WO2010045865A1 - kRas基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 - Google Patents

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WO2010045865A1
WO2010045865A1 PCT/CN2009/074508 CN2009074508W WO2010045865A1 WO 2010045865 A1 WO2010045865 A1 WO 2010045865A1 CN 2009074508 W CN2009074508 W CN 2009074508W WO 2010045865 A1 WO2010045865 A1 WO 2010045865A1
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seq
kras gene
codon
mutation
primer
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PCT/CN2009/074508
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许嘉森
吴诗杨
任立芬
何嘉英
杨惠夷
林一群
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广州益善生物技术有限公司
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention belongs to the field of biotechnology, and specifically relates to a detection probe for a mutation of a kRas gene, a liquid phase chip and a detection method thereof. Background technique
  • the Ras gene is a common oncogene in human tumors.
  • the Ras gene family consists of kRas, hRas, and nRas, and members of the gene family share up to 85% homology.
  • the protein encoded by the Ras gene is the P21 protein.
  • the P21 protein is located on the inner surface of the cell membrane and has GTPase activity, which is involved in the regulation system that conducts cell proliferation signals.
  • the activation state is the GTP binding state
  • the inactivation state is the GDP binding state
  • the main part of the active oncogene is the mutation of the 12th, 13th and 61st codons.
  • kRas gene Activation of kRas gene has been well studied in the development of pancreatic cancer, with kRas 12 crypton mutations being the most common.
  • the mutated kRas protein p21 has only weak GTPase activity and cannot rapidly decompose GTP. Therefore, the ras signaling protein is "locked" in the activated state of GTP binding, and the activated ras signaling protein causes uncontrolled proliferation of cells through the cell signaling pathway. Malignant change.
  • the mutation rate of the kRas gene is not the same in different tumor tissues.
  • colon cancer the frequency of mutation is 43%, 30% in lung cancer, and 29% in thyroid cancer.
  • bladder, liver, kidney, and uterine cancer the frequency of this mutation is 10% or less.
  • the mutation rate of kRas gene is as high as 75% -95%.
  • the mutation almost always occurs at the 12th codon.
  • the mutations are almost all CGT, GTT and GAT, while normal pancreatic tissue, acute and chronic pancreas
  • the kRas gene mutation is an early manifestation of pancreatic cancer, and the mutation rate is different during tumorigenesis: 26% in proliferative phase, 46% in papillary hyperplasia, 76% in carcinoma in situ, adenocarcinoma 80%, lymphatic metastasis 43%.
  • detecting the presence or absence of mutation at the 12th codon of the kRas gene is helpful for clinical diagnosis of benign and malignant pancreatic masses and diagnosis of pancreatic cancer. Detection of K-ras gene from pancreatic juice, bile, duodenal juice, feces, and peripheral blood 12 codon mutations are an important adjunct to the diagnosis of pancreatic cancer.
  • kRas gene mutation and non-small cell lung cancer The primary drug resistance of gefitinib, erlotinib and other targeted drugs kRas gene is a key in the epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathway. Downstream regulation molecules.
  • EGFR is a multifunctional glycoprotein widely distributed on the cell membrane of human tissues. It has tyrosine kinase activity and is one of the four members of the ErbB family, hence the name HER1 or ErbBl. EGFR is activated by a ligand to initiate intracellular signaling, A cascade of adaptor proteins and enzymes in the cytoplasm regulates transcription of transcription factor-activated genes, directing cell migration, adhesion, proliferation, differentiation, and apoptosis. Studies have shown that the high expression or abnormal expression of EGFR in many solid tumors provides a theoretical basis and experimental basis for EGFR-targeted tumor therapy and signal transduction intervention for EGFR signaling pathway.
  • EGFR receptor tyrosine kinase inhibitors gefitinib (Genfitinib, Irressa) and erlotinib (Erlotinib, Tarceva, Tarceva) have been approved by the US Food and Drug Administration for the treatment of advanced non-small cells. Lung cancer (NSCLC). In February 2005, China also approved gefitinib to enter the clinic. These drugs are used in the treatment of other tumors (such as breast cancer, colon cancer and stomach cancer) and are now in clinical trials.
  • NSCLC Lung cancer
  • Gefitinib an oral small molecule EGFR antagonist that competes with ATP for binding to the ATP-binding pocket of the EGFR tyrosine kinase domain to inhibit EGFR activity, and has been used in advanced and unsuitable traditional chemotherapy.
  • the clinical treatment of patients with non-small cell lung cancer is currently the most effective treatment for some patients with NSCLC.
  • the patient's responsiveness to this molecularly targeted drug is related to the individual's genetic background.
  • researchers at Harvard Medical School in the United States, Lynch et al. and Paez, etc. first reported that mutations in the EGFR tyrosine kinase coding region in lung cancer cells are a necessary prerequisite for targeted therapeutic drugs.
  • Deletion mutations in EGFR exon 19 and point mutations in exon 21 make patients sensitive to targeted therapeutic drugs such as gefitinib and erlotinib, while others may make patients resistant to these drugs, or Drug resistance.
  • Drug resistance is divided into primary resistance and secondary resistance (acquired resistance).
  • the T790 point mutation in EGFR exon 20 is associated with secondary resistance to targeted therapies.
  • the kRas gene mutation encoding GTPase downstream of the EGFR signaling pathway is responsible for the primary resistance of gefitinib. Erlotinib.
  • the presence of kRas gene point mutations in approximately 15% to 30% of non-small cell lung cancer patients (NSCLC) is associated with poor prognosis in patient-targeted therapy.
  • NSCLC non-small cell lung cancer patients
  • Mutations in the kRas gene are not only associated with primary resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors such as gefitinib and erlotinib in non-small cell lung cancer, but recent studies have also found that this gene mutation is also associated with colorectal cancer. The resistance of cetuximab is closely related.
  • the epidermal growth factor receptor (EGFR)-targeted drug cetuximab is effective against refractory colorectal cancer and can help overcome irinotecan resistance when used in combination with irinotecan-based chemotherapy.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • cetuximab treatment only some patients benefit from cetuximab treatment, so it is important to identify the predictors of efficacy.
  • kRas mutation detection products adopt real-time fluorescent quantitative PCR, and the detection sensitivity is at least 1-2% of the wild type, and the method has a high false positive rate.
  • Products using the liquid-chip technology platform for kRas gene mutation detection are blank at home and abroad.
  • One of the objects of the present invention is to provide a probe sequence for the detection of a mutation in the kRas gene.
  • Probes for detection of mutations in the kRas gene including:
  • kRas gene codon 12 5 'GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3', and the wild type probe of the 5 'GACCTGGTGGCGTAGGCAAG3' introducing the cleavage site BstOI, and the base sequence selected from
  • Another object of the present invention is to provide a liquid phase chip for detecting a mutation in the kRas gene.
  • the liquid phase chip can be used to detect related mutations of the kRas gene codons 12, 13 and/or 61 (Codonl2, 13 is located on Exon 2, Codon 61 is located on Exon 3), and can be used not only for early diagnosis of pancreatic cancer, but also for predicting non-small Cell lung cancer EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib or erlotinib, and colorectal cancer cetuximab or panitumumab drug treatment efficacy.
