CN105821144A - 一种用于检测甲状腺癌易感性相关的snp位点的引物及检测方法 - Google Patents

一种用于检测甲状腺癌易感性相关的snp位点的引物及检测方法 Download PDF

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李江林
张蓉
刘月
马明
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Abstract

本发明提供一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物，包括BRAF基因rs113488022位点引物、MSH2基因rs2303428位点引物、MLHI基因rs63750447位点引物、MBIP基因rs116909374位点引物和XRCC1基因rs1799782位点引物。采用该引物检测甲状腺癌易感性相关SNP位点的方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取DNA；(2)采用引物分别对目的片段序列进行PCR扩增；(3)对PCR产物进行纯化，测定其浓度和纯度；(4)纯化产物测序，并对SNP分型结果进行分析。该引物特异性好、灵敏度高、准确性好，检测方法简单，可预测受检者患甲状腺癌易感风险大小。

Description

一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法。
背景技术
甲状腺癌大约占所有恶性肿瘤的1％，是内分泌器官癌症中发病率最高的一种，占头颈部恶性肿瘤发病率的首位。据国际癌症学会资料统计，近年甲状腺癌在全球发病率逐年上升，每年增长约4％。我国的甲状腺癌发病率在近30年来，也由约10/100万上升到约30/100万～40/100万。甲状腺癌成为备受关注的肿瘤之一，也是内分泌系统肿瘤领域的研究热点。甲状腺癌和其它肿瘤一样，其发生、恶性程度的改变可能与众多癌基因、抑癌基因的突变、激活、失活、缺失等相关。在多基因遗传病中，遗传基础是由多基因构成的，它部分决定了个体发病的风险，同时环境对多基因遗传病产生较大影响，因此将遗传因素和环境因素共同作用决定个体患某种遗传病的风险称为遗传易感性，疾病的遗传易感性检测已经成为全世界科学研究的热点。基因作为遗传物质是影响遗传易感性的主要因素，因此对疾病相关基因进行易感风险检测可提前预知疾病的遗传易感性，其中采用单核苷酸多态性(SNP)作为基因组标志的关联分析方法较常见，是理想的遗传标志，它有遗传稳定性强，易于检测的特点。但可用于检测甲状腺癌易感风险的BRAF基因rs113488022位点、MSH2基因rs2303428位点、MLHI基因rs63750447位点MBIP基因rs116909374位点和XRCC1基因rs1799782位点及其各位点的引物并未见报道。
发明内容
针对于现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，可为甲状腺癌相关基因多态性检测提供可靠的结果，根据检测结果评估个体患甲状腺癌的风险几率，从而进行有效预防。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物，包括BRAF基因rs113488022位点的引物、MSH2基因rs2303428位点的引物、MLHI基因rs63750447位点的引物、MBIP基因rs116909374位点的引物和XRCC1基因rs1799782位点的引物；
其中，BRAF基因rs113488022位点的上下游引物序列分别为5′-ATCTCACCTCATCCTAACAC-3′(SEQIDNo：1)和3′-TGTGAATACTGGGAACTATG-5′(SEQIDNo：2)；
MSH2基因rs2303428位点的上下游引物序列分别为5′-GGTATATTTGTCATGGCTTC-3′(SEQIDNo：3)和3′-TCTCACAGGACAGAGACATA-5′(SEQIDNo：4)；
MLHI基因rs63750447位点的上下游引物序列分别为5′-
TCTTATTCTGAGTCTCTCCAC-3′(SEQIDNo：5)和
3′-AGAGAGAAGATGCAAGTGAT-5′(SEQIDNo：6)；
MBIP基因rs116909374位点的上下游引物序列分别为5′-
GATAAACTCAAGGACCAAAC-3′(SEQIDNo：7)和
3′-CCTCTTGAGAAGGAAGTAAA-5′(SEQIDNo：8)；
XRCC1基因rs1799782位点的上下游引物序列分别为5′-
CTATCTATGGGACACAGAAT-3′(SEQIDNo：9)和
3′-CCTAATTCGACAATACTGAC-5′(SEQIDNo：10)。
采用上述引物检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用所述的五种引物分别对目的片段进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果经过凝胶成像仪观察可见片段大小符合要求，无非特异条带；
(3)对步骤(2)PCR产物采用磁珠法进行纯化，将纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果经凝胶成像仪观察可见单一、明亮的条带，然后进行定量检测；
(4)将步骤(3)中的纯化产物采用ABI公司3730型测序仪测序，并对SNP分型结果进行分析。
本发明提供的一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，具有以下几种有益效果：
(1)本发明提供的引物可以实现特异性检测，具有稳定、特异性好的特点。
(2)本发明还提供了一种检测甲状腺癌易感性相关SNP位点的方法，该检测方法简单，通过使用特异性的引物，对目的片段序列进行PCR扩增，然后通过测序可准确的测定人甲状腺癌易感基因中的多态性位点基因型，其检测结果具有特异性好，灵敏度高，准确性好等优点，根据基因型结果预测受检者患甲状腺癌的风险几率，并针对性地采取有效预防措施进行预防，尽可能规避或者延迟疾病的发生，这对甲状腺癌的预测和预防具有重大意义。
附图说明
图1为不同受检者血液DNA样品在5种不同引物下的PCR扩增电泳图；其中，1、2、3孔为BRAF基因rs113488022位点的引物扩增出的条带；4、5、6孔为MSH2基因rs2303428位点的引物扩增出的条带；7、8、9孔为MLHI基因rs63750447位点的引物扩增出的条带；10、11、12孔为MBIP基因rs116909374位点的引物扩增出的条带；13、14、15孔为XRCC1基因rs1799782位点的引物扩增出的条带。
图2为BRAF基因rs113488022位点的测序峰图；
图3为MSH2基因rs2303428位点的测序峰图；
图4为MLHI基因rs63750447位点的测序峰图；
图5为MBIP基因rs116909374位点的测序峰图；
图6为XRCC1基因rs1799782位点的测序峰图；
具体实施方式
实施例1
1、样品的采集及其全基因组DNA的提取
用EDTA-K2抗凝管随机采集健康人的外周血3.0mL(随机选择3个受检者)，根据TIANampBloodDNAKit试剂盒要求提取受检者全基因组DNA，获得的全基因组DNA使用超微量蛋白核酸分析仪(柏精BioDropμLite)检测其浓度以及纯度，记录原始数据，将浓度和纯度都达到要求的DNA置于-20℃冰箱保存备用。
2、目的基因的PCR扩增、纯化和测序
用BRAF基因rs113488022位点的引物、MSH2基因rs2303428位点的引物、MLHI基因rs63750447位点的引物、MBIP基因rs116909374位点的引物和XRCC1基因rs1799782位点的引物分别对所提取的DNA进行目的片段PCR扩增，反应体系为50μL，引物情况见表1，PCR反应体系见表2所示；
表1引物名称、序列及产物长度
表2PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DNA a(100-150ng)
ddH2O 19-a
Primer F 3.0
Primer R 3.0
Primer STAR MAX 25.0
total 50.0
PCR扩增程序为：95℃预变性10min，94℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸30min，于4℃保存，过夜需放置-20℃冷冻；
PCR扩增结束后，取5μL扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，电泳图如图1所示；PCR扩增程序结束后对产物进行纯化：采用Mag-BindOligonucleotidePurificationKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；
上样测序：采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；用ABI公司3730型测序仪进行测序；
通过Chromas序列分析软件，将测序结果与标准序列进行比对，寻找SNP位点，通过分析SNP位点处碱基的类型，就可以得到SNP位点的基因型，SNP分型结果如图2、图3、图4、图5和图6所示。
结果分析：
由图1可知，每个基因的引物扩增的条件相同，即它们的TM值(DNA的解链温度)是固定的，不会随目的基因的序列不同而导致TM值不同，且扩增后的条带单一且明显，说明本发明提供的引物特异性好。
BRAF基因rs113488022位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，由图2可知，BRAF基因rs113488022位点的基因型为TT，说明该样品的该位点基因型为非易感基因型。
MSH2基因rs2303428位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，由图3可知，MSH2基因rs2303428位点的基因型为CC，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
MLHI基因rs63750447位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TA和AA；由图4可知，MLHI基因rs63750447位点的基因型为AA，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
MBIP基因rs116909374位点的非易感基因型为CC，易感基因型为CT和TT；由图5可知，MBIP基因rs116909374位点的基因型为CC，说明该样品的该位点基因型为非易感基因型。
XRCC1基因rs1799782位点的非易感基因型为CC，易感基因型为CT和TT；由图6可知，XRCC1基因rs1799782位点的基因型为CT，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
本发明定义的测序稳定性体现在测序结果上，测序结果直接与引物特异性、测序模板纯度、反应体系等有关，引物特异性好才会保证模板进行特异性的扩增，保证有可供测序的模板，同时模板纯度是测序准确性的保证，纯度不高导致测序峰位很低甚至不能判读的情况，纯度太高则会出现一段很高的峰位后突然降低的谱形，使测序长度变短；本发明提供的引物及方法保证了测序稳定，结果如图2-6，峰位一致，无干扰峰，无重叠峰，充分体现了测序稳定，因此，通过本发明提供的基因相关位点SNP的检测，判断其确切基因型，能够评估个体患甲状腺癌的风险几率，从而对加强甲状腺癌的预防具有重要的意义。

