CN108977526A - 一种他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法及试剂盒。所述检测方法包括(1)针对CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因设计特异性引物；(2)利用特异性PCR扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段；(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段；(4)进行单碱基延伸反应；(5)进行脱盐纯化处理；(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因CYP3A4、CYP3A5、和MDR1的基因序列。上述他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，检测准确性高、实验可重性高、通量大、成本低。本发明还提供了一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒，包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因基因的特异性引物对。上述他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒，简化了实验流程，人员操作时间短、难度小，实验自动化程度高。

Description

一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法 及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法及试剂盒。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus)是从链霉菌属(streptomyces tsukubaensis)中分离出的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。他克莫司为一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2(L-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，近年来是肝、肾移植的一线用药。环孢素(Cyclosporin)，是七十年代后期瑞士的Borel发现的一种从霉菌酵解产物里提取的一种只含11个氨基酸的环形多肽，可以有效地特异性抑制淋巴细胞反应和增生。环孢菌素A除用于器官移植外，还可以用于治疗自身免疫疾。临床上常用免疫抑制剂他克莫司、环孢素A等药物避免器官移植的排斥反应，但此类药物最适剂量范围窄，临床应用中剂量不足将导致移植物的免疫排斥导致移植失败；剂量过高将造成严重的肝肾毒性等不良反应。目前临床常规给药方法是先给不同患者相同剂量的药物，然后通过实时检测患者服药后的血药浓度检测来调整剂量，但这种方案还是不能解决给药前根据患者个体差异确定给药剂量，还会造成移植失败或造成肝肾毒性等不良反应，无法实现个体化用药。
不同个体对于药物治疗反应的差异可由多种因素造成，并产生不同的后果。其中20％～95％药物处置和效应差异由遗传因素所致，涉及药物靶体基因、药物代谢酶基因、药物转运相关基因、DNA修复酶基因以及一些辅基合成酶基因等。这些基因的遗传变异是形成药物疗效产生个体差异的基础，其他影响因素包括年龄、性别、疾病以及环境因素等。药物代谢是药物在体内代谢和消除的主要决定因素。药物在体内代谢向两个方向发展：代谢解毒和代谢活化，其中大部分药物的代谢在肝脏进行。细胞色素P450(CYP)酶系是肝脏中主要的代谢酶之一，该酶活性存在明显个体差异，对不同个体的药效果、药物不良反应及药物毒性均产生重要影响。P450(CYP)是一类非常重要的药物代谢酶家族，CYP基因多态性以及对药物代谢的影响，也是药物遗传学研究的最早对象之一。其中CYP3A亚家族是人类最主要的CYP亚族，50％以上的药物由其介导进行I相代谢。此外，人MDR1基因所编码基因产物P-gp是ABC运输系统的重要一员，属于ABCB1家族。P-gp是一种跨膜蛋白，作为泵将细胞内的一些药物转运到细胞外，它影响许多药物的吸收和代谢，在药物代谢转运中有重要作用。迄今发现编码P-gp的基因MDRI有48个单核苷酸多态性，且多态性的分布存在明显的种族差异。MDR1基因的多态性导致个体间基因表达的不同，造成P-gp将药物从细胞内转运到细胞外能力的差异，从而造成了多药耐药性个体差异性，因此对药物的生物利用度也不同。现有技术中采用直接测序检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性，成本高、操作程序复杂、耗时；杂交芯片检测方法存在假阳性率高、退火温度要求精确，特异性不高的问题；Taqman法探针制备以及配套使用的仪器设备昂贵，准确性不高。上述方法的局限性限制了CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性检测的实际应用。
发明内容
基于此，有必要针对上述现有技术中的不足，提供一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法及试剂盒。
一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)针对CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因设计特异性引物；
(2)利用特异性PCR扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段；
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段；
(4)进行单碱基延伸反应；
(5)进行脱盐纯化处理；
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因CYP3A4、CYP3A5、和MDR1的基因序列。
上述他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，检测准确性高，同金标准Sanger测序法的结果相比，准确率超过99.7％，同时可以直接检测DNA质谱，能检测出样本中的三等位SNP位点的存在，实验可重性高。该方法在检测通量上面比起传统的SNP位点其他检测技术要大很多，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，成本折算后单位点成本比其他同类检测SNP位点的技术方法花费少，适合多种用户和批量检测的需求，是检测SNP位点的理想工具。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1、SEQ ID Nos：3，和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：4，包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5、SEQ ID Nos：7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：6、SEQ ID Nos：8，还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：9、SEQ IDNos：11、SEQ ID Nos：13，和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10、SEQ ID Nos：12、EQID Nos：14，
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1的序列为CTCCTGGGAAGTGGTGAGGA，
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：2的序列为TTACCCAATAAGGTGAGTGGA，
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：3的序列为GCTTGTTGGGATGAATTTCAAG，
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：4的序列为ACAACTCAATCAATGTTAC，
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5的序列为CGAATGCTCTACTGTCATTTCT，
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：6的序列为GTGTGACACACAGCAAGAG，
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：7的序列为CTGTCCGTGATTAGAAGATAACAC，
