有效。
进一步地，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
进一步地，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
进一步地，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
进一步地，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸(SNUPE)、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
根据本发明的又一方面，提供了一种用于乳腺癌的复发诊断、患病风险评估、治疗效果评估或药物筛选的装置。该装置包括检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的模块；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
进一步地，装置还包括评估模块，评估模块用于将受试者检测值与未复发患者检测值相比，当选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平降低时，判定为受试者有乳腺癌复发的风险；当甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平升高时，判定为受试者患有乳腺癌的风险高。
进一步地，评估模块还用于将治疗前或者使用筛选药物前的受试者检测值与治疗后或者使用筛选药物后的受试者检测值相比，当选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平升高时，判定为受试者的治疗有效或用于筛选的药物有效；甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平降低时，判定为受试者的治疗有效或用于筛选的药物有效。
进一步地，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
进一步地，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
进一步地，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
进一步地，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸(SNUPE)、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于乳腺癌的复发诊断、患病风险评估、治疗效果评估和药物筛选的生物标志物。该生物标志物为cfDNA特异甲基化位点，特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
根据本发明的又一方面，提供了一种筛选与疾病相关的特异染色体甲基化位点的方法。该方法包括以下步骤：a)获取未复发患者和复发患者血液样本；b)从a)步骤获得的样本中分离得到血浆；c)从b)步骤的血浆中提取cfDNA；d)对c)步提取的cfDNA进行甲基化建库；e)确定样本的全基因组甲基化水平；f)分析cfDNA甲基化信息；以及g)筛选未复发患者和复发患者中具有明显差异的甲基化保守位点，即为与疾病相关的特异染色体甲基化位点。
进一步地，甲基化保守位点是指在未复发患者样本中甲基化水平的标准方差SD值小于等于0.1的甲基化位点。
进一步地，具有明显差异是指未复发患者样本和复发患者样本比较，甲基化水平变化在0.2以上，且p值小于等于0.05的位点；变化为升高或降低。
进一步地，患者为乳腺癌患者。
根据本发明的又一方面，提供了一种乳腺癌的复发诊断、患病风险评估或治疗效果评估的方法。该方法包括检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的步骤；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
进一步地，将受试者检测值与未复发患者检测值相比，当选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平降低时，判定为受试者有乳腺癌复发的风险；当甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平升高时，判定为受试者患有乳腺癌的风险高。
进一步地，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
进一步地，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
进一步地，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
进一步地，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸(SNUPE)、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
根据本发明的又一方面，提供了一种cfDNA特异甲基化位点作为生物标志物用于乳腺癌的复发诊断、患病风险评估、治疗效果评估和药物筛选的用途，特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
本发明确立了筛选疾病相关的特异甲基化位点的方法和标准，并以乳腺癌为例筛选到与乳腺癌的复发诊断相关的十个特异甲基化位点。所筛选到的特异甲基化位点作为乳腺癌的复发诊断标志物可以用于疾病的诊断、快速诊断。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例2中未复发样本中筛选出的42587个保守位点的甲基化水平热图；
图2示出了实施例3中未复发样本和复发乳腺癌样本对比筛选出的72个具有明显变化的甲基化位点；
图3示出了实施例4中在42587个未复发样本中保守的位点，34个在复发乳腺癌样本中发生了明显的变化；
图4示出了实施例5中筛选出的最终的10个位点的甲基化水平及根据这10个位点的甲基化水平进行样本聚类的结果；
