CN108977526A - 一种他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法及试剂盒。所述检测方法包括(1)针对CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因设计特异性引物;(2)利用特异性PCR扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段;(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段;(4)进行单碱基延伸反应;(5)进行脱盐纯化处理;(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因CYP3A4、CYP3A5、和MDR1的基因序列。上述他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,检测准确性高、实验可重性高、通量大、成本低。本发明还提供了一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒,包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因基因的特异性引物对。上述他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒,简化了实验流程,人员操作时间短、难度小,实验自动化程度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,特别是涉及一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法及试剂盒。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus)是从链霉菌属(streptomyces tsukubaensis)中分离出的发酵产物,其化学结构属23元大环内酯类抗生素。他克莫司为一种强力的新型免疫抑制剂,主要通过抑制白介素-2(L-2)的释放,全面抑制T淋巴细胞的作用,近年来是肝、肾移植的一线用药。环孢素(Cyclosporin),是七十年代后期瑞士的Borel发现的一种从霉菌酵解产物里提取的一种只含11个氨基酸的环形多肽,可以有效地特异性抑制淋巴细胞反应和增生。环孢菌素A除用于器官移植外,还可以用于治疗自身免疫疾。临床上常用免疫抑制剂他克莫司、环孢素A等药物避免器官移植的排斥反应,但此类药物最适剂量范围窄,临床应用中剂量不足将导致移植物的免疫排斥导致移植失败;剂量过高将造成严重的肝肾毒性等不良反应。目前临床常规给药方法是先给不同患者相同剂量的药物,然后通过实时检测患者服药后的血药浓度检测来调整剂量,但这种方案还是不能解决给药前根据患者个体差异确定给药剂量,还会造成移植失败或造成肝肾毒性等不良反应,无法实现个体化用药。
不同个体对于药物治疗反应的差异可由多种因素造成,并产生不同的后果。其中20%~95%药物处置和效应差异由遗传因素所致,涉及药物靶体基因、药物代谢酶基因、药物转运相关基因、DNA修复酶基因以及一些辅基合成酶基因等。这些基因的遗传变异是形成药物疗效产生个体差异的基础,其他影响因素包括年龄、性别、疾病以及环境因素等。药物代谢是药物在体内代谢和消除的主要决定因素。药物在体内代谢向两个方向发展:代谢解毒和代谢活化,其中大部分药物的代谢在肝脏进行。细胞色素P450(CYP)酶系是肝脏中主要的代谢酶之一,该酶活性存在明显个体差异,对不同个体的药效果、药物不良反应及药物毒性均产生重要影响。P450(CYP)是一类非常重要的药物代谢酶家族,CYP基因多态性以及对药物代谢的影响,也是药物遗传学研究的最早对象之一。其中CYP3A亚家族是人类最主要的CYP亚族,50%以上的药物由其介导进行I相代谢。此外,人MDR1基因所编码基因产物P-gp是ABC运输系统的重要一员,属于ABCB1家族。P-gp是一种跨膜蛋白,作为泵将细胞内的一些药物转运到细胞外,它影响许多药物的吸收和代谢,在药物代谢转运中有重要作用。迄今发现编码P-gp的基因MDRI有48个单核苷酸多态性,且多态性的分布存在明显的种族差异。MDR1基因的多态性导致个体间基因表达的不同,造成P-gp将药物从细胞内转运到细胞外能力的差异,从而造成了多药耐药性个体差异性,因此对药物的生物利用度也不同。现有技术中采用直接测序检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性,成本高、操作程序复杂、耗时;杂交芯片检测方法存在假阳性率高、退火温度要求精确,特异性不高的问题;Taqman法探针制备以及配套使用的仪器设备昂贵,准确性不高。上述方法的局限性限制了CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性检测的实际应用。
发明内容
基于此,有必要针对上述现有技术中的不足,提供一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法及试剂盒。
一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,所述检测方法包括如下步骤:
(1)针对CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因设计特异性引物;
(2)利用特异性PCR扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段;
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段;
(4)进行单碱基延伸反应;
(5)进行脱盐纯化处理;
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因CYP3A4、CYP3A5、和MDR1的基因序列。
上述他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,检测准确性高,同金标准Sanger测序法的结果相比,准确率超过99.7%,同时可以直接检测DNA质谱,能检测出样本中的三等位SNP位点的存在,实验可重性高。该方法在检测通量上面比起传统的SNP位点其他检测技术要大很多,一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验,成本折算后单位点成本比其他同类检测SNP位点的技术方法花费少,适合多种用户和批量检测的需求,是检测SNP位点的理想工具。
在其中一个实施例中,所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对,所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1、SEQ ID Nos:3,和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2、SEQ ID Nos:4,包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5、SEQ ID Nos:7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6、SEQ ID Nos:8,还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9、SEQ IDNos:11、SEQ ID Nos:13,和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10、SEQ ID Nos:12、EQID Nos:14,
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1的序列为CTCCTGGGAAGTGGTGAGGA,
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2的序列为TTACCCAATAAGGTGAGTGGA,
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:3的序列为GCTTGTTGGGATGAATTTCAAG,
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:4的序列为ACAACTCAATCAATGTTAC,
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5的序列为CGAATGCTCTACTGTCATTTCT,
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6的序列为GTGTGACACACAGCAAGAG,
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:7的序列为CTGTCCGTGATTAGAAGATAACAC,
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:8的序列为AGAGCGAGAGGACGCTATTGC,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9的序列为TCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGA,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10的序列为GGCATGTATGTTGGCCTCCT,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:11的序列为GAACAGTCAGTTCCTATATCCTGT,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:12的序列为CACAGCCACTGTTTCCAACC,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:13的序列为TCATTGCAATAGCAGGAGTTGT,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:14的序列为GATTAGAATACTTTACTCTACTT。
