CN102199657B

CN102199657B - 人表皮生长因子受体外显子19及21突变检测试剂盒

Info

Publication number: CN102199657B
Application number: CN201010131040.1A
Authority: CN
Inventors: 温剑平; 孙延波; 李菁华; 史红艳
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2010-03-24
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2030-03-24
Also published as: CN102199657A

Abstract

本发明涉及一种应用PCR技术检测人基因组表皮生长因子受体(EGFR)外显子19、21突变的检测试剂盒，该试剂盒由EGFR外显子19、21正常引物和突变引物组成的PCR反应试剂盒，可用于检测人雪中EGFR突变的各种形式。

Description

人表皮生长因子受体外显子19及21突变检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种应用PCR技术检测人基因组表皮生长因子受体(EGFR)外显子19、21突变的检测试剂盒。

背景技术

肺癌目前是世界范围内发生率和死亡率第一的恶性肿瘤，虽经多年努力，总的治疗效果仍不乐观。进入二十一世纪以来，以表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶标的分子靶向药物的出现为肺癌的治疗带来了新的希望和手段，以Gefitinib(商品名易瑞沙，由阿斯利康公司生产)和Erlotinib(商品名特罗凯，由罗氏公司生产)为代表的酪胺酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)是目前被多国批准并被广泛应用于进展或难治性非小细胞肺癌的小分子靶向药物。

最初的临床实践发现，经化疗失败的非小细胞肺癌病人对TKI药物治疗的总有效率可达10％以上，而对TKI药物有效的病人可在症状改善、病灶控制和生存时间等方面获得明显益处。东方人种、腺癌、女性和不吸烟是TKI药物治疗的优势人群，通过这种优势人群的选择可使TKI药物的有效性升高到40％以上。2004年，在“科学”和“新英格兰医学杂志”等期刊上发表了几篇关于EGFR突变与TKI药物敏感性关系的研究，发现EGFR突变的病人使用TKI药物的有效性高达71--100％。

现在已有许多大型医疗中心正在采用EGFR检测进行TKI药物治疗病人的选择，实践证明，通过EGFR检测可使TKI的有效率提高到80％以上。

目前有关EGFR突变的检测方法采用的均是核苷酸测序方法，即对EGFR外显子19和21进行PCR扩增，之后对PCR产物进行测序。应用核苷酸测序的方法检测EGFR外显子19和21突变有如下缺点：1)如果样本基因组DNA发生的是EGFR杂合性突变，就会出现两种PCR产物，而基因测序一般只能测出其中一种产物的序列。因此这种方法的缺点是：1)不能检测出杂合子的情况2)在杂合子情况下，测序信号可能有紊乱。3)在杂合子存在的情况下可能出现假阴性，即正常的EGFR序列可能随机成为检测结果。应用核苷酸测序的方法还存在费用较高，耗时较长的缺点。目前提供核苷酸测序服务的公司都集中在北京、上海等大型城市，国内目前有许多省会城市没有提供核苷酸测序服务的公司，这将导致检测周期过长的缺点。

发明内容

为了解决在检测EGFR突变中存在的上述问题，我们发明了一种直接用PCR法即可以检测出EGFR突变情况的技术，该技术的要点是，直接根据EGFR外显子19、21已知存在的3个突变类型的突变位点设计出特异性引物，特异性引物只扩增相对应的突变类型，经过电泳即可鉴定是哪一类的类型突变。与前述的测序方法相比，该方法经济、简单、快速，根据EGFR正常序列的引物还可以清晰地判断出突变类型是杂合性突变还是纯合性突变。

根据Gene Bank检索人EGFR 19、21外显子的正常核苷酸序列，根据相应文献报道确定EGFR外显子19、21突变的序列。EGFR外显子19突变类型为E746-A750缺失突变、L747-S752缺失突变；EGFR外显子21为L858R点突变。根据这些突变的核苷酸序列设计特异性引物，用于扩增特异性的核苷酸序列。

