JP7065858B2 - MET突然変異を宿すがんを治療するためのc-Met阻害剤の使用 - Google Patents
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Description
を有する。
a)患者のがん細胞内でのMET1092、MET1094またはMET1195突然変異の存在を、患者のがんの代表的試料中で分析することにより判定するステップと;
b)MET L1195F突然変異が患者のがん細胞内に存在する場合、c-Met阻害剤の投与を含む治療レジームを選択するステップと、
を含む、方法が提供される。
a)患者のがんの代表的試料を得るステップと;
b)患者のがん細胞内でのMET1092、MET1094またはMET1195突然変異の存在を、試料を分析することにより判定するステップと;
c)MET1092、MET1094またはMET1195突然変異が患者のがん細胞内に存在する場合、c-Met阻害剤の投与を含む治療レジームを選択するステップと、
を含む、方法が提供される。
a)患者のがんがMET1092、MET1094またはMET1195突然変異によって特徴づけられるか否かを判定するステップと;
b)患者のがんがMET1092、MET1094またはMET1195突然変異によって特徴づけられることが見出される場合、c-Met阻害剤を治療有効量で患者に投与するステップと、
を含む、方法が提供される。
a)患者のがんがMET1092、MET1094またはMET1195突然変異によって特徴づけられるか否かを結果が判定し得るような試験を要求するステップと;
b)患者のがんがMET1092、MET1094またはMET1195突然変異によって特徴づけられることが見出される場合、c-Met阻害剤を治療有効量で患者に投与するステップと、
を含む、方法が提供される。
a)患者のがんがMET1092、MET1094またはMET1195突然変異によって特徴づけられるか否かを結果が判定し得るような試験を要求するステップと;
b)患者のがんがMET1092、MET1094またはMET1195突然変異によって特徴づけられることが見出される場合、c-Met阻害剤を治療有効量で患者に処方するステップと、
を含む、方法が提供される。
a)患者のがんがMET1092、MET1094またはMET1195突然変異によって特徴づけられるか否かを結果が判定し得るような試験を要求するステップと;
b)患者のがんがMET1092、MET1094またはMET1195突然変異によって特徴づけられることが見出される場合、c-Met阻害剤を治療有効量で患者に投与するステップと、
を含む、方法が提供される。
i.IC50値は、生物学的活性の50%を阻害する試験化合物の濃度である。
ii.用いられる略称は、主なテキスト内または以下の段落内で説明されるか、またはそれ以外の場合、当該技術分野の読者には周知のものとなる。aPTT=活性化部分トロンボプラスチン時間;BCA=ビシンコニン酸;EDTA=エチレンジアミン四酢酸;CTCAE=有害事象共通用語規準;DBP=拡張期血圧;DoR=応答の持続期間;DVT=深部静脈血栓症;ECOG=米国東海岸がん臨床試験グループ;ECG=心電図;FBS=胎児ウシ血清;h=時間(秒);GFR=糸球体濾過率;HEK=ヒト胚性腎細胞系;IL-3=インターロイキン-3;LDS=ローディング色素溶液;LMWH=低分子量ヘパリン;NGS=次世代配列決定;NYHA=ニューヨーク心臓協会;ORR=奏効率;OS=全生存;PD=進行性疾患;PBS=リン酸緩衝食塩水;PFS=進行のない生存;PK=薬物動態;PO=経口的に;QD=1日1回;RFP=赤色蛍光タンパク質;SC=皮下に;SBP=収縮期血圧;TBST=トリス緩衝生理食塩水-ツイーン20;ULN=正常上限;WB=ウエスタンブロット。
MET WTおよびアミノ酸置換を有する特異的突然変異体のHEK293T細胞における一過性トランスフェクションにより、リン酸化MET WB分析を用いてのMETキナーゼを活性化するそれらの能力、またp-ERK1/2 WB分析を用いての下流経路活性化について検討した。MET WTおよびすべてのMET突然変異体は、DMSO処理条件およびリン酸化MET(Y1234/Y1235)の検出によって示されるように一過性に過剰発現されるとき、活性化している。新規なMET突然変異体L1195Fは、METおよびERK1/2を活性化し得、MET WTと同程度までサボリチニブ阻害に対して感受性がある。新規なMET突然変異体V1092IおよびH1094Lもまた、過剰発現により活性化され、下流ERK経路活性化をもたらす。それに対し、既知の強固なMET突然変異体を活性化するM1250Tは、100nMであくまで部分的に阻害され、Y1230Hはサボリチニブに対して完全に抵抗性を示す。この試験の結果は、図1に示し、MET L1195F、V1092IおよびH1094LがMETの突然変異体に加え、下流ERK1/2シグナル伝達を活性化しており、サボリチニブ処理により阻害され得ることを示す。