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：8的序列为AGAGCGAGAGGACGCTATTGC，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：9的序列为TCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGA，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10的序列为GGCATGTATGTTGGCCTCCT，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：11的序列为GAACAGTCAGTTCCTATATCCTGT，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：12的序列为CACAGCCACTGTTTCCAACC，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：13的序列为TCATTGCAATAGCAGGAGTTGT，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：14的序列为GATTAGAATACTTTACTCTACTT。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)中特异性PCR扩增的反应程序为：98℃热启动，10分钟；95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增40个循环；72℃终延伸，5分钟。
在其中一个实施例中，所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。
在其中一个实施例中，所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。
在其中一个实施例中，所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物，所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15、SEQ ID Nos：16，所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：17、SEQ ID Nos：18，所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：19、SEQ ID Nos：20、EQ ID Nos：21，
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15的序列为CTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA，
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：16的序列为AGCCATAGAGACAAGGGCA，
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：17的序列为CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA，
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：18的序列为CACAATTCACTTCACGTGGCA，
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：19的序列为CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT，
MDR1基因单碱基延伸反向引物SEQ ID Nos：20的序列为TCCTGGTAGATCTTGAAGGG，
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：21的序列为GAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGG。
在其中一个实施例中，所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为：95℃热启动，1分钟；95℃变性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；扩增40个循环；72℃终延伸，3分钟。
在其中一个实施例中，所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为：
(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ul ddH2O，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
本发明还提供了一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒，包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1、SEQ ID Nos：3，和两条CYP3A4基因的反向引物SEQID Nos：2、SEQ ID Nos：4，包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5、SEQ ID Nos：7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：6、SEQ ID Nos：8，还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：9、SEQ ID Nos：11、SEQ ID Nos：13，和三条MDR1基因的反向引物SEQ IDNos：10、SEQ ID Nos：12、EQ ID Nos：14，
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CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：7的序列为CTGTCCGTGATTAGAAGATAACAC，
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：8的序列为AGAGCGAGAGGACGCTATTGC，
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MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10的序列为GGCATGTATGTTGGCCTCCT，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：11的序列为GAACAGTCAGTTCCTATATCCTGT，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：12的序列为CACAGCCACTGTTTCCAACC，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：13的序列为TCATTGCAATAGCAGGAGTTGT，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：14的序列为GATTAGAATACTTTACTCTACTT。
上述他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒，简化了实验流程，人员操作时间短、难度小，实验自动化程度高。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物，所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15、SEQID Nos：16，所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：17、SEQ ID Nos：18，所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ IDNos：19、SEQ ID Nos：20、EQ ID Nos：21，
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15的序列为CTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA，
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：16的序列为AGCCATAGAGACAAGGGCA，
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：17的序列为CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA，
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：18的序列为CACAATTCACTTCACGTGGCA，
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：19的序列为CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT，