本发明设计的引物如下：

EGFR外显子19野生型上游引物：5`ttcccgtcgctatcaaggaattaag 3`

外显子19E746-A750缺失突变上游引物：5`gttaaaattcccgtcgctatcaaaa 3`

外显子19L747-A752缺失突变上游引物：5`gttaaaattcccgtcgctatcaagac 3`

EGFR外显子19通用下游引物：5`GCTCA CCAAG AGCAC TCACT CATCA 3`

EGFR外显子21野生型上游引物：5`CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT 3`

EGFR外显子21L858R突变上游引物：5`CATGT CAAGA TCACA GATTT TGGGCG 3`

EGFR外显子21通用下游引物：5`cagtggaccaccaaggcagctgtgac 3`

取病人血液标本，提取基因组，应用常规PCR反应条件做PCR反应，将PCR产物做电泳检测，即可判断出其是否发生突变，突变的类型、突变为纯合性还是杂合性。

根据上述引物所设计的PCR试剂盒，可用于人基因组中EGFR外显子19和21常见突变的检测。

附图说明

图1：EGFR外显子19、L858R野生型PCR产物电泳图

泳道1：DNA Marker 2000；

泳道2：EGFR外显子19野生型，可见约360nt长度的PCR产物；

泳道3：外显子19E746-A750缺失突变，无PCR产物；

泳道4：外显子19L747-A752缺失突变型；无PCR产物；

泳道5：EGFR外显子21野生型，可见415nt长度的PCR产物；

泳道6：EGFR外显子21L858R突变型；无PCR产物。

图2：EGFR外显子19E746-A750缺失突变型PCR产物电泳图

泳道1：DNA Marker 2000；

泳道2：EGFR外显子19野生型，可见约360nt长度的PCR产物；

泳道3：外显子19E746-A750缺失突变，可见约350nt长度PCR产物；

泳道4：外显子19L747-A752缺失突变上游引物，无PCR产物；

泳道5：EGFR外显子21野生型，可见415nt长度的PCR产物。

泳道6：EGFR外显子21L858R突变型，无PCR产物。

图3：EGFR外显子19L747-A752缺失突变型PCR产物电泳图

泳道1：DNA Marker 2000；

泳道2：EGFR外显子19野生型，可见约360nt长度的PCR产物；

泳道3：外显子19E746-A750缺失突变型，无PCR产物；

泳道4：外显子19L747-A752缺失突变型，可见约350nt长度PCR产物

泳道5：EGFR外显子21野生型，可见415nt长度的PCR产物。

图4：EGFR外显子子21L858R突变型PCR产物电泳图

泳道1：DNA Marker 2000；

泳道2：EGFR外显子19野生型，可见约360nt长度的PCR产物；

泳道3：外显子19E746-A750缺失突变型，无PCR产物。

泳道4：外显子19L747-A752缺失突变型，无PCR产物。

泳道5：EGFR外显子21野生型，可见415nt长度的PCR产物。

泳道6：EGFR外显子21 L858R突变型，可见415nt长度的PCR产物。

具体实施方式

实施例1 应用引物特异性PCR法检测临床病人EGFR外显子19、21突变材料：

寡核苷酸引物均有北京中美泰和有限公司合成，引物名称和序列如下：

EGFR外显子19野生型上游引物：5`ttcccgtcgctatcaaggaattaag 3`

外显子19E746-A750缺失突变上游引物：5`gttaaaattcccgtcgctatcaaaa 3`

外显子19L747-A752缺失突变上游引物：5`gttaaaattcccgtcgctatcaagac 3`

EGFR外显子19通用下游引物：5`gctcaccaagagcactcactcatca 3`

EGFR外显子21野生型上游引物：5`catgtcaagatcacagatttgggct 3`

EGFR外显子21L858R突变上游引物：5`catgtcaagatcacagattttgggcg 3`

EGFR外显子21通用下游引物：5`CAGTG GACCA CCAAG GCAGC TGTGA C 3`

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒均购自北京天根生物技术有限公司；病人血液标本均来自吉林大学第一医院。

方法：

1)人全血基因组提取

(1)用患者姓名拼音标记1.5ml离心管、CB3吸附柱；取患者全血200ul，加入对应的离心管内。

(2)加入20ul蛋白酶K溶液，加样器吸打二次；加人200ul缓冲液GB，吸打二次，盖盖后颠倒混匀三次；置70°水浴10分钟，溶液应变清亮。

(3)加入200ul无水乙醇，颠倒震荡15秒；加液体于相同标记的吸附柱内，吸附柱放入离心管中，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。

(4)向吸附柱内加入500ul缓冲液GD，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管；

向吸附柱内加入700ul漂洗液PW，8000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；

向吸附柱内加入500ul漂洗液PW，8000rpm离心1分钟，弃废液。

(5)将吸附柱放回收集管内，8000rpm离心5分钟，弃废液；室温放置10-15分钟；将吸附柱转入一个干净的收集管中，向吸附膜中间部位滴加200ul洗脱缓冲液TE，室温放置3分钟，8000rpm离心4分钟。

将收集管中的液体吸出，放入标有患者姓名的1.5ml离心管内，置4°备用。

2)PCR反应

(1)PCR反应体系

前步提取的病人基因组模板1ul；上下游引物各1ul，终浓度0.2uM；dNTP 1ul，水35.5ul，5X缓冲液10ul；Taq酶0.5ul。

(2)反应条件

95℃ 15min；95℃ 25`，59℃ 40`，72℃ 30`，40cycles；72℃ 3min。

3)PCR产物电泳

将PCR产物行1％浓度琼脂糖凝胶电泳。90V，电泳20分钟。用凝胶成像仪拍摄电泳结果。

结果：

电泳结果显示，可检测出EGFR外显子正常及各种突变情况，和核苷酸测序鉴定的结果一致。

附图中图1-图4的PCR产物电泳图的病人标本分别鉴定为EGFR外显子19野生型、外显子19E746-A750缺失突变型、外显子19L747-A752缺失突变型、EGFR外显子21 L858R突变型。各种缺失类型均为杂合性缺失。

序列表

<110>吉林大学

<120>人基因组表皮生长因子受体外显子19及21突变检测试剂盒

<160>5

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ttcccgtcgctatcaaggaattaag

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

tttaaaattcccgtcgctatcaaaa

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

tttaaaattcccgtcgctatcaagac

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

catgtcaagatcacagatttgggct

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

catgtcaagatcacagattttgggcg

Claims

1. SEQ NO.1-5所示序列的核苷酸在制备用于检测人基因组表皮生长因子受体外显子19及21突变试剂盒中的用途，其特征在于：

以SEQ NO.1-3作为上游引物，以5`gctca ccaag agcac tcact catca3`作为下游引物特异性扩增人基因组表皮生长因子受体外显子19野生型和突变型；

以SEQ NO.4-5作为上游引物，以5`cagtggaccaccaaggcagctgtgac3`作为下游引物特异性扩增人基因组表皮生长因子受体外显子21野生型和突变型。

2.根据权利要求1的用途，其中所述的试剂盒用于指导酪氨酸激酶受体抑制剂类抗癌药物临床应用。