Claims (4)

1.一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述引物包括BRAF基因rs113488022位点的引物、MSH2基因rs2303428位点的引物、MLHI基因rs63750447位点的引物、MBIP基因rs116909374位点的引物和XRCC1基因rs1799782位点的引物；
其中，BRAF基因rs113488022位点的上下游引物序列分别为5′-ATCTCACCTCATCCTAACAC-3′和3′-TGTGAATACTGGGAACTATG-5′；
MSH2基因rs2303428位点的上下游引物序列分别为5′-GGTATATTTGTCATGGCTTC-3′和3′-TCTCACAGGACAGAGACATA-5′；
MLHI基因rs63750447位点的上下游引物序列分别为5′-TCTTATTCTGAGTCTCTCCAC-3′和3′-AGAGAGAAGATGCAAGTGAT-5′；
MBIP基因rs116909374位点的上下游引物序列分别为5′-GATAAACTCAAGGACCAAAC-3′和3′-CCTCTTGAGAAGGAAGTAAA-5′；
XRCC1基因rs1799782位点的上下游引物序列分别为5′-CTATCTATGGGACACAGAAT-3′和3′-CCTAATTCGACAATACTGAC-5′。
2.采用权利要求1所述的引物检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用所述的五种引物分别对五种目的片段序列进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(3)对步骤(2)PCR产物采用磁珠法进行纯化，将纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳并观察，然后进行定量检测；
(4)将步骤(3)中的纯化产物采用测序仪测序，并对SNP分型结果进行分析。
3.根据权利要求2所述的检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：PrimerSTARMax25μL、PrimerF3μL、PrimerR3μL、DNA模板100-150ng，用ddH2O补足体积至50μL。
4.根据权利要求2所述的检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min，94℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸30min，于4℃保存。
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