CN101218353A - 预测癌症受试者中的治疗反应 - Google Patents

预测癌症受试者中的治疗反应 Download PDF

Info

Publication number
CN101218353A
CN101218353A CNA2006800219084A CN200680021908A CN101218353A CN 101218353 A CN101218353 A CN 101218353A CN A2006800219084 A CNA2006800219084 A CN A2006800219084A CN 200680021908 A CN200680021908 A CN 200680021908A CN 101218353 A CN101218353 A CN 101218353A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression level
rrm1
ercc1
described method
clone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800219084A
Other languages
English (en)
Inventor
杰罗尔德·贝普勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of South Florida
Original Assignee
University of South Florida
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of South Florida filed Critical University of South Florida
Publication of CN101218353A publication Critical patent/CN101218353A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

本发明涉及基于基因，诸如RRM1或ERCC1基因的瘤内表达水平确定受试者的适宜癌症疗法的方法。还提供了用于该方法的组合物和试剂盒。

Description

预测癌症受试者中的治疗反应
相关申请
本申请请求2005年5月4日提交的美国临时申请号US60/594,763的利益，将该文献完整地引入本文作为参考。
政府的支持
本发明得到了国立癌症研究院(National Cancer Institute)授予的R01-CA102726和R21-CA106616号政府资助。政府在本发明中拥有一定权利。
技术领域
本发明涉及基于基因(诸如RRM1或ERCC1基因)的瘤内表达水平确定受试者的适宜癌症疗法的方法。
背景
涉及DNA合成和损害修复的两种分子--核苷酸还原酶M1亚单位(RRM1)基因和切除修复交叉互补1(excision repair cross-complementing1)(ERCC1)基因在癌症发病机制中是重要的。RRM1和ERCC1为常用化疗剂的靶标。RRM1为吉西他滨的分子靶标且ERCC1对铂诱导的DNA加合物修复而言是决定性的。最常用于癌症疗法的有吉西他滨和含铂药剂，诸如顺铂和卡铂。
从历史上看，化疗对癌症患者的有益性有限。一般而言，仅约25％具有上皮恶性肿瘤的患者(诸如肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌和卵巢癌)得益于该疗法。然而，在最初的疗法失败后，第二周期的化疗通常是有效的，这提示对这类治疗的敏感性或抗性取决于肿瘤的具体特征，而这些具体特征是由参与化疗剂代谢途经的分子所决定的。因此需要研发可以用于预测或评价肿瘤对化疗剂敏感性的方法。
概述
已经发现RRM1或ERCC1的表达水平可以预测患者对癌症疗法的反应。该发现已经导致研发预测肿瘤对疗法的反应的试验。基于该试验所选择的疗法已经证实可比目前使用的对治疗的随机选择对癌症患者产生实质上更好的结果。这种试验要求采集肿瘤样本并且加工以便测定RRM1或ERCC1或它们两者的肿瘤内水平。发现低水平的RRM1表达与使用抗代谢药治疗的较好治疗反应相关，而发现低水平的ERCC1表达与使用含铂药剂治疗的较好治疗反应相关。发现患RRM1表达位于参比群体的最高或最低四分位数的肿瘤的患者对包括抗微管蛋白剂在内的化疗反应最佳。
在另一个方面中，本发明的特征在于为受试者评价适宜的化疗的方法。该方法包括：提供来自受试者的肿瘤样品；测定该肿瘤样品中的RRM1表达水平；和基于RRM1表达水平确定适宜的化疗。如果RRM1表达水平低于或等于参比组的中位值RRM1表达水平，那么包括抗代谢药在内的化疗被确定为适宜的；并且如果RRM1表达水平高于参比组的中位值RRM1表达水平，那么无抗代谢药的化疗被确定为适宜的。该方法可以进一步包括对受试者给予适当的化疗。例如，如果测定RRM1表达水平低于或等于参比组的中位值RRM1表达水平，那么可以对受试者给予抗代谢药，诸如吉西他滨或培美曲塞。
在某些实施方案中，该方法包括对受试者给予第二种化疗剂，诸如抗微管蛋白剂或含铂药剂。抗微管蛋白剂可以为：例如紫杉烷(taxane)，诸如紫杉醇(paclitaxel)或多西他赛(docetaxel)；或长春花生物碱(vincaalkaloid)，诸如长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblasine)、长春氟宁(vinflunine)或长春地辛(vindesine)。含铂药剂可以为：例如卡铂、顺铂或奥沙利铂(oxaliplatin)。在另一个实施方柔中，该方法除包括给予适当的化疗剂外，还包括对受试者给予放疗。
在某些实施方案中，通过上述方法评价的受试者患上皮恶性肿瘤，诸如肺癌(例如非-小-细胞肺癌)、乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌或卵巢癌。
上述方法还可以包括测定肿瘤样品中的ERCC1表达水平并且基于RRM1和ERCC1表达水平进一步确定适宜的化疗。如果ERCC1表达水平低于或等于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么包含含铂药剂的化疗被确定为适宜的，而如果ERCC1表达水平高于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么无含铂药剂的化疗被确定为适宜的。例如，含铂药剂可以为顺铂、卡铂或奥沙利铂。该方法可以进一步包括对受试者给予适当的化疗剂。
可以通过RT-PCR、RNA印迹、蛋白质印迹或免疫组织化学测定确定RRM1和ERCC1表达水平。
在另一个方面中，本发明的特征在于为受试者评价适宜的化疗的方法，通过下列步骤进行：提供来自受试者的肿瘤样品；测定该肿瘤样品中的ERCC1表达水平；和基于ERCC1表达水平确定适宜的化疗。如果确定ERCC1表达水平低于或等于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么包含含铂药剂的化疗被确定为适宜的。如果ERCC1表达水平高于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么无含铂药剂的化疗被确定为适宜的。
在某些实施方案中，该方法还包括测定肿瘤样品中的RRM1表达水平和基于ERCC1和RRM1表达水平确定适宜的化疗。如果RRM1表达水平低于或等于参比组中的中位值RRM1表达水平，那么包含抗代谢药的化疗被确定为适宜的，而如果RRM1表达水平高于参比组的中位值RRM1表达水平，那么无抗代谢药的化疗被确定为适宜的。
本文还描述了用于为受试者评价适宜的化疗的备选方法，通过下列步骤进行：提供来自受试者的肿瘤样品；测定该肿瘤样品中的RRM1表达水平；和基于RRM1表达水平确定适宜的化疗。通过该方法，如果RRM1表达水平低于或等于参比组最低四分位数的RRM1表达水平或大于或等于参比组的最高四分位数RRM1表达水平，那么包含抗微管蛋白剂的化疗被确定为适宜的。如果RRM1表达水平被测定并非处于参比组的最低四分位数中或最高四分位数中，那么无抗微管蛋白剂的化疗被确定是适宜的。抗微管蛋白剂可以为：例如紫杉烷，诸如紫杉醇或多西他赛；或长春花生物碱，诸如长春瑞滨、长春新碱、长春碱、长春氟宁或长春地辛。
在某些实施方案中，该方法进一步包括测定肿瘤样品中的ERCC1表达水平和基于RRM1和ERCC1表达水平确定化疗。如果ERCC1表达水平低于或等于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么包含含铂药剂的化疗是适宜的；并且如果ERCC1表达水平高于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么无含铂药剂的化疗是适宜的。含铂药剂可以为：例如顺铂、卡铂或奥沙利铂。
在某些实施方案中，该方法进一步包括对受试者给予适当的化疗。在另一个实施方案中，该方法包括对受试者给予放疗。
在一个方面中，本发明的特征在于基于RRM1表达水平评价包含化疗剂的组合物的功效的方法。该方法包括：(i)提供第一细胞系和第二细胞系，其中第一细胞系RRM1表达水平高于第二细胞系；(ii)在足以影响细胞生存力的时间内使第一和第二细胞系接触所述组合物；和(iii)评价第一和第二细胞系对细胞生存力的影响。与第一细胞系相比，第二细胞系的细胞生存力下降，表明该组合物很可能对表达较低水平的RRM1的肿瘤有效。与第二细胞系相比，第一细胞系的细胞生存力下降，表明该组合物能够对表达较高水平的RRM1的肿瘤有效。在某些实施方案中，该组合物包括抗代谢药(例如吉西他滨或培美曲塞)、抗微管蛋白剂或含铂药剂中的一种或多种。
在另一个方面中，本发明的特征在于基于ERCC1表达水平评价包含化疗剂的组合物的功效的方法。该方法包括：(i)提供第一细胞系和第二细胞系，其中第一细胞系比第二细胞系的ERCC1表达水平高；(ii)在足以影响细胞生存力的时间内使第一和第二细胞系接触所述组合物；和(iii)测定第一和第二细胞系的细胞生存力效应。与第一细胞系相比，第二细胞系细胞生存力下降，表明该组合物很可能对表达较低水平的ERCC1的肿瘤有效。与第二细胞系相比，第一细胞系细胞生存力下降，表明该组合物很可能对表达较高水平的ERCC1的肿瘤有效。在某些实施方案中，该组合物包括抗代谢药(例如吉西他滨或培美曲塞)、抗微管蛋白剂或含铂药剂中的一种或多种。
在另一个方面中，本发明的特征在于试剂盒，它包括用于测定来自患者组织样品中的RRM1表达的试剂，和说明书。在某些实施方案中，用于测定RRM1表达的试剂包括预先确定的份的选自下组的试剂：寡-dT引物、与RRM1 cDNA杂交的正向引物、与RRM1 cDNA杂交的反向引物、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲剂和核苷酸。在另一个实施方案中，用于测定RRM1表达的试剂包括用于进行蛋白质印迹或免疫组织化学测定的预先确定的份的抗-RRM1抗体和缓冲剂。该试剂盒还可以包括用于处理来自患者的组织样品，诸如活检组织样品的试剂。在某些实施方案中，该试剂盒还包括用于测定组织样品中的ERCC1表达的试剂。用于测定ERCC1表达的试剂可以是预先确定的份的与ERCC1 cDNA杂交的正向和反向引物、或抗-ERCC1抗体。
