CN112608997A - 多重荧光pcr法技术筛查嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的方法、引物及探针和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多重荧光PCR技术对嗜酸性粒细胞增多相关融合基因进行筛查的方法、引物及探针和组合物，筛查的嗜酸性粒细胞增多相关融合基因包括：FIP1L1‑PDGFRa、ETV6‑PDGFRβ、ETV6‑ABL、PCM1‑JAK2、BCR‑FGFR1、ZNF198‑FGFR1共6种。本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，将嗜酸性粒细胞增多相关融合基因整合在一起进行筛查，能更全面地辅助骨髓增殖性疾病的诊断、治疗及预后监测，本发明经济、准确度高、特异性强，适于大批量样本的临床检测。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种采用多重荧光PCR技术对嗜酸性粒细胞增多相关融合基因进行筛查的方法、引物及探针和组合物。本发明筛查的嗜酸性粒细胞增多相关融合基因包括：FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ、ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1。
技术背景
嗜酸性粒细胞是人体重要的一种细胞，约占白细胞总数的0.5％到3.0％临床上多见的是嗜酸性粒细胞增多的情况，诱发原因较多，因人而异。嗜酸性粒细胞增多症(hypereosinophilic syndrome，HES)是骨髓增殖性疾病的变异型，以嗜酸性粒细胞增多伴靶器官损害为特征。表现为不明原因的血液和/或骨髓嗜酸性粒细胞(eosinopilcell，EC)持续性增多。2008年修订的世界卫生组织(WHO)淋巴和造血组织肿瘤分类新增了“伴嗜酸粒细胞增多和PDGFRa，PDGFRβ或FGFRl异常的髓系和淋系肿瘤”这一组疾病类型。2016年修订的WHO指南提出了伴有PDGFRA、PDGFRB、或FGFR1重排或PCM1-JAK2和嗜酸性粒细胞增多的髓系/淋系肿瘤各亚型诊断标准，需要对相关的融合基因进行分子分析。
del(4)(q12)导致形成FIP1L1-PDGFRα融合基因，5'端为FIP1L1基因的部分结构，断裂点一般位于第7～10内含子附近大约40kb的区域，3'端为PDGFR基因的部分结构，断裂点一般在第12内含子附近。t(5；12)(q31-33；p12)染色体易位导致形成ETV6-PDGFRβ融合基因。PDGFRβ断裂点一般位于10号外显子上游区域。目前发现至少14个fgfr1伙伴基因，最常见的是位于13q12上的znf198基因，目前通过NCBI共检索到30余例伴有t(8；13)(p11；q12)遗传学异常的病例报道，但大部分患者未进行分子学检测。
对于上述这些融合基因，断裂位点多且不确定，同时发现有大量的伴侣基因。染色体核型分析可以检测染色体异常，不能确定核型变化形成的是哪种融合基因。FISH方法存在特异性的问题，且费用较高。高通量测序可以明确未知易位位点的检测手段，单费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广。荧光PCR法可以针对已知的融合位点设计特异性的引物组合，使用全血样本提取出的RNA逆转录之后通过多重荧光PCR进行定性分析，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。
发明内容
鉴于目前嗜酸性粒细胞增多相关融合基因筛查不能满足经济便利、检测范围广和结果准确等要求。本发明设计出一套用于多重荧光PCR方法的引物和探针对嗜酸性粒细胞增多相关融合基因进行筛查。其优点在于经济、准确度高和特异性强。
一种使用多重荧光PCR技术筛查FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ,ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1这6种常见嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的核苷酸序列如下(5’to3’)：
FIP1L1-9F：GCAGAGATCCAAGATGGCAGAT
FIP1L1-10F：TTGTTCAAGACTGGGCTTCCA
FIP1L1-11F：ATATGGGAGGGCCGAATCA
FIP1L1-12F：GGGCAAATGAGAACAGCAACA
FIP1L1-13F：ACTGCTCCACCTCTGATTCCA
PDGFRα-R：CAAGACCCGACCAAGCACTAGT
PDGFRα-P：FAM-CTGCCTTATGACTCAAGATGGGAGTTTCCAA-TAMRA
PDGFRβ-R：TGTACTCATGGCCGTCAGAG
PDGFRβ-P：FAM-CTCAATCACCTTCCATCGGATCTCGTAAC-TAMRA
ETV6-A4F：CCACCCTGGAAACTCTATACACAC
ETV6-A5F：CTCTGTCTCCCCGCCTGAA
T-ABL-R：TCCAACGAGCGGCTTCAC
T-ABL-P：FAM–TCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTT-TAMRA
PCM-26F：TGAGAGCCTTGCTACTACTGATG
PCM-36F：GGCTGGAAGTCCTGATACTGA
JAK2-9R：AGAGGTAATGATGTGCATCTGC
JAK2-9P：FAM–CAAAGCTTCCCTTAATGAGCTAAGTTCAATTTC-TAMRA
JAK2-11R：CGAACAGTTTCCATCTGGTAAC
JAK2-11P：FAM-TGAGAATGAAGAGTACAACCTCAGTGGGACA-TAMRA
BCR-4F：GGGCGACCTCTTCCAGAA
ZNF198-17F：GCCTGTGTATATCCCAGTTCC
FGFR1-10R：GAACCAGAAGAACCCCAGAG
FGFR1-10P：FAM-TCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAA-TAMRA。
1.使用多重荧光PCR技术，将存在于PDGFRa基因的下游引物、及其对应的探针配对不同的上游基因FIP1L1上的多条上游引物。使用引物的核苷酸序列如下：
2.使用多重荧光PCR技术，将存在于ETV6基因的上游引物配对不同的下游基因的多条下游引物和探针。使用引物的核苷酸序列如下：
3.使用多重荧光PCR技术，将存在于JAK2基因的多条下游引物、及其对应的探针配对不同的上游基因PCM1上的多条上游引物。使用引物的核苷酸序列如下：
