KR20220127175A

KR20220127175A - 피로인산염 검출용 구리 착물, 이를 포함하는 핵산 검출 키트 및 핵산 검출을 위한 정보제공방법

Info

Publication number: KR20220127175A
Application number: KR1020220029866A
Authority: KR
Inventors: 서영준; 쿠마라 라비
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2021-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2022-09-19

Abstract

본 발명은 피로인산염 검출용 구리 착물, 이를 포함하는 핵산 검출 키트 및 핵산 검출을 위한 정보제공방법에 관한 것으로, 피로인산염을 선택적으로 시각적 검출할 수 있으므로, 유전자 증폭 방법과 조합되어 유전자 증폭 과정 동안 필연적으로 발생되는 피로인산염 검출에 의해 시료에 포함된 핵산의 신속하고 간편한 검출이 가능하며, 질병 관련 표적유전자를 대상으로 하여 질병의 신속한 현장진단에도 활용될 수 있다.

Description

피로인산염 검출용 구리 착물, 이를 포함하는 핵산 검출 키트 및 핵산 검출을 위한 정보제공방법{Copper Complex for Pyrophosphate Detection, Nucleic acid Detection Kit comprising the same, and Method of Providing Information for Nucleic Acid Detection}

본 발명은 피로인산염 검출용 구리 착물, 이를 포함하는 핵산 검출 키트 및 핵산 검출을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

단순하고 선택성 및 민감도가 높은 발색 형광 물질은 생명공학자가 생화학 과정을 모니터링하는데 사용하는 필수적인 물질이다. 실제로, 생체 분석을 위한 발색 형광 생성 접근법은 유도 결합 질량 분석법(inductively coupled mass spectrometry), 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(inductively coupled mass spectrometry), 표면 강화 라만 산란법(surface enhanced Raman scattering), 핵 자기 공명 분광법(NMR), 원편광이색성(circular dichroism), 광학 회전 분산(optical rotatory dispersion), 가스 크로마토 그래피(gas chromatography), 고성능 액체 크로마토 그래피, 젤/모세관 전기 영동 및 전기 분석을 기반으로하는 기술(예: 순환 전압 전류 법/차동 펄스 전압 전류법)과 같은 종래 기술 대비 단순성, 견고성, 저렴한 비용, 취급 용이성, 휴대성, 단일 분자 수준에서 높은 공간 및 시간 분해능과 같은 많은 장점을 가지고 있다.

다만, 종래 형광 생성 접근법에 따르면, 일반적으로 생화학적 과정(예: 에너지 전달 및 소비 과정과 같은 세포 대사 과정), 삼투압/세포 내 이온 강도 유도 압력, 세포 온도, 효소 활동을 모니터링, 세포 분화 또는 생물학적으로 관련된 이온(Mn⁺/An^-)의 미량 수준 측정에 많은 비용이 소요된다. 또한, 종래 발색 형광 프로브는 세포 및 세포 내 시스템에서 생물학적으로 관련된 양이온과 음이온을 모니터링하기 위해 개발되었지만, 대부분은 수용체 부위(메탈킬레이팅, 양이온 결합부위)에 연결된 신호 시스템(fluorophore)을 통해 금속/양이온 이온을 측정하므로, 세포 내 양이온 및 음이온의 정확한 모니터링에 적용하기 어렵다.

음이온 감지를 위하여 수소 결합이 가능한 수용체 부위, 금속 이온의 변위/리간드 교환이 사용되는데, 비색 및 형광 측정 프로브는 일반적으로 거대한 초분자, 캐비턴드, 폴리머, 나노 복합재 및 유기/무기 하이브리드를 이용하므로 합성하는데 많은 시간과 비용이 소요된다. 또한, 생물학적 적용(예:inbioimaging)을 위해 개발된 종래 형광 프로브는 세포 및 세포 하 추적 중에 생물학적 매트릭스에서 소광될 수 있으며, 프로브 중 일부는 시험관 내(복잡한 생물학적 유체) 및 세포/세포 이하 시스템에서 광표백 특성과 함께 상대적으로 낮은 광 안정성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

따라서, 생화학 과정에서 합성되거나 소비되는 생물학적으로 관련된 음이온을 측정하기 위하여 높은 세포 형질 감염 능력과 높은 광 안정성을 나타내는 적절하고 합리적으로 설계된 프로브가 필요하고, 고감도 및 높은 광 안정성이 요구되나, 아직까지 이와 같은 성능을 나타내는 프로브는 보고된 바가 없다.

