CN102827935A - 定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒 - Google Patents

定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒。该试剂盒含有用于实时定量PCR检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探针I；所述上游引物I为序列表序列1、2、3、4和5所示五种单链DNA中的至少一种；所述下游引物I为序列表序列7和8所示两种单链DNA中的至少一种；所述TaqMan探针I为序列表序列9和10所示两种单链DNA中的至少一种。本发明试剂盒具有快速、简便等检测优点，一次实验即可覆盖常见类型的FIP1L1-PDGFRA融合基因，同时还可获得其mRNA水平。本发明可用于对临床表现为嗜酸细胞增多的患者进行FIP1L1-PDGFRA融合基因筛查、疗效评价，还可用于监测微小残留病。

Description

定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒。
背景技术
许多疾病具有外周血嗜酸细胞增多的表现，其中绝大多数都是由于感染、变态反应及自身免疫性疾病引起的反应性增多，个别情况下为克隆性的血液系统恶性疾病，鉴别诊断对于这些患者的确诊及随后的治疗都十分必要。具有嗜酸细胞增多表现的髓系增殖性肿瘤（MPN）中一部分涉及血小板衍化生长因子受体α（PDGFRA）基因异常，其最常见的异常类型为具有FIP1样基因1-血小板衍化生长因子受体α（FIP1L1-PDGFRA）融合基因。除了MPN之外，FIP1L1-PDGFRA融合基因亦见于个别具有嗜酸细胞增多表现的急性髓性白血病及T细胞淋巴瘤中。染色体4q12缺失导致形成FIP1L1-PDGFRA融合基因，由于其异常隐匿，因此常规的染色体核型分析不易检测到，有必要采用PCR或FISH技术检测该融合基因来确定。2008版WHO血液恶性肿瘤诊断标准中已提出，检测到FIP1L1-PDGFRA融合基因即可以做出髓系恶性肿瘤的诊断。
确定FIP1L1-PDGFRA融合基因的另一个意义在于其形成导致酪氨酸激酶PDGFRA处于持续活化状态。该作用机制类似于慢性髓性白血病中BCR-ABL融合基因的形成导致ABL酪氨酸激酶持续活化。近十年来，以伊马替尼为代表的人工合成小分子靶向药物——酪氨酸激酶抑制剂已广泛应用于慢性髓性白血病的治疗，目前已成为其一线治疗选择。而酪氨酸激酶PDGFRA是伊马替尼的另一个靶点，临床研究已证明小剂量或间断使用伊马替尼可以使FIP1L1-PDGFRA（+）的慢性嗜酸细胞白血病、急性髓性白血病及T细胞淋巴瘤患者很快获得血液学缓解甚至分子缓解。因此对于临床表现为嗜酸细胞增多的患者很有必要进行FIP1L1-PDGFRA融合基因的筛查，此外为了评价疗效，监测微小残留病，很有必要定量而敏感地检测FIP1L1-PDGFRA融合基因水平。
目前，常用的PCR技术检测FIP1L1-PDGFRA融合基因的方法往往是定性PCR后根据PCR产物电泳结果判断是否阳性。由于FIP1样基因1（FIP1L1）在DNA水平的断裂点不固定，目前已有报道显示涉及外显子9—13，PDGFRA基因断裂点基本在外显子12上，但是断裂点也往往不同，因此电泳条带大小不固定，为鉴别是否为特异性的PCR产物，还需要通过测序来确定，从而导致PCR过程较为繁琐。此外，定性PCR不能得出定量的结果，所以无法满足当前微小残留病检测的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒中含有实时定量PCR检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探针I；
所述上游引物I为序列表序列1、2、3、4和5所示五种单链DNA中的至少一种；所述下游引物I为序列表序列6和7所示两种单链DNA中的至少一种；所述TaqMan探针I为序列表序列8和9所示两种单链DNA中的至少一种。
在上述试剂或试剂盒中，还可含有实时定量PCR检测内参基因ABL mRNA的上游引物Ⅱ、下游引物Ⅱ和TaqMan探针Ⅱ；
所述上游引物Ⅱ为序列表序列10所示的单链DNA；所述下游引物Ⅱ为序列表序列11所示的单链DNA；所述TaqMan探针Ⅱ的核苷酸序列如序列表序列12所示。
在上述试剂或试剂盒中，还可含有用于制作标准曲线的标准品；所述标准品具体可为含有序列表序列13中第142-265位所示的核苷酸序列的质粒标准品。
在上述试剂或试剂盒中，所述TaqMan探针I和Ⅱ的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
在上述试剂或试剂盒中，还可含有独立包装的荧光PCR的Master Mix。
在上述试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒中还可含有阳性对照和/或阴性对照。
本发明采用基于TaqMan探针的实时定量PCR技术来检测常见类型的FIP1L1-PDGFRA mRNA水平，具有如下优点：
1）准确而特异：由于采用了基于TaqMan技术的实时定量PCR技术检测，保证了特异性扩增。
