CN107488715A - 基于自淬灭探针熔解曲线的pnpla3易感基因检测试剂盒及方法 - Google Patents

基于自淬灭探针熔解曲线的pnpla3易感基因检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PNPLA3基因多态性位点rs738409检测的试剂盒及检测方法，本发明设计了针对PNPLA3基因位点特异的引物和探针：上游引物F：5’‑AAGGGCATTTTCAAGTTTGTT‑3’；下游引物R：5’‑TCTGAAGGAAGGAGGGATAAGG‑3’荧光标记探针P：5’‑FAM‑T*G*I*TATGTTCCTGCTTCATCCC‑BHQ1‑3’本发明试剂盒具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势，适合于大规模临床开展；可以实现对PNPLA3的快速、有效且准确的分型定性检测，以期为NAFLD新药研发、分子遗传学预警预测模型的建立提供依据。

Description

基于自淬灭探针熔解曲线的PNPLA3易感基因检测试剂盒及 方法
(一)技术领域
本发明涉及一种基于自淬灭探针熔解曲线的非酒精性脂肪性肝病PNPLA3易感基因多态性检测试剂盒以及检测方法。
(二)背景技术
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性、坏死、炎性细胞浸润等为特征的临床病理综合征。NAFLD在世界范围内发病率成日益上升趋势，流行病学调查显示西方国家NAFLD的发病率为20％～30％，在我国上海地区NAFLD的发病率为15％。NAFLD的致病机制一般认为与肥胖、2型糖尿病、高脂血症、胰岛素抵抗综合征等密切相关。但现在越来越明确基因突变也是NAFLD发病的危险因素之一。目前，很多研究证实PNPLA3基因突变与NAFLD发病密切相关。
PNPLA3基因编码脂肪滋养蛋白，该蛋白具有脂肪酶和甘油酯转乙酰酶活性，调节肝脏甘油三酯代谢。目前发现且研究最多的与NAFLD相关的PNPLA3基因多态性位点是rs738409(I148M)，表现为鸟嘌呤代替胞嘧啶(C/G)，编码的蛋白由异亮氨酸变为甲硫氨酸，蛋白构象发生变化，限制了底物与蛋白结合催化位点，从而限制三酰甘油水解酶的活性，引起其在肝脏中的聚集。
关于PNPLA3基因突变(rs738409[G]，编码I148M)与NAFLD相关性研究结论主要为以下几个方面。首先，PNPLA3基因突变与肝脏脂肪含量的相关性显著，并且PNLA3基因rs738409[G]纯合子者肝脏脂肪含量高于不携带者2倍多。若排除BMI、糖尿病、酒精摄入和种族等因素的影响，PNPLA3基因变异与肝脏脂肪含量的相关性仍非常显著；其次，PNPLA3基因突变在一些人群中发现引起了肝脏相关酶学的升高。此外，相关研究证实，经过多次修正实验后，PNPLA3基因突变与总胆固醇、低密度脂蛋白水平显著相关。
综上所述，携带PNPLA3基因I148M G等位基因的个体是NAFLD的高危人群或易感人群。明确PNPLA3基因多态性(rs738409)将为个体非酒精性脂肪性肝病NAFLD指示提供参考依据，具有重要的临床应用意义。
目前，用于PNPLA3基因分型的方法主要有以下几种，各有其特点。
1、单链构象多态性技术(PCR-SSCP)
利用点突变或SNP可以对短的DNA单链构象造成影响，从而导致电泳速度的不同来进行检测。特点是可以进行特定区域突变的筛查，但需要跑PAGE胶，较为繁琐，并有一定的漏检率。
2、限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)
根据突变或SNP位点选择合适的内切酶对PCR产物进行酶切，然后电泳鉴定。该方法稳定可靠，但要注意酶切效率完全，而且不是所有的突变或SNP位点都有酶可以选择，容易造成污染。
3、等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)
利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。利用Taqman探针在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，具有极高的特异性和敏感度。
4、Taqman探针法(定量PCR)
适合已知SNP位点、位点数量少、通量高的检测。但是探针合成费用价格昂贵，不能同时发现未知SNP位点，并且容易造成假阳性结果。
5、高分辨率熔解曲线法(HRM)
原理简单，不需要对反应条件和体系进行特别的优化，容易实现，可进行突变的筛查，但需要特定仪器和试剂的支持。并且只能对片段内突变点进行检测，不能确定检测突变点的具体位置，容易造成假阳性结果。
6、直接测序法(Sanger法)
SNP分析的金标准，由于基因序列分析法检测的是易突变区的完整序列，因此可以检测未知突变位点。但测序实验操作较为复杂、实验周期较长、电泳容易造成实验室污染。
7、变性高效液相色谱法(DHPLC)
对于特定位点的突变检测，需要摸索各种条件，稳定性较差，影响因素太多，所以不容易做好。
