CN103739713A - 一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，由四部分序列组成：能特异性与人EGF受体（EGFR（L858R））突变序列特异性结合的蛋白片段I；人Apaf-1（1-97）蛋白片段II；由9个精氨酸残基串联而成9R-tag序列的蛋白片段III；以及蛋白片段I和蛋白片段II之间由3个甘氨酸残基组成的（3G）连接序列连接。利用遗传工程方法可大量表达该融合蛋白，纯化的融合蛋白在9R-tag的介导下可进入肺瘤细胞内并与含有EGFR（L858R）突变的EGFR二聚体或多聚体结合，从而介导继发Apaf-1二聚体或多聚体的形成；后者可通过诱导Caspase-9和-3蛋白酶活化从而激活Caspase介导的细胞凋亡细胞信号传导途径，引起肿瘤细胞的凋亡。这一融合蛋白可以作为药物用于肺癌的治疗。

Description

一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物制药和基因工程技术领域，尤其涉及含有人EGFR（L858R）突变蛋白序列结合蛋白和Apaf-1（1-97aa）、以及9R-tag的融合蛋白及其表达载体。

背景技术

肺癌是最常见且死亡率最高的一种肺部恶性肿瘤。在许多国家和地区肺癌的发病率占恶性肿瘤的首位。在过去的几十年中，尽管肺癌的诊疗技术取得了较大发展，但是肺癌患者的生存率并没有显著提高。造成这一结果的主要原因，一方面是由于肺癌病理生物学特性复杂，重症率高，大部分患者在初次确诊时已进入晚期或已发生转移；另一方面是由于缺乏有效的肺癌治疗手段。

目前肺癌的主要治疗手段仍然是手术、化疗和放疗，这些方法治疗癌症的特异性不足，副作用大，常常对正常组织和器官造成损伤。理想的肺癌治疗方法应当能特异地清除癌组织，而不破坏正常组织，在给患者较小痛苦的前提下提升患者生存质量、提高生存率。以靶向治疗、免疫治疗等技术为代表的肿瘤治疗新方法能够满足上述条件，且目前正在兴起。其中，靶向治疗，是指在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点设计相应的治疗药物。该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段。药物进入体内后会特异地选择致癌位点结合来发挥作用，使肿瘤细胞特异性死亡而不波及肿瘤周围的正常组织细胞。

肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）两大类，后者占肺癌总数的80%以上。许多NSCLC的发生被认为与表皮生长因子受体（EGFR）的激活突变有关。EGFR激活突变阳性的NSCLC在西方国家肺癌患者中的发病率通常为10%，而在亚洲肺癌患者中则高达30-40%。EGFR是一分子量为170kD的跨膜糖蛋白，含EGFR激活突变的肿瘤细胞增长迅速，容易发生转移，复发率高，因此被认为是NSCLC靶向治疗的一个比较理想的分子靶点。

现阶段，全球约有50多种肿瘤靶向治疗制剂在进行临床试验。在已批准进入临床试验的靶向制剂中，以肿瘤血管生成和EGFR为靶点的靶向药物约占所有靶向制剂的60%左右。以厄洛替尼（erlotinib）和吉非替尼（gefitinib）为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR TKI）是目前肺癌个体治疗中常用的分子靶向药物。但是此类靶向药物在临床实践中的效果并不理想，即使对于短期疗效显著的患者，也会在6～12月内发生不同程度的耐药现象。肿瘤耐药性的产生是现行靶向肿瘤治疗中遇到的主要障碍和失败原因。并且，大量临床实验证据表明，肿瘤在产生抗药性的过程中借助其肿瘤细胞的异质性和可塑性，在用药的过程中发生演化，产生更具侵袭性的肿瘤细胞，使后续治疗更具复杂性。

上述常规的靶向药物是通过阻断特定信号通路来实现抑制肿瘤细胞生长的目的。这一设计思路本身存在巨大缺陷—肿瘤细胞在药物压力之下可产生二次突变或激活其他替代细胞信号通路，这样就绕过了靶向药物的作用而产生抗药性。由于细胞内信号通路网络的复杂性，通过阻断某一条信号通路来实现抗肿瘤作用的药物势必要面对巨大的潜在药物抗性风险。因此，我们必须思考新的肿瘤靶向治疗方向。