  • a kRas gene mutation detecting liquid phase chip mainly comprises: A. coated probe microspheres: a wild type which is coated with an amino group modified to the kRas gene codon 12 and has a base sequence of SEQ ID NO 1 -2 a microsphere of the probe, and a microsphere coated with an amino group modified from one or more mutant probes having a base sequence of SEQ ID 0.3-8; and/or
  • Primer A primer for amplifying a target sequence enriched with the corresponding mutation site of the kRas gene codons 12, 13 and/or 61, and having a biotin label at the end of the target sequence.
  • the spacer arm is a sequence for spacing a specific probe from the surface of the microsphere or placing the specific probe in a hydrophilic environment.
  • a spacer sequence of an appropriate length between the probe sequence and the amino group By arranging a spacer sequence of an appropriate length between the probe sequence and the amino group, steric hindrance can be reduced, the efficiency of the hybridization reaction, and the specificity of the hybridization reaction can be improved.
  • Common spacer sequences include poly dT, poly (dT), oligotetraethylene glycol, and (CH2) n spacer arms (n ⁇ 3), such as (CH2) 12, (CH2) 18 and the like.
  • poly (dA) interference exists poly (TTG) can also be used as the spacer arm.
  • the spacer arm is a sequence of 5 to 40 T, more preferably a sequence of 10 T.
  • the target for amplifying a target sequence enriched with a Codon 12, 13 and/or 61 mutation site comprises: a target sequence for amplifying a codon 12 mutation site having a kRas gene
  • the base sequence is the primer of SEQ ID NO 19-21, at least one of which has a terminal biotin label; and/or
  • the base sequence for amplifying the target sequence enriched with the codon 13 mutation site of the kRas gene is the primer of SEQ ID NO. 22-25, and at least one of the primers has a terminal biotin label; /or
  • the base sequence for amplifying the target sequence enriched with the codon 61 mutation site of the kRas gene is the primer of SEQ ID NO. 26-32, and at least one of the primers has a terminal biotin label.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting a mutation of a kRas gene, which has the advantages of being fast, accurate, and simple in operation.
  • a method for detecting a mutation in a kRas gene, using the kRas gene mutation described above to detect a liquid phase chip comprising the following steps:
  • the main advantage of the present invention is that - (1) using the kRas gene mutation detecting liquid chip provided by the present invention, the kRas gene mutation can be detected at a relatively high frequency, and the reaction conditions are uniform, and the detection result is specific. Good, high sensitivity, detection accuracy of more than 99%.
  • the detection method of the present invention has simple steps, thereby avoiding many uncertain factors existing in a complicated operation process, and thus greatly improving the detection accuracy.
  • the detection method provided by the present invention requires much less time than the commonly used sequencing technology, and is particularly in line with clinical needs.
  • the present invention adopts the method of "introducing a cleavage site and then enzymatically enriching" to carry out PCR amplification of the target sequence and then uses it for detection, thereby avoiding interference caused by a large number of wild-type sequences in the product.
  • the liquid phase chip and the detection method provided by the invention can not only detect the kRas gene mutation in the tumor tissue sample, but also detect the kRas gene mutation in the body fluid of the tumor patient, thereby having convenient sampling, small patient suffering, and dynamic The advantage of monitoring.
  • Figure 1 is a schematic diagram of sequence information of Exon 2 and Exon 3 mutation regions
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the six mutant forms of codon 12 enriched by BstOI;
  • Figure 3 is a schematic diagram showing two mutant forms of enriched codon 13 by enzymatic digestion of Narl;
  • Figure 4 is a schematic diagram showing three mutant forms of entrapped enriched codon 61;
  • Figure 5 is a schematic view showing the analysis of the enzyme digestion results in Example 2.
  • Figure 6 is a schematic diagram showing the results of sensitivity experiments of the kRas gene Codon 12;
  • Figure 7 is a graphical representation of the experimental results of the detection of a mutant of the kRas gene Codon 12 in a wild type plasmid. detailed description
  • the EGFR project that the applicant has developed is to remove a large number of wild-type genes by incision first, and then use PCR to amplify the mutant gene.
  • the kRas gene has no corresponding cleavage site at the three mutation sites (the 12th and 13th codons of Exon 2 and the 61st codon of Exon 3), the wild type can be purposefully removed.
  • this experiment used a method of introducing a cleavage site in a mutation region by PCR, and then removing the wild type by enzymatic cleavage, thereby achieving the purpose of enriching the mutant sequence.
  • Codon 12 The main mutations in the kRas gene into active oncogenes are Codon 12, 13 and 61. Codonl2, 13 is located in Exon 2 (Fig. 1) and Codon 61 is located in Exon 3 (see Figure 1).
  • Codon 12 (10569bp to 10571bp of kRas gene) generally has 6 mutations: G
  • Codon 13 (10572bp to 10574bp of kRas gene) generally has two mutations: G
  • Codon 61 (the 28578bp to 28580bp of the kRas gene) generally has three mutations:
  • a 142 bp fragment enriches the fragment containing Codon 61 and can be enriched by the digestion of Bell
  • Two kinds of mutant type can be enriched by Bglll digestion CA
  • Washing solution 0.2ml/L Tween-20 (Sigma P-9416), lg/L SDS (Sigma L-4390)
  • oligonucleotide probes were designed for the wild type and mutant sequences of the kRas genes Codon 12, 13 and 61.
  • the specific steps for each microsphere coating are as follows:
  • the prepared kRas gene mutation detecting liquid phase chip comprises: A. coated probe microspheres, and the base sequence of each microsphere coated probe is as follows:
  • Primer a primer for amplifying a target sequence of a corresponding mutation site to be detected enriched with codons 12, 13 and 61 of the kRas gene, and the end of the amplified target sequence may have a biotin label
  • the base sequence of each primer is as follows:
  • kRas gene codon 12 (Codon 12)
  • a pair of restriction enzyme sites with BstOI were designed to introduce wild-type excision sites and wild type excision sequences for codon 12 of the kRas gene.
  • the mutant granule is amplified, and the wild type can be effectively removed by enzymatic cleavage, and the mutant is not digested by the enzyme, thereby achieving the purpose of enriching the mutant.
  • the reaction system is as follows:
  • Codon 12 mutant plasmids 1, 3, 9, 27, 81. 243, 729 copies were tested and each copy number was repeated 4 times.
  • PCR reaction system was the same as in Example 2. PCR reaction conditions:
  • Hybridization and Luminex detection (refer to hybridization detection of conventional Luminex liquid phase chips):
  • microsphere working solution Each of the examples in Example 1 was coated with a probe having the base sequence of codon 12 of the kRas gene as SEQ ID NO: 1-8 (probe name: 60C12W1, 60C12WEU 60C12MEEU 60C12ME2) , 60C12ME3, 60C12ME4. 60C12ME5, 60C12ME6) microspheres Vortex 30sec, sonicated for 30sec, mix well, then take out the required microspheres into the sterile centrifuge tube (0.5ul per reaction, each of which is 2000 Ail ), adding 1.5X hybridization buffer (32.5 ul per reaction) and TE buffer (14 ul per reaction), which is a microsphere working solution;
  • the hybridization plate was placed in a PCR machine, denatured at 95 3 for 3 min; hybridized at 60 ° C for 15 min;
  • SA-PE streptavidin phycoerythrin working solution (10ug/ml) with 1 X hybridization buffer, and preheat it in a 60 °C water bath;
  • the results of the hybridization assay are shown in Fig. 6.