8、芯片技术
与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点，仅适用于全基因组SNP扫描，不适宜单个基因的SNP位点检测，精度低，价格昂贵。
上述几种方法均存在一定的缺陷，有待进一步改进和发展。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种特异性好，灵敏度高，价格低廉，操作简便，通过仪器读取的Tm值即可直观明了地判读结果，基于自淬灭探针熔解曲线法检测PNPLA3基因多态性的试剂盒和方法。
本发明采用的技术方案是：
一种基于自淬灭探针熔解曲线的非酒精性脂肪性肝病PNPLA3易感基因多态性检测试剂盒，主要包括PNPLA3特异性扩增引物和荧光标记探针，以及DNA提取试剂和PCR反应试剂；
所述PNPLA3特异性扩增引物序列如下：
上游引物F：5’-AAGGGCATTTTCAAGTTTGTT-3’；
下游引物R：5’-TCTGAAGGAAGGAGGGATAAGG-3’；
荧光标记探针P：5’-FAM-T*G*I*TATGTTCCTGCTTCATCCC-BHQ1-3’；其中*标记碱基为硫代修饰，I为次黄嘌呤碱基。
本发明的关键在于特异性扩增引物和荧光标记探针，试剂盒中所用的其他试剂，即DNA提取试剂和PCR反应试剂，本领域普通技术人员可根据实际需要进行选择和调整。
为保证试剂盒检测结果的准确性，所述试剂盒还包括强/弱杂合型阳性质粒和阴性对照品。
所述强/弱杂合型阳性质粒由突变纯合型阳性质粒和野生纯合型阳性质粒等比例混合而成；
突变纯合型阳性质粒序列如SEQ ID No.1所示：5’-CCGGGTAGCCTGGAAATAGGGCCAGCTGTGGCTACTCTGTCTGAAAGGCAGTGAGGCATGGGGCTCCACCATGGGACAGACCCTGAGGTGCCCGACACCAGTGCCCTGCAGGCAGGAGATGTGTGAGCACACTTCAGAGGCCCCCAGGACTCAGCGCTAGCAGAGAAAGCCGACTTACCACGCCTCTGAAGGAAGGAGGGATAAGGCCACTGTAGAAGGGGATGAAGCAGGAACATACCAAGGCCTGTGAAAGCAAAGGAGAGAGAAGTTATAGGCGAGAGCACCCTTTTAATTTTCCTGATCCTTCATAAGCATTCTCCAAGTGAGCAGGGCAACAAACTTGAAAATGCCCTTTGCACAGAGTAGGTTAATCCATGGGTCAAAAGAACGGGGAACTAACATACACCCTCGGACTT-3’
野生纯合型阳性质粒序列如SEQ ID No.2所示：5’-CCGGGTAGCCTGGAAATAGGGCCAGCTGTGGCTACTCTGTCTGAAAGGCAGTGAGGCATGGGGCTCCACCATGGGACAGACCCTGAGGTGCCCGACACCAGTGCCCTGCAGGCAGGAGATGTGTGAGCACACTTCAGAGGCCCCCAGGACTCAGCGCTAGCAGAGAAAGCCGACTTACCACGCCTCTGAAGGAAGGAGGGATAAGGCCACTGTAGAAGGGCATGAAGCAGGAACATACCAAGGCCTGTGAAAGCAAAGGAGAGAGAAGTTATAGGCGAGAGCACCCTTTTAATTTTCCTGATCCTTCATAAGCATTCTCCAAGTGAGCAGGGCAACAAACTTGAAAATGCCCTTTGCACAGAGTAGGTTAATCCATGGGTCAAAAGAACGGGGAACTAACATACACCCTCGGACTT-3’
本发明还涉及利用所述试剂盒检测非酒精性脂肪性肝病PNPLA3易感基因多态性的方法，所述方法包括：
(1)提取待测样品DNA；样品可以是唾液等；
(2)配置PCR反应液，加入待测样品DNA，进行PCR扩增反应；每20μL PCR反应液由19.6μL PCR Mix和0.4μL酶液组成，PCR Mix组成如下：1×PCR bufferA(670mM Tris-HCl，67uM EDTA，166mM(NH4)2SO4，0.85mg/ml BSA)，5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.02μM F，0.4μM R，0.3μM P；酶液为5U/μL TaqHS；
扩增反应程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性15s，55℃退火20s，72℃20s，50个循环；
95℃变性1min，45℃低温杂交1min，之后在45℃～80℃范围内，采用Continuous(1％)模式做熔解曲线分析；
(3)以强/弱杂合型阳性质粒为阳性对照，1×TE为阴性对照，按照步骤
(2)方法进行PCR反应和熔解曲线分析；
(4)在阴性对照无熔解峰的前提下，根据熔解曲线进行结果判定：
当熔解曲线Tm值为65.12±1℃时，待测样品的多态性位点为突变纯合型；