在一个方面中，本发明的特征在于试剂盒，它包括用于测定来自患者组织样品中ERCC1表达的试剂，和说明书。用于测定ERCC1表达的试剂可以是预先确定的份的选自下组的试剂：寡-dT引物、与RRM1 cDNA杂交的正向引物、与RRM1 cDNA杂交的反向引物、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲剂和核苷酸。在另一个实施方案中，用于测定ERCC1表达的试剂包括用于进行蛋白质印迹或免疫组织化学测定的预先确定的份的抗-ERCC1抗体和缓冲剂。该试剂盒还可以包括用于处理来自患者的组织样品，诸如活检组织样品的试剂。在某些实施方案中，该试剂盒还包括用于测定组织样品中的RRM1表达的试剂。用于测定RRM1表达的试剂可以为预先确定的份的与RRM1 cDNA杂交的正向和反向引物或抗-RRM1抗体。
在另一个方面中，本发明的特征在于试剂盒，它包括用于测定来自患者的组织样品中RRM1表达的试剂，用于测定来自患者的组织样品中ERCC1表达的试剂，和说明书。在某些实施方案中，用于测定RRM1和ERCC1表达水平的试剂包括预先确定的份的选自下组的试剂：寡-dT引物、与RRM1 cDNA或ERCC1 cDNA杂交的正向和反向引物、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲剂和核苷酸。在另一个实施方案中，用于测定RRM1和ERCC1表达的试剂包括用于进行蛋白质印迹或免疫组织化学测定的预先确定的份的抗-RRM1抗体和抗-ERCC1抗体和缓冲剂。该试剂盒还可以包括用于处理来自患者的组织样品，诸如活检组织样品的试剂。
将本发明一种或多种实施方案的详细描述列在附图和如下的说明书中。本发明的其它特征、目的和优点从本说明书和附图并且从权利要求中显而易见。
附图描述
附图1A和1B为在35位患有局部晚期非-小-细胞非癌(NSCLC)的患者中进行两个周期的吉西他滨和卡铂化疗后RRM1(附图1A)和ERCC1(附图1B)表达与肿瘤大小改变百分比之间关系的散点图。黑点表示患者肿瘤皱缩低于30％(SD)，且灰色点表示患者肿瘤皱缩大于30％(PR/CR)。Spearman相关系数就RRM1而言为r＝-0.498(p＝0.002)且就ERCC1而言为r＝-0.293(p＝0.099)。
附图2A和2B为表示患者存活水平的示意图。附图2A表示基于基因RRM1和ERCC1表达使用化疗治疗的具有晚期NSCLC的53位患者的总存活和无进行性存活。附图2B表示使用指定化疗的总存活。GC，吉西他滨和卡铂；GD，吉西他滨和多西他赛；DC，多西他赛和卡铂；DV，多西他赛和长春瑞滨。
附图3A-3C为表示使用吉西他滨和顺铂治疗效果的示意图。附图3A和3B分别表示吉西他滨和顺铂在遗传修饰的细胞系中的体外功效。H23-R1为稳定超表达RRM1的细胞系；H23siR1用表达靶向RRM1的siRNA的序列稳定转染；对照组细胞系H23-Ct和H23siCt以与亲代H23细胞系类似的水平表达RRM1。使细胞接触不同浓度72小时并且通过MTS试验测定生存力。数据为来自三次独立实验的平均值+/-S.E.附图3C表示接触250nM吉西他滨或200nM顺铂6小时的细胞中凋亡水平。凋亡百分比为使用膜联蛋白V标记的细胞比例测定值。数据为来自三次独立实验的平均值+/-S.E.
附图4为表示与对照组细胞系相比H23siR1和H23-R1细胞系中吉西他滨和多西他赛诱导凋亡的示意图。
详细描述
在本发明中提供的方法可以用于确定对于患有增殖性病症(诸如上皮恶性肿瘤)的受试者适宜的疗法，或用于预测或评价包含化疗剂的组合物的功效。
“增殖性病症”为特征在于细胞分裂无规律性的病症。癌症(例如神经胶质瘤、前列腺癌、黑素瘤、癌、宫颈癌、乳腺癌、结肠癌或肉瘤)为增殖性病症的实例。以增殖性病症为特征的细胞(即“赘生性细胞”或“肿瘤细胞”)具有自主生长的能力，即特征在于细胞群不适当的增殖性生长的异常状态或情况。瘤细胞或肿瘤细胞为以异常高的速率增殖的细胞。包含瘤细胞的新的生长为瘤，也称作“肿瘤”。肿瘤为异常组织生长，一般形成明显的块，其由于细胞增殖而生长得比正常组织快。肿瘤可以表现出部分或完全缺乏结构性组织和与正常组织的功能性协调。本文所用的肿瘤指包括造血肿瘤以及实体瘤。
肿瘤可以为良性的(良性肿瘤)或恶性的(恶性肿瘤或癌)。可以将恶性肿瘤广泛分类成三种主要类型。来源于上皮结构的恶性肿瘤称作癌；来源于结缔组织，诸如肌肉、软骨、脂肪或骨的恶性肿瘤称作肉瘤；且影响包括免疫系统成分在内的造血结构(涉及血细胞形成的结构)的恶性肿瘤称作白血病和淋巴瘤。其它肿瘤包括，但不限于多发性神经纤维瘤。
增殖性病症包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵入力阶段无关。癌症包括各种器官系统，诸如肺、乳腺、甲状腺、淋巴系统、胃肠和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及腺癌，包括诸如大多数结肠癌、肾-细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非-小细胞肺癌、小肠癌和食道癌的恶性肿瘤。癌包括上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，诸如呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。其它癌包括那些由子宫颈、肺、头和颈、结肠和卵巢组织形成的癌。中枢神经系统癌症包括：神经胶质瘤(包括星形细胞瘤、混合性少突星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、室管膜瘤和少突神经胶质瘤)、脑膜瘤、垂体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、松果体瘤、脊髓瘤、造血肿瘤和中枢神经系统淋巴瘤。影响结缔组织，诸如脂肪、肌肉、血管、深部皮肤组织、神经、骨和软骨的癌症称作肉瘤。肉瘤包括：例如脂肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤、神经纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(GISTs)、纤维样肿瘤、尤因肉瘤、骨肉瘤和软骨肉瘤。
本文所述的方法特别与治疗患上皮恶性肿瘤的人相关，所述的上皮恶性肿瘤诸如肺癌(例如非-小-细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌或卵巢癌。上皮恶性肿瘤为影响上皮组织的癌症。
本文所用的“受试者”可以为任何患有增殖性病症的受试者。例如，该受试者可以为任何哺乳动物，诸如人，包括人癌症患者。典型的非人哺乳动物包括非人的灵长类(诸如猴子或猿)、小鼠、大鼠、山羊、奶牛、公牛、猪、马、绵羊、野猪、海獭、猫和狗。
本文所用的“抗代谢药”为具有与正常生化反应所需的物质(代谢物)类似的结构、但又有足够的不同以足以干扰正常细胞功能的化学物质。抗代谢药包括干扰DNA合成的嘌呤和嘧啶类似物。典型的抗代谢药包括：例如氨基蝶呤、2-氯脱氧腺苷、阿拉伯糖苷(ara C)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-FU)(及其衍生物，包括卡培他滨和替加氟)、吉西他滨、甲基叶酸、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、三甲曲沙、6-巯嘌呤和6-硫鸟嘌呤。
本文所用的“抗微管蛋白剂”意旨通过抑制有丝分裂纺锤体阻断细胞分裂的化疗剂。抗微管蛋白剂包括：例如紫杉烷紫杉醇和多西他赛；和长春花生物碱长春瑞滨、长春新碱、长春碱、长春氟宁和长春地辛。
本文所用的“含铂药剂”(platinum-containing agent)包括包含铂的化疗剂。含铂药剂与DNA交联并且使其烷基化，从而导致DNA合成和转录抑制。含铂药剂可以在任意细胞周期中起作用并且由此杀伤肿瘤和健康分裂的细胞。含铂药剂包括：例如铂、卡铂和奥沙利铂。
确定癌症疗法的方法。确定适宜癌症疗法的方法包括获得或提供来自患者的肿瘤样品和测定患者的RRM1或ERCC1表达水平。任意方法可以用于获得肿瘤样品，诸如活组织检查(例如芯针活组织检查)，和可以将组织用OCT(最佳组织切割化合物)包埋用于加工。例如，可以将在OCT中的组织加工成冷冻切片。诸如，可以通过激光俘获显微切割(LCM)采集肿瘤细胞，并且可以通过例如与聚合酶链反应(RT-PCR)结合的逆转录或RNA印迹分析测定RNA水平，或通过测定蛋白质水平的蛋白质印迹检测基因表达。在一种典型手段中，通过实时定量RT-PCR检测RRM1或ERCC1表达水平。还可以通过免疫组织化学测定这些基因的表达水平。
如果瘤内RRM1水平低，那么可以确定包含抗代谢药，诸如吉西他滨或培美曲塞的化疗为适宜的。如果瘤内RRM1水平高，那么可以确定无抗代谢药的化疗为适宜的。如果瘤内ERCC1水平低，那么可以确定包含含铂药剂的化疗为适宜的。例如，如果瘤内ERCC1水平低，那么可以确定包含顺铂、卡铂或奥沙利铂的化疗为适宜的。如果瘤内ERCC1水平高，那么可以确定无含铂药剂的化疗为适宜的。
“低”和“高”表达水平为相对值并且基于与参比组的值的比较。本文所用的“参比组”为从其中采集RRM1和/或ERCC1表达数据的样品癌症群体。通过测量样品群体中瘤内基因的表达水平来确定参比组中的表达水平(例如，参见Rosell等，Clin Cancer Res10：1318-25，2004；Lord等，Clin Cancer Res8：2286-2291，2002；Bepler等，J Clin Oncol22：1878-85，2004；和Simon等，Chest127：978-83，2005)。一般而言，如果表达水平等于或低于参比组中的中位值RRM1表达水平，那么肿瘤表现出“低”RRM1水平；而如果表达水平高于参比组中的中位值RRM1表达水平，那么肿瘤表现出“高”RRM1水平。类似地，如果表达水平等于或低于参比组中的中位值ERCC1表达水平，那么肿瘤表现出“低”ERCC1水平。“低”和“高”表达水平是相对的并且可以使用各新的参比组建立。在一种备选方案中，被确定对于受试者对化疗的反应具有预测作用的表达水平可以等于或低于参比组的最低三分之一或最低四分位数的表达水平，或者具有预测作用的表达水平可以被确定为等于或大于参比组的最高三分之一或最高四分位数的表达水平。
参比组的样品取自从相同物种的受试者(例如人受试者)，并且参比组的肿瘤优选是相同类型的(例如NSCLC的肿瘤)。例如，参比组的肿瘤可以都是：例如癌；造血肿瘤；脑瘤；或肉瘤。在某些实施方案中，参比组的肿瘤可以都例如来自肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌或卵巢癌。参比组的个体成员也可以共有其它的相似性，诸如在疾病阶段、预先治疗方案、生活方式(例如吸烟者或非吸烟者、超重或体重过轻)或其它人口统计学(例如年龄、遗传素质)上的相似性。例如，除具有相同类型的肿瘤外，参比组中的受试者还未接受过任何预先的全身化疗。参比组应包括来自至少10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180或200位受试者的肿瘤样品的基因表达分析数据。
可以通过任意方法，诸如通过定量RT-PCR、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析或免疫组织化学，测定参比组中的基因表达水平。按照与参比组中表达水平相同的方式测定来自测试受试者的肿瘤样品中的表达水平。