上記のようなMET WTおよびMET突然変異体構築物の一過性トランスフェクトHEK293T細胞を、指定用量(2.7nM~6.0μMの範囲)のサボリチニブ、INC280またはクリゾチニブで2.5時間処理し、リン酸化MET阻害の程度を検出した。結果を図2~7および下の表1に示す。
増殖がIL-3に依存するような安定細胞株集団を、IL-3の存在下でのそれらの相対的生存度についてアッセイし、細胞増殖における傾向を確立した。IL-3を除去し、各MET構築物の形質転換能を測定した。さらに、HGF処理条件は、MET依存性細胞増殖に全面的に寄与することを示す。この試験の結果を図8に示す。
2014年9月、PRCCを有する患者におけるサボリチニブ(AZD6094/HMPL-504)の有効性を評価するため、56歳女性を第II相試験に登録した(NCT02127710)。2012年12月、腹部リンパ節への幾つかの転移性病変の切除中、診断用試料を患者から収集した。このアーカイブ腫瘍試料を中央病理診断(central pathology)により分析し、高グレードを示したが、II型PRCCの鑑別は不十分であった。患者は、2014年9月2日、サボリチニブを用いた治療を開始した。先行全身療法は、スニチニブおよびサイトカインを含んだが、最良応答は先行選択された両治療法に対する進行性疾患(PD)であった。用いたサボリチニブサイクルは3週であった。
合成遺伝子pLVXIP_MET_FLAGを合成オリゴヌクレオチドおよび/またはPCR産物から構築した。断片をベクター骨格pLVXIRES-Puro_P839クローニング部位BamHI/EcoRIに挿入した。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、UV分光により濃度を測定した。最終構築物を配列決定により確認した。挿入部位内の配列(ABI)一致は100%であった。指定アミノ酸位置(NM_000245)M1250T、Y1230H、L1195F、H1094LおよびV1092Iでの点突然変異をMET WTと同様に作製した(Invitrogen byThermo Fischer Scientific)。
ヒト胚性腎細胞株(HEK293T)に、上のM&MのMET WTおよび突然変異体クローンのセクションにおいて概説したプラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの日、HEK293T細胞を蒔いて、95%コンフルエント状態にした(各ウイルス構築物につき1プレート)。MET構築物(24μg)およびOptimem(1.5mL)を、MasterMixとしてのOptimem(1.5mL/反応)中リポフェクタミン2000(60μL/反応、Invitrogen)と組み合わせ、室温で5分間インキュベートした。最終体積が約3mLになるように、Master Mix1.5mLを、構築物を含有する各チューブに添加した。各混合物を上下にピペッティングし、混合し、室温で20分間静置しておいた。プラスミドミックス(3mL)を、培地12mLを含有する10cmの各プレートに緩やかに添加し、プレートを一晩インキュベートした。24時間後、培地を除去し、大きな力を用いて293T細胞から緩やかにピペッティングする工程を設け、所望される投与プレート(6ウェルまたは96ウェル)内に1:10で再播種し、それを一晩接着させておいた。サボリチニブ(AZD6094)を、指定濃度のDMSOで希釈し、その後2.5時間処理して細胞培養条件まで希釈した。培地を細胞から吸引し、投与培地と交換した。得られたプレートを2.5時間インキュベートし、直ぐに氷冷溶解緩衝液に溶解し、-20℃で貯蔵した。
溶解緩衝液(TBS+1%NP40)に、PhosSTOPホスファターゼ阻害剤および完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を溶解緩衝液10mLごとに1錠ずつ添加した。混合物を冷却しておいた。半接着性293T細胞が懸濁されるまで溶解緩衝液培地(6ウェルディッシュ)をピペッティングすることにより、細胞をウェルから除去した。次に、これらを1500rpmで5分間遠心沈殿した。培地を吸引し、細胞ペレットを氷上で溶解緩衝液100μLに再懸濁した。直ぐに懸濁液をドライアイス下で2回凍結/解凍した。次に、試料を約14000rpmで10分間遠心分離した。上清を新しいチューブ(約85μL)に移し、使用準備が整うまで氷上で維持するかまたは-20℃で凍結させた。BCAアッセイを実施し、タンパク質濃度を測定した。溶解緩衝液を用いて試料を90μL中3.0mg/mlに正規化し、30μLのLDS試料緩衝液および還元剤溶液を添加した。得られた懸濁液を1500rpmで10秒間遠心分離し、試料を沸騰するまで加熱し(Thermo Cycler-200)、再び遠心分離し、冷却しておいた。