  • the MFI value greater than 100 is a valid value. Only 3 of the 4 tests were detected in 3 and 9 copies, and the average value of MFI was lower than 100 (higher SD value). All of the 81 copies of the 4 samples were detected and the repeatability was good ( The SD value is lower). The results show that the repeatability for low copy number detection is poor, for greater than
  • Example 4 kRas gene Codon 12 was detected in a wild type plasmid.
  • kRas Codon 12 wild type and mutant plasmids were mixed into a template in different proportions (total copy number is 20000), respectively, enzymatically enriched, and then subjected to Lmninex detection. Make multiple holes for each ratio. Two rounds of PCR amplification, enzymatic digestion, microsphere coating, hybridization and luminex detection methods and implementation The same is true for Example 3.
  • Example 5 Detection of colorectal cancer samples by liquid phase chip detection using kRas gene mutation
  • the preparation of the sample to be tested (plasma, serum and chestwater clear free nucleic acid can be extracted as follows):
  • Enzymatic enrichment of Codon 13 PCR amplification is as follows:
  • the reaction system is as follows:
  • Codon 61's Bel l digestion enrichment PCR amplification is as follows:
  • PCR reaction conditions Denaturation 94 20 S-C Annealing 60 °C 30 sec 25 cycle extension 72 °C 20 sec Extension 72 °C 10 min 1 Storage 4 °C 1 , PCR product Bel l digestion:
  • the reaction system is as follows:
  • Step Temperature Time Cycle number Pre-denaturation 94 "C 3 min 1 Denaturation 94 V 20 sec Annealing 60 V 30 sec
  • Codon 61 Bglll digestion enrichment PCR amplification as follows: First round of PCR amplification (introduction of Bglll cleavage site)
  • the reaction system is as follows:
  • micro Ball working fluid After 30 sec, mix well, then take out the required microspheres into a sterile centrifuge tube (0.5 ul per reaction, 2000 ul/ ⁇ per microsphere), and add 1.5X hybridization buffer (32.5 ul per reaction) And TE buffer (14ul per reaction), this is micro Ball working fluid;
  • Codon 12 has a cut-off value with a fluorescence value (MFI) greater than 100.
  • MFI fluorescence value
  • Codon 13 and Codon 61 have a cut-off value with a fluorescence value (MFI) greater than 200.
  • MFI fluorescence value
  • 6 of the 10 samples detected in this example were Codon 12 point mutations (samples No. 2, No. 3, No. 4, No. 5, No. 6, No. 9), and four cases had Codon 13 points. Mutations (samples No. 1, No. 4, No. 5, No. 10), and Codon 61 point mutations in the third case (samples No. 1, No. 2, No. 3).

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Description

kRas基因突变的检测探针、 液相芯片及其检测方法 技术领域
本发明属于生物技术领域， 具体的是涉及 kRas基因突变的检测探针、 液相芯片及其检 测方法。 背景技术
一、 kRas基因突变与胰腺癌的早期诊断
Ras基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。 Ras基因家族由 kRas、 hRas 和 nRas 组成， 基 因家族的各成员相互间同源性可达 85%。 Ras基因编码的蛋白质是 P21蛋白。 P21蛋白位于 细胞膜的内表面， 具有 GTP酶活性， 参于传导细胞增生信号的调控系统。其激活状态为 GTP 结合状态， 失活状态为 GDP结合状态， 其转变为活动性致癌基因的主要部位是第 12、 13和 61 密码子的突变。 kRas基因激活在胰腺癌的发生中已有肯定的研究， 其中以 kRas 12密 码子点突变最常见。 突变的 kRas蛋白 p21仅有微弱的 GTP酶活性， 不能迅速分解 GTP， 因 此 ras信号传导蛋白 "锁定"在 GTP结合的激活状态， 活化状态的 ras信号蛋白通过细胞 信号传导途径造成细胞不可控制地增殖、 恶变。
kRas 基因的突变率在不同的肿瘤组织中并不相同。 在结肠癌中， 其突变频率为 43 %， 肺癌中为 30 %，甲状腺癌中为 29 %， 膀胱、肝、 肾和子宫癌中， 则该突变发生频率为 10%或 低于 10%。
在胰腺癌中， kRas基因的突变率高达 75 % -95 %， 突变几乎总是发生在第 12位密码子 上， 突变方式也几乎皆为 CGT、 GTT及 GAT， 而正常胰腺组织、 急慢性胰腺炎、 胰岛素瘤、 胰腺良性囊肿及胰腺其他疾病均无 K-ras基因突变。 同时， kRas基因突变是胰腺癌发生过 程中早期即有的一种表现， 且在肿瘤发生过程中突变率不同： 增生期 26 % , 乳头增生期 46 % , 原位癌期 76 %， 腺癌期 80 %， 淋巴转移期 43 %。 因此， 检测 kRas基因第 12位密码子 有无突变， 有助于临床判断胰腺肿块的良恶性及胰腺癌的诊断。 从胰液、 胆汁、 十二指肠 液、 粪便、 外周血中检测 K-ras基因 12密码子点突变是胰腺癌诊断的一个重要辅助工具。 二、 kRas基因突变与非小细胞肺癌对吉非替尼、 厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药 kRas基因是表皮生长因子受体 （EGFR)信号传导通路中的一个关键的下游调节分子。