可以对肿瘤取样测定RRM1或ERCC1表达水平或它们两者，并且可以基于观察到的表达水平确定适宜的化疗。化疗可以包括单一药剂或多种化疗剂(例如两种、三种或三种以上化疗剂)。例如，当瘤内RRM1表达水平被确定为低时，可以确定适宜的化疗为单独使用抗代谢药。在一种备选方案中，可以确定适宜的化疗包括抗代谢药和第二种药剂，诸如抗微管蛋白剂(例如紫杉烷或长春花生物碱)、烷化剂(例如异环磷酰胺、环磷酰胺或其它氮芥衍生物)或含铂药剂(例如顺铂、卡铂或奥沙利铂)。当瘤内RRM1表达水平被确定为高时，适宜的化疗可以被确定包括例如含铂药剂，但这种适宜的化疗不应包括抗代谢药。
在另一个实例中，如果测定瘤内的RRM1表达水平与参比组相比处于最低三分之一或四分位数，或与参比组相比处于最高三分之一或四分位数，那么可以确定适宜的化疗为单独的抗微管蛋白剂。或者，可以确定适宜的化疗包括抗微管蛋白剂和第二种药剂，诸如抗代谢药或含铂药剂。当测定瘤内的RRM1表达水平与参比组相比处于中间的40-60％范围时，可以确定适宜的化疗包括抗代谢药或含铂药剂中的一种或多种，但这种适宜的化疗不应包括抗微管蛋白剂。
在另一个实例中，如果瘤内的ERCC1表达水平被确定为低，那么可以确定适宜的化疗为单独的含铂药剂。或者，可以确定适宜的化疗包括含铂药剂和第二种药剂，诸如抗代谢药或抗微管蛋白剂。当瘤内的ERCC1表达水平被确定为高时，可以确定适宜的化疗包括抗代谢药或抗微管蛋白剂中的一种或多种，但这种适宜的化疗不应包括含铂药剂。
在另一个实例中，测定RRM1和ERCC1的瘤内表达水平，并且基于两种基因的表达水平确定适宜的化疗剂。例如，如果经测定RRM1和ERCC1表达水平均低，那么可以确定适宜的化疗包括抗代谢药和含铂药剂，诸如卡铂、顺铂或奥沙利铂。如果经测定RRM1水平低并且经测定ERCC1水平高，那么可以确定适宜的化疗包括抗代谢药和任选的第二种药剂，诸如抗微管蛋白剂。这类化疗组合物不应包括含铂药剂。如果经测定RRM1水平高并且经测定ERCC1水平低，那么可以确定适宜的化疗包括含铂药剂和任选的第二种药剂，诸如抗微管蛋白剂或烷化剂。这类化疗组合物不应包括抗代谢药。如果经测定RRM1和ERCC1水平均高，那么可以确定适宜的化疗包括抗微管蛋白剂。该化疗不应包括抗代谢药或含铂药剂。
在另一个实例中，如果ERCC1表达水平低，且RRM1表达水平与参比组相比落入最低三分之一或四分位数或最高三分之一或四分位数的范围，那么可以确定适宜的化疗包括抗微管蛋白剂，诸如多西他赛或长春瑞滨和含铂药剂。如果经测定ERCC1水平高且RRM1表达水平与参比组相比落入最低三分之一或四分位数或最高三分之一或四分位数的范围，那么可以确定适宜的化疗包括抗微管蛋白剂和任选的第二种药剂，诸如抗代谢药。这类化疗组合物不应包括含铂药剂。如果ERCC1水平被确定为低且RRM1表达水平与参比组相比落入中间的40-60％的范围，那么可以确定适宜的化疗包括含铂药剂和任选的第二种药剂，诸如抗代谢药或烷化剂。这类化疗组合物不应包括抗微管蛋白剂。如果ERCC1水平被确定为高且RRM1表达水平与参比组相比落入中间的40-60％范围，那么可以确定适宜的化疗包括抗代谢药。该化疗不应包括抗微管蛋白剂或含铂药剂。
可以按照如本文所述的RRM1和ERCC1表达水平将其它化疗剂与抗代谢药、抗微管蛋白剂或含铂药剂一起给药，或替代抗代谢药、抗微管蛋白剂或含铂药剂。其它化疗剂包括：例如L-天冬酰胺酶、比卡鲁胺(bicalutamide)、博来霉素(bleomycin)、喜树碱(camptothecin)(CPT-11)、洋红霉素(carminomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、海鞘素(ecteinascidin)743、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷、埃波霉素(epothilone)、氟他胺(flutamide)、FK506、六甲蜜胺(hexamethyl melamine)、idatrexate、来氟米特(leflunimide)、亮丙瑞林(leuprolide)、异长春碱(leurosidine)、长春罗新(leurosine)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、普卡霉素(plicamycin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、泊非霉素(porfiromycin)、豹蛙酶(ranpirnase)、雷帕霉素(rapamycin)、托泊替康(topotecan)、替尼泊苷(teniposide)和塞替派(thiotepa)。
可以进一步对根据瘤内RRM1或ERCC1表达水平给予化疗的受试者给予放疗、免疫疗法或外科手术。
可以使用常规的给药方案对受试者给予化疗。适宜的剂量取决于如本文所述的基于RRM1和/或ERCC1表达水平对受试者确定为适宜的具体化疗剂。
可以通过标准方法给予化疗，包括通过口服，诸如以丸剂形式；通过静脉内注入体腔(诸如膀胱)；通过肌内；或通过鞘内。可以将化疗方案作为连续方案递送，例如通过静脉内、口服或在体腔内。可以按周期中递送化疗方案，包括给药的一天或数天，随后为休息和恢复期。恢复期可以持续1，2，3或4周或更长，且然后可以重复该周期。化疗过程可以包括至少2-12个周期(例如3，4，5，6，7，10或12个周期)。
可以将获自本文提供的方法的基因表达数据与来自患者医疗记录的信息合并，包括人口统计学数据；生命体征；教育；饮酒、吸烟和药物滥用史；医学史；和所记录的给予如上所述设计的化疗后为调整涉及增殖性病症预后的结论而给予的治疗。
在按照瘤内RRM1或ERCC1表达水平给予化疗时，可以监测患者对疗法的反应。例如，可以在给予化疗前和后测量肿瘤以便监测疾病进展。如果肿瘤尺寸减小，那么可以确定疾病正在好转或向好转转变。肿瘤尺寸部分减小可以表示疾病部分好转，而如果肿瘤完全消失，那么可以认为疾病完全好转。如果肿瘤尺寸增加，那么可以确定疾病处于发展阶段。如果肿瘤尺寸在给予化疗后不改变，那么可以将疾病分类为稳定。
也可根据癌症阶段评价患者。例如，可以根据TNM疾病分期系统评价患者。“T”描述肿瘤尺寸和它是否侵入邻近组织，“N”描述涉及的任何淋巴结，且“M”描述转移灶(癌症从一个身体部分扩散至另一个部分)。根据TNM等级，阶段0表示原位癌，其为仅存在于它所开始的细胞层中的早期癌症。阶段I，II，III和IV表示进行性恶化疾病状态。较高的阶段表示根据更大的肿瘤尺寸和/或癌症扩散至与原发性肿瘤相邻的邻近淋巴结和/或器官而证实的更为广泛性疾病。在阶段IV中，肿瘤已经扩散至至少一个其它器官。
还可以根据身体条件评价受试者，其中要关注的因素诸如体重减轻、胸膜渗出和涉及癌症的其它症状。例如，肺癌，包括小-细胞和非-小细胞肺癌症状包括持久咳嗽、痰中带血丝、胸痛和复发性肺炎或支气管炎。
以本发明为特征的方法可以对任意年龄的受试者进行，包括胎儿(例如在子宫内)、婴儿、初学走路的孩子、青少年、成人或老年人。
预测功效方法和筛选方法。本发明的特征还在于评价或预测包含化疗剂的组合物的功效的方法。这些方法使用至少两种细胞系和包含一种或多种化疗剂的组合物。所述的细胞系在RRM1或ERCC1表达水平上不同。例如，一种细胞系表达较低于标准对照组细胞系水平的RRM1，或一种细胞系表达高于标准对照组细胞系水平的RRM1。较高表达细胞系优选表达高于较低表达细胞系至少约20％，40％，60％，80％，100％，200％或300％的RRM1或ERCC1。
可以使用导致RRM1或ERCC1表达增加或减少的任何方式。例如，可以改造表达较低水平RRM1的细胞系以便表达导致表达水平较低的siRNA或反义RNA。或者，可以将RRM1表达置于调节启动子，诸如四环素应答启动子，IPTG应答启动子或蜕皮激素应答启动子的控制下。RRM1表达可以低于在亲代品系中的表达或表达可以在诱导前完全不存在。表达高水平RRM1的细胞包含在以高于内源性RRM1启动子水平表达RRM1的组成型启动子控制下的RRM1基因，或可以由诱导型启动子，诸如四环素应答启动子或IPTG应答启动子表达RRM1，使得诱导将表达驱动至高于在亲代品系中的水平。可以将驱动较高水平RRM1表达或指导较低水平表达的外源性序列稳定整合入亲代品系的基因组或可以瞬时转染入亲代品系。
使表达高和低水平RRM1或ERCC1的细胞接触候选化疗剂或化疗剂组合(例如2，3或4种化疗剂)，并且监测细胞与对照品系相比对化疗剂或多种化疗剂敏感性或抗性的增加。可以将导致对一种细胞系的敏感性超过对照组细胞系的药剂或药剂组合鉴定为对于表达相应水平RRM1或ERCC1的肿瘤的患者的候选治疗剂。
例如，如果表达低水平RRM1(即低于对照组亲代品系的水平)的细胞比对照组品系细胞对化疗剂更为敏感，那么该药剂为肿瘤具有表达低水平RRM1的肿瘤的患者的候选治疗剂。如果表达高水平RRM1(即高于对照组亲代品系的水平)比对照组品系对化疗剂更为敏感，那么该药剂为肿瘤具有表达高水平RRM1的肿瘤的患者的候选治疗剂。
在另一个实例中，如果表达低水平ERCC1(即低于对照组亲代品系的水平)的细胞比对照组品系细胞对化疗剂更为敏感，那么该药剂为治疗具有表达低水平ERCC1的肿瘤的患者的候选治疗剂。如果表达高水平ERCC1(即高于对照组亲代品系的水平)的细胞比对照组品系对化疗剂更为敏感，那么该药剂为治疗具有表达高水平ERCC1的肿瘤的患者的候选治疗剂。
本文所述的方法可以用于筛选试验以便鉴定治疗表达高或低水平RRM1或ERCC1的肿瘤的候选物药剂。可以使诸如上述那些细胞系接触一组药剂(例如小分子药物、核酸或多肽)以便鉴定导致表达低或高水平RRM1的细胞敏感性增加的药剂。
可以在人体测试前，在动物模型中测试上述筛选方法中鉴定的药剂或上述方法鉴定作为候选化疗的药剂或药剂组合。例如，可以在人体测试前测试这些疗法减小小鼠或灵长类模型中肿瘤尺寸的能力。
试剂盒。可以将实施本文所述方法的试剂、用具和/或说明书在试剂盒中提供。例如，该试剂盒可以包含确定对癌症患者适宜的疗法的试剂、用具和说明书。这类试剂盒可以包括诸如通过活检从患者中采集组织样品的试剂和处理该组织的试剂。该试剂盒还可以包括一种或多种进行基因表达分析的试剂，诸如进行测定RRM1和/或ERCC1在人体肿瘤样品中表达水平的RT-PCR、RNA印迹、蛋白质印迹分析或免疫组织化学的试剂。例如，在这类试剂盒中可以包括进行RT-PCR的引物，进行RNA印迹分析的探针和/或进行蛋白质印迹和免疫组织化学分析分析的抗体。还可以包括用于试验的适宜缓冲剂。还可以包括任意这些试验中所需的检测试剂。
本文所提供的试剂盒还可以包括描述如何进行测定基因表达试验的说明书。该说明书中还可以包括如何确定参比组，包括如何测定参比组中RRM1和/或ERCC1表达水平，和如何汇集表达数据以便建立与测试受试者比较用的参比物的说明。该说明书中还可以包括检测测试受试者基因表达和与将表达水平与参比组表达水平比较以便随后确定对测试患者适宜的化疗的说明。用于确定适宜化疗的方法如上所述并且可以在说明书中详细描述。
在另一个实例中，本发明提供的试剂盒可以包含基于RRM1或ERCC1表达水平预测候选化疗剂功效的试剂、用具和说明书。这类试剂盒可以包括用于调节细胞中RRM1或ERCC1表达水平的载体和用于检测细胞表型的试剂，诸如用于检测凋亡的试剂。如上所述还可以包括用于测定组织样品中RRM1和ERCC1表达水平的试剂。
