CN102465172A

CN102465172A - 非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102465172A
Application number: CN2010105340181A
Authority: CN
Inventors: 李明; 何瑰; 陈华云
Original assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2010-11-04
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-11-04
Also published as: CN102465172B

Abstract

本发明涉及非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备非小细胞肺癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒。利用本发明提供的方法制备的EGFR基因探针和ERCC1基因探针，结合杂交缓冲液、未标记的竞争性DNA及DAPI复染剂可以制备一种非小细胞肺癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒，实现EGFR和ERCC1两种指标的联合检测，有助于非小细胞肺癌的预后判断和疗效预测，可用于指导个体化治疗方案制定，选择合适治疗方法，从而降低死亡率，减少复发风险，达到优化诊疗效果的目的。

Description

非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备非小细胞肺癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒，本发明的非小细胞肺癌分子标志物相关探针及相应的试剂盒可用于非小细胞肺癌的预后判断和疗效预测。

背景技术

2006年卫生部肿瘤防治办公室统计了中国十大恶性肿瘤，肺癌居男性恶性肿瘤发病率首位，全球范围内肺癌死亡率居恶性肿瘤之首。肺癌基于其生物学特性、治疗和预后分为两类：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC约占80～85％。

临床上主要根据患者的病情发展选择治疗方案，包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、分子靶向治疗及综合治疗。对于NSCLC如果发现早可以进行手术根治治疗，但实际上，其中的75～85％发现已属中晚期肺癌，无法进行根治性手术治疗，只能采取放疗为主的治疗方式，而常规放疗5年生存率仅3～10％；化疗对NSCLC敏感性差，且有较强副作用；分子靶向治疗通过抗肿瘤药物特异地作用于肿瘤细胞的某些靶点，杀伤肿瘤细胞实现治疗目的。近年来一些非小细胞肺癌分子靶向治疗药物在我国临床实践中效果都比较好，譬如靶向药物易瑞沙在治疗肺癌复发转移和晚期非小细胞肺癌中的应用，他赛瓦用于治疗一线化疗失败的晚期非小细胞肺癌等。

NCCN(National Comprehensive Cancer Network)肿瘤学临床实践指南中对非小细胞肺癌治疗前临床分期手段、术后辅助化疗的药物剂量和具体方案、二线化疗的临床指南、药物的选择和晚期肺癌的支持治疗进行了详细说明。其中列举了预后和预测的生物标记物，包括EGFR、ERCC1、K-rasT和RRM1。

本发明根据NCCN推荐指标和近年来的研究结果，选择了以下两个指标作为非小细胞肺癌检测靶标来制备基因探针：

①EGFR。表皮生长因子受体(EGFR；epidermal growth factor receptor)是一种跨膜受体，EGF结合于胞外结构域，即形成受体二聚体并激活胞内酪氨酸激酶结构域，引发激酶自磷酸化和下游分子的磷酸化，激活包括增殖和存活在内的多种细胞功能。EGFR正常情况下表达于上皮细胞表面，而在一些人类恶性肿瘤中常常过度表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，肺癌、肾癌、前列腺癌等组织中都有EGFR的过表达[RI Nicholson，JMW Gee，ME Harper.EGFR and cancer prognosis.European Journal of Cancer，2001，37(4)：9-15]。近80％～85％的NSCLC患者可检测到EGFR，其表达水平在一个连续的范围中差异很大[Y Wu，W Zhong，L Li，L Zhang，C Zhou.EGFR mutations and the correlation with gefitinib therapy in Chinese NSCLC--Asystematic review based on individual patient data from 5 medical centers in China.Journal ofClinical Oncology，2006ASCO Annual Meeting Proceedings(Post-Meeting Edition).Vol 24，No 18S，2006：7187]。随着对信号转导及其异常与肿瘤关系研究的不断深入，出现了信号转导干预治疗(interference therapy in signal transduction)，即通过单克隆抗体、免疫毒素、酪氨酸激酶抑制剂、反义核苷酸、显性负性突变体等物质，针对信号转导通路中发生异常的环节来干预这种不正常的信号转导，从而达到抑制肿瘤生长的目的。目前最常见的治疗方式是：1.单克隆抗体。与EGFR结合，竞争和阻断EGF、TGFα等配体的结合，单克隆抗体也可与抗癌药物或毒素相偶联，从而达到特异性抑制肿瘤生长之目的；2.酪氨酸激酶抑制剂[Sequist LV，Martins R G，Spigel D，et al.First-line gefitinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer harboringsomatic EGFR mutations.J Clin Oncol 2008；26：2442-2449.Tsao MS，Sakurada A，Cutz JC，et al.Erlotinib in lung cancer-molecular and clinical predictors of outcome.N Engl J Med2005；353：133-144.]。EGFR酪氨酸激酶抑制剂可分为两大类：一类为非特异性酪氨酸激酶抑制剂，能抑制所有的酪氨酸激酶；另一类为目前使用较多的选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼和厄洛替尼等。