EGFR是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，为 ErbB 家族的四个成员之一， 因此又名 HER1或 ErbBl。 EGFR被配体激活后启动胞内信号传导， 经 过细胞质中衔接蛋白、 酶的级联反应， 调节转录因子激活基因的转录， 指导细胞迁移、 黏 附、 增殖、 分化和凋亡。 研究表明， 在许多实体肿瘤中存在 EGFR的高表达或异常表达， 为 以 EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对 EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础 和实验依据。 因此， 以表皮生长因子受体 （EGFR) 为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外 肿瘤界关注的焦点。 其中， EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼 （Genfitinib, Irressa) 和厄洛替尼 （Erlotinib , 特罗凯， Tarceva) 已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗 晚期非小细胞肺癌 （NSCLC) 。 我国在 2005年 2月也批准了吉非替尼进入临床。 这些药物 用于其他肿瘤 （如乳腺癌、 结肠癌和胃癌等） 的治疗， 目前也已经进入临床试验阶段。
吉非替尼，厄洛替尼是一种口服的小分子 EGFR拮抗剂，可与 ATP竞争结合 EGFR酪氨酸 激酶区的 ATP结合袋从而抑制 EGFR的活性， 已应用于晚期和不适宜传统化疗方案的非小细 胞肺癌患者的临床治疗， 是目前对于部分 NSCLC患者治疗最有效的药物。 然而， 患者对这 种分子靶向药物的反应性与个体的遗传背景相关。 2004年 6月， 美国哈佛医学院的研究人 员 Lynch等和 Paez等率先报道， 肺癌细胞中 EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是靶向治疗 药物奏效的一个必要前提条件。研究结果显示，对 EGFR酪氨酸激酶基因编码区突变型肿瘤， 吉非替尼的有效率高达 80 %以上， 而对无突变的野生型肿瘤上述药物基本无效。 这一最新 研究结果发表后受到了各国学者的高度重视， 并在不足一年的时间内相继被美国、 日本、 韩国和我国 （包括台湾）学者的研究所证实（Pao W等， 2004; Han SW等， 2005; Mitsudomi T等， 2005； Huang SF等， 2004； Mu XL等， 2005 ) 。
EGFR外显子 19的缺失突变和外显子 21的点突变使患者对吉非替尼，厄罗替尼等靶向 治疗药物敏感， 而另外有些突变则使患者对这些药物耐受， 或者称耐药性。 耐药性分原发 性耐药和继发性耐药（获得性耐药）。 EGFR外显子 20的 T790点突变与靶向治疗药物的继发 性耐药相关。 而位于 EGFR信号传导通路下游的编码 GTP酶的 kRas基因突变则是吉非替尼 (Gefitinib). 厄罗替尼 (Erlotinib ) 原发耐药的原因。 大约 15%_30%的非小细胞肺癌患 者 （NSCLC) 中存在 kRas基因点突变， 并与患者靶向治疗的预后差相关。 这些突变多位于 第二外显子的 12和 13密码子。 研究表明， 有 kRas基因突变的非小细胞肺癌对激酶抑制剂 吉非替尼和厄罗替尼的敏感性差。 这一发现最早由 Wi lliam Pao等人报道。 研究者选择了 60位对吉非替尼或厄罗替尼治疗敏感与不敏感的腺癌病人， 检测其 EGFR突变与 kRas突变 情况。在所有对吉非替尼或厄罗替尼治疗不敏感的病人中，有 24 % ( 9/38 )的病人存在 kRas 基因的突变； 而所有对这两个靶向治疗药物敏感的病人中， 没有一个存在 kRas 基因突变 ( 0/21 )。 2006年， Baoli Qin等人则在细胞水平上研究了 EGFR信号传导通路的关键分子与吉 非替尼靶向治疗耐药性之间的关系。 作者发现 Src和 Ras基因的激活可使肿瘤细胞对吉非 替尼的耐药性增强 30倍至 200倍。 此外， 韩国的 Sae-Won Han等人 （Clinical Cancer Res 2006； 12 (8 ))选择 69位接受吉非替尼治疗的非小细胞肺癌病人， 检测 EGFR基因拷贝数， K-ras基因突变， HER2， EGFR外显子 18-21的突变， 以及 Akt的磷酸化状况来研究与吉非 替尼药物敏感性相关的因素。 分析结果显示， kRas突变的患者均对吉非替尼治疗不敏感。 在 EGFR野生型患者中， 携带 kRas突变或者 p_Akt过表达的患者均存在较差的治疗效果， 且容易复发 （P = 0. 017)。 一般来讲， kRas突变和 EGFR突变是相互排斥的， EGFR突变主要 见于不吸烟者， 而 kRas突变更常见于吸烟相关的癌症。
三、 kRas基因突变与结直肠癌对西妥昔单抗的耐药
kRas基因的突变不仅与非小细胞肺癌对吉非替尼， 厄罗替尼等 EGFR酪氨酸激酶抑制 剂的原发耐药相关， 最近的研究还发现这一基因突变还与结直肠癌对西妥西单抗的耐药性 密切相关。
表皮生长因子受体 (EGFR)靶向药物西妥昔单抗对难治性结直肠癌有效，与伊立替康为 主的化疗方案联合应用时，有助于克服伊立替康耐药。 但是，仅部分患者能从西妥昔单抗治 疗中获益，因此明确疗效预测因素非常重要。
法国巴黎笛卡尔大学 Lievre等报告，采用西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌患者，肿瘤 kRas突变可预测治疗有效性和患者生存率 （Cancer Res 2006； 66： ( 8))。
研究者发现,肿瘤细胞 kRas突变与西妥昔单抗耐药和总生存期 (OS)较短相关。 在 30 例用西妥昔单抗治疗的转移性结肠癌患者中， 作者通过测序法分别检测了 kRas, BMF以及 PIK3CA基因的突变情况。研究发现 30例患者中， 西妥昔单抗对 11例患者有效， 而 19例患 者无疗效反应。 在这 19例患者中， 68. 4%的患者存在 kRas基因的突变， 而 11例西妥昔单 抗治疗有效的患者中均不存在 kRas基因突变。 同时， 没有 kRas基因突变的患者其总生存 期与存在 kRas 基因突变的患者相比具有显著的差别 （分别为 16. 3 个月与 6. 9 个月， P=0. 016)。
在此基础上，研究者纳入 89 例伊立替康耐药的结直肠癌患者进行了回顾性分析 [J Cl in Oncol 2008, 26 (3) : 374]。 患者分别接受伊立替康加西妥昔单抗 (88%)、 西妥昔单抗 加氟尿嘧啶和叶酸（10%)、 单纯西妥昔单抗（2%)治疗。
免疫组化显示，所有患者均高表达 EGFR。 总体上，西妥昔单抗对 26例患者有效。 西妥 昔单抗治疗对 24 例有 kRas 突变的患者均无效，治疗有效者均为无突变患者（26/65 例， P<0. 001)。 无突变患者的无进展生存期 (PFS)和 OS均显著长于有突变患者 (PFS : 31. 4周 对 10. 1周， Ρ=0· 0001 ; OS : 14. 3个月对 10. 1个月， Ρ=0· 026)。
该研究与其他数项已发表的研究结果一致，提示在难治性结直肠癌患者开始西妥昔单 抗治疗前，应该充分考虑检测 kRas突变情况，这样可能既有利于节约治疗成本，避免无谓地 使用昂贵试剂，又能使患者受益,使其免受无谓治疗的毒性作用。
四、 kRas突变检测试剂目前的开发状况
目前的 kRas基因突变检测产品多数采用实时荧光定量 PCR的方法， 检测的灵敏度最低 为野生型中 1-2 %的突变型， 同时该方法存在着假阳性率偏高的问题。利用液相芯片技术平 台进行 kRas基因突变检测的产品在国内外均属空白。
另外， 由于肿瘤的异质性， 游离核酸中可能仅有非常小量的突变基因， 而含有大量的野 生型基因， 混杂的大量野生型基因会阻碍突变基因的检出， 因此如何排除野生型序列对 kRas 基因突变检测的干扰是首要解决的一个关键问题。 发明内容
本发明的目的之一在于提供用于 kRas基因突变检测的探针序列。
实现上述目的的技术方案如下：
用于 kRas基因突变检测的探针， 包括有：
针对 kRas基因密码子 12的： 5 ' GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3 ' 、 和引入酶切位点 BstOI 的 5 ' GACCTGGTGGCGTAGGCAAG3 ' 的野生型探针， 以及选自碱基序列为