试剂盒中包括的信息材料可以为描述性的，指导性的，销售或其它涉及本文所述方法和/或试剂在本文所述方法中用途的材料。例如，试剂盒的信息材料可以包含接触信息，例如自然地址、email地址、website或电话号码，其中试剂盒的使用者可以获得有关进行基因表达分析和解释结果的实际信息，特别是当它们应用于人体对特异性化疗具有阳性反应的可能性时。
试剂盒可以包含用于试剂和信息材料的单独的容器、分配器或隔室。可以标记容器以便用于确定RRM1和ERCC1基因表达水平和随后确定用于人体的适宜化疗。
对试剂盒的信息材料的形式没有限定。在许多情况中，信息材料，例如说明书以印刷品形式，例如印刷文本、图和/或照片，例如标签或印刷插页提供。然而，也可以以其它格式提供信息材料，诸如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录。当然，还可以以任意格式的组合提供信息材料。
通过下列实施例进一步解释本发明，不应将这些实施例视为进一步的限定。
实施例
实施例1：RRM1表达减少与对吉西他滨的敏感性增加相关。
产生具有增加和减少的RRM1表达的稳定遗传修饰的细胞系和相应的对照组(Gautam等，Oncogene22：2135-42，2003)。将来源于肺腺癌的H23用作亲代细胞系(Carney等，Cancer Res45：2913-23，1985)。通过用pSUPER-siRRM1构建体稳定转染NCI-H23产生H23siR1。这些细胞表达靶向RRM1的siRNA，由此导致RRM1表达减少。为了产生该构建体，使用BglII和HindIII消化pSUPER-GFP/neo载体(OligoEngine，Seattle，WA)并且将退火的寡核苷酸(5’-GATCCCCgacgctagagcggtcttatTTCAAGAGAataagaccgctctagcgtcTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO：1)和5’-AGCTTTTCCAAAAAgacgctagagcggtcttatTCTCTTGAAataagaccgctctagcgtcGGG-3’(SEQ ID NO：2))连接入该载体。用小写字母表示19个核苷酸的RRM1靶序列。产生表达靶向序列GCTAATAGCGCGGAGTCTT(SEQ IDNO：3)的siRNA的对照组H23siCt细胞系。该序列与任何已知的基因均无相似性。H23-R1为稳定的超表达RRM1的细胞系，并且H23-Ct为其相应的对照组。两者均通过使用如上所述(Gautam等，Oncogene 22：2135-42，2003)克隆入表达质粒pCMV-Tag2(Stratagene，La Jolla，CA)的全长RRM1 cDNA转染产生。通过实时定量RT-PCR和蛋白质印迹分析评价这些细胞系中的RRM1表达水平。
改进的MTT试验(MTS试验，Promega，Madison，WI)用于评价RRM1表达对吉西他滨和含铂药剂体外治疗功效的影响。这种MTS试验使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑作为试剂。通过将4,000个细胞/孔接种在96孔平底平板上进行本试验。使H23-Ct、H23-R1、H23siR1、H23siCt细胞连续接触药物72或96小时。在37℃下孵育3小时后，在微量平板读出器(Benchmark Plus，Bio-Rad，Hercules，CA)中在490nm处测定吸收度。将所有实验均重复三次。将IC50(即将细胞生长抑制达50％的药物浓度)计算为：[(包含药物的一式三份孔中的平均吸收度-一式三份的空白孔中的平均吸收度)/(不含药物的一式三份的孔中的平均吸收度-一式三份的空白孔中的平均吸收度)]×100。
H23-R1与H23相比RRM1表达增加2.5-3.5倍(Gautam等，Oncogene22：2135-42，2003)。H23siR1 RRM1表达减少5倍。通过实时定量RT-PCR和蛋白质印迹测定RRM1和对照基因的表达水平。催化性核苷酸还原酶亚单位RRM2的表达未受影响。将这些细胞系对吉西他滨、顺铂和卡铂的敏感性与转染的对照组细胞系(H23-Ct和H23siCt)比较。RRM1表达增加产生对吉西他滨的抗性(表1，参见附图3A和附图3C)。H23-R1的吉西他滨IC50高于H23-Ct的IC50 8倍。RRM1表达的减少增加了对吉西他滨的敏感性。H23siR1的吉西他滨IC50低于H23siCt IC50 10倍。亲代细胞系(H23)对吉西他滨的反应与H23-Ct和H23siCt的反应类似。在RRM1表达与对顺铂(表1)和卡铂的细胞毒性反应之间存在类似的关系，虽然与对卡铂的细胞毒性反应之间的类似性程度较低。H23-R1对含铂药剂的抗性比相应对照组细胞系高出1.2-1.5倍，H23siR1对含铂药剂的敏感性比相应对照组细胞系高1.1-1.3倍。
表1. 具有改进的RRM1表达水平的细胞系的体外反应
细胞系 通过实时RT-PCR的相对RRM1表达 吉西他滨IC50+/-SD[nM] 顺铂IC50+/-SD[nM]  卡铂IC50+/-SD[nM]
H23 对照组 500+/-9 1,200+/-140  12,000+/-1,732
H23-R1 高3倍 6,000+/-107 1,500+/-85  20,000+/-0
H23-Ct 未改变 750+/-12 1,250+/-50  15,000+/-577
H23siR1 低5倍 100+/-29 950+/-7  10,000+/-1,000
H23siCt 未改变 1,015+/-140 1,000+/-210  13,000+/-1,414
为了测定药物诱导的体外凋亡，将3×105个细胞/孔接种在6-孔平板上并且使其贴壁过夜。以所示浓度向培养物中加入化疗剂。在2，4和6小时处理后，如制造商(BD Pharmingen，San Diego，CA)推荐的对细胞进行膜联蛋白V标记。通过流式细胞计量术测定标记的细胞百分比(FACScalibur，BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)。膜联蛋白V标记实验进一步揭示出药物诱导的细胞死亡与RRM1表达之间的反向关系(参见附图3A-3C)。使用250nM吉西他滨处理6小时后标记的细胞比例在对照组细胞系中占6.6-6.9％，在H23-R1中占2.6％且在H23siR1中占15.2％。顺铂以200nM接触6小时在H23-Ct和H23siCt中产生了14.5-15.1％的凋亡细胞，在H23-R1中产生了5.5％的凋亡细胞并且在H23siR1中产生了19.0％的凋亡细胞。
实施例2.临床试验揭示出RRM1表达和对基于吉西他滨的化疗的反应之间的逆相关。
为了如预期性地探讨瘤内RRM1表达对基于吉西他滨的化疗的反应有预测性的假设，我们对局部晚期非-小-细胞肺癌(NSCLC)的患者进行临床试验。公共机构评估委员会批准临床试验并且所有受试者均提供书面知情同意书。
评价了肿瘤RRM1表达对两个周期的基于第一线吉西他滨的化疗功效的影响。患局部晚期、且不能手术的NSCLC的患者接受作为诱导疗法的吉西他滨和卡铂(IndGC)。选择双药剂化疗，因为认为单药剂化疗对预先未经治疗的患任何阶段NSCLC的患者是不足够的(NSCLC治疗的国家综合癌症网络纲要)。试验合格中选条件包括组织学证实的NSCLC，不能做手术的IIIA或IIIB阶段疾病(排除具有细胞学阳性的胸膜渗出的患者；除外患IIB阶段疾病的一位患者)，通过RECIST可测定的疾病(Therasse等，J NatlCancer Inst92：205-16，2000)，在先未进行全身化疗或胸部放射，根据EasternCooperative Oncology Group标准的性能状态为0或1，不存在体重减轻(在三个月的在先诊断中＜5％)和足够的骨髓、肝和肾功能。
使用胸和上腹部电子计算机化断层X线摄影法(CT)、整体FDG正电子发射断层照相术(PET)和脑核磁共振成像给所有患者分阶段。IndGC由2个28天周期的吉西他滨(1,000mg/m2，在第1和第8天给予)和卡铂(AUC5，在第1天给予)组成。在第8周中重复CT和PET并且按照RECIST，通过对CT上的损害进行一维测量评价疾病反应。此后，患者同时接受放疗和化疗，以便对其疾病进行确定治疗。本研究需要在疗法前特别采集肿瘤样本以便进行分子分析，该步骤使用产生0.8mm直径组织样本的芯针活组织检查进行。立刻将样本冷冻在液氮中，用OCT包埋并且加工成冷冻切片。通过激光俘获显微切割(LCM)采集肿瘤细胞并且提取RNA。
为了进行基因表达分析，将包埋在OCT中的冷冻组织样品切成5-7μM切片。使用Arcturus系统(60mW，1.5毫秒，强度100，斑点大小～20μm)，通过LCM采集肿瘤细胞并且使用商购方法(PicoPure RNA分离试剂盒，#KIT0204，Arcturus，Mountain View，CA)提取总RNA。使用Superscript II和寡-dT(Invitrogen，Carlsbad，CA)产生互补DNA。每份样品按照一式三份在96-孔平板中(ABI prism7700，Perkin-Elmer，Foster City，CA)进行实时定量PCR基因分析。每一平板包含顺序稀释的参比cDNA以便进行标准曲线测定和不含模板的阴性对照。在先描述了为RRM1和ERCC1表达分析设计的引物和探针(Bepler等，J Clin Oncol22：1878-85，2004；Simon等，Chest127：978-83，2005)。将商购引物和探针用于官家基因18S rRNA(Perkin-Elmer，#4310893E-0203015)的表达分析，将其用作内部参照标准。通过将阈值循环与标准曲线比较测定样品中靶RNA的相对量且然后通过将靶量除以18SrRNA的量确定标准化量。
在化疗前后获得一维肿瘤测量值并且将疾病反应记录为与治疗前比较后的改变百分比并且还按照RECIST分类为完全好转(CR)、部分好转(PR)、稳定的疾病(SD)和进行性疾病(PD)。使用在多通道螺旋CT扫描仪上的静脉造影获得的影像测量最大直径的至少一个和多达6个单独的癌症损害。使用图像-档案-通信系统工作站(Siemens MagicView1000)进行测量并且每隔6-8周重复它们。使用公式1-(SumCTpost/SumCTpre)比较治疗后与治疗前测量值来计算肿瘤直径总数改变的百分比。正值表示肿瘤皱缩且负值表示肿瘤生长。将在成像研究或物理检查上出现的新的和在先未观察到的肿瘤损害解读为疾病进展。将总存活(OS)记录为从第一次治疗之日到死亡之日所经过的时间。将无进行性存活(PFS)记录为从第一次治疗之日到首个疾病进展或死亡证据出现之日经过的时间。在随访的最后一天检查未出现情况的患者(2006年3月24日)。
在2003年11月至2006年1月，有40位合格患者加入。在开始疗法前3位患者收回了其同意，因为他们希望在距家较近处治疗。在28位患者中，进行活检以便获得仅用于分子研究的组织，在9位患者中，也将活检用于建立诊断。在1位患者中，发生气胸，需要放置胸导管。在2位患者中，肿瘤采集未产生用于基因表达分析的足够材料。从剩余的25位患者中，通过LCM采集了30-4,500个肿瘤细胞。所有35位患者均完成了IndGC，并且疾病反应为肿瘤直径增加9％，到减小100％都有。20位患者具有SD，14位具有PR且1位具有CR。将患者的临床特征概括在表2中。
表2.两试验中的RRM1和ERCC1表达和患者特征