当熔解曲线Tm值为60.81±1℃时，待测样品的多态性位点为野生纯合型；
当熔解曲线有两个熔解曲线峰，Tm值为：65.12±1℃和60.81±1℃时，待测样品的多态性位点为杂合型。
本发明的有益效果主要体现在：本发明采取的自淬灭探针熔解曲线法，特异性好，灵敏度高，价格低廉，操作简便，通过仪器读取的Tm值即可直观明了地判读结果。同时，也避免了开关操作带来的污染。
(四)附图说明
图1为突变纯合型样品熔解曲线，Tm值为：65.12±1℃；
图2为野生纯合型样品熔解曲线Tm值为：60.81±1℃；
图3为杂合型样品熔解曲线有两个熔解峰，Tm值为：65.12±1℃和60.81±1℃；
图4为阴性对照熔解曲线，无熔解峰。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
引物、探针具体序列信息如下：
上游引物F：5’-AAGGGCATTTTCAAGTTTGTT-3’；
下游引物R：5’-TCTGAAGGAAGGAGGGATAAGG-3’；
荧光标记探针P：5’-FAM-T*G*I*TATGTTCCTGCTTCATCCC-BHQ1-3’；其中*标记碱基为硫代修饰，I为次黄嘌呤碱基。
扩增反应试剂PCR Mix，组成为：1×PCR bufferA((670mM Tris-HCl，67uM EDTA，166mM(NH4)2SO4，0.85mg/ml BSA))，5mM MgCl2溶液，0.2mM dNTP溶液，0.02uM F，0.4uM R，0.3uM P。
基于自淬灭探针熔解曲线法检测PNPLA3基因多态性的试剂盒的方法，包括如下步骤：
S1：样本DNA提取
取10uL唾液样本加入到90uL DNA提取液(DNA-EZ Reagents V All-DNA-Out，生工生物工程(上海)股份有限公司)中(可按比例适当增加唾液样本，但总液体样品用量最好不要超过DNA提取液用量的1/10)，80℃恒温水浴锅加热5min，离心，加入等体积的超纯水，简短振荡混匀取5uL稀释后的裂解物直接进行PCR(裂解物体积最好不超过总体系的1/10)
S2：配制PCR反应液，包含n×19.6ul PCR Mix和n×0.4ul酶液，其中酶液组成为：5U/ul TaqHS(TaKaRa TaqTM Hot Start Version,Takara)；
扩增具体操作步骤：
1、将反应试剂从冰箱取出融化，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。取n×19.6ulPCR Mix和n×0.4ul酶液加入到1.5ml离心管中配置PCR反应液，分别以每管20ul分装于PCR反应管；
2、向PCR反应管中加入5uL稀释的唾液裂解物(DNA样本)，3000rpm离心数秒。同时，以强/弱杂合型阳性质粒(质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成，载体为pUC57-Amp，序列如前所述)做阳性对照，以1×TE做阴性对照。将已加入模板的PCR反应管转移至PCR扩增区；
3、将已加好模板的PCR反应管放入仪器(ABI 7500)内，仪器的程序设定如下：
扩增反应程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性15s，55℃退火20s，72℃20s，50个循环。
95℃变性1min，45℃低温杂交1min，之后在45℃～80℃范围内，采用Continuous(1％)模式做熔解曲线分析；
S4：结果分析，阳性对照：强/弱杂合型阳性质粒(质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成，载体为pUC57-Amp)，阴性对照：1×TE。
结果分析具体操作如下：
参照图1至图4，检测阴性对照时，阴性对照：1×TE无熔解峰(如图4)的前提下。当熔解曲线Tm值为：65.12±1℃(如图1)时，检测的多态性位点为突变纯合型(GG型)；当熔解曲线Tm值为：60.81±1℃(如图2)时，检测的多态性位点为野生纯合型(CC型)；当熔解曲线有两个熔解曲线峰，Tm值为：65.12±1℃和60.81±1℃(如图3)时，多态性位点为杂合型(GC型)。
本发明共检测了50份人类基因组样本，同时采用对称扩增法将扩增产物送去测序，对比结果。如下表1：
表1
通过金标准的测序方法验证本发明的检测符合率达到100％。并充分体现了本发明操作简便成本低廉，特异性好，结果易判读等优势。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建医科大学孟超肝胆医院
<120> 基于自淬灭探针熔解曲线的PNPLA3易感基因检测试剂盒及方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 416
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