MDR1基因单碱基延伸反向引物SEQ ID Nos：20的序列为TCCTGGTAGATCTTGAAGGG，
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：21的序列为GAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGG。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果；
(1)本发明所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法在检测通量上面比起传统的SNP位点其他检测技术要大很多，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，是检测SNP位点的理想工具；
(2)本发明所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法检测准确性高，同金标准Sanger测序法的结果相比，准确率超过99.7％，同时可以直接检测DNA质谱，能检测出样本中的三等位SNP位点的存在，实验可重性高。
(3)本发明所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法低成本、性价比高，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，成本折算后单位点成本比其他同类检测SNP位点的技术方法花费少，适合多种用户和批量检测的需求。
(4)本发明所述的基因序列SNP位点核酸质谱检测方法实验流程简单、人员操作时间短、难度小，实验自动化程度高，数据处理软件处理方便，报告结果清晰易懂。
附图说明
图1为本发明一实施例的核酸质谱分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)针对CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因设计特异性引物；
(2)利用特异性PCR扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段；
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段；
(4)进行单碱基延伸反应；
(5)进行脱盐纯化处理；
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因CYP3A4、CYP3A5、和MDR1的基因序列。
本发明所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法主要基于PCR和单碱基延伸技术，其原理是首先通过PCR引物对含待检SNP的目标片段进行扩增，PCR结束后加入限制性内切酶去除反应液中的dNTP。然后在反应液中加入SNP延伸引物及ddNTP等相关组分并进行单碱基延伸反应，反应过程中SNP延伸引物可与待检测SNP的5’端序列结合并延伸一个碱基，根据不同SNP模板可得到不同的延伸产物。
优选地，所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1、SEQ ID Nos：3，和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：4，包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5、SEQ ID Nos：7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ IDNos：6、SEQ ID Nos：8，还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：9、SEQ ID Nos：11、SEQID Nos：13，和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10、SEQ ID Nos：12、EQ ID Nos：14，
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1的序列为CTCCTGGGAAGTGGTGAGGA，
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：2的序列为TTACCCAATAAGGTGAGTGGA，
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：3的序列为GCTTGTTGGGATGAATTTCAAG，
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：4的序列为ACAACTCAATCAATGTTAC，
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5的序列为CGAATGCTCTACTGTCATTTCT，
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：6的序列为GTGTGACACACAGCAAGAG，
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：7的序列为CTGTCCGTGATTAGAAGATAACAC，
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：8的序列为AGAGCGAGAGGACGCTATTGC，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：9的序列为TCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGA，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10的序列为GGCATGTATGTTGGCCTCCT，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：11的序列为GAACAGTCAGTTCCTATATCCTGT，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：12的序列为CACAGCCACTGTTTCCAACC，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：13的序列为TCATTGCAATAGCAGGAGTTGT，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：14的序列为GATTAGAATACTTTACTCTACTT。
相比于其他传统的检测CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因基因的技术手段，本发明经检测CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因基因区域的SNP位点，这一点就与传统的荧光定量PCR、或Sanger测序法较为不同。正如上述核酸质谱的原理，利用核酸质谱检测方法仅在目的区域SNP位点延伸一个具有多态性的碱基，不需要检测整个特异性扩增的基因片段。整体检测的通量、实验时间、反应成本、结果进度均较传统方法有很大的提升及优化，具有很好的市场应该价值。
优选地，所述步骤(2)中特异性PCR扩增的反应程序为：98℃热启动，10分钟；95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增40个循环；72℃终延伸，5分钟。
优选地，所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。
优选地，所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。
优选地，所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物，所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15、SEQ ID Nos：16，所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ IDNos：17、SEQ ID Nos：18，所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ IDNos：19、SEQ ID Nos：20、EQ ID Nos：21，
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15的序列为CTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA，
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：16的序列为AGCCATAGAGACAAGGGCA，