5 ' GACCTCGTGGCGTAGGCAAG3 ' 、 5 ' GACCTAGTGGCGTAGGCAAG3 ' 、
5 ' GACCTTGTGGCGTAGGCAAG3 ' 、 5 ' GACCTGATGGCGTAGGCAAG3 ' 、
5， GACCTGCTGGCGTAGGCAAG3 ' 、 和 5 ' GACCTGTTGGCGTAGGCAAG3 ' 中的一种或多种的引入酶 切位点 BstOI的突变型探针； 和 /或
针对 kRas基因密码子 13的： 5， AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA3 ' 、 和引入酶切位点 Narl 的 5， AGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3 ' 野生型探针， 以及选 自碱基序列为 5， AGCTGGTGACGCCGGCAAGA3 ' 禾口 5 ' AGCTGGTTGCGCCGGCAAGA3 ' 中的一种或二种引入酶切位点 Narl的突变型探针； 和 /或
针对 kRas基因密码子 61的： 5， AGCAGGTCAAGAGGAGTACAGT3 ' 野生型探针、 引入酶 切位点 Bel l 的 5， AGCTGATCAAGAGGAGTACAGT3 ' 、 和引入酶切位点 Bgl l l 的 5， AGCAGGTCAAGATCTGTACAGT3 ' 的野生型探针，以及选自引入酶切位点 Bel l的碱基序列为 5 ' AGCTGATAAAGAGGAGTACAGT3 ' 、 5 ' AGCTGATCTAGAGGAGTACAGT3 ' 、引入酶切位点 Bgl II 5 ' AGCAGGTCATGATCTGTACAGT3， 中的一种或多种突变型探针。
本发明的另一目的是提供 kRas 基因突变检测液相芯片。 该液相芯片可用于检测 kRas 基因密码子 12、 13和 /或 61 ( Codonl2、 13位于 Exon 2， Codon 61位于 Exon 3上） 的相 关突变， 不但可用于胰腺癌早期诊断， 而且可预测非小细胞肺癌 EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉 非替尼或厄罗替尼， 以及结直肠癌西妥西单抗或帕尼单抗药物治疗疗效。
实现上述目的的技术方案如下：
一种 kRas基因突变检测液相芯片， 主要包括有： A. 包被探针的微球： 包被有氨基 修饰的针对 kRas基因密码子 12的碱基序列为 SEQ ID NO 1 -2的野生型探针的微球， 以 及包被有氨基修饰的选自碱基序列为 SEQ ID 0.3 -8中的一种或多种突变型探针的微球； 和 /或
包被有针对 kRas基因密码子 13的碱基序列为 SEQ ID NO. 9- 10 的氨基修饰的野生型 探针的微球，以及包被有选自碱基序列为 SEQ ID NO. 11 - 12中的一种或二种氨基修饰的突 变型探针的微球； 和 /或
包被有针对 kRas基因密码子 61的碱基序列为 SEQ ID NO 13 - 15的氨基修饰的野生 型探针的微球， 以及包被有选自引入酶切位点 Bel l的碱基序列为 SEQ ID NO. 16— 17、 和 引入酶切位点 Bgl l l SEQ ID NO.18 中的一种或多种引入的氨基修饰的突变型探针的微球； 上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂， 且每种微球具有不同颜色编码； 以及
B.引物： 用于扩增出富集有 kRas基因密码子 12、 13和 /或 61的需检测的相应突变位 点的目标序列的引物， 且该目标序列的末端具有生物素标记。
所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性 环境中的序列。 通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列， 可减少空间位阻， 提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚 dT，即 poly ( dT)， 寡聚四聚乙二醇以及 （CH2) n间隔臂 （n≥3 )， 如 ( CH2 ) 12、 ( CH2) 18等。 另外， 如果 存在 poly ( dA)干扰， 还可以用 poly ( TTG) 作为间隔臂。 优选地， 所述间隔臂为 5 _40 个 T的序列， 更优选为 10个 T的序列。
优选地， 用于扩增出富集有 Codon 12、 13和 /或 61突变位点的目标序列的弓 |物包括有： 用于扩增出具有 kRas基因密码子 12突变位点的目标序列的碱基序列为 SEQ ID NO 19 一 21的引物， 上述引物中至少有一条带有末端的生物素标记； 和 /或 用于扩增出富集有 kRas基因密码子 13突变位点的目标序列的碱基序列为 SEQ ID NO. 22-25的引物， 所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记； 和 /或
用于扩增出富集有 kRas基因密码子 61突变位点的目标序列的碱基序列为 SEQ ID NO. 26-32的引物， 所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。
本发明的另一目的还在于提供一种 kRas基因突变的检测方法，该方法具有快速、准确、 操作简便等优点。
一种 kRas基因突变的检测方法，使用上述的 kRas基因突变检测液相芯片，包括以下歩 骤：
( 1 )用带有酶切位点的 PCR引物对野生型和突变型的标本进行第一轮 PCR扩增；
(2) 将步骤 （1 ) 中的 PCR扩增后的产物进行酶切；
(3)以酶切后的产物为模板进行对突变型的 kRas基因进行第二轮 PCR扩增；
(4)第二轮 PCR扩增产物与上述相应的包被有探针的微球进行杂交；
(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应， 然后进行信号检测。
本发明的主要优点在于- ( 1 )采用本发明提供的 kRas基因突变检测液相芯片， 可同时对 kRas基因突变相对频率较 高的位点进行检测， 检测时的反应条件均一， 检测结果特异性好， 灵敏度高， 检测准确度 达 99 %以上。
( 2 )本发明的检测方法步骤简单， 因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定因素， 因 而可大大提高检测准确率。
( 3 )本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。
( 4)本发明采用 "引入酶切位点， 然后酶切富集"的方法进行目标序列的 PCR扩增进而用 于检测， 避免了产物中大量野生型序列对检测结果所造成的干扰。
( 5 )本发明所提供的液相芯片、 检测方法不仅能检测肿瘤组织样本中的 kRas基因突变， 同时也能检测肿瘤病人体液中的 kRas基因突变， 从而具有采样方便、 病人痛苦小、 能够动 态监测的优势。 附图说明
图 1是 Exon 2和 Exon 3 突变区的序列信息示意图；
图 2 是 BstOI的酶切富集 codon 12的 6种突变型示意图；
图 3 是通过 Narl的酶切富集 codon 13的 2种突变型示意图； 图 4是 酶切富集 codon 61的 3种突变型示意图;
图 5是实施例 2中酶切结果分析示意图;
图 6是 kRas基因 Codon 12的灵敏度实验结果分析示意图;
图 7是 kRas基因 Codon 12在野生型质粒中检出突变型的实验结果分析示意图。 具体实施方式
申请人已开发的 EGFR项目是通过内切先去除大量的野生型基因， 然后用 PCR去扩增突 变型基因。 但因为 kRas基因在三个突变位点处 （Exon 2 的第 12、 13密码子和 Exon 3的第 61 密码子） 都没有相应的酶切位点可以把野生型有目的的去除。 本实验首次采用通过 PCR技术 在突变区引入酶切位点的方法， 然后通过酶切来去除野生型， 从而达到富集突变型序列的目 的。
1) lSt PCR引入酶切位点
kRas基因转变为活动性致癌基因的主要突变为点是 Codon 12、 13和 61。 Codonl2、 13 位于 Exon 2 (图 1 ) ， Codon 61位于 Exon 3 (参见图 1 ) 。
Codon 12 (kRas 基因的第 10569bp 到 10571bp ) 一般存在 6 种突变： G|r -〉 G|r，