局部晚期NSCLC中的基因表达/疾病反应评价的预测试验 使用基于晚期转移型NSCLC中基因表达的治疗选择进行的预试验
参与的患者[N] 40 69
进行成功基因分析的患者[N] 35 53
用于基因分析的肿瘤细胞[N] 30-4,500 180-3,000
RRM1表达(中值，范围) 2.85，0.18-129.3 12.1，0.0-1，637.3
ERCCl表达(中值，范围) 6.70，0.30-741.1 12.4，0.9-8，102.8
疾病反应[N]CRPRSDPD不能评价 1(3％)14(40％)20(57％)0(0％)0 0(0％)22(42％)24(46％)6(12％)1
肿瘤组织学[N]腺癌鳞状细胞癌大细胞或未指定的NSCLC 11(31％)11(31％)13(37％) 33(62％)2(4％)18(34％)
肿瘤阶段[N]IIBIIIAIIIB(包括非-恶性胸膜渗出)IIIB(恶性胸膜渗出)IV 1(3％)18(51％)16(46％)NANA NANANA1(2％)52(98％)
男性/女性[N] 18/17 31/22
年龄中位值(范围)[岁] 63(47-87) 63(38-78)
局部晚期NSCLC中的基因表达/疾病反应评价的预测试验 使用基于晚期转移型NSCLC中基因表达的治疗选择进行的预试验
吸烟情况[N]终生为非吸烟者戒烟(＞1年)活跃吸烟 2(6％)20(57％)13(37％) 6(11％)35(66％)12(23％)
ECOG性能状态[N]01 14(40％)21(60％) 25(47％)28(53％)
在3个月内体重减轻＞/＝5％[N]不存在存在 34(97％)1(3％) 49(92％)4(8％)
按照管家基因18S rRNA的表达校准RRM1和ERCC1表达值。
RRM1表达在0.18-129.3的范围。在RRM1表达与疾病反应幅度之间存在显著的(p＝0.002)反相关性(r＝-0.498，Spearman相关系数)(附图1A)。当将患者分入有反应(CR/PR)和无反应(SD)的组中时，RRM1表达明显与反应相关(p＝0.03，卡方检验)，其中高RRM1肿瘤表达的患者对IndGC的反应比低水平表达的患者低。ERCC1表达也与对IndGC的反应幅度成反相关(r＝-0.283，p＝0.099)(附图1B)，但与对IndGC的反应分类不成反相关(p＝0.32)(参见表3)。在基因表达与采集的肿瘤数量、患者年龄或性别、肿瘤组织病理学和吸烟情况之间无显著联系。
表3.在具有局部晚期NSCLC的患者中的RRM1和ERCC1表达和与对吉西他滨和卡铂反应的相关性
RRM11 ERCC11 疾病反应2
所有患者(N＝35)中值(范围) 2.85(0.18-129.3) 6.70(0.30-741.1) 23％(-9％-+100％)
与反应的相关性3(p-值) r＝(-)0.498p＝0.002 r＝(-)0.283p＝0.099
具有PR/CR的患者(N＝15)中位值(范围) 1.84(0.18-9.94) 3.79(1.17-49.79) 44％(+30％-+100％)
具有SD的患者(N＝20)中位值(范围) 13.06(0.87-129.3) 10.38(0.30-741.1) 12％(-9％-+29％)
1根据管家基因18S rRNA的表达而加以校准给出的值；2正值表示肿瘤消退且负值表示肿瘤生长；3Spearman相关系数。
统计分析包括如下。按照Spearman计算基因表达与肿瘤反应、分析的细胞数量和患者年龄连续变量之间的相关系数。将Cox’s比例风险(Proportional Hazards)分析用于评价基因表达对存活的影响。将汇集的t-检验用于检验基因表达与性别或其它二分患者变量之间的显著性。将单因子变异数分析(one way ANOVA test)用于检验基因表达与患者吸烟情况或具有两个以上的值的其它非-连续患者变量之间的显著性。使用Kaplan-Meier方法估计OS和PFS概率。将Log-Rank检验用于确定存活曲线之间的显著性水平。
实施例3.临床试验揭示出按照RRM1和ERCC1表达水平给予化疗时改善了患者反应和存活
为了检验基于基因表达选择化疗是否可以改善患者的存活，我们在患晚期和不能治愈的NSCLC的患者中进行了II期单一医疗机构治疗试验。在本研究中，对双药剂化疗方案的决定基于基因RRM1和ERCC1的表达。试验合格中选条件包括组织学证实的NSCLC，IV或IIIB阶段(具有恶性胸膜渗出)疾病；通过RECIST可测定的疾病(Therasse等，J Natl Cancer Inst92：205-16，2000)，在诊断出晚期NSCLC前的3年中未进行全身化疗，根据Eastern Cooperative Oncology Group标准的性能状态为0或1，年龄＞18和足够的骨髓、肝和肾功能。允许患稳定的脑转移的患者加入。允许在先放疗，只要它在开始研究所选择的化疗前至少3周已停止，该患者已经从放疗毒性中恢复并且至少一个可测量的靶损害位于放射区域外部。
肿瘤采集需要芯针活组织检查。将样本即刻冷冻，切片并且进行LCM以便肿瘤细胞采集。通过实时定量RT-PCR用定制设计和验证的引物和探针测定RRM1和ERCC1表达水平(Bepler等，J Clin Oncol22：1878-85，2004；Simon等，Chest127：978-83，2005)。有关化疗剂的决定基于基因表达水平。如果RRM1表达等于或低于16.5，那么给予吉西他滨，并且如果ERCC1表达等于或低于8.7，那么给予卡铂。基于我们在NSCLC患者表达分析方面经验选择这些水平，目的在于达到接近预测的组中值的值(Rosell等，ClinCancer Res 10：1318-25，2004；Lord等，Clin Cancer Res8：2286-2291，2002；Bepler等，J Clin Oncol22：1878-85，2004；Simon等，Chest127：978-83，2005)。
在该患者组中的实际中值相似(RRM1中位值12.1，范围0.0-1，637.3；ERCC1中位值12.4，范围0.9-8，102.8)。因此，对患者的治疗由如下组成：如果RRM1和ERCC1低于选择的值，则为吉西他滨和卡铂(GC)；如果RRM1低于且ERCC1高于所述值，则吉西他滨和多西他赛(GD)；如果RRM1高于且ERCC1低于所述值，则多西他赛和卡铂(DC)；如果RRM1和ERCC1均高于所述值，则多西他赛和长春瑞滨(DV)。
从2004年2月到2005年12月，69位合格患者参与。8位患者退出(5位在进行活检后退出)，并且1位在疗法前因为运输问题而被排除。基因表达分析在5位患者中失败，且2位患者因2004年夏季弗罗里达的自然灾害而始终无法接受指定的治疗(表2)。在接受指定疗法治疗的53位患者中，12位接受GC，20位接受GD，7位接受DC，且14位接受DV。
药物递送剂量如下。吉西他滨，在第1和第8天，1,250mg/m2，和卡铂，在第1天AUC5；将它们每隔21天给予一次。在第1和第8天，吉西他滨，1,250mg/m2；和在第1和第8天，多西他赛，40mg/m2；将它们每隔21天给予一次。在第1天，多西他赛，75mg/m2；和在第1天，卡铂，AUC5；将它们每隔21天给予一次。在第1和第15天，长春瑞滨，45mg/m2，和在第1和第15天，多西他赛，60mg/m2，将它们每隔28天给予一次。在疗法前和每隔两个周期后进行CT扫描。将它们用于测定和记录一维疾病反应。给予治疗，直到通过RECIST确定为疾病进展，或总计6个周期。由治疗的临床医师决定进一步的疗法。对每位患者记录对疗法的最佳反应并且定义为2，4或6个周期后通过CT记录的最大肿瘤皱缩。在完成本研究所选择的化疗后，要求患者至少每隔3个月进行一次CT扫描来进行跟踪以便确定疾病状态。如上所述测定并且记录疾病反应、总存活(overall survival)(OS)和无进行性存活(progression-free survival)(PFS)。
最佳治疗反应为：22位患者PR(42％，95％置信区间(CI)29-57％)，24位患者SD(46％，95％CI32-61％)，且6位患者PD(12％，95％CI4-23％，4位发生新的转移灶，2位肿瘤直径增加大于20％)。因此，疾病控制率(PR/SD)为88.5％(95％CI76.6-95.6％)。1位患者无法评估。他因与药物相关的肝毒性而不能完成第一个周期的化疗。
6个月和12个月OS率为87％(95％CI，73-94％)和62％(95％CI，43-77％)。6-个月和12-个月PFS率为60％(95％CI，45-73％)和18％(95％CI，7-33％)(附图2A和表4)。
表4.在基于RRM1和ERCC1表达治疗的患晚期NSCLC的患者中的总存活和无进行性存活和与其它试验的比较
本II期研究MCC-13208 我们在先的II期研究，MCC-126211 随机化III期研究，ECOG-15942
OS(95％CI) PFS(95％CI) OS(95％CI) PFS(95％CI) OS(95％CI) PFS(95％CI)
3个月 90％(77-96％) 81％(67-89％) 75％(59-86％) 65％(48-78％) 82％(80-84％) NA3
6个月 87％(73-94％) 60％(45-73％) 58％(41-71％) 38％(23-52％) 58％(63-74％) NA
9个月 73％(55-85％) 40％(24-55％) 40％(25-5 5％) 28％(15-42％) 44％(41-46％) NA
12个月 62％(43-77％) 18％(7-33％) 38％(23-52％) 10％(3-21％) 33％(31-36％) NA
反应率4 42％(22/52) 24％(9/38) 19％(229/1207)
OS时间中位值 13.4个月 6.7个月 8.0个月
PFS时间中位值 7.0个月 4.9个月 3.7个月5
1在Oncology68：382-390，2005中；2在N Engl J Med 346：92-98，2002中；3NA，无法得到；4对治疗的最佳反应，包括部分和完全好转；5报导为进展前的时间(time-to-progression)。
正如从本研究设计中预测的，在基因表达与对疗法的反应之间(RRM1，r＝0.290，p＝0.053；ERCC1，r＝-0.101，p＝0.508)或基因表达与存活之间(RRM1和OS，p＝0.38；RRM1和PFS，p＝0.38；ERCC1和OS，p＝0.10；ERCC1和PFS，p＝0.32)无显著相关性。所选择的疗法在患者OS(p＝0.78)或PFS(p＝0.70)方面未表现出差异(附图2B)。
实施例4.RRM1影响细胞增殖、凋亡和治疗功效
进行研究以便研究RRM1表达对作为恶性肿瘤表型决定因素的增殖、凋亡和治疗功效的作用。
使用聚焦在包含约10-15个细胞的区域上的录像照相机进行时间推移录像描记(TLV)。进行连续10天的记录。使用这一手段能够跟踪每一单个细胞的子代。许多H23-R1细胞发生凋亡，而H23-Ct细胞成指数生长。通过形态和生化试验证实凋亡。H23-R1的平均分裂间隔时间为41.9小时(标准偏差19.0小时，95％置信区间32.3-51.5小时)且H23-Ct的平均分裂间隔时间为25.7小时(标准偏差3.9小时，95％置信区间24.3-27.1小时)。