한편, 피로인산염(PPi, HP₂O₇ ^3-)은 DNA 복제, 핵산 안정화 및 삼투압 유지, ATP 가수 분해 및 CPPD(calcium pyrophosphate dihydrate crystal deposition)와 관련된 여러 질병에 관여하므로, 항상성 또는 세포의 생리적 조건 하에서 생화학적 과정(alkaline phosphatase(ALP) enzymatic catalysis)을 간접적으로 모니터링하는 데 필수적인 요소인 것으로 이해되고 있으나, 내인성으로 생성된 PPi의 활동 모니터링에 효과적으로 적용 가능한 형광 프로브는 현재까지 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 핵산 증폭 과정에서 발생하는 피로인산염을 고민감도로 시각적 검출할 수 있는 발색 탐지체를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허등록 제10-1875662호

본 발명의 하나의 목적은 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 피로인산염(pyrophosphate) 검출용 조성물을 제공하는 것이다:

본 발명의 다른 목적은 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 핵산 검출용 키트를 제공하는 것이다:

[화학식 3]

.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 3으로 표시되는 화합물이 포함된 미지의 시료에 대해 목적 핵산 증폭을 위한 반응을 수행하는 단계; 및 핵산 증폭 반응 중 또는 핵산 증폭 반응 후 상기 시료의 색이 무색으로 변화된 경우 상기 시료에 목적 핵산이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 목적 핵산 검출을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다:

[화학식 3]

.

본 발명의 일 양상은 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 피로인산염(pyrophosphate) 검출용 조성물을 제공한다:

[화학식 3]

.

기존의 유전자를 진단하는 방법은 복잡한 합성 과정을 거친 여러 개의 올리고뉴클레오티드와 유전자에 표식 해놓은 형광으로 신호를 증폭 시키는 방법을 사용하나, 이러한 방법들은 시간과 비용이 많이 들고, 형광분석기가 필요하기 때문에 신속한 현장진단에 적합하지 못하였다.

본 발명의 화학식 3으로 표시되는 화합물은 다양한 핵산 증폭 반응에서 필연적으로 방출되는 피로인산염과 선택적으로 친화성이 높을 뿐만 아니라, 시각적으로 변화의 검출이 가능하므로, 핵산의 증폭 방법과 조합되어 핵산 증폭 반응이 이루어졌는지를 실시간으로 분석하기 위한 발색 탐지체로 활용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 피로인산염은 핵산 증폭 반응 과정에서 생성되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(Ribonucleic acid)일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 증폭 반응은 PCR(Polymerase Chain Reaction), RCA(Rolling circle amplification), IVT(Invitro Transcription), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), HDA(Helicase Dependent Amplification), RPA(Recombinase Polymerase Amplification), Ramification Amplification, SDA(Strand Displacement Amplification), LAMP(Loop mediated Isothermal Amplification), EXPAR(Exponential Amplification Reaction), EASA(Exonuclease III assisted signal amplification), Y junction probes, Nickase, ICSDP(Isothermal circular strand displacement polymerization), CHA(catalytic hairpin assembly) 및 HCR(hybridization chain reaction)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법일 수 있다.

본 발명의 화학식 3으로 표시되는 화합물은 높은 온도에서도 안정하므로, 등온증폭 방법 외에도 다양한 온도 조건을 요구하는 PCR 방법 등 다양한 핵산 증폭 반응에 대해서도 안정적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 핵산 검출용 키트를 제공한다:

[화학식 3]

.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 핵산은 증폭 반응에 의하여 증폭되는 것일 수 있다.

본 발명의 키트는 핵산 증폭 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 완충액, DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자, UDG 및/또는 dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 화학식 3으로 표시되는 화합물이 포함된 미지의 시료에 대해 목적 핵산 증폭을 위한 반응을 수행하는 단계; 및 핵산 증폭 반응 중 또는 핵산 증폭 반응 후 상기 시료의 색이 무색으로 변화된 경우 상기 시료에 목적 핵산이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 목적 핵산 검출을 위한 정보제공방법을 제공한다:

[화학식 3]

.

본 방법의 첫 번째 단계는 화학식 3으로 표시되는 화합물이 포함된 미지의 시료에 대해 목적 핵산 증폭을 위한 반응을 수행하는 단계이다.

목적 핵산이 포함되어 있는지 알 수 없는 미지의 시료를 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 목적 핵산의 증폭에 필요한 시약과 함께 증폭한다. 미지의 시료에 목적 핵산이 포함되어 있을 경우, 핵산 증폭 과정에서 과량의 피로인산염이 발생하게 되며, 목적 핵산이 포함되어 있지 않을 경우 핵산 증폭은 이루어지지 않으므로 미지의 시료 내의 피로인산염 함량에는 유의적인 변화가 일어나지 않는다.

목적 핵산의 염기서열 정보 및 목적 핵산의 증폭에 필요한 프라이머 서열은 당업자가 접근할 수 있는 데이터베이스, 프로그램 및 당업계의 통상적인 지식을 바탕으로 용이하게 도출될 수 있다. 또한, 핵산 증폭 반응 방법 및 핵산 증폭 반응에 필요한 시약은 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 방법의 두 번째 단계는 핵산 증폭 반응 중 또는 핵산 증폭 반응 후 상기 시료의 색이 무색으로 변화된 경우 상기 시료에 목적 핵산이 존재하는 것으로 결정하는 단계이다.