②ERCC1。核苷酸切除修复交叉互补组1(ERCC1；excision repair cross-complementingrodent repair deficiency，complementation group 1)是核苷酸剪切修复复合体的5′核酸内切酶。ECRR1见于所有的肿瘤细胞，其表达水平差异很大。在完全切除的、未接受过围手术期化疗或放疗的NSCLC患者中，ERCC1水平是生存预后指标。肿瘤ERCC1高表达的患者生存期显著长于低表达者[Simon GR，Sharma S，Cantor A，et al.ERCC1expression is a predictor ofsurvival in resected patients with non-small cell lung cancer.Chest2005；127：978-983]。多项转化型研究证明，ERCC1水平可用于预测含铂化疗治疗NSCLC的疗效；高水平者耐药，低水平者敏感。Olaussen等发现已行手术切除的NSCLC患者中，测定的ERCC1蛋白表达可以预测含顺铂辅助治疗的获益情况[Olaussen KA，Dunant A，Fouret P，etal.DNA repair by ERCC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based a djuvant chemotherapy.N Engl J Med 2006；355：983-991]，低表达者可从辅助化疗中获益。Bepler等报道ERCC1蛋白表达水平与卡铂/吉西他滨或吉西他滨单药治疗后疾病缓解成显著负相关，低表达者缓解率更高[Bepler G，Li X，Schell M，et al.Predictive value of RRM1 and ERCC1 protein levels in aprospective community-based trial of gemcitabine/carboplatin versus gemcitabine alone[abstract].J Clin Oncol 2008；26：8033.]。

利用探针对上述两种标志物进行联合检测，有助于非小细胞肺癌的预后判断和疗效预测，可用于指导个体化治疗方案制定，选择合适治疗方法，从而降低死亡率，减少复发风险，达到优化诊疗效果的目的。

本发明提供了两种非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法，并在此基础上利用这些探针自主研制了非小细胞肺癌荧光原位杂交检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供EGFR基因探针和ERCC1基因探针的制备方法。

根据本发明一个优选的实施方案，EGFR基因探针和ERCC1基因探针的制备步骤包括：

(1)克隆筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有EGFR基因和ERCC1基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。

(2)克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆(Invitrogen RPCI11.C)，取10μl克隆菌液添加到5ml TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；针对EGFR基因探针和ERCC1基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。

(3)基因探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩；获得探针，避光、-20±5℃储存。

(4)基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。

根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有EGFR基因最优选的克隆，编号为RP11-815K24。

根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有ERCC1基因最优选的克隆，编号为RP11-752G9。

根据本发明一个优选的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列分别为EGFR基因探针：上游引物5’-ACTCCAGACATCTTTCCATCTGC-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物5’-AATCATTGCTCTCATGAGTGGTG-3’(SEQ ID NO：2)；ERCC1基因探针：上游引物5’-GCAATGAGCCGAGATAGAA-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物5’-TGGCTAGCCCATTACTCTA-3′(SEQ ID NO：4)；PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×40循环；72℃10分钟。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针制备步骤中克隆质粒DNA提取可使用市售的质粒提取试剂盒，优选Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针制备步骤中克隆质粒DNA的定量是将质粒DNA稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针制备步骤中质粒DNA进行荧光标记可以使用切口平移方法标记，利用DNaseI和DNA聚合酶I实现基因探针的荧光标记。