在其中一个实施例中,所述步骤(2)中特异性PCR扩增的反应程序为:98℃热启动,10分钟;95℃变性,30秒;55℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增40个循环;72℃终延伸,5分钟。
在其中一个实施例中,所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为:37℃消化处理45分钟,85℃加热变性5分钟,冰浴10分钟。
在其中一个实施例中,所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。
在其中一个实施例中,所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物,所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15、SEQ ID Nos:16,所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:17、SEQ ID Nos:18,所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:19、SEQ ID Nos:20、EQ ID Nos:21,
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15的序列为CTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA,
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:16的序列为AGCCATAGAGACAAGGGCA,
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:17的序列为CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA,
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:18的序列为CACAATTCACTTCACGTGGCA,
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:19的序列为CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT,
MDR1基因单碱基延伸反向引物SEQ ID Nos:20的序列为TCCTGGTAGATCTTGAAGGG,
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:21的序列为GAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGG。
在其中一个实施例中,所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为:95℃热启动,1分钟;95℃变性,5秒;56℃退火,5秒;80℃延伸,5秒;扩增40个循环;72℃终延伸,3分钟。
在其中一个实施例中,所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为:
(1)在树脂板上铺好待用树脂,风干5-10分钟;
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本,补充25ul ddH2O,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(3)除去封口膜,将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定,然后将样本板和树脂板一起翻转,使风干的树脂落入样本板的反应孔内,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟,再3000转/分钟离心5分钟,然后点样上机,用核酸质谱仪进行检测。
本发明还提供了一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒,包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对,所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1、SEQ ID Nos:3,和两条CYP3A4基因的反向引物SEQID Nos:2、SEQ ID Nos:4,包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5、SEQ ID Nos:7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6、SEQ ID Nos:8,还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9、SEQ ID Nos:11、SEQ ID Nos:13,和三条MDR1基因的反向引物SEQ IDNos:10、SEQ ID Nos:12、EQ ID Nos:14,
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1的序列为CTCCTGGGAAGTGGTGAGGA,
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2的序列为TTACCCAATAAGGTGAGTGGA,
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:3的序列为GCTTGTTGGGATGAATTTCAAG,
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:4的序列为ACAACTCAATCAATGTTAC,
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5的序列为CGAATGCTCTACTGTCATTTCT,
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6的序列为GTGTGACACACAGCAAGAG,
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:7的序列为CTGTCCGTGATTAGAAGATAACAC,
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:8的序列为AGAGCGAGAGGACGCTATTGC,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9的序列为TCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGA,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10的序列为GGCATGTATGTTGGCCTCCT,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:11的序列为GAACAGTCAGTTCCTATATCCTGT,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:12的序列为CACAGCCACTGTTTCCAACC,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:13的序列为TCATTGCAATAGCAGGAGTTGT,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:14的序列为GATTAGAATACTTTACTCTACTT。
上述他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒,简化了实验流程,人员操作时间短、难度小,实验自动化程度高。
在其中一个实施例中,所述试剂盒还包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物,所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15、SEQID Nos:16,所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:17、SEQ ID Nos:18,所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ IDNos:19、SEQ ID Nos:20、EQ ID Nos:21,
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15的序列为CTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA,
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:16的序列为AGCCATAGAGACAAGGGCA,
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:17的序列为CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA,
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:18的序列为CACAATTCACTTCACGTGGCA,
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:19的序列为CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT,
MDR1基因单碱基延伸反向引物SEQ ID Nos:20的序列为TCCTGGTAGATCTTGAAGGG,