图5示出了实施例6中筛选出的9个高甲基化位点的受试者工作特征曲线；以及
图6示出了实施例6中筛选出的1个低甲基化位点的受试者工作特征曲线。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本发明的发明人建立了统一、标准的与疾病检测特定位点的甲基化水平的变化情况来辅助诊断复发乳腺癌的方法，并筛选到与乳腺癌患病和复发相关的特异甲基化位点，由此完成了本发明。
在本发明中，“诊断”、“患病风险评估”和“治疗效果评估”具有本领域公知的含义，例如，“诊断”是对是否复发该疾病进行判断，“患病风险评估”是对患病风险的大小以及治疗后复发风险的大小进行评估，“治疗效果评估”是对是否具有治疗效果进行评估，例如，如果症状减轻、消失，病灶减小或消失，或者疾病不再进展，则治疗有效。
在本发明中，“未复发样本”和“复发样本”具有不同的含义，未复发样本是指手术或用药后，没有复发转移的样本；复发样本是指已复发转移的样本。
在本发明中，“甲基化”是指CpG位点的甲基化。
在本发明中，甲基化水平可以采用本领域公知的表示方法，例如可以用测序时检测到的甲基化胞嘧啶C占检测到的总C的比例来表示，具体为β值(beta value),数值范围为0～1或者0～100％。在一些实施方案中，甲基化水平的表示方法为β值(beta value),数值范围为0～1。
在本发明中，甲基化水平的升高或降低的判断方法为β值的差值大于等于0.2。
在本发明中，“SD值”即标准偏差值，具有本领域公知的含义和计算方法，例如可参考《生物统计附实验设计》。
在本发明中，“p值”和“q值”具有本领域公知的含义和计算方法，例如可参考《生物统计附实验设计》，例如p值＝假设是正确但是被拒绝的概率＝阴性个数/总个数,是对与样本数据的一个检验概率。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，试剂盒用于选自以下用途中的一项或多项：乳腺癌的复发诊断、乳腺癌患病风险的评估、乳腺癌治疗效果的评估和乳腺癌治疗药物的筛选；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
本发明确立了筛选疾病相关的特异甲基化位点的方法和标准，并以乳腺癌为例筛选到与乳腺癌的复发诊断相关的十个特异甲基化位点。所筛选到的特异甲基化位点作为乳腺癌的复发诊断标志物可以用于疾病的诊断、快速诊断。
优选的，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本，该样本方便采集，不会给患者带来过多的痛苦，在本实施方式中，优选的，患者为乳腺癌患者。
优选的，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
优选的，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489，同时对十个特异甲基化位点进行检测，准确率更高。
根据本发明一种典型的实施方式，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
根据本发明一种典型的实施方式，试剂包括寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物用于扩增含有特异甲基化位点的核苷酸序列。
在本发明中，所述的试剂盒中还可以含有选自以下的一种或多种的试剂：dNTP，缓冲液，DNA聚合酶，限制性内切核酸酶(包括甲基特异性内切核酸酶)和标记物(包括荧光标记物、化学发光标记物和放射标记物等)。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的试剂盒。该试剂盒中包含检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平的试剂，试剂盒用于选自以下用途中的一项或多项：乳腺癌的复发诊断、乳腺癌患病风险的评估、乳腺癌癌治疗效果的评估和乳腺癌治疗药物的筛选；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
优选的，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
优选的，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
优选的，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
根据本发明一种典型的实施方式，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平的试剂为用于焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱检测的试剂。
根据本发明一种典型的实施方式，试剂包括寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物用于扩增含有特异甲基化位点的核苷酸序列。
在本发明中，所述的试剂盒中还可以含有选自以下的一种或多种的试剂：dNTP，缓冲液，DNA聚合酶，限制性内切核酸酶(包括甲基特异性内切核酸酶)和标记物(包括荧光标记物、化学发光标记物和放射标记物等)。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于治疗乳腺癌的药物筛选的方法。该包括检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的步骤；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
根据本发明一种典型的实施方式，当与使用筛选药物前相比，选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平升高，表明受试者用于筛选的药物有效；当与使用筛选药物前相比，甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平降低时，表明受试者用于筛选的药物有效。