G|T->G|T, G|T->G!T,隱 GT -〉圖 GT，議 GT -〉圖 GT， | T->|GTo 在 Codon 12 处引入酶切位点是通 过把 10566bp的 "G"突变为 "C"， 从而引入 BstOI (BstNI)的酶切位点 （参见图 2)， 为了 降低风险，还设计了另一种方案，就是把 10566bp 的" G"突变为 "A"，通过引入 Bsel l (BsrSI) 的酶切位点来切除野生型。 设计一对引物， 扩增约 150bp的片段来富集含有 Codon 12 的 片段， 通过酶切可以去除野生型， 富集 6种突变型。
Codon 13 (kRas 基因的第 10572bp 到 10574bp ) 一般存在 2 种突变： G |C -〉 G議 C， |GC->|GCo 在 Codon 13 处引入酶切位点是通过把 10576_10577bp的 "TA"突变为 "CC"， 从而引入 Narl 的酶切位点来切除野生型。 设计一对引物， 扩增约 150bp的片段来富集含 有 Codon 13 的片段， 通过 Narl的酶切可以去除野生型， 富集 2种突变型 （参见图 3 )
Codon 61 (kRas 基因的第 28578bp 到 28580bp) —般存在 3 种突变： |ΑΑ->||ΑΑ
C1A->C|A ， CA|->CA|。 因为在 Codon 61 处无法通过引入单个酶切位点的方法酶切富集 3 种突变型，要通过引入 Bcll (28574bp 的" A" 突变为 "T"， 28576bp的" G" 突变为 "A" ) 和 BglII (28583-28585bp的 "GGA" 突变为 "TCT" )两个酶切位点来切除野生型。 设计两 对引物， 分别扩增从 28558bp 到 28701 bp共 144bp的片段和扩增从 28459bp到 28600bp共
142bp的片段来富集含有 Codon 61 的片段，通过 Bell的酶切可以富集 |AA-〉|VA , C|A->C|A 两种突变型， 通过 Bglll的酶切可以富集 CA|-〉CA||的突变型 （参见图 4)t 本项目需要用到的主要材料
1)野生型（质粒名称： Exon2和 Exon 3)及 11种突变型质粒（表 1)
表 1本实验需要使用的突变型质粒
Figure imgf000010_0001
溶液配方： 偶联液 （pH4.5): 0. lmol/L MES (Sigma M-2933)
洗涤液： 0.2ml/L Tween-20 (Sigma P-9416), lg/L SDS (Sigma L-4390)
TE (pH8.0) (储存液）： lOmmol/L Tris (Sigma 337501), lmmol/L EDTA (Sigma E-5134)
2XTm杂交缓冲液
Figure imgf000010_0002
过滤后贮存于 4°C。
实施例 1
kRas基因突变检测液相芯片的制备
一、 探针序列设计及微球包被
针对 kRas基因 Codon 12、 13和 61的野生型与突变型序列， 设计特异的寡核苷酸探针。 每种微球包被的具体步骤如下：
( 1 ) 取微球母液 （购自 Luminex公司） vortex (漩涡震荡） 30s， 超声处理 lmin;
( 2) 取出 8ul微球母液， 共含 0.8χ 105— 1.2χ 105个微球至 0.5ml离心管中；
( 3 ) l 5,000rpm离心 10min， 小心弃去上清液；
( 4) 加入 lOul偶联液 （pH4.5 )， vortex 30s, 超声处理 lmin;
( 5 ) 加入 2pmol/ul探针工作液 2ul;
( 6) 加入 2.5ul 浓度为 5mg/ml 的 EDC ( 1-乙基 - ( 3-二甲基氨基丙基） -碳酰二亚 胺盐酸盐） 工作液， 25 °C避光孵育 30min; 重复该步骤一次；
( 7) 加入 0.2ml洗涤液， vortex 30s， 12,000g离心 5min， 小心弃去上清液； 重复该 步骤一次；
( 8 ) 加入 500ulTE溶液， vortex 30s， 超声处理 30s;
( 9) 12,000g离心 5min， 小心弃去上清液；
( 10 ) 加入 20ulTE溶液， 储存于 2-8 °C。 制备得到的 kRas基因突变检测液相芯片包括有： A. 包被探针的微球， 每种微球包被 的探针的碱基序列如下:
微球号 探针名称 (突变位点） 探针碱基序列 SEQ NO
12 60C12W1 5 ' NH2-TTTTTTTTTTGAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3 ' 1
20 60C12WE1 ( GCT-)CCT ) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTGACCTGGTGGCGTAGGCAAG3 ' 2
28 60C12MEE1 (GGT-)CGT) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTGACCTCGTGGCGTAGGCAAG3 ' 3
16 60C12ME2 (GGT->AGT) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTGACCTAGTGGCGTAGGCAAG3 ' 4
18 60C12ME3 (GGT->TGT) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTGACCTTGTGGCGTAGGCAAG3 ' 5
21 60C12ME4 (GGT->GAT) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTGACCTGATGGCGTAGGCAAG3， 6
45 60C12ME5 (GGT->GCT) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTGACCTGCTGGCGTAGGCAAG3 ' 7
63 60C12ME6 (GGT->GTT) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTGACCTGTTGGCGTAGGCAAG3 ' 8
38 60C13W 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCTGGTGGCGTAGGCAAGA3 ' 9
53 60C1漏（GTA -〉 GCC) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3 ' 10
72 60C13丽 1 (GGC -〉 GAC) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCTGGTGACGCCGGCAAGA3 ' 11
66 60(：13丽2 (&&1：- 60 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCTGGTTGCGCCGGCAAGA3， 12
22 C61W1 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCAGGTCAAGAGGAGTACAGT3 ' 13
25 C61WBcl (AGG->TGA) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCTGATCAAGAGGAGTACAGT3 ' 14
32 C61MBcl (CAA->AAA) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCTGATAAAGAGGAGTACAGT3 ' 16 36 C61MBc2 (CAA->CTA) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCTGATCTAGAGGAGTACAGT3' 17
76 C61WBgl (GGA->TCT) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCAGGTCAAGATCTGTACAGT3' 15
77 C61MBgl (CAA -〉 CAT) 5 ' NH2-TTTTTTTTTTAGCAGGTCATGATCTGTACAGT3' 18
B.引物： 用于扩增出富集有 kRas基因密码子 12、 13和 61的需检测的相应突变位点的目标 序列的引物， 且扩增出的目标序列的末端可具有生物素标记， 每种引物的碱基序列如下：
Figure imgf000012_0001