发明内容

为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，解决了目前靶向药物存在的潜在药物抗性风险问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含：

[1]能与人EGFR受体EGFR（L858R）突变位点特异性结合的蛋白片段I；

[2]人Apaf-1蛋白片段II；

[3]由9个精氨酸残基串联而成的9R-tag序列的蛋白片段III；

[4]连接所述蛋白片段I和蛋白片段II的3个甘氨酸残基组成的连接序列。

所述蛋白片段I优选为能与人EGFR（L858R）突变位点特异性识别结合的人源化小鼠抗体重链或轻链可变区序列蛋白片段；

所述蛋白片段II为人Apaf-1蛋白第1至97位氨基酸残基序列蛋白片段；

所述小鼠抗体重链和轻链可变区氨基酸序列及其编码DNA序列分别为：

重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

QVQLQQSGAGLVKPSQTLSLSCKASGFNFKDYTMHWVRQAPGQGLEWVGDIYPGSGGTRYAQRFKSRVTISVDTSKNTAYMEMNSLRAEDTAVYYCTRNGGPSFYTGFDYWGQGTTVTVSS（SEQ IDNO.1）

重链可变区的编码DNA序列为：

5’-caggugcagcugcagcaguccggcgcgggccuggugaaaccgucccagacccugucccuguccugcaaagcguccggcuuuaauuuuaaagauuauaccaugcauugggugcgucaggcgccgggccagggccuggaaugggugggcgauauuuauccgggcuccggcggcacccguuaugcgcagcguuuuaaaucccgugugaccauuuccguggauaccuccaaaaauaccgcguauauggaaaugaauucccugcgugcggaagauaccgcgguguauuauugcacccguaauggcggcccguccuuuuauaccggcuuugauuauuggggccagggcaccaccgugaccguguccucc-3’

轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

DIQMTQSPSTLSASPGDRVTITCRASQDVHNTGVAWYQQKPGKAPKLLIYYVSELYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSNLVPWTFGQGTKVQL（SEQ ID NO.2）

轻链可变区的编码DNA序列为：

5’-gauauucagaugacccaguccccguccacccuguccgcguccccgggcgaucgugugaccauuaccugccgugcgucccaggaugugcauaauaccggcguggcgugguaucagcagaaaccgggcaaagcgccgaaacugcugauuuauuauguguccgaacuguauuccggcgugccgucccguuuuuccggcuccggcuccggcaccgauuuuacccugaccauuuccucccugcagccggaagauuuugcgaccuauuauugccagcauuccaaucuggugccguggaccuuuggccagggcaccaaagugcagcug-3’

所述人EGFR（L858R）特异性人源化小鼠抗体重链或轻链可变区序列可以位于所述人Apaf-1蛋白片段II的N端或C端；所述9R-tag序列的蛋白片段III位于所述人Apaf-1蛋白片段II的C端或N端。

优选的所述融合蛋白的序列从N端到C端为：人EGFR（L858R）突变点特异性人源化小鼠抗体重链或轻链可变区序列——GGG——人Apaf-1蛋白片段II——RRRRRRRRR。

所述融合蛋白诱导含EGFR（L858R）突变的肺癌及其它肿瘤细胞的凋亡。

所述融合蛋白中所含的人EGFR（L858R）突变位点特异性人源化小鼠抗体重链或轻链可变区序列可以是其它能与人EGFR（L858R）突变体结合的蛋白质或功能区（domain），也可以是能与其它肿瘤细胞内特异性肿瘤生物标记物（biomarker）如突变的癌基因蛋白、转位的融合蛋白、不同修饰的蛋白（如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、羟基化等蛋白修饰）特异性结合的蛋白或功能区，其相应的融合蛋白对不同相应肿瘤的凋亡起诱导作用。