根据本发明一个优选的实施方案，50μl切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间，标记条件为16℃2小时。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针标记的荧光素为荧光素标记的dUTP，并优选Spectrum dUTP。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用1～2μl灭菌纯化水或Human Cot-1DNA(1μg/μl)溶解沉淀。

本发明的另一个目的是利用EGFR基因探针和ERCC1基因探针制备一种非小细胞肺癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒。

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

(1)样本处理和制片：按照原位杂交方法对各类型样本进行处理。

(2)杂交：配制杂交液，主要包括标记探针和杂交缓冲液。合适温度下进行8～16小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。

(3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，对不同信号进行观察计数。

基于以上技术方案发明的试剂盒包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA，DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g/ml。

根据本发明的一个优选实施方案，荧光标记探针混合物包括EGFR基因探针和ERCC1基因探针，每人份荧光标记探针混合物中两种基因探针的使用量均为0.5μl。

根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记探针混合物和未标记的竞争性DNA配制杂交液，其中未标记的竞争性DNA选择Human COT-1DNA。每人份杂交液中加入7μl杂交缓冲液，1μl荧光标记探针混合物，Human COT-1DNA使用量为1μg，并用H₂O补至10μl。

根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。

利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行信号计数。

本发明与现有技术相比，具有下列优点：

(1)实现了对同一样本进行两种非小细胞肺癌分子标志物的同时检测；

(2)进行准确、快速的信号计数、且结果重复性好；

(3)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞信号计数，操作相对简单；

(4)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系。

附图说明

图1显示克隆鉴定的电泳结果。目的产物298bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示代表300bp。

图2显示克隆鉴定的电泳结果。目的产物286bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示代表300bp。

图3显示人类外周血淋巴细胞中EGFR基因探针(红色)检测结果。

图4显示人类外周血淋巴细胞中ERCC1基因探针(绿色)检测结果。

图5显示非小细胞肺癌组织样本中EGFR基因(红色)和ERCC1基因(绿色)的检测结果。其中箭头分别指示出两色探针的荧光信号。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：EGFR基因探针的制备

(1)引物设计克隆筛选：EGFR基因位于人染色体7p12区段，NCBI Mapview数据库检索所有含有EGFR基因的克隆，筛选出包含有该基因的克隆，编号为RP11-815K24。

(2)克隆培养和鉴定：购买克隆RP11-815K24，取10μl克隆菌液添加到5mlTB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；菌液使用上游引物5’-ACTCCAGACATCTTTCCATCTGC-3’和下游引物5’-AATCATTGCTCTCATGAGTGGTG-3’进行PCR扩增，扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×40循环；72℃10分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果分别在298bps具有明亮的条带(参见附图1)。

(3)基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的纯化水稀释为100ng/μl，用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP，选择orange-dUTP标记EGFR基因。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

组分加入量

10×DNA聚合酶I buffer 5μl

0.5mM dTTP 1μl

1mM d3TP 1μl

DNA聚合酶I 10U/μl 1μl

DNase I 0.001U/μl 5μl

0.2mM orange-dUTP 2.5μl

模板 1μg

水补足50μl

配完后震荡混匀，16℃标记2小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。取5μl使用2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。

对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

标记产物 45μl

Human Cot-1DNA 5μl

醋酸钠(3mol/L) 5μl

无水乙醇 125μl

混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用5μl灭菌纯化水溶解沉淀，获得EGFR基因探针，避光、-20℃储存。

(4)EGFR基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(7号染色体)上均可见荧光信号。

实施例2：ERCC1基因探针的制备

(1)引物设计克隆筛选：ERCC1基因位于人染色体19q13区段，NCBI Mapview数据库检索所有含有ERCC1基因的克隆，筛选出包含有该基因的克隆，编号为RP11-752G9。

