JP5947392B2 - 膵嚢胞の鑑別 - Google Patents
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Description
本発明は癌管理の分野に関する。特に、予後および診断の分野に関する。
標準的な医療行為において腹部イメージングの使用が増加した結果、膵嚢胞が同定される頻度が高まっている。同時に、これらの嚢胞の管理が重要な臨床上の問題となっている(1,2)。これらの病変は、剖検で調べられた患者の20%超において(3)、MRIで検査された患者の19.6%において(4〜6)、およびCTで検査された患者の2.6%において見出される(7,8)。非常に多くの場合、嚢胞は、膵臓病変とは無関係の症状のためにイメージングを受ける患者において偶発的所見として同定される。しかし、嚢胞が同定されると、難しい一生涯の管理の問題が発生する(1,2,9〜13)。ほぼ必ず良性である嚢胞のタイプもあれば、低グレードの悪性のものもあるし、浸潤性膵管腺癌(PDA)の前駆型であるものもあり、PDAは予後不良を伴う(14〜17)。従って、嚢胞タイプの識別は膵嚢胞を有する患者の有効な管理にとって重要である。残念なことに、従来の臨床所見、X線撮影所見、または細胞学的所見から嚢胞のタイプを決定することは、多くの場合、困難である(1,2,9〜16,17)。
a. VHL;
b. GNAS;
c. RNF43、KRAS;および
d. CTNNB1。
突然変異のパターンによりそれがどのタイプの膵嚢胞であるかが示される。
a. VHL;
b. GNAS;
c. RNF43、KRAS;および
d. CTNNB1。
該オリゴヌクレオチドは、突然変異部位を含むまたは突然変異部位に隣接する領域にハイブリダイズする。固体支持体は100個未満の遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドを含む。
a. VHL;
b. GNAS;
c. RNF43、KRAS;および
d. CTNNB1。
該オリゴヌクレオチドは、突然変異部位を含むまたは突然変異部位に隣接する領域にハイブリダイズする。キットは100個未満の遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドを含む。
[本発明1001]
以下の工程を含む、膵嚢胞を鑑別する方法:
膵嚢胞の嚢胞液または上皮細胞から単離された核酸を、膵嚢胞に特徴的な突然変異に関して試験する工程であって、以下の各群から少なくとも一つの遺伝子が試験される、工程:
a.VHL;
b.GNAS;
c.RNF43、KRAS;および
d.CTNNB1。
[本発明1002]
以下の工程を含む、膵嚢胞を漿液性嚢胞腺腫として同定する方法:
膵嚢胞の嚢胞液または上皮細胞から単離された核酸を、VHLにおける突然変異に関して試験する工程であって、該突然変異により該嚢胞が漿液性嚢胞腺腫であることが示される、工程。
[本発明1003]
以下の工程を含む、膵嚢胞を膵管内乳頭粘液性腫瘍または粘液性嚢胞腫瘍として同定する方法:
膵嚢胞の嚢胞液または上皮細胞から単離された核酸を、RNF43またはKRASにおける突然変異に関して試験する工程であって、該遺伝子の一方または両方における突然変異により膵管内乳頭粘液性腫瘍または粘液性嚢胞腫瘍が示される、工程。
[本発明1004]
以下の工程をさらに含む、本発明1003の方法:
前記核酸をGNASにおける突然変異に関して試験する工程であって、GNASにおける突然変異により前記嚢胞が膵管内乳頭粘液性腫瘍であることが示唆される、工程。
[本発明1005]
突然変異が置換突然変異またはヘテロ接合性の消失である、本発明1002の方法。
[本発明1006]
突然変異が置換突然変異またはヘテロ接合性の消失である、本発明1003の方法。
[本発明1007]
KRAS突然変異がコドン12内にある、本発明1003の方法。
[本発明1008]
GNAS突然変異がコドン201内にある、本発明1004の方法。
[本発明1009]
CTNNB1突然変異が、コドン32〜コドン37より選択される一つのコドン内にある、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記遺伝子の各々が試験される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
a.VHL;
b.GNAS;
c.RNF43、KRAS;および
d.CTNNB1
の各群からの少なくとも一つの遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドのセットを含む固体支持体