4.使用多重荧光PCR技术，将存在于FGFR1基因的下游引物、及其对应的探针配对不同的上游基因上的多条上游引物。使用引物的核苷酸序列如下：
筛查上述融合基因的引物探针还包括扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下(5’to3’)：
ABL1-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL1-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL1-P：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT–TAMRA。
本发明的创新点在于：
1.FIP1L1-PDGFRα发生融合基因时，PDGFRα的断裂点一般位于第12内含子附近，本方法选择跨12-13外显子区域设计引物及相应探针，FIP1L1的断裂位点较多，分布在7-10内含子区域，本发明选择在9、10、11、12、13外显子设计引物。为了最大限度的兼顾各种融合方式，减少单管体系中的引物数量，防止相互干扰。上游引物位置设计方案见图1。
2.嗜酸性粒细胞增多相关融合基因筛查的组合方案上，本发明考虑到引物二聚体、发夹结构等干扰因素，将筛查分为两组进行：
第一组，筛查FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ,ETV6-ABL融合基因，引物探针序列如下：
第二组，筛查PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1融合基因，引物探针序列如下：
本发明还提供使用多重荧光PCR技术筛查FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ,ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1这6种常见嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的引物和探针在制备筛查6种常见嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的试剂盒中的应用。
本发明还提供了使用多重荧光PCR技术筛查FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ,ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1这6种常见嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的方法，其包括以下步骤：
1.提取人全血样本中的RNA；
2.用上述引物进行PCR扩增，使用多重荧光PCR法，得到特异性扩增产物；PCR扩增条件为：95℃1min；95℃10s，58℃35s(40个循环，58℃处收集荧光)；
3.结果判读标准如下：
①使用分析软件SDS v1.5分析荧光PCR结果，CT值＞35或无荧光PCR扩增曲线为阴性，如图2；
②使用分析软件SDS v1.5分析荧光PCR结果，CT值＜35为阳性，如图3；
③使用染色体核型分析的方法，能够观察到核型变化，即为阳性，如图4；
④在标准比对序列范围内，与比对序列完全一致，则认为PCR产物为阳性，如图6。
有益效果
本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，将嗜酸性粒细胞增多相关融合基因整合在一起进行筛查，能更全面地辅助骨髓增殖性疾病的诊断、治疗及预后监测，相较于以往的FISH等方法，该方法具有更高精度，且便于结果的判读。而且本发明将引物及探针的合理配比以及优化，将检测条件达到最佳，从而大大提升了效率。该方法经济、准确度高、特异性强，适于大批量样本的临床检测。
附图说明
图1是本发明检测区域、引物设计区域示意图。
图2使用本发明引物和方法检测第一个待测样本的荧光PCR图谱(阴性)
图3使用本发明引物和方法检测第二个待测样本的荧光PCR图谱(第一组阳性)
图4使用染色体核型分析检测第二个样本的染色体核型分析图谱(t(5；12)(q33；p13))
图5使用本发明引物和方法检测第三个待测样本的荧光PCR图谱(第二组阳性)
图6使用Sanger法对第三个待测样本进行验证的Sanger测序图谱(参考序列NG_007729.1)
具体实施方式
实施例1：
本发明设计的扩增引物如下表所示：
实施例2：
血液RNA的提取：
在洁净的1.5ml离心管中加入1ml 10×红细胞裂解液，取混匀后抗凝全血0.5ml，颠倒混匀。
室温放置5min，4000rpm离心3min。弃上清，所得团块即为样本白细胞。向细胞团块中加入lml Trizol Reagent。用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显细胞团块，室温静置5min。向上述Trizol保存液中加入氯仿200μl(Trizol Reagent的1/5体积量)，盖紧离心管盖，漩涡混匀30s。待充分乳化至粉红色(无分相现象)后，在冰上静置10min。14,000rpm，4℃离心10min。从离心机中小心取出离心管，用移液器垂直吸取上清液450μl转移至另一新的装有预冷异丙醇的离心管中)。上下颠倒离心管充分混匀后，在冰上或-30℃静置10min。14,000rpm，4℃离心10min。使用75％的DEPC-乙醇(切勿触及沉淀)洗涤沉淀两次。使用无水乙醇洗涤沉淀两次。沉淀干燥后加入RNase-free水溶解，所得即为样本RNA。
10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl 82g，NaHCO3 8.4g，EDTA-Na2 3.72g，加ddH2O定容至1000ml。
实施例3：
逆转录扩增：按如下试剂及试剂量配置PCR扩增体系，其中primer mix 2.5μl，加去离子水7.5μl，加入RNA模板6μl，70℃5min预变性后放置冰上；加入5*RT buffer 4μl，Enzyme Mix 1μl(东洋纺(上海)生物科技有限公司)，去离子水7μl。其扩增程序为：37℃10min；98℃5min
实施例4：
将引物配制成MIX混合物：
将引物分成2组，按照上游引物0.4μl、下游引物0.8μl、探针0.4μl，混合成MIX，终浓度为10μM。
多重荧光PCR试剂配制：引物MIX 2μl，THUNDERBIRD Probe qPCR Mix 12.5μl，50Rox 0.5μl(东洋纺(上海)生物科技有限公司)，RNase-free dH2O 8μl，模板cDNA 2μl。
多重荧光PCR扩增程序为：95℃1min；95℃10s，58℃35s(40个循环)