본 발명의 화학식 3으로 표시되는 화합물은 피로인산염에 대해 선택적 친화성을 나타내므로, 미지의 시료에 목적 핵산이 존재할 경우 핵산 증폭 반응 중 또는 반응 후 핵산 증폭 반응 과정에서 생성된 피로인산염과 화학식 3으로 표시되는 화합물이 반응하게 된다. 한편, 화학식 3으로 표시되는 화합물이 피로인산염과 반응할 경우 Cu²⁺ 이온이 대체되고 로다민 고리 폐쇄에 의해 흡광도가 감소되므로, 반응 전 분홍색을 나타내던 시료의 색이 반응 후 무색을 나타내게 된다. 따라서, 미지의 시료에 목적 핵산이 존재할 경우, 미지의 시료의 핵산 증폭 반응 중 또는 반응 후 시료의 색이 무색으로 변하게 되므로, 이를 시각적으로 인식하여 시료에 목적 핵산이 존재하는지 여부를 간편하게 결정할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미지의 시료는 생물학적 시료일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 객담, 세균, 정액, 세포 조직, 침, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시료일 수 있다.

본 발명의 화학식 3으로 표시되는 화합물은 피로인산염 이외의 생체 분자 및 이온에 대한 친화성이 매우 낮으므로, 다양한 생물학적 시료에 적용되더라도 목적 핵산의 선택적 검출에 효과적으로 활용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 목적 핵산은 질병 관련 표적유전자일 수 있다.

본 발명의 화학식 3으로 표시되는 화합물이 포함된 시료를 대상으로 질병 관련 표적유전자의 증폭 반응을 수행하여 시료가 분홍색에서 무색으로 변하는지 여부를 관찰함으로써, 해당 시료에 질병 관련 표적유전자가 존재하는지 여부를 시각적으로 간편하게 판단할 수 있고, 이를 통하여 시료를 제공한 대상이 해당 질병을 앓고 있는지에 대한 정보를 신속하게 제공할 수 있다.

피로인산염 검출용 구리 착물, 이를 포함하는 핵산 검출 키트 및 핵산 검출을 위한 정보제공방법에 따르면, 피로인산염을 선택적으로 시각적 검출할 수 있으므로, 유전자 증폭 방법과 조합되어 유전자 증폭 과정 동안 필연적으로 발생되는 피로인산염 검출에 의해 시료에 포함된 핵산의 신속하고 간편한 검출이 가능하며, 질병 관련 표적유전자를 대상으로 하여 질병의 신속한 현장진단에도 활용될 수 있다.

도 1은 화학식 2로 표시되는 전구체 화합물 1의 ¹H NMR 스팩트럼을 나타낸 그래프이다.
도 2는 화학식 2로 표시되는 전구체 화합물 1의 ¹³C NMR 스팩트럼을 나타낸 그래프이다.
도 3은 화학식 5로 표시되는 전구체 화합물 2의 ¹H NMR 스팩트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는 화학식 5로 표시되는 전구체 화합물 2의 ¹³C NMR 스팩트럼을 나타낸 그래프이다.
도 5는 화학식 7로 표시되는 전구체 화합물 3의 ¹H NMR 스팩트럼을 나타낸 그래프이다.
도 6은 화학식 7로 표시되는 전구체 화합물 3의 ¹³C NMR 스팩트럼을 나타낸 그래프이다.
도 7은 화학식 10으로 표시되는 전구체 화합물 4의 ¹H NMR 스팩트럼을 나타낸 그래프이다.
도 8은 화학식 10으로 표시되는 전구체 화합물 4의 ¹³C NMR 스팩트럼을 나타낸 그래프이다.
도 9는 다양한 생체 분자 존재 하에서 구리 착물 1의 a) UV-Vis 스팩트럼 및 b) 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 다양한 생체 분자에 대한 구리 착물 1 내지 4의 선택성을 나타낸 그림이다.
도 11은 화학식 2로 표시되는 전구체 화합물과 다양한 금속 착물 중 구리 착물의 선택적 친화성을 나타낸 그래프이다.
도 12는 구리 착물 1의 피로인산염 감지에 필요한 최소 구리 이온 당량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 구리 착물 1의 피로인산염 감지에 필요한 최소 반응 시간을 나타낸 그래프이다.
도 14는 다양한 음이온 존재 하에서 구리 착물 1의 피로인산염에 대한 선택적 친화성을 나타낸 그래프이다.
도 15는 구리 착물 1에 의하여 감지 가능한 피로인산염의 최소 당량을 나타낸 그래프이다.
도 16은 구리 및 피로인산염의 유무에 따른 화학식 2로 표시되는 전구체 화합물 1의 ¹H NMR 스펙트럼 변화를 나타낸 그래프이다.
도 17은 a) 구리 착물 1이 RCA 반응을 식별하는 메커니즘을 나타낸 모식도 및 b) RCA 반응의 아가로스 젤 전기영동 및 구리 착물 1의 존재하에서의 양성 및 음성 반응의 비색 변화를 나타낸 그림이다.
도 18은 a) PCR 반응의 다양한 사이클에서 구리 착물 1의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 그래프 및 b) 다양한 사이클에서 반응 시약을 나타낸 사진이다.
도 19는 a) 구리 착물 1이 RNA 증폭 반응을 감지하는 메커니즘을 나타낸 모식도 및 b) 증폭 반응의 젤 전기영동 및 구리 착물의 존재하에 양성 및 음성 반응의 비색 변화를 나타낸 사진이다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 구리 착물 1의 제조