全細胞可溶化物から40μgのタンパク質を、SDS-PAGE10%Bis-Tris MidiGel(LifeTech)を用いるゲル電気泳動を介して分離した。電気泳動後、分離されたタンパク質をニトロセルロース(LifeTech)膜上に移した。膜をブロッキングし、抗体とTBST中5%脱脂粉乳との非特異的結合を阻止した。次に、膜を目的のタンパク質に対して産生される一次抗体とともにインキュベートし、次にその後の二次抗体を一次抗体に対して産生されるHRPとコンジュゲートした。最後に、膜を増強された化学発光(ECL,Thermo Fisher Scientific)を介して検出可能な基質とともに室温で3分間インキュベートし、画像処理システム(Fuji,ImageQuant LAS-4000)を用いて展開した。
全細胞可溶化物を、Multi-SPOT Phospho(Tyr1349)/Total Met Assay(MesoScale Discovery,MSD)で用いるため、上記のように調製した。MSDは、空間的に異なるスポットでのリン酸化Met(Tyr1349)および全Metに対する捕捉抗体がプレコーティングされているプレートを提供する。ブロッキング溶液150μLを各ウェルに添加した。プレートを接着プレートシールで密封し、室温で激しく振盪させながら(300~1000rpm)1時間インキュベートした。プレートを300μL/ウェルのトリス洗浄緩衝液で3回洗浄した。試料を1ウェルあたり25μL添加した。プレートを接着プレートシールで密封し、室温で激しく振盪させながら(300~1000rpm)1時間インキュベートした。プレートを300μL/ウェルのトリス洗浄緩衝液で3回洗浄した。検出抗体溶液25μLを、MSDプレートの各ウェルに添加した(抗-全Metを電気化学発光化合物、MSD SULFO-TAG標識とコンジュゲートした)。プレートを接着プレートシールで密封し、室温で激しく振盪させながら(300~1000rpm)1時間インキュベートした。プレートを300μL/ウェルのトリス洗浄緩衝液で3回洗浄した。1×Read Buffer Tの150μLをMSDプレートの各ウェルに添加した。分析のため、プレートをMSD SECTOR(登録商標)Imagerに負荷した。SECTOR(登録商標)Imagerはプレート電極に電圧を印加することで、電極表面に結合した標識の発光を引き起こす。その装置では、発光の強度が測定され、試料中に存在するリン酸化Met(Tyr1349)および全Metの定量的尺度を提供する。パーセントリン酸化Metは、MSDリン酸化/全多重リン酸化タンパク質アッセイで、独立のMSDリン酸化Metおよび全Metタンパク質を用いて算出され得る。
IL-3依存性マウスのプロB細胞株Ba/F3を、ウイルス構築物の突然変異体、ポリブレンを8μg/mLの最終濃度で有する6ウェルプレートに、5.2×105細胞/mLの密度で蒔き、完全培地(RPMI-1640(Gibco)、10%FBS、1%L-グルタミン(L-glut)、IL-3の1ng/mL)で体積が2mLになるまで満たした。懸濁培養物をパラフィルムで密封し、20℃、1500~2000rpmで45分間遠心分離し、次に一晩インキュベートし、完全培地と交換した。培養密度(2.0×106細胞/mL)で、2~4日後、培地がピューロマイシンを0.5μg/mLの最終濃度で含有する場合、選択的圧力を加えながら培地を交換した。ピューロマイシンとともにセレクチン下で細胞を3週間維持した。細胞集団を分割し、1ウェルを処理し、安定細胞株中で感染クローンを検証した。Qiagen Blood and Tissue Kitを用いてDNAを抽出し、NanoDropを用いてDNA濃度を検証した。Q5 Hot Start High Fidelity 2X Master Mix(New England BioLabs)を用いたPCRにより、DNAを増幅した。臭化エチジウムを有する1%アガロースゲル上での電気泳動により、PCR産物を精製した。正確な分子量のバンドをゲルから切断し、Wizard SV Gel Purification Kit(Promega)を用いて精製した。NanoDropを用いてDNA濃度を検証し、10nMの精製されたDNAおよび10μMのプライマーを配列決定し、MET突然変異体クローンの安定細胞株を確認した(Eton Bioscience)。Sequencer 5.4を用いて配列を確認した。細胞の陰性対照群を、ポリブレンおよび構築物を有しないウイルスパッケージに感染させ、また細胞の陽性対照群を、ポリブレンおよび赤色蛍光タンパク質(RFP)ウイルスに感染させた。
Met配列決定プライマー:
F1 AGATACGACGCCCGGGTGC(配列番号3)
F2 AGAAAATCCACTGCGCCG(配列番号4)
F3 CGTGCACAACAAGACAGG(配列番号5)
非コード鎖プライマー:
R1 TCTGGTCATCAGCTCCCA(配列番号6)
R2 AGCAGGCTCAGCACGTTGG(配列番号7)
R3 AACTGGTCCTCGGGGAAGG(配列番号8)