2）覆盖全面：由于FIP1L1-PDGFRA融合基因中FIP1L1部分在DNA水平的断裂点不固定在同一内含子上，PDGFRA的断裂点也在其外显子12的不同位置，本发明分别在FIP1L1外显子9-13上设计上游引物，并将探针和下游引物设计在PDGFRA上，可覆盖目前已有的各种融合类型的FIP1L1-PDGFRa融合基因。
3）简便而快速：扩增后直接获得结果，无需再电泳及测序。
4）定量检测：采用实时定量PCR技术检测，分别检测目的基因和内参基因，并根据标准曲线获得拷贝数，计算FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平，能够准确反映肿瘤负荷，用于治疗过程中微小残留病的监测，指导临床治疗。
附图说明
图1为采用实施例1试剂盒检测12例FIP1L1-PDGFRA融合基因阳性样品PCR产物的测序和分析结果。其中，从上至下依次为编号为1-12的阳性待测样品。
图2为采用实施例1试剂盒检测不同浓度待测样品中FIP1L1-PDGFRA融合基因和内参基因ABL的扩增曲线。其中，图A为FIP1L1-PDGFRA融合基因，图B为内参基因ABL。
图3为采用实施例1试剂盒检测FIP1L1-PDGFRA融合基因和内参基因ABL的标准曲线。其中，图A为FIP1L1-PDGFRA融合基因，图B为内参基因ABL。
图4为实施例1试剂盒检测监测微小残留病结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的荧光PCR的Master mix购自美国ABI公司。
实施例1、检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒
一、FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA的RQ-PCR扩增体系Ⅰ组成
1、上游引物Ⅰ：5条分别位于FIP1L1外显子9、10、11、12和13上的引物FIe9、10、11、12和13；
2、下游引物Ⅰ：2条位于PDGFRA外显子13上的引物PDRi和PDRi2；
3、TaqMan探针Ⅰ：2条分别位于PDGFRA外显子12和13上的TaqMan探针PDpro和PDpro2；
4、荧光PCR的Master mix。
上述引物及探针的序列和终浓度如表1所示。
表1.FIP1L1-PDGFRA公共体系中的引物及探针
Figure BDA00002070107200031
注：TaqMan探针Ⅰ的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
二、内参基因ABL的RQ-PCR扩增体系Ⅱ组成
1、上游引物Ⅱ（位于ABL外显子2）：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’（序列表序列10所示），终浓度为0.3μM；
2、下游引物Ⅱ（位于ABL外显子3）：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’（序列表序列11所示），终浓度为0.3μM；
3、TaqMan探针Ⅱ（位于ABL外显子3）：5’-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3’（序列表序列12所示），浓度为0.2μM，该TaqMan探针Ⅱ的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4、荧光PCR的Master mix。
三、ABL质粒标准品
ABL质粒标准品包括1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL和1×102拷贝/μL五个浓度的ABL质粒标准浓度水溶液，其制备方法如下：
依据标准品序列覆盖并大于RQ-PCR扩增片段的产物的原则设计ABL基因PCR扩增引物5’-CCTTCAGCGGCCAGTAGC-3’和5’-GGACACAGGCCCATGGTAC-3’，以一例正常人外周血单个核细胞的总RNA反转录得到的cDNA为模板,进行PCR扩增，产物进行电泳，经鉴定后进行回收、纯化，然后连接到pGEM-T Easy载体上，转染TOP10大肠杆菌，利用蓝白斑筛选阳性克隆，对阳性克隆进行质粒小提，经测序证实，连接到pGEM-T Easy载体上的ABL基因的序列如序列表序列13所示。其中，序列表序列13的第142—172位为上述步骤二的内参基因RQ-PCR体系的上游引物Ⅱ，序列表序列13的第245—265位为上述步骤二的内参基因RQ-PCR体系的下游引物Ⅱ，序列表序列13的第210—237位为上述步骤二的内参基因RQ-PCR体系的TaqMan探针Ⅱ。
将上述测序正确的阳性克隆进行质粒中提，然后进行质粒浓度测定、计算质粒拷贝数，进行10倍系列稀释，分装成1×106拷贝/μl、1×105拷贝/μl、1×104拷贝/μl、1×103拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×101拷贝/μl，置-80℃冻存。
四、阴性对照及阳性对照