为了监测细胞增殖，使用RRM1-转染的细胞系(H23-R1)和对照组细胞系(H23-Ct)进行细胞周期分布分析。结果表明G2-期细胞的比例在H23-R1品系(27％)中明显高于H23-Ct(6％)品系。通过连续稀释产生H23-R1的克隆亚系，并且观察到如通过定量RT-PCR测定的G2中细胞百分比与RRM1相对表达之间的强相关性。通过手工计数中期和通过在普卡霉素染色后的FACS分析证实在G2中而非在M期中的这些细胞。在这些品系之间不存在表型差异。这一结果提示RRM1超表达主要延缓了G2-期的进展。
测定RRM1-转染细胞系(H23-R1)和对照组细胞系(H23-Ct)中发生凋亡的细胞比例。经测定细胞凋亡细胞比例在H23-R1品系(11％)中明显高于在H23-Ct品系(2％)中。在一系列针对涉及导致凋亡的途径的蛋白质进行的蛋白质印迹分析中，与H23-Ct相比，H23-R1在蛋白质PARP p89(2.2倍；PARPp116的裂解产物；PARP＝聚-ADP-核糖-聚合酶)、AIF(2.7倍；AIF＝凋亡诱导因子)和细胞色素C(1.7倍)上实质性增加。这一结果提示凋亡增加主要通过内源性线粒体途径介导。在亲代细胞系NCI-H23与对照组细胞系H23-Ct在这些蛋白质的表达水平上不存在显著差异。
将改进的MTT试验(MTS)用于评价RRM1表达对最常用于肺癌疗法的药剂的治疗功效的影响。我们使用H23-R1，即RRM1超表达3.5倍的细胞系；使用siRNA技术产生H23siR1，即RRM1表达减少(0.2倍)的细胞系。通过实时RT-PCR和蛋白质印迹测定表达水平。RRM2和β-肌动蛋白表达未受影响。
通过用pSUPER-siRRM1构建体稳定转染NCI-H23产生H23siR1。为了产生该构建体，用BgIII和HindII消化pSUPER-GFP/neo载体并且将退火的寡核苷酸(5’-GATCC CCgac gctag agcgg tctta tTTCA AGAGA ataag accgctctag cgtcT TTTTG GAAA-3’(SEQ ID NO：1)和5’-AGCTT TTCCA AAAAgacgct agagc ggtct tatTC TCTTG AAata agacc gctct agcgt cGGG-3’(SEQ IDNO：2))连入该载体。用大写字母表示RRM1靶序列。使用与任何已知基因无相似性的靶向序列GCTAATAGCGCGGAGTCTT(SEQ ID NO：3)产生H23siCt细胞系。
通过将4,000个细胞/孔接种在96孔平底平板上进行MTS试验。使H23-Ct、H23-R1、H23siR1、H23siCt细胞连续接触药物72或96小时。使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑试剂进行本试验。在37℃下孵育3小时后，在490nm处测定吸收度。将所有实验重复三次。将IC50(即：将细胞生长抑制达50％的药物浓度)计算为：[(包含药物的一式三份孔中的平均吸收度-一式三份的空白孔中的平均吸收度)/(不含药物的一式三份的孔中的平均吸收度-一式三份的空白孔中的平均吸收度)]×100。结果如表5中所示。
表5：NCI-H23和RRM1表达增加和减少的构建体的IC50值。给出的值为来自各自一式三份进行的三次独立实验的平均值+/-SD。
 吉西他滨IC50[nM]  顺铂IC50[nM] 多西他赛IC50[nM] 长春瑞滨IC50[μM]
 NCI-H23  500+/-9.0  1,200+/-140  1,000+/-0.0  8.0
 H23-R1  6,000+/-107  1,500+/-85.0  9.0+/-7.0  0.4
 H23-Ct  750+/-12.0  1,250+/-50.0  700+/-141  20.0
 H23siR1  100+/-29.0  950+/-7.0  6.0+/-3.0  0.01
 H23siCt  1,015+/-140  1,000+/-210.0  2,500+/-134  20.0
RRM1表达增加产生对吉西他滨的抗性。H23-R1的吉西他滨IC50高于H23-Ct的IC508倍(表4)。亲代细胞系(NCI-H23)对吉西他滨的反应与H23-Ct对吉西他滨的反应类似。RRM1表达减少增加了对吉西他滨的敏感性。
在RRM1表达与对顺铂的细胞毒性反应之间存在类似的，但是很小的相关性。不过，H23-R1的IC50稍高于相应对照值，且H23siR1的IC50稍低于相应对照值。
当使用多西他赛和长春瑞滨时，发现作为RRM1表达的函数的复杂细胞毒性反应。与对照组细胞系相比，H23-R1和H23siR1对多西他赛和长春瑞滨的敏感性更高。
在处理2，4和6小时后使用3×105个细胞/孔测定6-孔平板中作为药物接触结果的凋亡的诱导。然后用膜联蛋白V标记细胞并且通过流式细胞计量术(FACScalibur，Becton Dickinson)测定标记。在吉西他滨处理4小时和6小时后，H23siCt细胞中的2.55％和5.05％凋亡，而H23siR1细胞中的5.09％和15.7％凋亡(附图4)。同样，接触多西他赛后凋亡的细胞比例在H23siR1中高于在对照组细胞中。多西他赛在H23-R1中诱导的凋亡也高于在对照组细胞中诱导的凋亡。与对照组细胞相比，两种药物在RRM1表达减少的细胞系中导致的凋亡增加均具有显著性(p＜0.05)。
表6.观察结果概述
RRM1高度表达 RRM1中度表达 RRM1低度表达 ERCC1高度表达 ERCC1低度表达
吉西他滨(抗代谢药) 抗性 敏感性
培美曲塞(抗代谢药) 抗性 敏感性
多西他赛(抗微管蛋白剂) 敏感性 抗性 敏感性
长春瑞滨(抗微管蛋白剂) 敏感性 抗性 敏感性
顺铂(DNA交联/烷化剂) 最小抗性 最小敏感性 抗性 敏感性
卡铂(DNA交联/烷化剂) 最小抗性 最小敏感性 抗性 敏感性
已经描述了本发明的许多实施方案。尽管如此，但是可以理解可以在不脱离本发明实质和范围的情况下进行各种变型。因此，其它实施方案属于如下权利要求的范围。

Claims (66)

1.为受试者评估适宜化疗的方法，包含：
(i)提供来自受试者的肿瘤样品；
(ii)  测定该肿瘤样品中RRM1的表达水平；和
(iii)基于RRM1表达水平确定适宜的化疗，其中如果RRM1表达水平低于或等于参比组的中位值RRM1表达水平，那么确定包含抗代谢药的化疗是适宜的，并且其中如果RRM1表达水平高于参比组的中位值RRM1表达水平，那么无抗代谢药的化疗被确定是适宜的。
2.权利要求1所述的方法，进一步包含测定肿瘤样品中ERCC1的表达水平。
3.权利要求2所述的方法，进一步包含基于ERCC1表达水平确定化疗，其中如果ERCC1表达水平低于或等于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么包含含铂药剂的化疗被确定是适宜的，并且如果ERCC1表达水平高于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么无含铂药剂的化疗被确定是适宜的。
4.权利要求3所述的方法，其中含铂药剂为顺铂、卡铂或奥沙利铂。
5.权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中测定RRM1表达水平包含进行RT-PCR、RNA印迹、蛋白质印迹或免疫组织化学测定。
6.权利要求2-5中任意一项所述的方法，其中测定ERCC1表达水平包含进行RT-PCR、RNA印迹、蛋白质印迹或免疫组织化学测定。
7.权利要求1-6中任意一项所述的方法，进一步包含对受试者给予适宜的化疗。
8.权利要求1-6中任意一项所述的方法，进一步包含如果经测定RRM1表达水平低于或等于参比组的中位值RRM1表达水平，则对受试者给予抗代谢药。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的抗代谢药为吉西他滨或培美曲塞。
10.权利要求7-9中任意一项所述的方法，进一步包含对受试者给予第二种化疗剂。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的第二种化疗剂为抗微管蛋白剂或含铂药剂。
12.权利要求11所述的方法，其中抗微管蛋白剂为紫杉烷或长春花生物碱。
13.权利要求12所述的方法，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
14.权利要求12所述的方法，其中长春花生物碱为长春瑞滨、长春新碱、长春碱、长春氟宁或长春地辛。
15.权利要求11所述的方法，其中含铂药剂为卡铂、顺铂或奥沙利铂。
16.权利要求3-15中任意一项所述的方法，进一步包含如果经测定ERCC1的表达水平低于或等于参比组的中位值ERCC1表达水平，则对受试者给予含铂药剂。
17.权利要求16所述的方法，其中含铂药剂为顺铂、卡铂或奥沙利铂。
18.权利要求16所述的方法，进一步包含如果经测定RRM1表达水平低于或等于参比组的中位值RRM1表达水平，则对受试者给予抗代谢药。
19.权利要求18所述的方法，其中所述的抗代谢药为吉西他滨或培美曲塞。
20.权利要求1-19中任意一项所述的方法，其中所述的受试者具有上皮恶性肿瘤。
21.权利要求1-19中任意一项所述的方法，其中所述的受试者具有肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌或卵巢癌。
22.权利要求1-19中任意一项所述的方法，其中所述的受试者具有非-小-细胞肺癌。
23.权利要求1-22中任意一项所述的方法，进一步包含对受试者给予放疗。
24.为受试者评估适宜化疗的方法，包含：
(i)提供来自受试者的肿瘤样品；
(ii)测定该肿瘤样品中ERCC1的表达水平；和
(iii)基于ERCC1表达水平确定适宜的化疗，其中如果ERCC1表达水平低于或等于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么包含含铂药剂的化疗被确定是适宜的，并且其中如果ERCC1表达水平高于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么无含铂药剂的化疗被确定是适宜的。
25.权利要求24所述的方法，进一步包含测定肿瘤样品中的RRM1表达水平。
26.权利要求24所述的方法，进一步包含基于RRM1表达水平确定适宜的化疗，其中如果RRM1表达水平低于或等于参比组的中位值RRM1表达水平，那么包含抗代谢药的化疗被确定是适宜的，并且其中如果RRM1表达水平高于参比组的中位值RRM1表达水平，那么无抗代谢药的化疗被确定是适宜的。
27.为受试者评估适宜化疗的方法，包含：
(i)提供来自受试者的肿瘤样品；
(ii)测定该肿瘤样品中的RRM1表达水平；和
(iii)基于RRM1表达水平确定适宜的化疗，其中如果RRM1表达水平低于或等于参比组的最低四分位数RRM1表达水平或高于或等于参比组的最高四分位数RRM1表达水平，那么确定包含抗微管蛋白剂的化疗是适宜的，并且其中如果测定RRM1表达水平不是位于参比组的最低四分位数之中或不是位于参比组的最高四分位数中，那么无抗微管蛋白剂的化疗被确定是适宜的。
28.权利要求27所述的方法，进一步包含测定肿瘤样品中的ERCC1表达水平。
29.权利要求28所述的方法，进一步包含基于ERCC1表达水平确定适宜的化疗，其中如果ERCC1表达水平低于或等于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么包含含铂药剂的化疗是适宜的，并且如果ERCC1表达水平高于参比组的中位值ERCC1表达水平，那么不使用含铂药剂的化疗是适宜的。