細胞を完全培地(+IL-3、Ba/F3依存性増殖因子)、IL-3を含まない培地(-IL-3)、およびIL-3を含まないがMETに対するリガンドHGFを含む培地(-IL-3/+HGF)で処理した。CellTiter-Glo(登録商標)Cell Viability Assay(Promega)を用いて生存度を測定し、Cellometer(Nexcelom)を用いて21日の生細胞数を取得した。親Ba/F3細胞株を陰性対照としてアッセイした。すべてのMET安定株を、6ウェルフォーマットで二通りにアッセイした。つまり、細胞を1.0×106細胞/mlで蒔き、3つの条件:+IL-3(10ng/mL)、-IL-3、-IL-3/+HGF(100ng/mL)のいずれか1つの指定条件下で培養した。0日目および3日目にCellTiter-Glo(登録商標)試薬を血清添加培地中で培養した細胞に直接的に添加し、CellTiter-Glo(登録商標)試薬対細胞の体積比を1:1にし、室温で20分間振盪し、100μlを白色不透明の底板に移し、照度計(Tcan)を用いて記録する。二通りの読み取り値を各実験において平均化する(n=3)。
アーカイブ腫瘍検体の1つの5μM厚切片を、H&E染色および中央病理診断レビュー(Labcorp)に用いた。病理学者2名が染色切片を読み取り、PRCC診断を確認し、組織学的サブタイプ(1型または2型)を割り当てた。1名の病理学者が彼らの分析に確信をもてない場合、PRCC病理の専門知識を有する外部からの第3の病理学者が症例を読み取る(Brigham and Woman’s Hospital)。
方法および材料は、その他でも記載されている(Frampton et al,Nature Biotechnology 2013)。つまり、400の遺伝子パネル(バージョンT7)の目標とするNGSが、Foundation Medicine Inc.CLIA研究室におけるDNAの調製およびライブラリーの構築の後に実施された。FMIパイプラインに由来する変異体を要求するため、専用分析を用いる。生の配列決定BAMファイルがAZバイオインフォマティクスパイプラインにより再分析され、FMIにより報告された知見を確認する。
MET L1195F突然変異体におけるPRCC患者の腫瘍応答は、未治療であるかまたは過去に治療された、乳頭状腎細胞がん(PRCC)を有する患者におけるサボリチニブ(AZD6094/HMPL-504)の有効性を評価するための非盲検単群多施設大規模第II相試験の間に測定した(ClinicalTrials.gov identifier:NCT02127710;ウェブアドレス:https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02127710)。熟練した臨床チームが結果を再現することを可能にするであろう主な試験および投与の詳細は、次の通りである。
(ANC)≧1500/μL
(Hgb)≧9g/dL
血小板≧100,000/μL
ALTおよびAST≦2.5×ULN
総ビリルビン≦1.5×ULN
不安定狭心症。
うっ血性心不全(NYHA≧グレード2)。
急性心筋梗塞。
脳卒中または一過性脳虚血発作。
Claims (9)
- がんの治療のための、有効成分としてc-Met阻害剤を含む医薬組成物であって、前記がんがMET L1195F変異を有し、かつ前記c-Met阻害剤がサボリチニブまたはその薬学的に許容できる塩である、医薬組成物。
- 前記がんが肺がん、胃がんまたは乳頭状腎細胞がんである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記がんが乳頭状腎細胞がんである、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記がんがII型乳頭状腎細胞がんである、請求項3に記載の医薬組成物。
- がんの治療が、患者のがんの代表的試料を、前記がんがMET L1195F変異を有するか否かを判定するためインビトロで分析するステップを含み、ここで前記患者のがんがMET L1195F変異を有することが見出される場合、前記患者はc-Met阻害剤での治療に適し、かつ前記c-Met阻害剤がサボリチニブまたはその薬学的に許容できる塩である、請求項1~4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが、MET L1195F変異を有するII型乳頭状腎細胞がんであり、かつ前記c-Met阻害剤が、サボリチニブまたはその薬学的に許容できる塩であり、600mgのサボリチニブをその遊離塩基形態で含む医薬組成物の1日1回投与で投与される、請求項1に記載の医薬組成物。
- がん患者がc-Met阻害剤での治療に対して適合するか否かの判定を補助する方法であって、患者のがんの代表的試料を、前記がんがMET L1195F変異を有するか否かを判定するためインビトロで分析するステップを含み、ここで前記患者のがんがMET L1195F変異を有することが見出される場合、前記患者はc-Met阻害剤での治療に適し、かつ前記c-Met阻害剤がサボリチニブまたはその薬学的に許容できる塩である、方法。
- 前記がんが乳頭状腎細胞がんである、請求項7に記載の方法。
- がんの治療用の薬剤の調製におけるc-Met阻害剤の使用であって、前記がんがMET L1195F変異を有し、かつ前記c-Met阻害剤がサボリチニブまたはその薬学的に許容できる塩である、c-Met阻害剤の使用。
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