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：17的序列为CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA，
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：18的序列为CACAATTCACTTCACGTGGCA，
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：19的序列为CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT，
MDR1基因单碱基延伸反向引物SEQ ID Nos：20的序列为TCCTGGTAGATCTTGAAGGG，
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：21的序列为GAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGG。
优选地，所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为：95℃热启动，1分钟；95℃变性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；扩增40个循环；72℃终延伸，3分钟。
优选地，所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为：
(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ul ddH2O，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
核酸质谱检测时通过将反应液与树脂混合进行离子交换，用于去除液体中吸附于DNA片段上的K+、Na+、Mg2+等离子，防止其干扰质谱检测结果。
反应液与基质在靶板上结晶，进行质谱检测并得到图谱。由于各延伸产物分子量不同，因此可以在各自的分子量位置查看是否出现检测峰，然后判断该样品的SNP分型。核酸质谱平台特异性良好，使用国际通用标准品能达到30ppm，最低检测限为5ng基因组DNA,对比试验选择的金标准验证技术为Sanger测序技术和同类型获批的检测产品，符合性均为100％。
一种HLA-B*5801基因的检测试剂盒，包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1、SEQ IDNos：3，和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：4，包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5、SEQ ID Nos：7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：6、SEQID Nos：8，还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：9、SEQ ID Nos：11、SEQ ID Nos：13，和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10、SEQ ID Nos：12、EQ ID Nos：14，
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1的序列为CTCCTGGGAAGTGGTGAGGA，
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：2的序列为TTACCCAATAAGGTGAGTGGA，
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：3的序列为GCTTGTTGGGATGAATTTCAAG，
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：4的序列为ACAACTCAATCAATGTTAC，
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5的序列为CGAATGCTCTACTGTCATTTCT，
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：6的序列为GTGTGACACACAGCAAGAG，
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：7的序列为CTGTCCGTGATTAGAAGATAACAC，
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：8的序列为AGAGCGAGAGGACGCTATTGC，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：9的序列为TCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGA，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10的序列为GGCATGTATGTTGGCCTCCT，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：11的序列为GAACAGTCAGTTCCTATATCCTGT，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：12的序列为CACAGCCACTGTTTCCAACC，
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：13的序列为TCATTGCAATAGCAGGAGTTGT，
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：14的序列为GATTAGAATACTTTACTCTACTT。
优选地，所述试剂盒还包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物，所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15、SEQ ID Nos：16，所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：17、SEQ IDNos：18，所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：19、SEQ IDNos：20、EQ ID Nos：21，
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15的序列为CTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA，
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：16的序列为AGCCATAGAGACAAGGGCA，
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：17的序列为CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA，
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos：18的序列为CACAATTCACTTCACGTGGCA，
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：19的序列为CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT，
MDR1基因单碱基延伸反向引物SEQ ID Nos：20的序列为TCCTGGTAGATCTTGAAGGG，
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：21的序列为GAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGG。
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1：利用核酸质谱检测方法对人CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因SNP位点的检测
1.人基因组DNA提取
(1)在生物安全柜中对病人的血液样本进行基因组DNA提取操作。采用Blood&CellCulture DNA Mini Kit(Qiagen Cat No:13323)进行提取实验。
(2)引物设计
针对人CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因进行SNP位点引物设计，分别针对这个SNP设计特异性的PCR引物和单碱基延伸引物，所设计的PCR引物序列如表1所示。
表1
(3)特异性PCR反应