实施例5：
分析荧光PCR结果，CT值＜35为阳性。
实施例6：
第一个待检全血样本检测：对第一个待检全血样本按实施例2-5所述进行RNA提取、逆转录扩增，荧光PCR、结果分析，得到图谱如图2。显示为阴性。
实施例7：
第二个待检全血样本检测：对第二个待检全血样本按实施例2-5所述进行RNA提取、逆转录扩增，荧光PCR、结果分析，得到图谱如图3。根据荧光PCR结果判断标准，显示为第一组阳性。对该样本进行染色体核型分析，染色体核型分型结果为t(5；12)(q33；p13)。染色体核型分析结果图谱4如图4。
实施例8：
第三个待检全血样本检测：对第三个待检全血样本按实施例2-5所述进行RNA提取、逆转录扩增，荧光PCR、结果分析，得到图谱如图5。根据荧光PCR结果判断标准，显示为第二组阳性。对该扩增产物进行sanger测序法验证，得到图谱6如图6。
序列表
<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司
<120> 多重荧光PCR法技术筛查嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的方法、引物及探针和组合物
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagagatcc aagatggcag at 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgttcaaga ctgggcttcc a 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atatgggagg gccgaatca 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggcaaatga gaacagcaac a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actgctccac ctctgattcc a 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagacccga ccaagcacta gt 22
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgccttatg actcaagatg ggagtttcca a 31
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtactcatg gccgtcagag 20
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcaatcacc ttccatcgga tctcgtaac 29
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccaccctgga aactctatac acac 24
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctctgtctcc ccgcctgaa 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tccaacgagc ggcttcac 18
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcagcggcca gtagcatctg actt 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgagagcctt gctactactg atg 23
<210> 15
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<212> DNA
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<400> 15
ggctggaagt cctgatactg a 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agaggtaatg atgtgcatct gc 22
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caaagcttcc cttaatgagc taagttcaat ttc 33
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgaacagttt ccatctggta ac 22
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgagaatgaa gagtacaacc tcagtgggac a 31
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
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<400> 20
gggcgacctc ttccagaa 18
<210> 21
<211> 21
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gcctgtgtat atcccagttc c 21
<210> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaaccagaag aaccccagag 20
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gatacgaagg gagggtgtac ca 22
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctcggccagg gtgttgaa 18
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgcttctgat ggcaagctct acgtctcct 29
Claims (7)
1.多重荧光PCR技术筛查FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ,ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1共6种嗜酸性粒细胞增多相关融合基因，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如下：
FIP1L1-9F：GCAGAGATCCAAGATGGCAGAT
FIP1L1-10F：TTGTTCAAGACTGGGCTTCCA