优选的，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
优选的，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
优选的，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
根据本发明一种典型的实施方式，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
根据本发明一种典型的实施方式，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平的方法包括使用寡核苷酸引物扩增含有特异甲基化位点的核苷酸序列的步骤。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于乳腺癌的复发诊断、患病风险评估、治疗效果评估或药物筛选的装置。该装置包括检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的模块；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
根据本发明一种典型的实施方式，特异甲基化位点的ROC是指根据复发乳腺癌诊断标志物的特异甲基化位点绘制的受试者工作特征曲线(ROC)。详细筛选过程如下：根据实验结果，包括灵敏度和特异性，通过受试者工作特征曲线(ROC)，分析点chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489,发现chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489可以作为高甲基化的诊断方式，chr9:36303536可以作为低甲基化的诊断方式。
根据本发明一种典型的实施方式，装置还包括评估模块，评估模块用于将受试者检测值与未复发患者检测值相比，当选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平降低时，判定为受试者有乳腺癌复发的风险；当甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平升高时，判定为受试者患有乳腺癌的风险高。
根据本发明一种典型的实施方式，评估模块还用于将治疗前或者使用筛选药物前的受试者检测值与治疗后或者使用筛选药物后的受试者检测值相比，当选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平升高时，判定为受试者的治疗有效或用于筛选的药物有效；甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平降低时，判定为受试者的治疗有效或用于筛选的药物有效。
优选的，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
优选的，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
优选的，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
根据本发明一种典型的实施方式，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于乳腺癌的复发诊断、患病风险评估、治疗效果评估和药物筛选的生物标志物。该生物标志物为cfDNA特异甲基化位点，特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选与疾病相关的特异染色体甲基化位点的方法。该方法包括以下步骤：a)获取未复发患者和复发患者血液样本；b)从a)步骤获得的样本中分离得到血浆；c)从b)步骤的血浆中提取cfDNA；d)对c)步提取的cfDNA进行甲基化建库；e)确定样本的全基因组甲基化水平；f)分析cfDNA甲基化信息；以及g)筛选未复发患者和复发患者中具有明显差异的甲基化保守位点，即为与疾病相关的特异染色体甲基化位点。
根据本发明一种典型的实施方式，甲基化保守位点是指在未复发患者样本中甲基化水平的标准方差SD值小于等于0.1的甲基化位点。详细筛选过程如下：测得样本的全基因组甲基化水平，根据illumina官方Methylation Analysis Algorithms生成含有每个样品每个位点的甲基化水平即Raw data。经过质控和标准化，去除背景噪声和缺失值，将剩余的全部甲基化信息，进行分析对比。根据未复发患者样本间的甲基化水平(β值)的SD值筛选甲基化保守位点，即sd(betas of non relapse samples)≤0.1。
根据本发明一种典型的实施方式，具有明显差异是指未复发患者样本和复发患者样本比较，甲基化水平变化在0.2以上，且p值小于等于0.05的位点，变化为升高或降低。详细筛选过程如下：经过0.1、0.15、0.2、0.25和0.3等不同差异标准的尝试之后，最终确定了明显差异为未复发患者样本和复发患者癌症样本之间甲基化水平均值的差的绝对值大于等于0.2，即|mean(betas of non relapse samples)–mean(betas of relapse samples)|≥0.2。这个标准的确立，保证了既能有明显的分类效果，又能保留尽可能多的有效位点以供下一步筛选。利用limma软件包，根据未复发患者和复发癌患者的cfDNA甲基化水平比对，经过0.1、0.5、0.01和0.001等不同差异标准的尝试之后，最终确定了明显差异为p值小于等于0.05，即t.test(betas of non relapse samples,betas of relapse samples)≤0.05，这个标准的确立，保证了既能有明显的分类效果，又能保留尽可能多的有效位点以供下一步筛选。
根据本发明一种典型的实施方式，作为复发乳腺癌诊断标志物的特异甲基化位点是指在未复发患者样本中保守而在复发样本中发生异常甲基化，且对分类贡献程度最大的位点。详细筛选过程如下：利用Random Froest算法筛选出贡献程度大的位点。经过不同位点数量的尝试之后，最终选定定了分类贡献程度最大的10个位点，即CpG sites with top10MeanDecreaseAccuracy calculated by randomForest R package。这样既保证了有明显的分类效果，又能保留尽可能少的有效位点以方便临床快速检验。之后仅根据这10个位点的甲基化水平对样本进行了聚类,聚类结果符合临床预期。这10个特异甲基化位点可以作为乳腺癌复发诊断的标志物。