を含む、膵嚢胞を鑑別診断するための装置であって、該オリゴヌクレオチドが突然変異部位を含むまたは突然変異部位に隣接する領域にハイブリダイズし、該固体支持体が100個未満の遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドを含む、装置。
[本発明1012]
a.VHL;
b.GNAS;
c.RNF43、KRAS;および
d.CTNNB1
の各群からの少なくとも一つの遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブのセット
を含む、膵嚢胞の鑑別診断に役立つキットであって、該オリゴヌクレオチドが突然変異部位を含むまたは突然変異部位に隣接する領域にハイブリダイズし、該キットが100個未満の遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドを含む、キット。
[本発明1013]
試験がハイブリダイゼーションを利用する、本発明1001、1002、または1003のいずれかの方法。
[本発明1014]
試験がライゲーションを利用する、本発明1001、1002、または1003のいずれかの方法。
[本発明1015]
試験が増幅を利用する、本発明1001、1002、または1003のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記核酸がRNF43における突然変異に関して試験される、本発明1003の方法。
本発明者らは、膵嚢胞の様々なタイプを識別するために用いることができるマーカーのセットを開発した。この識別は嚢胞からの嚢胞液を用いて、および/または嚢胞からの上皮細胞を用いて決定することができる。従って、外科的試料は必要ではない。嚢胞液または細胞から得られた核酸を試験することによって、特定のタイプの突然変異についての標的である遺伝子パネルが同定された。これらの突然変異により、その遺伝子が腫瘍発生の過程において重要であることが確認される。特定のタイプの突然変異が同定されたが、同一マーカーにおける他の突然変異またはエピジェネティックな変化によって、結果的に同一の腫瘍に至ってもよい。
材料および方法
患者および検体
本研究は、Johns Hopkins Medical Institutions、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、Wayne State University Emory University、およびUniversity of Indianaの治験審査委員会の承認を得た。病変は、標準的な基準(74)を用いてIPMN、MCN、SPN、またはSCAと分類された。SCAを有する患者の中に、VHL症候群の臨床的特徴を持った者はおらず、SPNのすべてがステージ1B、pT2N0M0であった(74)。IPMNは国際的に認められた基準に従ってサブタイプに分類された(75)。
DNAは、AllPrepキット(Qiagen)を用いて製造業者の説明書に従って嚢胞壁から精製した。DNAは、製造業者のプロトコールに従って、嚢胞液250μLから、RLTM緩衝液(Qiagen)3mlを加えた後AllPrep DNAカラム(Qiagen)に結合させることによって精製した。すべての場合において、DNAは以前に記載されたプライマーおよび条件を用いてqPCRで定量した(76)。
ライブラリは、以前に記載された通りに修正されたIllumina(Illumina, San Digeo, CA)のプロトコールに従って作製した(77)。要約すると、(1)TE 100マイクロリットル(μl)中1〜3マイクログラム(μg)のゲノムDNAをCovaris超音波処理器(Covaris, Woburn, MA)で100〜500bpの大きさに断片化した。150bpよりも短い断片を除去するために、DNAを5 x Phusion HF緩衝液 25μl、ddH2O 416μl、およびNT結合緩衝液 84μlと混合してNucleoSpinカラム(カタログ#636972, Clontech, Mountain View, CA)に装填した。該カラムを卓上遠心機で14,000gにて1分間遠心して、洗浄緩衝液(ClontechのNT3)600μlで1回洗浄して、完全に乾燥するまで2分間再度遠心した。DNAはキットに含まれる溶出緩衝液45μl中に溶出した。(2)精製して断片化したDNAをH2O 40μl、エンドリペア反応緩衝液10μl、エンドリペア酵素ミックス(カタログ# E6050, NEB, Ipswich, MA)5μlと混合した。該エンドリペア混合液100μlを20℃で30分間インキュベートして、PCR精製キット(カタログ#28104, Qiagen)により精製して、溶出緩衝液(EB)42μlで溶出した。