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:21的序列为GAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGG。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果;
(1)本发明所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法在检测通量上面比起传统的SNP位点其他检测技术要大很多,一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验,是检测SNP位点的理想工具;
(2)本发明所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法检测准确性高,同金标准Sanger测序法的结果相比,准确率超过99.7%,同时可以直接检测DNA质谱,能检测出样本中的三等位SNP位点的存在,实验可重性高。
(3)本发明所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法低成本、性价比高,一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验,成本折算后单位点成本比其他同类检测SNP位点的技术方法花费少,适合多种用户和批量检测的需求。
(4)本发明所述的基因序列SNP位点核酸质谱检测方法实验流程简单、人员操作时间短、难度小,实验自动化程度高,数据处理软件处理方便,报告结果清晰易懂。
附图说明
图1为本发明一实施例的核酸质谱分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,所述检测方法包括如下步骤:
(1)针对CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因设计特异性引物;
(2)利用特异性PCR扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段;
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段;
(4)进行单碱基延伸反应;
(5)进行脱盐纯化处理;
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因CYP3A4、CYP3A5、和MDR1的基因序列。
本发明所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法主要基于PCR和单碱基延伸技术,其原理是首先通过PCR引物对含待检SNP的目标片段进行扩增,PCR结束后加入限制性内切酶去除反应液中的dNTP。然后在反应液中加入SNP延伸引物及ddNTP等相关组分并进行单碱基延伸反应,反应过程中SNP延伸引物可与待检测SNP的5’端序列结合并延伸一个碱基,根据不同SNP模板可得到不同的延伸产物。
优选地,所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对,所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1、SEQ ID Nos:3,和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2、SEQ ID Nos:4,包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5、SEQ ID Nos:7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ IDNos:6、SEQ ID Nos:8,还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9、SEQ ID Nos:11、SEQID Nos:13,和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10、SEQ ID Nos:12、EQ ID Nos:14,
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1的序列为CTCCTGGGAAGTGGTGAGGA,
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2的序列为TTACCCAATAAGGTGAGTGGA,
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:3的序列为GCTTGTTGGGATGAATTTCAAG,
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:4的序列为ACAACTCAATCAATGTTAC,
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5的序列为CGAATGCTCTACTGTCATTTCT,
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6的序列为GTGTGACACACAGCAAGAG,
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:7的序列为CTGTCCGTGATTAGAAGATAACAC,
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:8的序列为AGAGCGAGAGGACGCTATTGC,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9的序列为TCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGA,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10的序列为GGCATGTATGTTGGCCTCCT,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:11的序列为GAACAGTCAGTTCCTATATCCTGT,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:12的序列为CACAGCCACTGTTTCCAACC,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:13的序列为TCATTGCAATAGCAGGAGTTGT,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:14的序列为GATTAGAATACTTTACTCTACTT。
相比于其他传统的检测CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因基因的技术手段,本发明经检测CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因基因区域的SNP位点,这一点就与传统的荧光定量PCR、或Sanger测序法较为不同。正如上述核酸质谱的原理,利用核酸质谱检测方法仅在目的区域SNP位点延伸一个具有多态性的碱基,不需要检测整个特异性扩增的基因片段。整体检测的通量、实验时间、反应成本、结果进度均较传统方法有很大的提升及优化,具有很好的市场应该价值。
优选地,所述步骤(2)中特异性PCR扩增的反应程序为:98℃热启动,10分钟;95℃变性,30秒;55℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增40个循环;72℃终延伸,5分钟。
优选地,所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为:37℃消化处理45分钟,85℃加热变性5分钟,冰浴10分钟。
优选地,所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。
优选地,所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物,所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15、SEQ ID Nos:16,所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ IDNos:17、SEQ ID Nos:18,所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ IDNos:19、SEQ ID Nos:20、EQ ID Nos:21,
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15的序列为CTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA,
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:16的序列为AGCCATAGAGACAAGGGCA,
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:17的序列为CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA,
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:18的序列为CACAATTCACTTCACGTGGCA,
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:19的序列为CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT,
MDR1基因单碱基延伸反向引物SEQ ID Nos:20的序列为TCCTGGTAGATCTTGAAGGG,
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:21的序列为GAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGG。