利用特异性PCR技术扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段，按照表2的反应体系配制扩增反应，反应体系配制完成后按照表3的反应程序进行扩增。
表2
5ul体系/ul
10*PCR buffer 0.5
2.5mmol/L MgCl2 0.2
2.5mmol/L Dntp 0.25
CYP3A4(rs2242480)F(50uM) 0.15
CYP3A4(rs2242480)R(50uM) 0.15
CYP3A4(rs2740574)F(50uM) 0.15
CYP3A4(rs2740574)R(50uM) 0.15
CYP4A5(rs776746)F((50uM) 0.2
CYP4A5(rs776746)R(50uM) 0.2
CYP4A5(rs4646450)F(50uM) 0.15
CYP4A5(rs4646450)R(50uM) 0.15
MDR1(rs1045642)F(50uM) 0.18
MDR1(rs1045642)R(50uM) 0.18
MDR1(rs1128503)F(50uM) 0.16
MDR1(rs1128503)R(50uM) 0.16
MDR1(rs2032582)F(50uM) 0.15
MDR1(rs2032582)R(50uM) 0.15
Hot start PCR Taq(5U/ul) 0.5
DNA(10ng/ul) 1
ddH2O 0.27
表3
(4)碱式磷酸酶消化处理
利用虾碱式磷酸酶对多重PCR反应产物进行消化，去除体系内多余的dNTP。每个反应体系中加入0.5U的碱式磷酸酶，用配套的10*Tris-Buffer调节缓冲液浓度，每个反应加入10*Tris-Buffer 0.5ul。然后在预热的水浴锅内进行37℃消化处理45分钟，然后85℃加热变性5分钟，最后冰浴10分钟。
(5)进行单碱基延伸反应
配制单碱基延伸反应体系，按照表4的反应体系配置。取2ul配制好的单碱基延伸反应的反应液加入到前步消化反应的体系内，然后按照表5的反应程序进行单碱基延伸反应。
表4
5ul/ul
10*iPLEX buffer 0.5
iPLEX ddNTP 0.2
iPLEX延伸引物CYP3A4(rs2242480)E(25uM) 0.2
iPLEX延伸引物CYP3A4(rs2740574)E(25uM) 0.2
iPLEX延伸引物CYP4A5(rs776746)E(25uM) 0.2
iPLEX延伸引物CYP4A5(rs4646450)E(25uM) 0.2
iPLEX延伸引物MDR1(rs1045642)E(25uM) 0.2
iPLEX延伸引物MDR1(rs1128503)E(25uM) 0.2
iPLEX延伸引物MDR1(rs2032582)E(25uM) 0.2
iPLEX单碱基延伸酶 0.2
10*Tris Buffer 2.7
表5
(6)产物脱盐纯化及核酸质谱上机前处理
(a)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；
(b)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ul ddH2O，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(c)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(d)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
(7)核酸质谱仪上机及软件数据分析
按照仪器的操作规程进行上机检测操作，待样品检测完毕，对检测结果进行软件处理分析，最终得到检测结果，核酸质谱分析图具体见图1。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)针对CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因设计特异性引物；
(2)利用特异性PCR扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段；
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段；
(4)进行单碱基延伸反应；
(5)进行脱盐纯化处理；
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因CYP3A4、CYP3A5、和MDR1的基因序列。
2.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1、SEQ IDNos：3，和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：4，包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5、SEQ ID Nos：7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：6、SEQID Nos：8，还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos：9、SEQ ID Nos：11、SEQ ID Nos：13，和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10、SEQ ID Nos：12、EQ ID Nos：14。
3.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中特异性PCR扩增的反应程序为：98℃热启动，10分钟；95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增40个循环；72℃终延伸，5分钟。
4.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。
5.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。
6.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物，所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15、SEQ IDNos：16，所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：17、SEQ ID Nos：18，所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：19、SEQ ID Nos：20、EQ ID Nos：21。
7.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为：95℃热启动，1分钟；95℃变性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；扩增40个循环；72℃终延伸，3分钟。
8.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为：
(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ul ddH2O，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
9.一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒，其特征在于，包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos：1、SEQ ID Nos：3，和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：4，包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos：5、SEQ ID Nos：7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos：6、SEQ ID Nos：8，还包含三条MDR1基因的正向引物SEQID Nos：9、SEQ ID Nos：11、SEQ ID Nos：13，和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos：10、SEQ ID Nos：12、EQ ID Nos：14。
10.根据权利要求9所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物，所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：15、SEQ ID Nos：16，所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos：17、SEQ IDNos：18，所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ ID Nos：19、SEQ IDNos：20、EQ ID Nos：21。
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