本发明的积极效果：本发明所述的一种新型靶向抗肺瘤细胞抗体融合蛋白药物，为针对所有其它肿瘤的靶向治疗提供了一个新的方向。本发明首先利用抗体药物对阳性肺癌细胞中的特异性靶标即突变的EGFR蛋白（L858R）靶点进行特异性识别。不像现行的肿瘤靶向治疗药物，该新型药物本身并不直接阻断肺癌细胞内任何肿瘤细胞赖以生存的特定细胞信号传导通路，而是在肺瘤细胞内主动激活细胞凋亡（apoptosis）信号系统，引起肺瘤细胞自动死亡。

附图说明

图1：。用免疫印迹方法对EGFR（L858R）特异性单克隆抗体的特异性进行鉴定的检测图。

图2：PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中第一道为DNA分子量大小标志物，第二道为小鼠VH链PCR片段。

图3：EGFR(L858R)Ab-Apaf-1(1-97)-9R融合蛋白在肺癌细胞中的Caspase-3激活作用，其中：Lane1:A549细胞；Lane2:A431细胞；Lane3:H1975细胞；Lane4:H3255细胞。

图4：EGFR(L858R)Ab-Apaf-1(1-97)-9R融合蛋白诱导肺癌细胞的凋亡作用。

图5：EGFR(L858R)Ab-Apaf-1(1-97)-9R融合蛋白对植入小鼠的人肺癌细胞的生长抑制作用。

具体实施方式

结合肿瘤生物学基础研究的最新进展，本发明提供了一种新型的靶向抗肺瘤细胞抗体融合蛋白药物。该抗体药物主要由三部分构成：抗EGFR（L858R）特异性抗体重链或轻链可变区蛋白片段、Apaf-1（1-97aa）功能区蛋白片段和9R-tag蛋白片段。

抗EGFR（L858R）特异性单链抗体可以特异性与肿瘤细胞中的EGFR（L858R）突变蛋白结合，与正常EGFR不反应。该抗体片段是由小鼠抗人EGFR（L858R）单克隆抗体的重链或轻链可变区经人源化后制备而成。

Apaf-1是一种重要的细胞凋亡蛋白酶激活因子，在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用。Apaf-1含有3个不同的功能区：（1）N-端的CARD功能区，负责召集Caspase-9；（2）Ced-4同源功能区，负责结合ATP；（3）C-端色氨酸/天冬氨酸重复序列功能区，负责完成二聚体或多聚体化。Apaf-1在细胞色素C作用下完成聚合活化，能够激活Caspase级联反应，从而引起细胞的凋亡。

9R-tag是指由9个连续排列的精氨酸残基组成的氨基酸序列，大量实验表明9R-tag可以作为一种调控细胞内蛋白运输的信号标签有效地介导蛋白质跨细胞质膜和核膜、跨血脑屏障运输。在蛋白质中加入9R-tag序列的目的是促进该蛋白质向细胞内的运输。

利用此新型融合蛋白治疗肺癌的原理是：融合蛋白通过9R-tag标签的介导进入细胞内。在肺瘤细胞中，该药物中的EGFR（L858R）抗体重链或轻链可变区序列可识别并特异性结合EGFR（L858R）突变位点。由于肿瘤细胞中EGFR突变体以二聚体/多聚体形式存在，因此，当融合蛋白与EGFR（L858R）结合后能够形成融合蛋白二聚体或多聚体，从而继发形成Apaf-1（1-97aa）二聚体或多聚体。Apaf-1（1-97aa）的二聚/多聚化可激活caspase级联途径，进而启动细胞凋亡信号通路，从而实现肺瘤细胞的定向“自杀”。