阴性对照：取离体的1例正常人外周血单个核细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。
阳性对照：取离体的1例经临床确诊为嗜酸细胞增多且经测序证实为FIP1L1-PDGFRA融合基因类型为FIP1L1部分为外显子10和PDGFRA部分为外显子12的患者的骨髓或外周血单个核细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。
五、使用方法
所有待测样品均需扩增内参基因ABL，计算ABL的拷贝数并确定待测样品的质量。待测样品合格（ABL拷贝数≥30000的样品认为合格，否则重新抽取样品再检测）的患者，进行FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA的RQ-PCR扩增。具体方法如下：
1、取离体的待测病人的骨髓或外周血单个核细胞，提取总RNA并反转录，获得待测样品的cDNA。
2、在步骤二9μl内参基因ABL的RQ-PCR扩增体系Ⅱ中，加入1μl步骤1待测样品的cDNA，进行RQ-PCR反应，计算ABL的拷贝数并确定待测样品的质量。
若待测样品合格（ABL拷贝数≥30000的样品认为合格，否则重新抽取样品再检测），用步骤一FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA的RQ-PCR扩增体系Ⅰ及步骤二9μl内参基因ABL的RQ-PCR扩增体系Ⅱ同时分管进行RQ-PCR反应。
反应程序：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，62℃1min，40个循环。
3、标准曲线的制作
每批RQ-PCR制作一个标准曲线，即扩增1×106、1×105、1×104、1×103及1×102拷贝/μl的ABL质粒标准品，其中，1×102拷贝/μl的ABL质粒标准品同时做两管平行管，其余各浓度的标准品分别扩增一管；扩增体系为9μl步骤二的扩增体系Ⅱ中分别加1μl各浓度的ABL质粒标准品。
以ABL质粒标准品起始拷贝的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，制作标准曲线。
4、对照
在每批RQ-PCR中均同时扩增步骤四的阳性对照及阴性对照。
5、数据处理
根据步骤3的标准曲线，计算各样品中FIP1L1-PDGFRA拷贝数和ABL拷贝数，计算待测样品FIP1L1-PDGFRA mRNA水平：
Figure BDA00002070107200051
6、储存条件
4℃避光储存1个月；-20℃避光储存1.5年。
实施例2、检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平试剂盒的特异性及准确率
1、待测样品：247例临床诊断为嗜酸细胞增多患者的离体骨髓或外周血单个核细胞；
2、按照文献“邱镜滢,党辉,任汉云等.自体血浆培养体系对改善白血病骨髓细胞染色体的研究.北京医科大学学报.1993,25:249-251”中的核型分析方法对步骤1的待测样品进行FIP1L1-PDGFRA融合基因鉴定，结果如表1所示；
3、使用实施例1的试剂盒检测步骤1待测样品的cDNA，结果共有12例为阳性，FIP1L1-PDGFRA mRNA水平如表1所示；
4、对步骤3的阳性PCR产物进行直接测序，与基因FIP1L1和PDGFRA基因组DNA序列进行比对，测序图谱及比对结果如图1所示，得出FIP1L1-PDGFRA融合基因类型结果如表1所示。
表1.FIP1L1-PDGFRA（+）患者融合基因类型及FIP1L1-PDGFRA mRNA水平
Figure BDA00002070107200061
结果表明：使用实施例1试剂盒检测阴性对照，无扩增产物；检测阳性对照，得到扩增产物，经测序证实为FIP1L1-PDGFRA融合基因；247例待测样品中12例为阳性，其余为阴性，经测序证实这12例阳性待测样品中均含有FIP1L1-PDGFRA融合基因；其中9例成功进行了核型分析检测，均为正常核型。
实施例3、检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平试剂盒的FIP1L1-PDGFRA融合基因及内参基因ABL标准曲线
取实施例2中编号为1的样品cDNA进行10倍系列稀释（起始浓度记为1，稀释后的浓度依次记为：10-1、10-2、10-3），分别用实施例1的试剂盒扩增四个不同浓度样品中的FIP1L1-PDGFRA融合基因及内参基因ABL，每个浓度做2个重复，FIP1L1-PDGFRA融合基因和内参基因ABL的扩增曲线和标准曲线如图2和图3所示。图3中FIP1L1-PDGFRA融合基因及内参基因ABL标准曲线的斜率分别为-3.51和-3.47,扩增效率一致，说明可以使用ABL质粒标准品制作的一条标准曲线分别定量FIP1L1-PDGFRA及ABL，并计算FIP1L1-PDGFRA mRNA水平。ABL质粒标准品的标准曲线方程为：Y=-3.50X+39.67，相关系数＞0.99，其中，Y代表CT值，X代表拷贝数的lg值。
实施例4、检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平试剂盒的灵敏度