FIP1L1-11F：ATATGGGAGGGCCGAATCA
FIP1L1-12F：GGGCAAATGAGAACAGCAACA
FIP1L1-13F：ACTGCTCCACCTCTGATTCCA
PDGFRα-R：CAAGACCCGACCAAGCACTAGT
PDGFRα-P：FAM-CTGCCTTATGACTCAAGATGGGAGTTTCCAA-TAMRA
PDGFRβ-R：TGTACTCATGGCCGTCAGAG
PDGFRβ-P：FAM-CTCAATCACCTTCCATCGGATCTCGTAAC-TAMRA
ETV6-A4F：CCACCCTGGAAACTCTATACACAC
ETV6-A5F：CTCTGTCTCCCCGCCTGAA
T-ABL-R：TCCAACGAGCGGCTTCAC
T-ABL-P：FAM–TCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTT-TAMRA
PCM-26F：TGAGAGCCTTGCTACTACTGATG
PCM-36F：GGCTGGAAGTCCTGATACTGA
JAK2-9R：AGAGGTAATGATGTGCATCTGC
JAK2-9P：FAM–CAAAGCTTCCCTTAATGAGCTAAGTTCAATTTC-TAMRA
JAK2-11R：CGAACAGTTTCCATCTGGTAAC
JAK2-11P：FAM-TGAGAATGAAGAGTACAACCTCAGTGGGACA-TAMRA
BCR-4F：GGGCGACCTCTTCCAGAA
ZNF198-17F：GCCTGTGTATATCCCAGTTCC
FGFR1-10R：GAACCAGAAGAACCCCAGAG
FGFR1-10P：FAM-TCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAA-TAMRA。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，
用于PDGFRa基因检测引物和探针的核苷酸序列是：FIP1L1-9F，FIP1L1-10F，FIP1L1-11F，FIP1L1-12F，FIP1L1-13F，PDGFRα-R，PDGFRα-P；
用于ETV6基因检测引物和探针的核苷酸序列是：PDGFRβ-R，PDGFRβ-P，ETV6-A4F，ETV6-A5F，T-ABL-R，T-ABL-P；
用于JAK2基因检测引物和探针的核苷酸序列是：PCM-26F，PCM-36F，JAK2-9R，JAK2-9P，JAK2-11R，JAK2-11P；
用于FGFR1基因检测引物和探针的核苷酸序列是：BCR-4F，ZNF198-17F，FGFR1-10R，FGFR1-10P。
3.根据权利要求1或2所述的引物和探针，其特征在于，还包括扩增作为内参的管家基因
ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下：
ABL1-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL1-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL1-P：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
4.用多重荧光PCR技术筛查FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ,ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1这6种嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的组合物，其特征在于，所述组合物包括组合物1和组合物2，其中：
组合物1包括筛查FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ和ETV6-ABL融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列是：FIP1L1-9F，FIP1L1-10F，FIP1L1-11F，FIP1L1-12F，FIP1L1-13F，PDGFRα-R，PDGFRα-P，PDGFRβ-R，PDGFRβ-P，ETV6-A4F，ETV6-A5F，T-ABL-R和T-ABL-P；
组合物2包括筛查PCM1-JAK2、BCR-FGFR1和ZNF198-FGFR1融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列是：PCM-26F，PCM-36F，JAK2-9R，JAK2-9P，JAK2-11R，JAK2-11P，BCR-4F，ZNF198-17F，FGFR1-10R，FGFR1-10P。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，还包括扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下：
ABL1-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL1-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL1-P：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
6.权利要求1-5中任意一项所述的引物和探针在制备检测6种嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的试剂盒中的应用。
7.筛查及鉴定FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ、ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1共6种嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取人全血样本中的RNA；
(2)用上述引物进行PCR扩增，使用多重荧光PCR法，得到特异性扩增产物；PCR扩增条件为：95℃1min；95℃10s，58℃35s(40个循环，58℃处收集荧光)；
(3)结果判读标准如下：
①使用分析软件SDS v1.5分析荧光PCR结果，CT值＞35或无荧光PCR扩增曲线为阴性；
②使用分析软件SDS v1.5分析荧光PCR结果，CT值＜35为阳性；
③使用染色体核型分析的方法，能够观察到核型变化，即为阳性；
④在标准比对序列范围内，与比对序列完全一致，则认为PCR产物为阳性。
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