오븐에서 건조된 둥근 바닥 플라스크에서 화학식 1로 표시되는 화합물(1당량)의 건조 톨루엔 용액을 Lawesson 시약(1당량)으로 처리한 다음, 혼합물을 N₂ 하에서 8시간 동안 120℃ 온도로 환류 가열하였다. 그 후, 혼합물을 냉각시키고 감압하에서 농축시킨 다음, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/hexane, 3:7)를 통해 정제하여 82%의 수율로 화학식 2로 표시되는 전구체 화합물 1을 제조하였으며, 전구체 화합물 1 구조를 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 통하여 확인하였다. NMR 용매로 CDCl₃, D₂O, DMSO-d6 또는 CD₃CN을 사용하고 내부 표준(internal standard)으로 테트라메틸실란을 사용하여 Bruker AV-400 분광기를 사용하여 기록한 결과, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 결과는 다음과 같이 확인되었다(도 1 및 도 2):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.86 (s, 1H), 7.90-7.87 (m, 1H), 7.42-7.35 (m, 2H), 7.14-7.12 (m, 1H), 7.06-7.02 (m, 1H), 6.99-6.97 (m, 1H), 6.82-6.72 (m, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 6.37-6.35 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 6.18-6.14 (m, 2H), 3.27-3.19 (m, 8H), 1.09-1.04 (t, J = 6.98 Hz, 12H).

¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) 206.92, 151.6, 148.9, 139.14, 133.18, 131.58, 130.22, 122.83, 128.66, 127.38, 108.8, 97.36, 44.18, 31.15, 13.87. MS (LC/MS, HRMS): calcd for C33H34N4OS2 ([M]) : m/z 566.2174; found: 567.217.

오븐 건조된 바이알에서 화학식 2로 표시되는 전구체 화합물 1(1당량), 황산구리(1당량) 및 DMF(약 1㎖)의 혼합물을 N₂하에서 16시간 동안 37℃의 온도로 교반한 다음, DMF를 진공하에서 증발시키고 잔류물을 디에틸에터로 세척하여 최종적으로 화학식 3으로 표시되는 구리(copper(Cu²⁺)) 착물 1을 제조하였다.

화학식 1	화학식 2	화학식 3

실시예 2. 구리 착물 2의 제조

오븐에서 건조된 둥근 바닥 플라스크에서 화학식 4로 표시되는 로다민하이드라진 수화물(1당량)을 EtOH에 녹인 용액을 피리딘-2-카브알데하이드(pyridine-2-carbaldehyde)(1당량)로 처리한 다음 트리플루오로아세트산(TFA, 2방울)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 80℃에서 4시간 동안 가열 후 냉각시키고 감압하에 농축시킨 다음, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/hexane, 2:8)를 통해 정제하여 76%의 수율로 화학식 5로 표시되는 전구체 화합물 2를 제조하였다.

전구체 화합물 2 구조를 실시예 1의 ¹H 및 ¹³C NMR 방법과 동일한 방법으로 확인한 결과는 다음과 같다(도 3 및 도 4):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.36-8.34 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.93-7.88 (t, J = 6.72 Hz, 2H), 7.46-7.51 (m, 1H), 7.41-7.32 (m, 2H), 7.03-6.93 (m, 2H), 6.47 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.38-6.35 (d, J = 2.75 Hz, 2H), 6.17-6.124 (m, 2H), 3.248-3.174 (m, 8H), 1.07-1.02 (t, J = 7.8 Hz, 12H).

¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) 165.4, 154.5, 152.9, 152.8, 148.98, 145.9, 136.08, 133.73, 128.25, 128.04, 127.64, 123.71, 123.57, 120.63, 108.05, 105.57, 98.29, 65.84, 44.30, 12.62. MS (LC/MS, HRMS): calcd for C33H35N5O2 ([M]) m/z 545.2791; found: 545.279.

오븐 건조된 바이알에서 화학식 5로 표시되는 전구체 화합물 2(1당량), 황산구리(1당량) 및 DMF(약 1㎖)의 혼합물을 N₂하에서 16시간 동안 37℃의 온도로 교반한 다음, DMF를 진공하에서 증발시키고 잔류물을 디에틸에터로 세척하여 최종적으로 화학식 6으로 표시되는 구리 착물 2를 제조하였다.

화학식 4	화학식 5	화학식 6

실시예 3. 구리 착물 3의 제조

피리딘-2-카브알데하이드(pyridine-2-carbaldehyde) 대신 5-(티오펜-2-일)티오펜-2-카브알데하이드(5-(thiophen-2-yl)thiophene-2-carbaldehyde)를 사용한 것을 제외하면 실시예 2와 동일한 방법으로 화학식 7로 표시되는 전구체 화합물(수율: 64%) 3 및 화학식 8로 표시되는 구리 착물 3을 제조하였다.