取实施例2中编号为1的待测样品cDNA进行系列稀释（起始浓度记为1，稀释后的浓度依次记为：10-1、10-2、10-3、5×10-4、10-4），分别用实施例1的试剂盒扩增FIP1L1-PDGFRA融合基因及内参基因ABL，每个浓度做2个重复，RQ-PCR检测结果如表2所示，10-4的2管均未检测出，5×10-4的2管平均为8拷贝。因此，实施例1试剂盒检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA敏感度为10个拷贝。
表2.不同浓度样品的RQ-PCR检测结果
Figure BDA00002070107200071
实施例5、本试剂盒稳定性检测
1、日间差分析
①取实施例2中编号为2的待测样品cDNA用实施例1的试剂盒扩增FIP1L1-PDGFRA融合基因，共进行5批次RQ-PCR实验，结果如下表所示，从表中数据可知，日间差变异系数（CV）为0.71％。
  实验批次   CT值
  1   26.79
  2   26.6
  3   26.62
  4   26.34
  5   26.81
②取实施例2中编号为2的待测样品cDNA用实施例1的试剂盒扩增内参基因ABL，共进行5批次RQ-PCR实验，结果如下表所示，从表中数据可知，日间差变异系数（CV）为0.87％。
  实验批次   CT值
  1   24.65
  2   24.2
  3   24.35
  4   24.71
  5   24.56
(2)日内差分析
①取实施例2中编号为2的待测样品cDNA用实施例1的试剂盒扩增FIP1L1-PDGFRA融合基因，在同一批次进行了5个平行孔的RQ-PCR反应，结果如下表所示，从表中数据可知，日内差变异系数（CV）为0.64％。
  标本编号   CT值
  1   26.55
  2   26.78
  3   26.97
  4   26.78
  5   26.58
②取实施例2中编号为2的待测样品cDNA用实施例1的试剂盒扩增内参基因ABL，在同一批次进行了5个平行孔的RQ-PCR反应，结果如下表所示，从表中数据可知，日内差变异系数（CV）为0.48％。
  标本编号   CT值
  1   24.46
  2   24.63
  3   24.71
  4   24.73
  5   24.52
实施例6、利用FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平检测试剂盒监测微小残留病
用实施例1的检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平试剂盒对1例经形态学、细胞遗传学及分子生物学方法确诊为FIP1L1-PDGFRA融合基因阳性的慢性嗜酸细胞白血病患者在使用伊马替尼治疗过程中的FIP1L1-PDGFRA mRNA水平变化，结果如图4所示。结果表明，采用本发明的试剂盒能够定量检测出FIP1L1-PDGFRA mRNA水平的变化，准确反映白血病负荷的变化，正确评价疗效。
Figure IDA00002070108000011
Figure IDA00002070108000021
Figure IDA00002070108000031
Figure IDA00002070108000041
Figure IDA00002070108000061

Claims (6)

1.用于定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中含有用于实时定量PCR检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探针I；
所述上游引物I为序列表序列1、2、3、4和5所示五种单链DNA中的至少一种；所述下游引物I为序列表序列6和7所示两种单链DNA中的至少一种；所述TaqMan探针I为序列表序列8和9所示两种单链DNA中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中含有实时定量PCR检测内参基因ABL mRNA的上游引物Ⅱ、下游引物Ⅱ和TaqMan探针Ⅱ；
所述上游引物Ⅱ为序列表序列10所示的单链DNA；所述下游引物Ⅱ为序列表序列11所示的单链DNA；所述TaqMan探针Ⅱ的核苷酸序列如序列表序列12所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中含有用于制作标准曲线的标准品；所述标准品为含有序列表序列13中第142-265位所示核苷酸序列的质粒标准品。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述TaqMan探针I和Ⅱ的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中含有独立包装的荧光PCR的Master Mix。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中含有阳性对照和/或阴性对照。
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