根据本发明一种典型的实施方式，患者为复发乳腺癌患者。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种乳腺癌的复发诊断、患病风险评估或治疗效果评估的方法。该方法包括检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的步骤；特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
优选的，将受试者检测值与未复发患者检测值相比，当选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平降低时，判定为受试者有乳腺癌复发的风险；当甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平升高时，判定为受试者患有乳腺癌的风险高。
优选的，待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
优选的，乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
优选的，特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
根据本发明一种典型的实施方式，检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种cfDNA特异甲基化位点作为生物标志物用于乳腺癌的复发诊断、患病风险评估、治疗效果评估和药物筛选的用途，特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者血液样本的收集鉴定
搜集未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者的血液样本，并经具有丰富经验的医师通过验证收集(样本由天津肿瘤医院提供)。
实施例2
保守甲基化位点的筛选
搜集获取未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者的血液样本，并利用QIAampCirculating Nucleic Acid Kit试剂盒从血浆中提取cfDNA。
具体操作步骤如下：1)利用密度梯度离心法，以1900g的转速离心，将红细胞、白细胞和血浆分离，在最上层清澈的为血浆，将血浆取出，再利用14000rpm的转速，进行再次高速离心，上层为血浆；2)将1)提取的血浆加入已经加了蛋白酶k的50ml离心管中，再加入裂解液ACL(已含有CarrierRNA)，得到第一混合液；3)将2)中最后所得第一混合液混匀，放于60℃水浴30分钟；4)将完成3)后第一混合液从水浴中取出，加入ACB，按1：1.8的比列，即1ml血浆，1.8mlACB，得第二混合液；5)将4)中得到的第二混合液利用真空泵抽滤，抽滤完后，利用ACW1、ACW2和无水乙醇进行洗涤；6)14000rpm空离3分钟，56℃蒸干去除乙醇；7)利用30ul水洗脱，得到cfDNA；8)将7)中所得的cfDNA进行甲基化建库。
利用全基因组DNA甲基化二代测序仪X-ten，测得样本的全基因组甲基化水平，根据illumina官方Methylation Analysis Algorithms生成含有每个样品每个位点的甲基化水平即Raw data，将全部甲基化信息，进行分析对比，根据样本间的甲基化水平(β值)的SD值筛选出442587个甲基化保守位点(SD值≤0.2)，结果参见图1。
实施例3
明显差异的甲基化位点的筛选
经过0.1、0.15、0.2、0.25和0.3等不同差异标准的尝试之后，最终确定了明显差异为未复发乳腺癌患者样本和复发乳腺癌患者样本之间甲基化水平均值的差的绝对值大于等于0.2这个标准的确立，保证了既能有明显的分类效果，又能保留尽可能多的有效位点以供下一步筛选。利用limma软件包，根据未复发乳腺癌患者样本和复发乳腺癌患者样本的cfDNA甲基化水平比对，经过0.1、0.5、0.01和0.001等不同差异标准的尝试之后，最终确定了明显差异为p值小于等于0.05这个标准的确立，保证了既能有明显的分类效果，又能保留尽可能多的有效位点以供下一步筛选。根据筛选后确立的标准绘制了图，参见图2。
实施例4
筛选出发生明显变化的保守性位点
根据实施例2和实施例3中的结果，筛选出两者的交集即在健康人中保守而在复发乳腺癌患者中发生明显变化的甲基化位点，结果参见图3。
实施例5
进一步筛选出作为复发乳腺癌诊断标志物的特异甲基化位点
根据实施例4结果，利用Random Froest算法筛选出贡献程度大的位点，经过不同位点数量的尝试之后，最终选定定了分类贡献程度最大的10个位点。这样既保证了有明显的分类效果，又能保留尽可能少的有效位点以方便临床快速检验。之后仅根据这10个位点的甲基化水平对样本进行了聚类(见图4)，这10个特异甲基化位点可以作为乳腺癌复发诊断的标志物。
实施例6
特异甲基化位点的ROC
根据实施例5的实验结果，通过接受者操作曲线(ROC)，分析点chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489,发现chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489可以作为高甲基化的诊断方式，chr9:36303536可以作为低甲基化的诊断方式，结果参见图5和6。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (28)

1.一种检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于选自以下用途中的一项或多项：乳腺癌的复发诊断、乳腺癌患病风险的评估、乳腺癌治疗效果的评估和乳腺癌治疗药物的筛选；所述特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