30.权利要求27所述的方法，进一步包含对受试者给予适宜的化疗。
31.权利要求29所述的方法，进一步包含对受试者给予适宜的化疗。
32.权利要求27所述的方法，进一步包含如果经测定RRM1表达水平低于或等于参比组的最低四分位数RRM1表达水平，或如果经测定RRM1表达水平高于或等于参比组的最高四分位数RRM1表达水平，则对受试者给予抗微管蛋白剂。
33.权利要求32所述的方法，其中所述的抗微管蛋白剂为紫杉烷或长春花生物碱。
34.权利要求33所述的方法，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
35.权利要求33所述的方法，其中长春花生物碱为长春瑞滨、长春新碱、长春碱、长春氟宁或长春地辛。
36.权利要求29所述的方法，进一步包含如果经测定ERCC1表达水平低于或等于参比组的中位值ERCC1表达水平，则对受试者给予含铂药剂。
37.权利要求36所述的方法，其中所述的含铂药剂为顺铂、卡铂或奥沙利铂。
38.权利要求27-37中任意一项所述的方法，其中所述的受试者具有上皮恶性肿瘤。
39.权利要求27-38中任意一项所述的方法，进一步包含对受试者给予放疗。
40.权利要求27-39中任意一项所述的方法，进一步包含对受试者进行外科手术。
41.用于评价包含化疗剂的组合物功效的方法，该方法包含：
(i)提供第一细胞系和第二细胞系，其中第一细胞系RRM1的表达水平高于第二细胞系；
(ii)在足以影响细胞生存力的时间内使第一细胞系和第二细胞系接触所述组合物；和
(iii)测定第一和第二细胞系的细胞生存力效应，其中第二细胞系比第一细胞系在细胞生存力方面下降表明所述组合物很可能对表达较低水平的RRM1的肿瘤有效。
42.权利要求41所述的方法，其中所述的组合物包含抗代谢药、抗微管蛋白剂或含铂剂中的一种或多种。
43.权利要求42所述的方法，其中所述的抗代谢药为吉西他滨或培美曲塞。
44.权利要求42所述的方法，其中所述的抗微管蛋白剂为紫杉烷或长春花生物碱。
45.权利要求44所述的方法，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
46.权利要求44所述的方法，其中长春花生物碱为长春瑞滨、长春新碱、长春碱、长春氟宁或长春地辛。
47.权利要求42所述的方法，其中含铂药剂为卡铂、顺铂或奥沙利铂。
48.用于评价包含化疗剂的组合物功效的方法，该方法包含：
(i)提供第一细胞系和第二细胞系，其中第一细胞系RRM1的表达水平高于第二细胞系；
(ii)在足以影响细胞生存力的时间内使第一细胞系和第二细胞系接触所述组合物；和
(iii)测定第一和第二细胞系的细胞生存力效应，其中第一细胞系比第二细胞系在细胞生存力方面下降表明所述组合物很可能对表达较高水平的RRM1的肿瘤有效。
49.用于评价包含化疗剂的组合物功效的方法，该方法包含：
(i)提供第一细胞系和第二细胞系，其中第一细胞系ERCC1的表达水平高于第二细胞系；
(ii)在足以影响细胞生存力的时间内使第一细胞系和第二细胞系接触所述组合物；和
(iii)测定第一和第二细胞系的细胞生存力效应，其中第二细胞系比第一细胞系在细胞生存力方面下降表明所述组合物很可能对表达较低水平的ERCC1的肿瘤有效。
50.权利要求49所述的方法，其中所述的组合物包含抗代谢药、抗微管蛋白剂或含铂药剂中的一种或多种。
51.权利要求50所述的方法，其中所述的抗代谢药为吉西他滨或培美曲塞。
52.权利要求50所述的方法，其中所述的抗微管蛋白剂为紫杉烷或长春花生物碱。
53.权利要求50所述的方法，其中含铂药剂为卡铂、顺铂或奥沙利铂。
54.权利要求52所述的方法，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
55.权利要求52所述的方法，其中长春花生物碱为长春瑞滨、长春新碱、长春碱、长春氟宁或长春地辛。
56.用于评价包含化疗剂的组合物功效的方法，该方法包含：
(i)提供第一细胞系和第二细胞系，其中第一细胞系ERCC1的表达水平高于第二细胞系；
(ii)在足以影响细胞生存力的时间内使第一细胞系和第二细胞系接触所述组合物；和
(iii)测定第一和第二细胞系的细胞生存力效应，其中第一细胞系比第二细胞系在细胞生存力方面下降表明所述组合物很可能对表达较高水平的ERCC1的肿瘤有效。
57.试剂盒，包含：
(i)用于测定来自患者的组织样品中RRM1表达的试剂；和
(ii)说明书。
58.权利要求57所述的试剂盒，其中用于测定RRM1表达的试剂包含预先确定的份的选自下组中的试剂：寡-dT引物、与RRM1 cDNA杂交的正向引物、与RRM1 cDNA杂交的反向引物、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲剂和核苷酸。
59.权利要求57所述的试剂盒，其中用于测定RRM1表达的试剂包含预先确定的份的用于进行蛋白质印迹或免疫组织化学测定的抗-RRM1抗体和缓冲剂。
60.权利要求57所述的试剂盒，进一步包含用于处理来自患者的组织样品的试剂。
61.权利要求57所述的试剂盒，进一步包含用于测定活检组织中ERCC1表达的试剂。
62.试剂盒，包含：
(i)用于测定来自患者的组织样品中ERCC1表达的试剂；和
(ii)说明书。
63.权利要求62所述的试剂盒，其中用于测定ERCC1表达的试剂包含预先确定的份的选自下组中的试剂：寡-dT引物、与ERCC1 cDNA杂交的正向引物、与ERCC1 cDNA杂交的反向引物、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲剂和核苷酸。
64.权利要求62所述的试剂盒，其中用于测定ERCC1表达的试剂包含预先确定的份的用于进行蛋白质印迹或免疫组织化学测定的抗-ERCC1抗体和缓冲剂。
65.权利要求62所述的试剂盒，进一步包含用于处理来自患者的组织样品的试剂。
66.试剂盒，包含：
(i)用于测定来自患者的组织样品中RRM1表达的试剂；
(ii)用于测定来自患者的组织样品中ERCC1表达的试剂；和
(ii)说明书。
CNA2006800219084A 2005-05-04 2006-05-04 预测癌症受试者中的治疗反应 Pending CN101218353A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US59476305P 2005-05-04 2005-05-04
US60/594,763 2005-05-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101218353A true CN101218353A (zh) 2008-07-09

Family

ID=37308325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800219084A Pending CN101218353A (zh) 2005-05-04 2006-05-04 预测癌症受试者中的治疗反应

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20060252082A1 (zh)
EP (3) EP2204454A1 (zh)
JP (2) JP2008541701A (zh)
KR (1) KR20080026093A (zh)
CN (1) CN101218353A (zh)
AU (1) AU2006243782A1 (zh)
WO (1) WO2006119464A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102465172A (zh) * 2010-11-04 2012-05-23 中山大学达安基因股份有限公司 非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法及其应用
CN103882139A (zh) * 2014-04-04 2014-06-25 上海赛安生物医药科技有限公司 一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008026946A2 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic disorders
JP2010520204A (ja) * 2007-03-02 2010-06-10 アムジェン インコーポレイテッド 腫瘍疾患を治療するための方法および組成物
AU2008266048A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 University Of South Florida Methods of diagnosing and treating cancer
TWI428132B (zh) * 2007-07-02 2014-03-01 Lilly Co Eli 癌症化療效果之強化
WO2009089521A2 (en) * 2008-01-10 2009-07-16 Nuvera Biosciences, Inc. Predictors for evaluating response to cancer therapy
EP2295564A4 (en) 2008-05-21 2011-08-10 Toray Industries COMPOSITION AND METHOD FOR DETERMINING CREAM CANCER
WO2011009963A1 (en) * 2009-07-24 2011-01-27 Institut Gustave-Roussy Parp and adjuvant cisplatin-based chemotherapy in non-small-cell lung cancer
KR20150113113A (ko) * 2013-01-29 2015-10-07 몰레큘러 헬스 게엠베하 임상적 판단 지원을 위한 시스템 및 방법
WO2016066797A2 (en) * 2014-10-30 2016-05-06 University Of Helsinki Ovarian cancer prognostic subgrouping

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1191096B1 (en) * 1999-06-28 2011-10-12 Yusuke Nakamura Ovel protein and dna thereof
US6248535B1 (en) * 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
US6582919B2 (en) * 2001-06-11 2003-06-24 Response Genetics, Inc. Method of determining epidermal growth factor receptor and HER2-neu gene expression and correlation of levels thereof with survival rates
US6518416B1 (en) * 2000-12-01 2003-02-11 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression
US6602670B2 (en) * 2000-12-01 2003-08-05 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression
US7049059B2 (en) * 2000-12-01 2006-05-23 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 and TS expression
US20020090652A1 (en) * 2000-12-22 2002-07-11 Fu Emil Wei-Ming Inverse labeling method for the rapid identification of marker/target proteins
US6956111B2 (en) * 2001-03-02 2005-10-18 Response Genetics, Inc. Method of determining dihydropyrimidine dehydrogenase gene expression
US6686155B2 (en) * 2001-06-14 2004-02-03 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on glutathione-S-transferase pi expression
AU2002343443A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Classification of lung carcinomas using gene expression analysis
WO2004031408A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene
EP2226396A1 (en) * 2003-05-30 2010-09-08 Genomic Health, Inc. Gene expression markers for response to EGFR inhibitor drugs
CA2540167A1 (en) * 2003-09-29 2005-05-12 Pathwork Informatics, Inc. Systems and methods for detecting biological features
DE102005044129A1 (de) * 2005-09-15 2007-03-22 NOWE Streugeräte Goldmann und Bartling GmbH Sandstreueinrichtung bei Schienenfahrzeugen, insbesondere Hochgeschwindigkeitsfahrzeugen
AU2008266048A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 University Of South Florida Methods of diagnosing and treating cancer

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102465172A (zh) * 2010-11-04 2012-05-23 中山大学达安基因股份有限公司 非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法及其应用
CN103882139A (zh) * 2014-04-04 2014-06-25 上海赛安生物医药科技有限公司 一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒
CN103882139B (zh) * 2014-04-04 2015-06-03 上海赛安生物医药科技有限公司 一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
US20130164747A1 (en) 2013-06-27
EP2460886B1 (en) 2014-01-01
EP1877569A1 (en) 2008-01-16
WO2006119464A1 (en) 2006-11-09
KR20080026093A (ko) 2008-03-24
JP2012196235A (ja) 2012-10-18
EP2204454A1 (en) 2010-07-07
JP2008541701A (ja) 2008-11-27
EP2460886A1 (en) 2012-06-06
EP1877569A4 (en) 2009-07-15
AU2006243782A1 (en) 2006-11-09
US20060252082A1 (en) 2006-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101218353A (zh) 预测癌症受试者中的治疗反应
Bardia et al. Biomarker analyses in the phase III ASCENT study of sacituzumab govitecan versus chemotherapy in patients with metastatic triple-negative breast cancer
Fleitas et al. Circulating endothelial cells and microparticles as prognostic markers in advanced non-small cell lung cancer
Wang et al. Bone marrow morphology is a strong discriminator between chronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified and reactive idiopathic hypereosinophilic syndrome
Ntziachristos et al. Genetic inactivation of the polycomb repressive complex 2 in T cell acute lymphoblastic leukemia
EP2171086B1 (en) Methods of diagnosing and treating cancer
Li et al. BCOR–CCNB 3‐positive soft tissue sarcoma with round‐cell and spindle‐cell histology: a series of four cases highlighting the pitfall of mimicking poorly differentiated synovial sarcoma
CN102132160A (zh) 与转移有关的信号和决定子以及它们的使用方法及用途
CN104080926B (zh) 对nedd8活化酶(nae)抑制剂的反应的生物标记
CN104822844A (zh) 预测对抑制剂的反应的生物标记物和方法以及其用途
CN103328971B (zh) 急性髓细胞性白血病应答法尼基转移酶抑制剂治疗的测定方法
Smolle et al. Influence of tumor-infiltrating immune cells on local control rate, distant metastasis, and survival in patients with soft tissue sarcoma
CN107076727A (zh) 用于确定患者特定突变的致癌指数的方法和系统
Alonso-Álvarez et al. Primary refractory follicular lymphoma: a poor outcome entity with high risk of transformation to aggressive B cell lymphoma
CN102947446A (zh) 肺腺癌的预后预测方法、肺腺癌的检测试剂盒以及用于治疗肺腺癌的医药组合物
Pai et al. Regional and clonal T cell dynamics at single cell resolution in immune checkpoint blockade
EP2954331B1 (en) Use of facilitates chromatin transcription complex (fact) in cancer
Gu et al. Cell-free DNA sequencing of intraocular fluid as liquid biopsy in the diagnosis of vitreoretinal lymphoma
Johansen et al. A PTPmu Biomarker is Associated with Increased Survival in Gliomas
Ruzzi et al. ADK-VR2, a cell line derived from a treatment-naïve patient with SDC4-ROS1 fusion-positive primarily crizotinib-resistant NSCLC: a novel preclinical model for new drug development of ROS1-rearranged NSCLC
CN103620412B (zh) 作为对表皮生长因子受体治疗剂治疗的响应的预测物的cxcr1
Mori et al. Longer prostate stromal cell telomere length is associated with increased risk of death from other cancers
Blacklock Application of Genomics to Identify Novel Prognostic Biomarkers for Cancers in Dogs
Kijan et al. The Histopathological Characteristic of Gastric Carcinoma in the Belgian Tervueren and Groenendael Dog: A Comparison of Two Classification Methods. Animals 2023, 13, 1532
Zhang et al. Cancer Related Venous Thromboembolism for Chinese In-Hospital Cancer Patients: Incidence, Diagnostic Model and Correlation with Driving Genes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20080709