为了获得本发明的融合蛋白（简称为SBC-426），首先要获得能与人EGFR（L858R）突变体特异性结合的抗体可变区编码序列。将人工化学合成的人EGFR（L858R）突变体肽KITDFGRAKLLG与KLH进行化学交联，然后按常规免疫学方法免疫Balb/c小鼠。经过三次免疫后，待小鼠血清中抗EGFR（L858R）肽特异性抗体滴度用ELISA测定超过1:10000时，取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞进行融合，按标准制备分泌小鼠单克隆抗体杂交瘤的方法进行细胞克隆的筛选、亚克隆及鉴定，最后得到与人EGFR（L858R）突变体蛋白质特异性反应的单克隆抗体（4G8）。并进一步确认该单克隆抗体只特异性识别含L858R突变的人EGFR，与野生型人EGFR并无任何交叉反应。该识别人EGFR（L858R）突变蛋白的抗体也可用类似的方法从包括家兔、大鼠等其它动物制备而成。用常规免疫球蛋白重链和轻链克隆方法从4G6杂交瘤细胞中克隆出编码识别人EGFR（L858R）突变蛋白抗体的重链和轻链可变区基因。进一步按照现有方法（Lo,B.K.C.:Antibody Engineering:Methods in MolecularBiology Volume248,2004,pp135-159）将二者进行人源化改造。用重叠PCR方法（overlapping PCR）将人源化改造后的抗体重链或轻链cDNA编码序列通过编码三个串联Gly（Gly-Gly-Gly）的连接序列与编码人Apaf-1（1-97aa）的编码序列以及编码9个串联Arg（9R）的编码序列按同阅读框（in-frame）连接在一起，从而得到编码该融合蛋白（SBC-426）的cDNA序列（如上述发明内容部分所示）。Apaf-1（1-97aa）编码序列可以在抗体重链或轻链可变区编码序列的5’端上游（蛋白质N端）或3’端下游（蛋白质C端）。9R序列可置于融合蛋白的N端或C端。

进一步构建能够表达SBC-426融合蛋白的表达载体。本发明的表达载体可以是真核表达载体包括酵母、昆虫、哺乳动物细胞的表达载体，也可以是原核表达载体包括大肠杆菌的表达载体。这些表达载体都可以通过购买得到。将SBC-426融合蛋白编码序列通过常规分子生物学方法克隆到表达载体中启动子和/或增强子的下游；然后将该表达载体导入到相应的宿主细胞中诱导融合蛋白的表达。当采用哺乳动物细胞系如293、CHO、NSO细胞系等作为宿主细胞表达该融合蛋白时，可在其上游加上信号肽编码序列，而使细胞合成的SBC-426融合蛋白分泌进入培养上清液中。为了获得足够量的SBC-426融合蛋白，本发明还提供了一种大规模、高效的SBC-426表达方法：当用哺乳动物细胞作为宿主细胞时，可用电脉冲方法（electro-poration）或其它基因转染（transfection）方法将SBC-426表达载体转染到宿主细胞中，从而使宿主细胞在SBC-426编码序列上游强启动子/增强子调控序列作用下介导高效表达SBC-426蛋白。也可以通过常规方法筛选建立稳定表达SBC-426蛋白的哺乳动物细胞系。如用大肠杆菌作为宿主细胞时，先制备感受态大肠杆菌细胞，用SBC-426原核表达载体转化感受态大肠杆菌细胞。将产生SBC-426融合蛋白的工程菌或细胞系在适当的培养基中进行发酵。所用的发酵培养基根据宿主的不同而异。哺乳动物细胞可用DMEM或其它培养基加上10%胚牛血清作为培养基；而大肠杆菌可选用LB培养基。

为了获得SBC-426融合蛋白纯品，首先收集含有SBC-426的细胞发酵培养基上清液或用超声或高压匀浆破菌法将工程菌胞内合成的融合蛋白溶于裂解液中。如果工程菌产生的融合蛋白以包涵体形式存在，则先按常规方法收集包涵体，然后进行蛋白质复性。在纯化SBC-426融合蛋白的过程中，先将含有SBC-426蛋白的细胞培养液上清液/裂解液/复性液用EGFR（L858R）肽亲和层析进行初步纯化，然后用反向层析和离子交换层析等生化纯化方法分离得到SBC-426融合蛋白原液。将此蛋白原液进行冷冻干燥制成粉剂、便于保存和运输。