전구체 화합물 3 구조를 실시예 1의 ¹H 및 ¹³C NMR 방법과 동일한 방법으로 확인한 결과는 다음과 같다(도 5 및 도 6):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.732 (s, 1H), 7.92-7.89 (d, J = 7.4Hz, 1H), 7.47-7.35 (m, 2H), 7.14-7.11 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.10-7.08 (d, J = 3.46 Hz, 1H), 7.06-7.03 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.95-6.87 (m, 3H), 6.47-6.42 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 6.39-6.35 (d, J = 3.2 Hz, 2H), 6.21-6.15 (m, 2H), 3.30-3.20 (m, 8H), 1.12-1.04 (t, J = 6.7 Hz, 12H).

¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) 164, 153.4, 149.1, 141.8, 139.9, 139.5, 137.6, 133.2, 130.2, 127.9, 124.91, 124.34, 123.84, 123.46, 123.31, 108.04, 97.99, 44.84, 12.68. MS (LC/MS, HRMS): calcd for C37H36N4O2S2 ([M ]) : m/z 632.2280; found: 632.228.

화학식 7	화학식 8

실시예 4. 구리 착물 4의 제조

오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에서 EtOH 중 화학식 9로 표시되는 화합물(1당량)의 용액을 하이드라진 수화물(hydrazine hydrate)(1.1당량)로 처리하고, 4시간 동안 80℃에서 환류 가열한 다음 냉각하고 농축하였다. 그 후, 감압하에서 생성된 슬러리를 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/hexane, 1:1)를 통해 정제하여 64%의 수율로 화학식 10으로 표시되는 전구체 화합물 4를 제조하였다.

전구체 화합물 4 구조를 실시예 1의 ¹H 및 ¹³C NMR 방법과 동일한 방법으로 확인한 결과는 다음과 같다(도 7 및 도 8):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3): δ9.84 (s, 1H), 7.68-7.55 (m, 2H), 7.49-7.41 (t, J = 8.2Hz, 1H), 7.33-7.24 (m, 1H), 5.2 (s, 2H), 3.33 (s, 1H).

¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) 166.71, 137.04, 133.01, 131.58, 128.32, 126.46, 126.09. MS (LC/MS, HRMS): calcd for C8H10N2S ([M]) : m/z 168.0357; found:168.036.

오븐 건조된 바이알에서 화학식 10으로 표시되는 전구체 화합물 4(1당량), 황산구리(1당량) 및 DMF(약 1㎖)의 혼합물을 N₂하에서 16시간 동안 37℃의 온도로 교반한 다음, DMF를 진공하에서 증발시키고 잔류물을 디에틸에터로 세척하여 최종적으로 화학식 11으로 표시되는 구리 착물 4를 제조하였다.

화학식 9	화학식 10	화학식 11

실험예 1. 생체 분자에 대한 구리 착물 1의 선택적 친화성 확인

실시예 1 내지 4에서 제조한 구리 착물 1 내지 4가 생체 분자에 대해 선택적 친화성을 나타내는지 분석하였다.

구체적으로, 구리 착물 1 내지 4를 각각 dNTPs(natural deoxynucleotide triphosphates), DTT(dithiothreitol), 피로인산염(pyrophosphate, PPi), 시스테인(cysteine) 또는 인간 혈청(human serum, HS)과 반응시킨 후 흡광도 변화를 측정하여 친화성을 분석하였다. UV-Vis 스펙트럼은 Cary Series UV-Vis 분광 광도계(Agilent Technologies)와 석영 큐벳(경로 길이: 1cm)을 사용하여 실온에서 기록하였으며, 흡광도 변화는 큐벳에서 샘플 용액의 UV 조사 직후에 측정되었다.

그 결과, 구리 착물 2 내지 4와는 달리, 구리 착물 1은 PPi가 존재하는 경우 흡광도가 크게 감소하는 것으로 나타나(도 9), dNTPs, DTT, 시스테인 및 인간 혈청 대비 PPi에 대해 특히 높은 선택성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 10).

이와 같은 결과를 통하여, 구리 착물 1은 다양한 생체 분자가 존재하는 조건하에서도 PPi를 효과적으로 감지하는데 적용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 2. 다양한 금속 착물 중 구리 착물의 선택적 친화성 확인

실시예 1에서 제조한 구리 착물 1이 구리가 아닌 다른 금속 이온과 복합체를 형성하는 경우에도 선택적 친화성을 나타내는지 확인하기 위하여, 다른 금속 이온(Ca²⁺, K⁺, Ln³⁺, Mg²⁺, Ni²⁺, Rb³⁺, Zn²⁺)과 형성된 착물의 선택성을 분석하였다. 실시예 1에서 제조된 화학식 2로 표시되는 전구체 화합물 1 및 화학식 3으로 표시되는 구리 착물 1에 대해 UV-Vis 스펙트럼을 실험예 1과 동일한 방법으로 조사한 결과, 구리 복합체 형성시 564nm에서 UV 흡광도의 극적인 변화가 관찰되었으며, 무색에서 옅은 분홍색으로의 상당한 색상 변화가 동반된 것으로 확인되었다. 반면, 전구체 화합물 1이 Ca²⁺, K⁺, Ln³⁺, Mg²⁺, Ni²⁺, Rb³⁺ 또는 Zn²⁺과 복합체를 형성한 경우에는 구리 복합체 1과 같은 UV 흡광도 변화 및 색상의 변화가 나타나지 않았다(도 11).