(3)Aテール処理するため、エンドリペア処理したDNA 42μlすべてを10X dAテーリング反応緩衝液 5μlおよびクレノウ(エキソ-クレノウ)(カタログ# E6053, NEB, Ipswich, MA)3μlと混合した。該混合液50μlを37℃で30分間インキュベートした後、DNAをMinElute PCR精製キット(カタログ#28004, Qiagen)で精製した。精製したDNAを70℃のEB 25μlで溶出した。(4)アダプターのライゲーションのため、Aテール処理したDNA 25μlをPE-アダプター(Illumina)10μl、5X ライゲーション緩衝液 10μl、およびQuick T4 DNAリガーゼ(カタログ# E6056, NEB, Ipswich, MA)5μlと混合した。該ライゲーション混合液を20℃で15分間、インキュベートした。(5)アダプターライゲーション処理したDNAを精製するために、工程(4)のライゲーション混合液 50μlをNT緩衝液 200μlと混合して、NucleoSpinカラムでクリーンアップした。DNAを溶出緩衝液50μl中に溶出した。(6)増幅ライブラリを得るために、各50μlのPCRを10個用意し、各々は、H2O 29μl、5 x Phusion HF緩衝液 10μl、10mMの各dNTPを含有するdNTPミックス 1μl、DMSO 2.5μl、Illumina PEプライマー#1 1μl、Illumina PEプライマー#2 1μl、Hotstart Phusionポリメラーゼ 0.5μl、および工程(5)のDNA 5μlを含んだ。用いたPCRプログラムは、98℃で2分間;98℃で15秒間、65℃で30秒間、72℃で30秒間を6サイクル;および72℃で5分間であった。PCR産物を精製するために、(10個のPCR反応液からの)PCR混合液500μlをNucleoSpin Extract IIキットのNT緩衝液1000μlと混合して、工程(1)において記載したように精製した。ライブラリDNAを70℃の溶出緩衝液で溶出して、DNA濃度は260nmでの吸光度により推定した。
ヒトエクソームのキャプチャーは、以前に記載された通りに修正されたAgilentのSureSelect Paired-End Target Enrichment System (All Exon 50 Mbキット、Agilent, Santa Clara, CA)のプロトコールに従って実施した(77)。(1)SureSelect Hyb #1 25μl、SureSelect Hyb #2 1μl、SureSelect Hyb #3 10μl、およびSureSelect Hyb #4 13μlを含有するハイブリダイゼーション混合液を調製した。(2)前記のPEライブラリDNA 3.4μl(0.5μg)、SureSelect Block #1 2.5μl、SureSelect Block #2 2.5μl、およびBlock #3 0.6μlを、384ウェルDiamond PCRプレート(カタログ# AB-1111, Thermo-Scientific, Lafayette, CO)の一つのウェル中に入れて、microAmp透明接着フィルム(カタログ#4306311; ABI, Carlsbad, CA)で密封して、95℃で5分間GeneAmp PCRシステム9700サーモサイクラー(Life Sciences Inc., Carlsbad CA)中に置いて、続いて(加温した蓋を被せて)65℃に保持した。(3)工程(1)のハイブリダイゼーション緩衝液 25〜30μlを別の密封したプレート中で、加温した蓋を被せて65℃で少なくとも5分間加熱した。(4)SureSelectオリゴキャプチャーライブラリ 5μl、ヌクレアーゼフリーの水 1μl、および希釈したRNase Block(ヌクレアーゼフリーの水を用いてRNase Blockを1:1で希釈して調製した)1μlを混合して、別の密封した384ウェルプレート中で65℃で2分間加熱した。(5)すべての反応液を65℃に維持しながら、工程(3)のハイブリダイゼーション緩衝液 13μlを工程(4)のSureSelectキャプチャーライブラリミックス 7μlに加え、続いて工程(2)のライブラリ含有液全体(9μl)に加えた。該混合物を8〜10回、ゆっくりとピペッティングした。(6)該384ウェルプレートをしっかりと密封して、該ハイブリダイゼーション混合液を、加温した蓋を被せて65℃で24時間インキュベートした。