将纯化的SBC-426融合蛋白进行临床前研究，结果表明该融合蛋白可以非常有效地进入到肺癌和正常细胞中，并且该融合蛋白可在体外细胞培养中直接杀伤带有EGFR（L858R）突变的H1975和H3255人肺癌细胞，而对含有野生型EGFR的A549人肺癌细胞及其它正常人细胞无任何细胞毒作用。并且，实验表明在H1975、H3255和A549肺癌细胞植入（xenograft）小鼠动物模型中，注射该融合蛋白可使H1975和H3255植入肿瘤体积明显缩小，而对A549植入肿瘤无影响。临床前毒理学试验表明，该融合蛋白对小鼠无明显毒副作用。因此，本发明制备的SBC-426融合蛋白可以作为一种安全有效的针对含EGFR（L858R）突变的人肺癌治疗药物。

本发明的原理还可用于制备其它新型抗癌药物。针对其它含有可形成二聚体或多聚体并含有肿瘤特异性点突变、蛋白修饰、转位（拼接、蛋白质融合）、缺失等肿瘤相关蛋白质的不同肿瘤，可制备针对这些特异性肿瘤相关蛋白突变、缺失、转位（蛋白融合）或修饰（磷酸化、甲基化、乙酰化等）-特异性抗体，将其抗体可变区编码序列与Apaf-1（1-97aa）编码序列和GGG连接序列以及9R-tag照本发明的方式连在一起，制备融合蛋白作为激活肿瘤细胞凋亡途径的新抗癌药物。除了Apaf-1外，其它细胞凋亡途径中的含细胞“死亡功能区”（death domain）的蛋白质也可以与上述的抗体可变区以相同方式制成融合蛋白发挥激活肿瘤细胞凋亡的抗癌作用。

以下将通过具体实施方式对本发明进行举例说明，但应当理解这些实例研究不以任何形式限制本发明范围。

实施例1：EGFR（L858R）突变体特异性小鼠单克隆抗体的制备。

人工化学合成EGFR（L858R）突变体特异性短肽，短肽序列为TDFGRAKKLLGGGC。将EGFR（L858R）短肽与KLH载体蛋白利用短肽末端的C氨基酸残基进行共价交联（Thermo Scientific公司试剂盒，产品编号#77605）。本发明中分泌单克隆抗体的杂交瘤制备方法，如无特别说明，均按Harlow,E&Lane,D:Antibodies:A LaboratoryManual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988一书进行。将该交联产物用福氏完全佐剂和福氏非完全佐剂免疫Balb/c小鼠，每次免疫抗原剂量为0.5mg。三次免疫后当血清中EGFR（L858R）特异性抗体滴度达1:10000时，取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行融合。用ELISA方法筛选EGFR（L858R）突变体多肽反应阳性克隆，然后进行亚克隆、筛选，最后得到分泌EGFR（L858R）突变体特异性单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株（4G8）。从杂交瘤培养上清液中纯化出EGFR（L858R）特异性单克隆抗体。用免疫印迹（WesternBlot）方法对该抗体的特异性进行鉴定，结果如图1所示，该抗体只识别人肺癌细胞H1975和H3255中含L858R突变的EGFR，而对A431细胞中所含的大量野生型EGFR没有任何识别作用。这证明该抗体是EGFR（L858R）突变体特异性抗体。

实施例2：人源化EGFR（L858R）突变体小鼠单克隆抗体重链和轻链可变区制备

为了从分泌识别人EGFR（L858R）突变体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞（4G8）中克隆出编码抗体VH和VL的cDNA，先按Zhou等人发表的方法（Zhou,H.et al:Nucleic Acids Res22:888-9,1994），合成一套克隆小鼠VH和VL的cDNA的通用（universal）寡核苷酸引物。从5×106个杂交瘤（4G8）细胞中抽提其总RNA作为模板，由oligo（dT）作为引物，在连接酶作用下催化合成cDNA。逆转录酶介导的cDNA合成反应如下：

反应环境：30℃，10分钟；50℃，30分钟；95℃，5分钟；置于4℃保存备用。

进一步将逆转录反应合成的cDNA作为模板，在上述通用小鼠VH和VL克隆引物介导下分别进行PCR反应。反应条件如下：

反应环境：94℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，1分钟。反应为35个周期，最后一个周期置72℃，10分钟。