(2)克隆培养和鉴定：购买克隆RP11-752G9，取10μl克隆菌液添加到5mlTB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；菌液使用上游引物5’-GCAATGAGCCGAG

ATAGAA-3’和下游引物5’-TGGCTAGCCCATTACTCTA-3’进行PCR扩增，扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×40循环；72℃10分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果分别在286bps具有明亮的条带(参见附图2)。

(3)基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的纯化水稀释为100ng/μl，采用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP，选择green-dUTP标记ERCC1基因。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

组分加入量

10×DNA聚合酶I buffer 5μl

0.5mM dTTP 1μl

1mM d3TP 1μl

DNA聚合酶I 10U/μl 1μl

DNase I 0.001U/μl 5μl

0.2mM green-dUTP 2.5μl

模板 1μg

水补足50μl

标记产物 45μl

Human Cot-1DNA 5μl

醋酸钠(3mol/L) 5μl

无水乙醇 125μl

混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用5μl灭菌纯化水溶解沉淀，获得ERCC1基因探针，避光、-20℃储存。

(4)ERCC1基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(19号染色体)上均可见荧光信号。

实施例3：非小细胞肺癌荧光原位杂交检测试剂盒制备

以10人份/盒为例。

(1)杂交液配制

将标记好的探针依次放好，首先溶解探针。使用1μl灭菌纯化水溶解按实施例1方法制备的EGFR基因探针干粉中，充分混匀。然后另取1μl灭菌纯化水溶解实施例2方法制备的ERCC1基因探针干粉中，充分混匀。按下表方案配制荧光标记探针混合物：

按下表方案配制杂交液：

(2)DAPI复染剂配制

抗褪色液：全程操作必须避光，10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，调节pH为9.0，加入9ml甘油，反复震荡混匀，-20℃储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色，假如呈现黄色或者橙色则需废弃并重新配制。

用去离子水配制1mg/ml DAPI储存液。

取2.5μl的DAPI溶液(0.1mg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20℃避光密闭保存。

(3)成品组装

组分名称	规格	数量
			杂交液	100μl/管	1管
DAPI复染剂	100μl/管	1管
			说明书		1份

实施例4：非小细胞肺癌荧光原位杂交检测试剂盒的使用方法

以福尔马林固定石蜡包埋的肺组织样本为例。

(1)玻片预处理

玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜；取出玻片，放入室温二甲苯中30分钟，再将其放入室温1∶1(V∶V)的二甲苯：无水乙醇中10分钟，放入室温无水乙醇中10分钟，再依次放入室温100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇各3分钟；室温去离子水中静置3分钟，吸取多余水分；100±5℃的去离子水中煮片25分钟(切片水平放置于容器中，样本面朝上)，晾干后，放入37±1℃预热的蛋白酶K反应液中消化8～15分钟左右，室温2×SSC中漂洗5分钟，依次放入室温70％，90％，100％梯度乙醇脱水各3分钟。晾干玻片；继续杂交过程。

(2)样品和探针同时变性

从试剂盒中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心；加8μl的杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；85±1℃的热台上变性5分钟；将玻片放入预热的杂交盒中，避光，37±1℃孵育过夜(约16小时)；继续杂交后洗涤步骤。

(3)杂交后洗涤及复染

取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入37±1℃2×SSC中10分钟；再将其放入37±1℃0.1％NP-40/2×SSC洗涤2分钟；室温70％乙醇3分钟；暗处晾干。

复染：滴加10μl DAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

(4)结果分析

在Olympus BX51荧光显微镜下，用滤镜组分别观察DAPI复染的杂交荧光信号，用CCD照相记录。在40×物镜下寻找，在100×物镜下计数；调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到信号点；记录观察每个细胞中的各探针的数目。