실험예 3. 구리 착물 1의 피로인산염 감지에 필요한 최소 구리 이온 당량 및 반응 시간 확인

실시예 1에서 제조한 구리 착물 1의 피로인산염 감지에 필요한 최소 구리 이온 당량 및 반응 시간을 분석하였다.

구체적으로, 물/MeOH(7:3) 내에서, Cu²⁺의 다양한 당량 범위(0 내지 3 당량, 0.2 당량 간격) 및 반응 시간(0 내지 20분)에 따른 흡광도 변화를 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 0.2 당량에서도 급격한 흡광도 변화가 확인되었으며, 구리 이온의 당량이 증가할수록 지속적으로 흡광도가 증가하는 것으로 확인되었다(도 12). 또한, 2분이라는 매우 짧은 반응 시간에서도 흡광도가 급격하게 증가하는 것으로 확인되었다(도 13).

실험예 4. 다양한 음이온 존재 하에서 구리 착물 1의 선택적 친화성 확인

실시예 1에서 제조한 구리 착물 1이 PPi가 아닌 다른 음이온에 대해서도 친화성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 음이온(Ca²⁺, K⁺, Ln³⁺, Mg²⁺, Ni²⁺, Rb³⁺, Zn²⁺)과의 선택성을 분석하였다.

구체적으로, 실시예 1에서 제조된 화학식 3으로 표시되는 구리 착물 1과 PPi, CO₃ ^2-, PO₄ ^3-,BR^-, F^-, SO₄ ^2-, H₃PO₄ ^-, HCO₃ ^-, I^-, SO₃ ^-, Aco^-, NO₃ ^-의 반응에 따른 UV-Vis 스펙트럼을 실험예 1의 방법과 동일한 방법으로 조사하였다.

그 결과, 구리 착물 1의 스펙트럼은 PPi과 반응하는 경우에만 565nm 파장에서 감소를 나타낸 것으로 확인되었으며, PPi를 제외한 다른 음이온 중 어느 것도 유의미한 변화를 유도하지 않은 것으로 나타났다. 또한, PPi를 추가한 후 분홍색에서 무색으로의 극적인 색상 변화가 확인되었으며, 이는 PPi가 구리 착물 1에서 Cu²⁺ 이온을 대체하고 로다민 고리 폐쇄를 통해 흡광도를 감소시키기 때문임을 확인하였다(도 14).

실험예 5. 구리 착물 1에 의하여 감지 가능한 피로인산염의 최소 당량 확인

구리 착물 1에 의하여 감지 가능한 PPi의 최소 당량을 확인하기 위하여, 구리 복합체 1에 대해 다양한 당량의 PPi를 반응시킨 후, 흡광도 변화를 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, PPi 당량이 증가함에 따라 구리 착물 1의 흡광도 강도가 선형으로 감소하였으며(도 15a), PPi 당량을 0에서 1로 증가시키면 흡광도 강도가 급격히 감소하는 것으로 나타나(도 15b), PPi가 구리 착물 1과 높은 반응성을 나타내는 것으로 확인되었다.

실험예 6. 구리 착물 1 및 피로인산염의 구조적 친화성 확인

순차적 비색 변화가 나타나는 원인을 조사하기 위하여, 전구체 화합물 1을 CD₃CN에, Cu²⁺ 이온을 D₂O에 녹인 다음, 이들을 혼합하여 구리 착물 1을 제조한 후 1H NMR 스팩트럼을 분석하였다.

그 결과, Cu²⁺ 이온이 추가될 경우 Schiff 염기 CH=N 양성자 (a)의 신호가 8.83ppm에서 8.79ppm으로 상향장 이동을 나타내며, PPi가 추가될 경우 다시 8.83ppm으로 하향장 이동이 나타나(도 16), 구리 복합체 형성 및 PPi에 의해 유도된 후속 분해에 의한 구조적 친화성이 확인되었다.

실험예 7. RCA 반응에서 구리 착물 1의 유전자 진단 기능 확인

유전자 증폭과정에서 방출되는 PPi 검출을 통한 유전자 진단에 화학식 3으로 표시되는 구리 착물 1이 적용될 수 있는지 확인하기 위하여, 대표적인 등온 DNA 증폭 방법인 RCA(Rolling circle amplification)에 구리 착물 1을 적용하여 분석하였다(도 17a).