キャプチャーしたDNAライブラリをIllumina GAIIx/HiSeq Genome Analyzerで試料当たり1レーンを用いて配列決定して、最終のライブラリ断片から150(2 x 75)塩基対を得た。配列決定されたリードを解析して、CASAVA 1.7ソフトウェア(Illumina)のElandアルゴリズムを用いてヒトゲノムhg18に対してアライメントした。重複するタグは除去して、ミスマッチの塩基は、(i)該塩基が5個を超える別個のタグによって同定され;(ii)特定のミスマッチ塩基を含む別個のタグの個数が、別個のタグの総数の少なくとも20%であり;かつ(iii)該塩基が対応する正常試料中のタグの>0.1%では存在せず、かつ、(iv)SNPデータベース(National Library of Medicine of the National Institutes of Heatlhによる1000ゲノム由来のdbSNP Build 134 リリース)には存在しない場合にのみ、突然変異と同定した。CHASM値は以前に記載されたように決定した(45)。
VHL、RNF43、およびKRASの関連する部分を含有するPCR産物を、表S6に記載したプライマーを用いて、以前に記載された条件(41)を用いて増幅した。各10ulのPCRは、2x Phusion Flash PCRマスターミックス(New England Biolabs)5ul中1〜100個の鋳型分子、ならびに最終濃度0.25uMのフォワードプライマーおよび1.5uMのリバースプライマーを含有した。VHLおよびRNF43の増幅に用いたプライマーの配列を表S6に示す;KRASプライマーは以前に記載されている(41)。以下のサイクル条件を用いた:98℃で2分間;98℃で10秒間、69℃で15秒間、72℃で15秒間を3サイクル;98℃で10秒間、66℃で15秒間、72oCで15秒間を3サイクル;98℃で10秒間、63℃で15秒間、72℃で15秒間を3サイクル;98℃で10秒間、60℃で60秒間を41サイクル。反応は少なくとも四つ組で実施して、それぞれを独立して評価した。Phusionポリメラーゼを不活化するためにプロテイナーゼK(18.8mg/ml、Roche)0.5ulおよびdH2O 4.5ulを含有する溶液 5ulを各ウェルに加えて、60℃で30分間インキュベートして、続いて該プロテイナーゼKを不活化するために98℃で10分間インキュベートした。
本文において「A±B」と列記されたすべての値は、平均値(A)および標準偏差(B)に相当する。本文中に別段の記載のない限り、分布の比較のためには、標本分散が等しくないと仮定する両側t検定を用いた。P値は、(http://faculty.vassar.edu/lowry/VassarStats.html)で入手可能なデータインターフェースを用いて算出した。
実験デザイン
腫瘍性嚢胞は腫瘍性上皮細胞および非腫瘍性細胞(間質性、血管性、および炎症性(17))の混合物から構成される(図1)。本発明の突然変異検出能力を最大限とするために、本発明者らは腫瘍性上皮細胞を非腫瘍性細胞から慎重に顕微解剖した。MCNの病変には細胞性の卵巣型間質が存在するので(図1C、D)、これはMCNでは非常に困難であった。顕微解剖の後、本研究で分析した各嚢胞試料の腫瘍性細胞含有率は少なくとも33%であった。
SCAの分析
SureSelect Enrichment Systemによってキャプチャーされた配列中の一塩基多型を用いて、本発明者らは8名のSCA患者の対応する正常DNA試料において15,190±428個のヘテロ接合性バリアントを同定することができた。調べた8例のSCAの各々において、少なくとも一つの染色体領域のヘテロ接合性の消失(LOH)が同定された(図2、表S3)。LOHの最大率(70%±13%)から、顕微解剖で達成された腫瘍性細胞含有率が高い割合であったことが確認された。大多数のSCAで消失した唯一の領域は3p染色体上にあった(図2、図3Aの例)。8例中7例のSCAが3p染色体のアレルを消失し、該消失は9,934,713〜12,850,443の塩基で画定された。このLOHが、残っているアレルの倍加に関連しているかどうかを調べるために、本発明者らはLOHの領域内にあるすべての配列のコピー数を、同一嚢胞の他のすべての染色体領域のそれと比較した。これは、材料および方法の項目で説明したように、デジタル核型分析(29)により正規化したタグ数を比較することによって達成された。この分析の結果、3p染色体のLOHを示す7例のSCAすべてにおいて、3p染色体配列の1コピーのみが腫瘍に残っていることが示された(残りのゲノムは多倍数体ではなく平均二倍体であると仮定した)。
IPMNの分析