ccgggtagcc tggaaatagg gccagctgtg gctactctgt ctgaaaggca gtgaggcatg 60
gggctccacc atgggacaga ccctgaggtg cccgacacca gtgccctgca ggcaggagat 120
gtgtgagcac acttcagagg cccccaggac tcagcgctag cagagaaagc cgacttacca 180
cgcctctgaa ggaaggaggg ataaggccac tgtagaaggg gatgaagcag gaacatacca 240
aggcctgtga aagcaaagga gagagaagtt ataggcgaga gcaccctttt aattttcctg 300
atccttcata agcattctcc aagtgagcag ggcaacaaac ttgaaaatgc cctttgcaca 360
gagtaggtta atccatgggt caaaagaacg gggaactaac atacaccctc ggactt 416
<210> 2
<211> 416
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
ccgggtagcc tggaaatagg gccagctgtg gctactctgt ctgaaaggca gtgaggcatg 60
gggctccacc atgggacaga ccctgaggtg cccgacacca gtgccctgca ggcaggagat 120
gtgtgagcac acttcagagg cccccaggac tcagcgctag cagagaaagc cgacttacca 180
cgcctctgaa ggaaggaggg ataaggccac tgtagaaggg catgaagcag gaacatacca 240
aggcctgtga aagcaaagga gagagaagtt ataggcgaga gcaccctttt aattttcctg 300
atccttcata agcattctcc aagtgagcag ggcaacaaac ttgaaaatgc cctttgcaca 360
gagtaggtta atccatgggt caaaagaacg gggaactaac atacaccctc ggactt 416

Claims (4)

1.一种基于自淬灭探针熔解曲线的非酒精性脂肪性肝病PNPLA3易感基因多态性检测试剂盒，主要包括PNPLA3特异性扩增引物和荧光标记探针，以及DNA提取试剂和PCR反应试剂，其特征在于：
所述PNPLA3特异性扩增引物序列如下：
上游引物F：5’-AAGGGCATTTTCAAGTTTGTT-3’；
下游引物R：5’-TCTGAAGGAAGGAGGGATAAGG-3’；
荧光标记探针P：5’-FAM-T*G*I*TATGTTCCTGCTTCATCCC-BHQ1-3’；其中*标记碱基为硫代修饰，I为次黄嘌呤碱基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括强/弱杂合型阳性质粒和阴性对照品。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述强/弱杂合型阳性质粒由突变纯合型阳性质粒和野生纯合型阳性质粒等比例混合而成；突变纯合型阳性质粒序列如SEQ IDNo.1所示，野生纯合型阳性质粒序列如SEQ ID No.2所示。
4.利用权利要求1所述试剂盒检测非酒精性脂肪性肝病PNPLA3易感基因多态性的方法，所述方法包括：
(1)提取待测样品DNA；
(2)配置PCR反应液，加入待测样品DNA，进行PCR扩增反应；
每20μL PCR反应液由19.6μLPCR Mix和0.4μL酶液组成，PCR Mix组成如下：1×PCRbufferA，5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.02μM F，0.4μM R，0.3μM P；酶液为5U/μLTaqHS；
扩增反应程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性15s，55℃退火20s，72℃20s，50个循环；
95℃变性1min，45℃低温杂交1min，之后在45℃～80℃范围内，采用Continuous(1％)模式做熔解曲线分析；
(3)以强/弱杂合型阳性质粒为阳性对照，1×TE为阴性对照，按照步骤(2)方法进行PCR反应和熔解曲线分析；
(4)在阴性对照无熔解峰的前提下，根据熔解曲线进行结果判定：
当熔解曲线Tm值为65.12±1℃时，待测样品的多态性位点为突变纯合型；
当熔解曲线Tm值为60.81±1℃时，待测样品的多态性位点为野生纯合型；
当熔解曲线有两个熔解曲线峰，Tm值为：65.12±1℃和60.81±1℃时，待测样品的多态性位点为杂合型。
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