6.一种用于检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平的试剂，所述试剂盒用于选自以下用途中的一项或多项：乳腺癌的复发诊断、乳腺癌患病风险的评估、乳腺癌癌治疗效果的评估和乳腺癌治疗药物的筛选；所述特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述患者为未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平的试剂为用于焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱检测的试剂。
11.一种用于治疗乳腺癌的药物筛选的方法，其特征在于，包括检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的步骤；所述特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，当与使用筛选药物前相比，选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平升高，表明受试者用于筛选的药物有效；当与使用筛选药物前相比，甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平降低时，表明受试者用于筛选的药物有效。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
17.一种用于乳腺癌的复发诊断、患病风险评估、治疗效果评估或药物筛选的装置，其特征在于，所述装置包括检测受试者待测样品中cfDNA特异甲基化位点的甲基化水平的模块；所述特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
18.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述装置还包括评估模块，所述评估模块用于将受试者检测值与未复发患者检测值相比，当选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平降低时，判定为受试者有乳腺癌复发的风险；当甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平升高时，判定为受试者患有乳腺癌的风险高。
19.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述评估模块还用于将治疗前或者使用筛选药物前的受试者检测值与治疗后或者使用筛选药物后的受试者检测值相比，当选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个甲基化位点的甲基化水平升高时，判定为受试者的治疗有效或用于筛选的药物有效；甲基化位点chr9:36303536的甲基化水平降低时，判定为受试者的治疗有效或用于筛选的药物有效。
20.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述待测样品为乳腺癌患者的血液或血浆样本。
21.根据权利要求18所述的装置，其特征在于，所述乳腺癌患者包括未复发乳腺癌患者和复发乳腺癌患者。
22.根据权利要求20或21所述的装置，其特征在于，所述特异甲基化位点为chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489。
23.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述检测受试者待测样品中特异甲基化位点的甲基化水平所采用的方法为焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、定量和/或定性的亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、联合亚硫酸氢盐的靶向测序、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法或质谱。
24.一种用于乳腺癌的复发诊断、患病风险评估、治疗效果评估和药物筛选的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为cfDNA特异甲基化位点，所述特异甲基化位点选自chr14：62948600，chr4:105201765，chr15:20108371，chr9:77020082，chr21:10949711，chr7:135919712，chr9:36303536，chr17:50394411，chr4:49112280和chr16:62765489中的一个或多个。
25.一种筛选与疾病相关的特异染色体甲基化位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)获取未复发患者和复发患者血液样本；
b)从a)步骤获得的样本中分离得到血浆；
c)从b)步骤的所述血浆中提取cfDNA；
d)对c)步提取的所述cfDNA进行甲基化建库；
e)确定样本的全基因组甲基化水平；
f)分析cfDNA甲基化信息；以及
g)筛选未复发患者和复发患者中具有明显差异的甲基化保守位点，即为与疾病相关的特异染色体甲基化位点。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述甲基化保守位点是指在未复发患者样本中甲基化水平的标准方差SD值小于等于0.1的甲基化位点。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述具有明显差异是指未复发患者样本和复发患者样本比较，甲基化水平变化在0.2以上，且p值小于等于0.05的位点；所述变化为升高或降低。
28.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述患者为乳腺癌患者。
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