将上述PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，可见1条约400bp的带（如图2所示）。将其分离纯化、克隆到pBluescript（+）质粒中去，进行测序分析。将测序结果用NCBI提供的BLAST程序进行同源性分析，证明了该VH序列与小鼠VH家族的高度同源性。采用同样的方法我们得到了VLcDNA编码序列。按照已发表的方法（O’Brien,S.&Jones,T.:Huminization of Monoclonal Antibody by CDR Craftingin Recombinant Antibodies for Cancer Therapy:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology).Vol207,p81-100,2003,SpringerPress），将从4G8细胞中克隆的EGFR（L858R）突变体特异性抗体VH和VL序列分别进行CDR Crafting方法人源化。

实施例3：在大肠杆菌中VH—GGG—Apaf-1（1-97aa）—9R融合蛋白（SBC-426）的表达和制备

根据VH—GGG—Apaf-1（1-97aa）—9R氨基酸序列，依据大肠杆菌密码子偏爱性，人工合成优化的适合大肠杆菌表达的编码该融合蛋白的DNA序列。合成基因时，在其5’端引入KpnI酶切位点GGTACC，在其3’端引入终止密码子TAA和SalI酶切位点GTCGAC。以下分子克隆技术操作方法，如无特别说明，均参照文献操作：Green.M.R:Molecular cloning,A Laboratory Manual(4th),Cold SpringHarbor Press,2012.将该合成的DNA序列先克隆到pBluescript（+）质粒中用于保存该合成的DNA序列。进一步从pBluescript（+）质粒中用KpnI和SalI将融合蛋白编码基因切除下来克隆到pET32a（+）表达载体（Novagen）中去。用含有融合蛋白编码DNA插入序列的pET32a（+）重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），所得到的即为用于表达VH—GGG—Apaf-1（1-97aa）—9R重组融合蛋白的基因工程菌。

将表达融合蛋白的工程菌接种于5ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，置37℃摇床继续培养，当O.D.600达到0.5时，加入IPTG到终浓度为0.5mM进行诱导融合蛋白表达，4小时后收获菌体。将菌体用10mM的PBS洗1次，然后悬浮于5ml细菌裂解缓冲液（20mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,1mM Na2EDTA,1mM EGTA,1%Triton,1mM PMSF）中超声破菌。将细菌裂解物在4℃条件下，10000rpm离心30分钟。取上清上样于TDFGRAKLLGGGC肽亲和层析柱中，用10倍柱体积的10mM PBS缓冲液洗涤亲和层析柱；用酸性洗脱缓冲液（0.1M glycine-HCl,pH2.8）洗脱柱上的融合蛋白。收集洗涤融合蛋白峰，用十分之一体积的1M Tris-HCl,pH8.5中和之。然后置于4℃针对10mM PBS透析过夜。

实施例4：融合蛋白对人EGFR（L858R）突变体特异性识别作用。

将人肺癌细胞系H3255、H1975（二者均含有EGFR（L858R）突变）和人皮肤癌细胞系A431（含有大量野生型EGFR）置于含10%胚牛血清的DMEM培养基中于37℃，5%CO2条件下培养，当细胞达到75%的满载密度程度（confluent）时，用PBS将细胞洗1次，然后将细胞直接于1×Laemmli buffer中裂解。将细胞裂解物上样于8%SDS-PAGE胶中电泳，按常规免疫印迹方法将蛋白质转印于硝酸纤维膜上，再用含5%BSA，0.1%Tween20的PBS缓冲液封闭硝酸纤维膜。随后将纯化的融合蛋白按1:1000稀释于含0.1%Tween20PBS缓冲液中与该封闭后的硝酸纤维膜置于室温温育2小时。用0.1%Tween20的PBS洗涤3次，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗-9R抗体（购自美国Cell Application，Inc）（1:1000稀释与0.1%Tween20PBS中），置于室温温育1小时。用0.1%Tween20PBS洗涤3次后，用ECL试剂盒（美国Pierce公司）显色。结果与前述的单克隆抗体4G8相同，该融合蛋白只与H3255和H1975肺癌细胞中的EGFR（L858R）突变体结合。与A431细胞中的野生型EGFR均无结合。这证明该融合蛋白是针对人EGFR（L858R）突变体特异性的。