구체적으로, 표 5와 같이 두 가지의 반응 혼합물 20㎕을 준비하였다. 즉, RM-1은 RCA 반응에 필요한 모든 성분이 포함되도록 혼합물을 구성한 반면, RM-2는 SplintR ligase를 제외하고 구성하여 RCA가 수행되지 않도록 혼합물을 구성하였다(표 5). 그 후, RM-1 및 RM-2 두 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 유지한 다음 물(water) 중의 구리 착물 1 25M 용액에 첨가하였다.

구분		사용량	RM-1	RM-2
primer	5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'(서열번호 1)	100pmol/㎕, 2㎕	○	○
Padlock Template	5'[Phosphate]-CTGATAAGCTAATGACGGATTGATGACACCCTAACCCTAACCCTAACCCTGATAGTCTACATGTTAACGATCAACATCAGT-3'(서열번호 2)	100pmol/㎕, 1㎕	○	○
SplintR ligase		25,000U/㎖, 1㎕	○	×
dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)		2mM, 8㎕	○	○
Phi29 DNA polymerase		10U/㎕, 1㎕	○	○
10X BSA		2㎕	○	○
splint R ligase buffer (50mM Tris-HCL, 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 10mM (NH₄)₂SO₄, 4mM DTT)		pH7.5(25℃), 2㎕	○		○
dH₂O		나머지	○		○

증폭 후, 천연 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(nPAGE, 18%) 방법으로 증폭된 DNA 산물을 검출하였다.

구체적으로, 반응 혼합물(10㎖)을 6x 로딩 완충액(2.5㎖)과 혼합하고 웰에 로딩한 다음, 1x TBE 완충액(89mM Tris, 89mM 붕산염, 2mM EDTA, pH8.3)에서 90 내지 180분 동안 95/80V의 일정한 전위와 3mA의 전류로 전기영동을 수행하고 젤 이미지 시스템으로 스캔하였다. 유사하게, RCA 산물 15㎕를 4x 버퍼과 혼합하고, 젤을 EB(ethidium bromide)로 염색한 다음 ChemiDoc MP 이미징 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 촬영하였다.

그 결과, RM-1은 옅은 분홍색에서 무색으로 색상이 변경된 반면, RM-2의 색상은 변경되지 않은 것으로 확인되었으며(도 17b), 젤 전기영동을 사용하여 RCA에 의하여 증폭된 RM-1 산물을 확인하였다(도 17b).

실험예 8. PCR 반응에서 구리 착물 1의 유전자 진단 기능 확인

유전자 증폭과정에서 방출되는 PPi 검출을 통한 유전자 진단에 화학식 3으로 표시되는 구리 착물 1이 적용될 수 있는지 확인하기 위하여, RCA와는 다른 온도 조건을 사용하는 가장 일반적인 DNA 증폭 방법인 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 구리 착물 1을 적용하여 분석하였다.

구체적으로, P1 및 P2 프라이머(표 6), 및 T1 및 T2 주형서열(표 6)을 포함하는 반응 혼합물 22㎕을 준비하였다. Positive 군은 표 7의 PCR 반응에 필요한 모든 성분이 포함되도록 혼합물을 구성한 반면, Negative 군은 표 7의 성분 중 PCR 마스터 믹스를 제외하고 구성하여 PCR이 수행되지 않도록 혼합물을 구성하였다.

명칭	핵산서열(5'→3')	서열번호
T1	GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCTCCAAGAAGCCGGTCCCCATCACAAGTGCAACCGC	서열번호 3
T2	TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCCGGGTTATTACATGCGCTGGCACTTGCCCGTACGGCGGTTGCACTTGTGATGGGG	서열번호 4
P1	CACACAGGAAACAGCTATGAC	서열번호 5
P2	GAAATTAATACGACTCACTATAGG	서열번호 6

구분	사용량
T1 및 T2주형서열	1pmole/㎕, 2㎕(각각)
P1 및 P2 프라이머	10pmole/㎕, 2㎕(각각)
PCR 마스터 믹스(Taq DNA polymerase(0.05U/㎕), reaction buffer, 4mM MgCl₂, 0.4mM dNTPs)	10㎕
dH₂O 중 구리 착물 1	25μM, 2㎕
dH₂O	나머지

PCR 반응은 표 8의 조건으로 수행하였다.

구분	온도	시간	비고
pre-denaturation	94℃	3분
denaturation	94℃	30초	25반복
annealing	56℃	30초
extension	72℃	1분
final extension	72℃	5분

그 결과, Positive 군에서 5사이클에서 25사이클까지 명확한 색상 변화가 관찰된 반면, Negative 군에서는 25사이클 이후에도 색상 변화가 관찰되지 않은 것으로 나타나(도 18), 구리 착물 1은 다양한 온도 변화에서 매우 안정적인 PCR 반응에 적용 가능한 복합체임을 확인하였다.

실험예 9. RNA 증폭 반응에서 구리 착물 1의 유전자 진단 기능 확인

RNA 증폭과정에서 방출되는 PPi 검출을 통한 유전자 진단에 화학식 3으로 표시되는 구리 착물 1이 적용될 수 있는지 확인하였다(도 19a).