实施例 2、 kRas基因密码子 12 ( Codon 12 ) 通过 PCR引入酶切位点及野生型的切除 针对 kRas基因密码子 12 的序列，设计的一对带有 BstOI的酶切位点引物对野生型和突 变型粒进行扩增， 通过酶切可以有效地去除野生型， 而突变型不会被酶切， 从而达到富集 突变型的目的。
一、 PCR的扩增
PCR反应体系：
Codon 12反应体系 每反应 （μΐ )
灭菌 ddH20 28. 8
5 X Colorless GoTaq Flexi Buffer 10 2. 5mM dNTP混合液 2
MgCl2 25mM 5
引物 F: K12EF (10uM) 1
引物 R: K12R1 (lOuM) 1
GoTaq Hot Start polymerase ( 5U/ul ) 0. 2
模板 DNA 2
总体积 50
PCR反应条件:
Figure imgf000013_0001
二、 PCR产物 BstOI 酶切:
反应体系如下：
Figure imgf000013_0002
酶切结果图 5。 PAGE胶的结果表明 Codon 12 野生型被酶切而且酶切完全， 但突变型没 被酶切。 这结果证明了 PCR引入酶切位点去除野生型， 富集突变型方法的可行性。
实施例 3、 kRas基因 Codon 12的灵敏度实验
为了测定 Codon 12的灵敏度， 取 Codon 12 突变型质粒 1， 3， 9， 27， 81. 243, 729个拷贝 进行检测， 每种拷贝数重复 4次。
一、 PCR扩增及酶切 第一轮 PCR扩增
PCR反应体系与实施例 2相同。 PCR反应条件：
Figure imgf000014_0001
2、 PCR产物 BstOI 酶切: 反应体系同实施例 2。
3、 第二轮 PCR扩增 PC 反应体系：
Figure imgf000014_0002
PCR反应条件:
Figure imgf000014_0003
最后延伸 72 "C 10 min 1
保存 4°C oo 1
二、 Luminex检测
杂交及 Luminex检测 （可参照常规 Luminex液相芯片的杂交检测）：
(1) 配制微球工作液： 将实施例 1中的每种包被有针对 kRas基因密码子 12的碱基序列 为 SEQ ID N0 1-8的探针 （探针名称： 60C12W1、 60C12WEU 60C12MEEU 60C12ME2, 60C12ME3, 60C12ME4. 60C12ME5、 60C12ME6)的微球 Vortex 30sec，超声处理 30sec， 充分混匀，随即取出所需微球到灭菌离心管中（每反应 0.5ul, 其中每种微球为 2000 个 Ail)， 加入 1.5X杂交液缓冲液 (每个反应 32.5ul)和 TE缓冲液 (每个反应 14ul)， 此为微球工作液；
(2) 根据样品情况，使用记号笔对 96孔板（杂交板）进行标记（阴性对照孔标记为" N" )， 然后每孔加入 47ul微球工作液；
(3) 各样品孔加入 3ul相应的待杂交检测样品 （第二轮 PCR产物）； "N"孔加入 3ul TE;
(4) 置杂交板于 PCR仪中， 95Ό变性 3min; 60°C杂交 15min;
(5) 用 1 X杂交缓冲液配制 SA-PE (链亲和素藻红蛋白） 工作液 （10ug/ml)， 并置 60°C 水浴锅预热；
(6) 往杂交完毕的杂交板中加入已预热至 60°C的 SA-PE工作液 （10ug/ml)， 每孔 25ul;
(7) 置 PCR仪上 60°C反应 5min;
(8) 将 Luminex仪器托盘温度设置为 60°C， 按 Luminex仪器使用方法设置仪器参数 （每 个样品读取微球 100个， 读数时间 25s)。 将杂交板置于 Luminex仪器托盘中， 检测 样品 MFI值。
三、 结果分析
杂交检测的结果如图 6， MFI值大于 100的为有效数值。 3 和 9个拷贝的在 4次检测中 只有一次被检测出， MFI的平均值都低于 100 (SD值较高）， 81个拷贝的 4次检测中均能被 检测， 重复性较好 （SD值较低）。 结果说明了对于低拷贝数检测的重复性较差， 对于大于
80个拷贝数的检测的重复性较好。
实施例 4、 kRas基因 Codon 12在野生型质粒中检出突变型的实验
为了在大量的野生型中检出少量的突变型， 以 kRas Codon 12野生型和突变型质粒按 不同比例混合为模板 （总拷贝数为 20000)， 分别进行酶切富集， 再进行 Lmninex检测， 每 种比例做复孔。 两轮 PCR扩增， 酶切富集， 微球包被， 杂交及 luminex检测的方法与实施 例 3的相同。
检测的结果如图 7 (MFI值大于 100的为有效数值）：
检测的结果表明： Codon 12 可以在 20000个拷贝中检测出 80个突变型质粒。 这实验 结果说明了用 PCR引入酶切位点的方法可在大量的野生型 kRas基因中测出少量的突变型基 因。
实施例 5 、 运用 kRas基因突变检测液相芯片对结直肠癌样本的检测
一、 待测样本的准备 （血浆、 血清和胸水上清游离核酸的提取均可按以下方法）：
参照 AxyPr印全血基因组小量提取试剂盒说明， 详细步骤如下：
( 1 ) 取患者抗凝静脉血或胸腔积液约 2. 5ml， 3000rpm离心 15分钟， 取 300μ1上清加到 一个 1. 5ml干净无菌的离心管中；
( 2 ) 向离心管中加入 500μ1 API缓冲液， 涡旋振荡充分混匀；
( 3 ) 加入 ΙΟΟμΙ ΑΡ2缓冲液， 涡旋振荡充分混匀；
(4) 室温下 12， OOOrpm离心 10分钟
( 5 ) 小心吸取上清加入放在 2ml收集管上的吸附柱 AxyPrep中， 盖上盖子，
以 6， OOOrpm离心 1分钟；
(6 ) 倒掉废液收集管中的废液， 用 800μ1缓冲液 W1洗涤 1次， 以 6， OOOrpm离心 1分钟；
( 7 ) 倒掉废液收集管中的废液， 加入 800μ1缓冲液 W2， 以 12， OOOrpm离心 1分钟； 倒掉废 液收集管中的废液， 加入 500μ1缓冲液 W2， 以 12， OOOrpm离心 1分钟， 弃掉废液；
(8 ) 将吸附柱 AxyPr印放回空收集管中， 12， OOOrpm离心 1分钟；
(9 ) 将吸附柱 AxyPr印置于一干净无菌的 1. 5ml离心管中， 加入 40μ1 TE缓冲液， 室温下 放置 1分钟， 12， OOOrpm离心 1分钟洗脱 DNA， 电泳检测， _2(TC保存。
二、 待测样品的 PCR扩增与酶切富集：
Codon 12 样本的酶切富集 PCR扩增与实施例 3相同。
Codon 13 的酶切富集 PCR扩增如下：
1. 第一轮 PCR扩增
PCR反应体系：
Codon 13反应体系 每反应 （μΐ ) 灭菌 ddH20 28. 8
5 X Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2. 5mM dNTP混合液 2 MgCl2 25mM 5
Codon 13引物 F: K13F1 (lOuM) 1
Codon 13引物 R: K13R (lOuM) 1
GoTaq Hot Start polymerase ( 5U/ul ) 0. 2 模板 DNA 2 总体积 50
PCR反应条件:
Figure imgf000017_0001
、 PCR产物 Narl 酶切:
反应体系如下：
Figure imgf000017_0002
3、 第二轮 PCR扩增
PCR反应体系：
Codon 12反应体系 每反应 （ul ) 灭菌 ddH20 28. 8
5 X Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2. 5mM dNTP混合液 2 MgCl2 25mM 5
Codon 13引物 F: K13F2 (lOuM) 1
Codon 13引物 R: K13R- bio (lOuM) 1
GoTaq Hot Start polymerase ( 5U/ul ) 0. 2 模板 DNA 2 总体积 50
PCR反应条件:
Figure imgf000018_0001
Codon 61 的 Bel l酶切富集 PCR扩增如下：
第一轮 PCR扩增 （引入 Bel l的酶切位点）
PCR反应体系：
Figure imgf000018_0002
PCR反应条件:
Figure imgf000018_0003
变性 94 20 S㊀ C 退火 60 °C 30 sec 25循环 延伸 72 °C 20 sec 延伸 72 °C 10 min 1 保存 4°C 1 、 PCR产物 Bel l 酶切:
反应体系如下：
Figure imgf000019_0001
3、 第二轮 PCR扩增 （引入 Bel l的酶切位点）