实施例5：融合蛋白对含人EGFR（L858R）突变体肺癌细胞的细胞凋亡诱导作用。

将H3255、H1975和A549人肺癌细胞和A431置于含10%胚牛血清的DMEM培养基中于37℃，5%CO2条件培养。当细胞占满达75%细胞培养瓶培养面积（confluency）时，加入纯化的融合蛋白（终浓度为10μg/ml），继续培养36小时。然后，一方面制备细胞裂解物，用抗Caspase-3（Asp175）抗体（Cell Signaling Technology,Inc）进行免疫印迹检测不同细胞中Caspase-3的活化情况，结果如图3所示，只在含有EGFR（L858R）突变体的肺癌细胞H3255和H1975中可见活化的caspase-3，而含有野生型EGFR的A549和A431中该融合蛋白均不活化caspase-3。另一方面，用TUNEL Labeling Kit（MicroplateReader-based）（R&D Systems，Inc）检测细胞的凋亡情况，结果如图4所示，融合蛋白只诱导含EGFR（L858R）突变体的H3255细胞产生显著的凋亡效应，而对含野生型EGFR的A431肿瘤细胞无任何细胞凋亡作用。

实例6：融合蛋白对植入小鼠的人肺癌细胞的生长抑制作用。

将1×106H3255肿瘤细胞悬浮于0.15ml PBS中分别经皮下注射给Balb/c小鼠的右背部位（0天）。从第1天开始，给小鼠经静脉分别注射融合蛋白（每天1μg）、不含9R-tag的抗体—Apaf-1（1-97aa）融合蛋白（每天1μg）或PBS，连续注射10天，从第11天开始至第20天止，每2天用卡尺测量肿瘤的生长。第20天处死小鼠测量肿瘤的重量。结果表明注射该融合蛋白可特异性抑制含有EGFR（L858R）突变的H3255肺癌细胞在小鼠体内的生长；而对照组对该肿瘤细胞在小鼠体内的生长无明显影响作用（见图5）。

以上所述的仅为本发明的优选实施例，所应理解的是，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的思想和原则之内所做的任何修改、等同替换等等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含： 

[1]能与人EGFR受体EGFR（L858R）突变位点特异性结合的蛋白片段I； 

[2]人Apaf-1蛋白片段II； 

[3]由9个精氨酸残基串联而成的9R-tag序列的蛋白片段III； 

[4]连接所述蛋白片段I和蛋白片段II的3个甘氨酸残基组成的连接序列。 

2.根据权利要求1所述的一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，其特征在于：所述蛋白片段I为人EGFR（L858R）突变点特异性人源化小鼠抗体重链或轻链可变区序列蛋白片段；所述蛋白片段II为人Apaf-1蛋白第1至97位氨基酸残基序列蛋白片段。 

3.根据权利要求2所述的一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，其特征在于：所述人EGFR（L858R）突变点特异性人源化小鼠抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述人EGFR（L858R）突变点特异性人源化小鼠抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

4.根据权利要求2或3所述的一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，其特征在于：所述人EGFR（L858R）突变点特异性人源化小鼠抗体重链或轻链可变区序列位于所述人Apaf-1蛋白片段II的N端或C端；所述9R-tag序列的蛋白片段III位于所述人Apaf-1蛋白片段II的C端或N端。 

5.根据权利要求4所述的一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的序列从N端到C端为：人EGFR（L858R）突变点特异性人源化小鼠抗体重链或轻链可变区序列—— GGG——人Apaf-1蛋白片段II——RRRRRRRRR。 

6.根据权利要求1所述的一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白，其特征在于：所述蛋白片段I为能与除肺瘤细胞外其它肿瘤细胞内特异性肿瘤生物标记物特异性结合的蛋白或功能区。 

7.权利要求1～5所述的一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白诱导含EGFR（L858R）突变的肺癌细胞的凋亡。 

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