구체적으로, 표 9와 같이 두 가지의 반응 혼합물 20㎕을 준비하였다. RM-3은 RNA 증폭 반응에 필요한 모든 성분이 포함되도록 혼합물을 구성한 반면, RM-4는 T7 RNA 중합효소를 제외하고 구성하여 RNA 증폭 반응이 수행되지 않도록 혼합물을 구성하였다(표 9). 그 후, RM-3 및 RM-4 두 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 유지한 다음 물(water) 중의 구리 착물 1 25M 용액에 첨가하였다.

구분			사용량	RM-3	RM-4
duplex	primer	5'-TAATACGACTCACTATAG-3'(서열번호 7)	100μM, 1㎕	○	○
duplex	주형 서열	5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTGATAGCTAGCTTATCAGACTGA TGTTGACCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'(서열번호 8)	100μM, 1㎕	○	○
rNTP mixture			2mM, 2㎕(각각)	○	○
DTT			100mM, 2㎕	○	○
T7 RNA polymerase			25U, 0.5㎕	○	×
RNASe Inhibitor			20U, 0.5㎕	○	○
dH₂O			나머지	○	○

그 결과, RM-3의 색상은 옅은 분홍색에서 무색으로 색상이 변한 반면, RM-4의 색상은 변하지 않은 것으로 확인되었으며, 실험예 7과 동일한 방법으로 젤 전기영동을 수행한 결과, 증폭 산물을 확인하였다(도 19b, lane 4).

이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 화학식 3으로 표시되는 구리 착물 1은 다양한 핵산 증폭 반응에 사용되어 증폭 과정에서 방출되는 PPi를 시각적으로 검출할 수 있는 발색 탐지체로 적용될 수 있으므로, 핵산 증폭 반응이 수행되었는지를 실시간으로 분석하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION JEONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Copper Complex for Pyrophosphate Detection, Nucleic acid Detection Kit comprising the same, and Method of Providing Information for Nucleic Acid Detection <130> DHP22-125 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCA primer <400> 1 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 2 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Padlock Template <400> 2 ctgataagct aatgacggat tgatgacacc ctaaccctaa ccctaaccct gatagtctac 60 atgttaacga tcaacatcag t 81 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T1 <400> 3 gaaattaata cgactcacta tagggttaac tttaagaagg agatatacca tgggctccaa 60 gaagccggtc cccatcacaa gtgcaaccgc 90 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2 <400> 4 tttcacacag gaaacagcta tgacccgggt tattacatgc gctggcactt gcccgtacgg 60 cggttgcact tgtgatgggg 80 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 <400> 5 cacacaggaa acagctatga c 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 <400> 6 gaaattaata cgactcacta tagg 24 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> duplex primer <400> 7 taatacgact cactatag 18 <210> 8 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> duplex template <400> 8 tagcttatca gactgatgtt gatagctagc ttatcagact gatgttgacc ctatagtgag 60 tcgtatta 68

Claims

화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 피로인산염(pyrophosphate) 검출용 조성물:
[화학식 3]

.
제 1 항에 있어서, 상기 피로인산염은 핵산 증폭 반응 과정에서 생성되는 것인 피로인산염 검출용 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(Ribonucleic acid)인 것인 피로인산염 검출용 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 증폭 반응은 PCR(Polymerase Chain Reaction), RCA(Rolling circle amplification), IVT(Invitro Transcription), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), HDA(Helicase Dependent Amplification), RPA(Recombinase Polymerase Amplification), Ramification Amplification, SDA(Strand Displacement Amplification), LAMP(Loop mediated Isothermal Amplification), EXPAR(Exponential Amplification Reaction), EASA(Exonuclease III assisted signal amplification), Y junction probes, Nickase, ICSDP(Isothermal circular strand displacement polymerization), CHA(catalytic hairpin assembly) 및 HCR(hybridization chain reaction)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법인 것인 피로인산염 검출용 조성물.
화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 핵산 검출용 키트:
[화학식 3]

.
제 5 항에 있어서, 상기 핵산은 증폭 반응에 의하여 증폭되는 것인 핵산 검출용 키트.
화학식 3으로 표시되는 화합물이 포함된 미지의 시료에 대해 목적 핵산 증폭을 위한 반응을 수행하는 단계; 및
핵산 증폭 반응 중 또는 핵산 증폭 반응 후 상기 시료의 색이 무색으로 변화된 경우 상기 시료에 목적 핵산이 존재하는 것으로 결정하는 단계
를 포함하는 목적 핵산 검출을 위한 정보제공방법:
[화학식 3]

.
제 7 항에 있어서, 상기 미지의 시료는 생물학적 시료인 것인 목적 핵산 검출을 위한 정보제공방법.
제 8 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 객담, 세균, 정액, 세포 조직, 침, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시료인 것인 목적 핵산 검출을 위한 정보제공방법.
제 7 항에 있어서, 상기 목적 핵산은 질병 관련 표적유전자인 것인 목적 핵산 검출을 위한 정보제공방법.