(5)结果判定

按处理方法要求进行操作，记录EGFR基因、ERCC1基因的数目。荧光原位杂交结果显示：在人外周血淋巴细胞中，中期染色体上的对应靶点可见两个信号点，其它染色体区域未见荧光信号；间期细胞核中仅见两个信号点，未见其它荧光信号。在非小细胞肺癌组织样本中，核内可见双色探针荧光信号。(参见附图3～5)。

实施例5：非小细胞肺癌荧光原位杂交检测试剂盒的临床使用评价

临床回顾性研究30例非小细胞肺癌组织样本，均为晚期NSCLC，分别使用靶向药物厄洛替尼和吉西他滨联合顺铂化学治疗，如下表所示。以0～24个月的随访调查确认疾病进展或出现不可耐受的毒副反应。对这些样本使用本实施例3中所述非小细胞肺癌荧光原位杂交检测试剂盒进行检测，按照实施例4进行操作和结果判断。检测结果如表1所述。

表1EGFR和ERCC1基因状态改变

注：治疗方式1为厄洛替尼治疗，2为吉西他滨联合顺铂治疗。

从检测结果知，免疫组化EGFR高表达的样本中有31％(5/16)存在EGFR基因状态异常情况；而对于免疫组化EGFR低表达样本中仍有43％(6/14)存在EGFR基因状态异常情况。本次检测中ERCC1的阳性率为6％(2/30)。

使用SPSS17.0进行生存分析，结果如表2所示。

表2中位数生存时间

注：

组1为免疫组化高表达，组2为免疫组化低表达，组3为FISHSH检测EGFR有扩增，组4为FISH检测EGFR无扩增。

治疗方式1为厄洛替尼治疗，2为吉西他滨联合顺铂治疗。

从结果可知，在FISH检测EGFR有扩增这一组别，靶向药物厄洛替尼治疗的生存时间与吉西他滨联合顺铂治疗存在明显差异(18.00和8.25)，而其它组别中无显著差异。提示在选择靶向药物治疗时，对于IHC初筛为阴性的样本，仍应采用FISH法对EGFR基因表达作进一步检测。通过使用FISH方法进行EGFR检测的结果有助于针对性的选择治疗方案及判断预后。ERCC1检测结果中2例阳性病例使用吉西他滨联合顺铂治疗，效果均不理想，提示从一定程度上预测铂类药物的疗效。

因此，非小细胞肺癌患者中通过本试剂盒对EGFR和ERCC1两项指标的联合检测，有助综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系，还对于明确基因分类，指导临床用药、治疗和判断预后效果都极其有益。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种EGFR基因探针和ERCC1基因探针的制备方法，其特征在于2种基因探针的制备步骤包括：

(1)克隆筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有EGFR基因和ERCC1基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆；

(2)克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买克隆Invitrogen RPCI11.C，取10μl克隆菌液添加到5ml含氯霉素抗性的TB培养液中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml含氯霉素抗性的TB培养液中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；针对EGFR基因探针和ERCC1基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定；

(3)基因探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，获得探针，避光、-20±5℃储存；

2.根据权利要求1的方法，其特征还在于克隆筛选步骤中含有EGFR基因最优的克隆，编号为RP11-815K24，含有ERCC1基因最优选的克隆，编号为RP11-752G9。

3.根据权利要求1的方法，其特征还在于克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列分别为：

EGFR基因探针：上游引物5’-ACTCCAGACATCTTTCCATCTGC-3’和下游引物5’-AATCATTGCTCTCATGAGTGGTG-3’；

ERCC1基因探针：上游引物5’-GCAATGAGCCGAGATAGAA-3’和下游引物5’-TGGCTAGCCCATTACTCTA-3′。

4.根据权利要求1的方法，其特征还在于基因探针制备过程中50μl切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间。

5.一种非小细胞肺癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒，包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，荧光标记探针混合物包含EGFR基因探针和ERCC1基因探针，其特征在于每人份荧光标记探针混合物中EGFR基因探针和ERCC1基因探针的使用量均为0.5μl。

6.根据权利要求5的试剂盒，其特征还在于未标记的竞争性DNA为Human COT-1DNA。