PCR反应体系：
Figure imgf000019_0002
PCR反应条件:
步骤 温度 时间 循环数 预变性 94 "C 3 min 1 变性 94 V 20 sec 退火 60 V 30 sec
30循环 延伸 72 V 20 sec 最后延伸 72 "C 10 min 1 保存 4°C oo 1
Codon 61 的 Bglll酶切富集 PCR扩增如下： 第一轮 PCR扩增 （引入 Bglll的酶切位点）
PCR反应体系：
Figure imgf000020_0001
PCR反应条件:
Figure imgf000020_0002
2、 PCR产物 Bglll 酶切:
反应体系如下：
Figure imgf000020_0003
Bglll内切酶 (lOU/ul) 0.5
PCR产物 10
灭菌 dd 0 34
总体积 50
3、 第二轮 PCR扩增 （引入 Bglll的酶切位点）
PCR反应体系：
Figure imgf000021_0001
PCR反应条件:
Figure imgf000021_0002
二、 Luminex 检测
杂交及 Lumine 检测
(1) 配制微球工作液： 将实施例 1中的每种包被有针对 kRas基因密码子 12、 codonl3, 和 codon61 的碱基序列为 SEQ ID NO. 1-18 的探针的不同微球 Vortex 30sec, 超声处理
30sec,充分混匀，随即取出所需微球到灭菌离心管中（每反应 0.5ul, 其中每种微球为 2000 个 /ul)， 加入 1.5X杂交液缓冲液（每个反应 32.5ul)和 TE缓冲液 (每个反应 14ul)， 此为微 球工作液；
( 2 )其余杂交检测及 Luminex检测步骤同实施例 3中杂交及 Luminex检测部分。
三、 检测结果与数据分析
反应后产物通过 Luminex序列分析仪器检测， 检测结果如表 1所示。 Codon 12以荧光 值 (MFI)大于 100为 cut-off 值， 当 Codon 12突变型探针的 MFI值大于 100时， 判定该样 本为存在 Codon 12的突变， 否则判定该样本为 Codon 12野生型。 Codon 13和 Codon 61 以荧光值 (MFI)大于 200为 cut-off 值， 当 Codon 13或 Codon 61突变型探针的 MFI值大于 200时， 判定该样本为存在 Codon 13或 Codon 61的突变， 否则判定该样本为 Codon 13或 Codon 61野生型。
根据上述判定标准， 本实施例所检测的 10份样本中， 6例存在 Codon 12点突变 （2号， 3 号， 4号， 5号， 6号， 9号样本）， 4例存在 Codon 13点突变 （1号， 4号， 5号， 10号样本） ， 3 例存在 Codon 61点突变 （1号， 2号， 3号样本）。
表 1血清样本的检测结果
Figure imgf000022_0001

Claims

权 利 要 求
1. 用于 kRas基因突变检测的探针， 其特征是： 包括有：
针对 kRas基因密码子 12的： SEQNO.1、 和引入酶切位点 BstOI的 SEQNO.2的野生型 探针， 以及选自碱基序列为 SEQNO.3— SEQ O.8中的一种或多种的引入酶切位点 BstOI的 突变型探针； 和 /或
针对 kRas基因密码子 13的： SEQ N0.9、 和引入酶切位点 Narl的 SEQ NO.10野生型 探针， 以及选自碱基序列为 SEQNO.ll和 SEQN0.12中的一种或二种引入酶切位点 Narl的 突变型探针； 和 /或
针对 kRas基因密码子 61的： SEQN0.13 野生型探针、引入酶切位点 Bell的 SEQN0.14、 和引入酶切位点 Bglll的 SEQN0.15的野生型探针， 以及选自引入酶切位点 Bell的碱基序 列为 SEQN0.16、 SEQN0.17、 引入酶切位点 Bglll的碱基序列为 SEQ N0.18 中的一种或 多种的突变型探针。
2. 一种 kRas基因突变检测液相芯片， 其特征是， 主要包括有： A. 包被探针的微球： 分别包被有针对 kRas基因密码子 12的碱基序列为 SEQ N0.1、 SEQ N0.2的氨基修饰 的野生型探针的微球， 以及分别包被有氨基修饰的选自碱基序列为 SEQ N0.3-SEQ N0.8中 的一种或多种突变型探针的微球； 和 /或
分别包被有针对 kRas基因密码子 13的碱基序列为 SEQN0.9、 SEQ NO.10 的氨基修饰的 野生型探针的微球，以及分别包被有选自碱基序列为 SEQNO.ll和 SEQN0.12中的一种或二 种氨基修饰的突变型探针的微球； 和 /或
分别包被有针对 kRas基因密码子 61的碱基序列为 SEQ NO.13, SEQ NO.14, 禾 Π SEQ NO.15的氨基修饰的野生型探针的微球， 以及包被有选自引入酶切位点 Bell的碱基序列为 SEQ NO.16, SEQN0.17、 引入酶切位点 Bglll SEQ NO.18 中的一种或多种氨基修饰的突变 型探针的微球；
上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂， 且每种微球具有不同颜色编码； 以及
B.引物： 用于扩增出富集有 kRas基因密码子 12、 13和 /或 61的需检测的相应突变位 点的目标序列的引物， 且该目标序列的末端具有生物素标记。
3.根据权利要求 2所述的 kRas基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述引物包括有： 用于扩增出富集有 kRas基因密码子 12突变位点的目标序列的碱基序列分别为 SEQ ID NO. 19— SEQ ID NO. 21的引物， 上述引物中至少有一条带有末端的生物素标记； 和 /或 用于扩增出富集有 kRas基因密码子 13突变位点的目标序列的碱基序列分别为 SEQ ID NO. 22— SEQ ID NO. 25的引物， 所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记； 和 /或 用于扩增出富集有 kRas基因密码子 61突变位点的目标序列的碱基序列为 SEQ ID NO.
26- SEQ ID N0.32的引物， 所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。
4.根据权利要求 2所述的 kRas基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述间隔臂为 5— 40个 T的序列。
5.一种 kRas基因突变的检测方法， 其特征是， 使用权利要求 2所述的 kRas基因突变检测 液相芯片， 包括以下步骤：
( 1 )用带有酶切位点的 PCR引物对野生型和突变型的标本进行第一轮 PCR扩增；
(2) 将步骤 （1 ) 中的 PCR扩增后的产物进行酶切；
(3)以酶切后的产物为模板进行对突变型的 kRas基因进行第二轮 PCR扩增；
(4)第二轮 PCR扩增产物与权利要求 2中相应的所述的包被有探针的微球进行杂交；
(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应， 然后进行信号检测。
6.根据权利要求 5所述的 kRas基因突变的检测方法， 其特征是， 第一轮 PCR扩增所用引物 为： 针对 kRas基因密码子 12突变位点的 SEQ ID NO.19、 SEQ ID NO.20—对引物； 禾口 /或 针对 kRas基因密码子 13突变位点的 SEQ ID N0.22、 SEQ ID N0.24—对引物； 禾 Π/或 针对 kRas基因密码子 61突变位点的 SEQ ID N0.26、 SEQ ID N0.27一对引物以及 SEQ ID N0.29、 SEQ ID N0.31—对引物。
7.根据权利要求 5所述的 kRas基因突变的检测方法， 其特征是， 第二轮 PCR扩增所用引物 为：
针对 kRas基因密码子 12突变位点的 SEQ ID N0.19、 SEQ ID N0.21一对引物； 禾 Π/或 针对 kRas基因密码子 13突变位点的 SEQ ID N0.23、 SEQ ID N0.25—对引物； 禾 Π/或 针对 kRas基因密码子 61突变位点的 SEQ ID N0.26、 SEQ ID N0.28 的一对引物以及 SEQ ID NO.30和 SEQ ID N0.32 的一对引物， 上述每对引物中的其中一条的 5 ' 末端带有生物 素标记。
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