十分にアノテーションされた169個の癌遺伝子を分析した以前の研究において、本発明者らはIPMN試料においてGNASおよびKRASの反復性の突然変異を同定し、これらの突然変異が、それぞれ、IPMNの66%および81%で存在することを示した(41)。KRAS突然変異はこれまでにIPMNおよびPDAにおいて同定されている(42)(43)。これらの分析を拡張するために、本発明者らは、顕微解剖した8例の高グレードのIPMNおよび対応する正常組織に由来するDNAについてエクソーム全体のシーケンシングを実施した。
MCNの分析
IPMNと比べてMCNでは比較的少ないLOH事象が同定された(図2、表S3)。2例以上の腫瘍で消失した領域は一つのみであり、この領域は17q染色体上であり、RNF43遺伝子を含んでいた(図3Cの例)。
SPNの分析
SPNに関するもっとも注目すべき発見は、同定された遺伝子変化が少ないことであった。何らかのLOHが示されたのは、研究された8例の腫瘍のうちの1例のみであった(図2D、図3、および表S3)。LOHが存在しないのは、非腫瘍性細胞による顕微解剖試料の汚染のためではなかった;この可能性は、病理組織学的分析によって、および後述される通りCTNNB1変異型アレルの高い割合(39%〜59%;表S4)によって排除することができた。
Claims (15)
- 以下の工程を含む、膵嚢胞を鑑別することを補助する方法:
膵嚢胞の嚢胞液または上皮細胞から単離された核酸を、膵嚢胞に特徴的な突然変異に関して試験する工程であって、以下のa-dの各遺伝子が試験され、
VHLにおける突然変異により漿液性嚢胞腺腫が示され、
GNASにおける突然変異により膵管内乳頭粘液性腫瘍が示され、
RNF43における突然変異により膵管内乳頭粘液性腫瘍または粘液性嚢胞腫瘍が示され、
CTNNB1における突然変異により充実性偽乳頭状腫瘍が示される、工程:
a.VHL;
b.GNAS;
c.RNF43;および
d.CTNNB1。 - 以下の工程を含む、膵嚢胞を膵管内乳頭粘液性腫瘍または粘液性嚢胞腫瘍として同定することを補助する方法:
膵嚢胞の嚢胞液または上皮細胞から単離された核酸を、RNF43およびKRASにおける突然変異に関して試験する工程であって、該遺伝子の一方または両方における突然変異により膵管内乳頭粘液性腫瘍または粘液性嚢胞腫瘍が示される、工程。 - 以下の工程をさらに含む、請求項2に記載の方法:
前記核酸をGNASにおける突然変異に関して試験する工程であって、GNASにおける突然変異により前記嚢胞が膵管内乳頭粘液性腫瘍であることが示唆される、工程 - 突然変異が置換突然変異またはヘテロ接合性の消失である、請求項2に記載の方法。
- KRAS突然変異がコドン12内にある、請求項2に記載の方法。
- GNAS突然変異がコドン201内にある、請求項3に記載の方法。
- CTNNB1突然変異が、コドン32〜コドン37より選択される一つのコドン内にある、請求項1に記載の方法。
- KRASの核酸がさらに試験される、請求項1に記載の方法。
- a.VHL;
b.GNAS;
c.RNF43;および
d.CTNNB1
の各々の遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドのセットを含む固体支持体
を含む、膵嚢胞を鑑別診断するための装置であって、該オリゴヌクレオチドが突然変異部位を含むまたは突然変異部位に隣接する領域にハイブリダイズし、該固体支持体が100個未満の遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドを含む、装置。 - a.VHL;
b.GNAS;
c.RNF43;および
d.CTNNB1
の各々の遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブのセット
を含む、膵嚢胞の鑑別診断に役立つキットであって、該オリゴヌクレオチドが突然変異部位を含むまたは突然変異部位に隣接する領域にハイブリダイズし、該キットが100個未満の遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドを含む、キット。 - 試験がハイブリダイゼーションを利用する、請求項1または2に記載の方法。
- 試験がライゲーションを利用する、請求項1または2に記載の方法。
- 試験が増幅を利用する、請求項1または2に記載の方法。
- KRAS遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項9に記載の装置。
- KRAS遺伝子に対して相補性であるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブをさらに含む、請求項10に記載のキット。
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