优选地,所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为:95℃热启动,1分钟;95℃变性,5秒;56℃退火,5秒;80℃延伸,5秒;扩增40个循环;72℃终延伸,3分钟。
优选地,所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为:
(1)在树脂板上铺好待用树脂,风干5-10分钟;
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本,补充25ul ddH2O,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(3)除去封口膜,将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定,然后将样本板和树脂板一起翻转,使风干的树脂落入样本板的反应孔内,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟,再3000转/分钟离心5分钟,然后点样上机,用核酸质谱仪进行检测。
核酸质谱检测时通过将反应液与树脂混合进行离子交换,用于去除液体中吸附于DNA片段上的K+、Na+、Mg2+等离子,防止其干扰质谱检测结果。
反应液与基质在靶板上结晶,进行质谱检测并得到图谱。由于各延伸产物分子量不同,因此可以在各自的分子量位置查看是否出现检测峰,然后判断该样品的SNP分型。核酸质谱平台特异性良好,使用国际通用标准品能达到30ppm,最低检测限为5ng基因组DNA,对比试验选择的金标准验证技术为Sanger测序技术和同类型获批的检测产品,符合性均为100%。
一种HLA-B*5801基因的检测试剂盒,包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对,所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1、SEQ IDNos:3,和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2、SEQ ID Nos:4,包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5、SEQ ID Nos:7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6、SEQID Nos:8,还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9、SEQ ID Nos:11、SEQ ID Nos:13,和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10、SEQ ID Nos:12、EQ ID Nos:14,
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1的序列为CTCCTGGGAAGTGGTGAGGA,
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2的序列为TTACCCAATAAGGTGAGTGGA,
CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:3的序列为GCTTGTTGGGATGAATTTCAAG,
CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:4的序列为ACAACTCAATCAATGTTAC,
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5的序列为CGAATGCTCTACTGTCATTTCT,
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6的序列为GTGTGACACACAGCAAGAG,
CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:7的序列为CTGTCCGTGATTAGAAGATAACAC,
CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:8的序列为AGAGCGAGAGGACGCTATTGC,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9的序列为TCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGA,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10的序列为GGCATGTATGTTGGCCTCCT,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:11的序列为GAACAGTCAGTTCCTATATCCTGT,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:12的序列为CACAGCCACTGTTTCCAACC,
MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:13的序列为TCATTGCAATAGCAGGAGTTGT,
MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:14的序列为GATTAGAATACTTTACTCTACTT。
优选地,所述试剂盒还包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物,所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15、SEQ ID Nos:16,所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:17、SEQ IDNos:18,所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:19、SEQ IDNos:20、EQ ID Nos:21,
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15的序列为CTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA,
CYP3A4基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:16的序列为AGCCATAGAGACAAGGGCA,
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:17的序列为CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA,
CYP3A5基因单碱基延伸引物SEQ ID Nos:18的序列为CACAATTCACTTCACGTGGCA,
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:19的序列为CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT,
MDR1基因单碱基延伸反向引物SEQ ID Nos:20的序列为TCCTGGTAGATCTTGAAGGG,
MDR1基因单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:21的序列为GAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGG。
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1:利用核酸质谱检测方法对人CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因SNP位点的检测
1.人基因组DNA提取
(1)在生物安全柜中对病人的血液样本进行基因组DNA提取操作。采用Blood&CellCulture DNA Mini Kit(Qiagen Cat No:13323)进行提取实验。
(2)引物设计
针对人CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因进行SNP位点引物设计,分别针对这个SNP设计特异性的PCR引物和单碱基延伸引物,所设计的PCR引物序列如表1所示。
表1
(3)特异性PCR反应
利用特异性PCR技术扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段,按照表2的反应体系配制扩增反应,反应体系配制完成后按照表3的反应程序进行扩增。
表2
5ul体系/ul | |
10*PCR buffer | 0.5 |
2.5mmol/L MgCl2 | 0.2 |
2.5mmol/L Dntp | 0.25 |
CYP3A4(rs2242480)F(50uM) | 0.15 |
CYP3A4(rs2242480)R(50uM) | 0.15 |
CYP3A4(rs2740574)F(50uM) | 0.15 |
CYP3A4(rs2740574)R(50uM) | 0.15 |
CYP4A5(rs776746)F((50uM) | 0.2 |
CYP4A5(rs776746)R(50uM) | 0.2 |
CYP4A5(rs4646450)F(50uM) | 0.15 |
CYP4A5(rs4646450)R(50uM) | 0.15 |
MDR1(rs1045642)F(50uM) | 0.18 |
MDR1(rs1045642)R(50uM) | 0.18 |
MDR1(rs1128503)F(50uM) | 0.16 |
MDR1(rs1128503)R(50uM) | 0.16 |
MDR1(rs2032582)F(50uM) | 0.15 |
MDR1(rs2032582)R(50uM) | 0.15 |
Hot start PCR Taq(5U/ul) | 0.5 |
DNA(10ng/ul) | 1 |
ddH2O | 0.27 |
表3
(4)碱式磷酸酶消化处理
利用虾碱式磷酸酶对多重PCR反应产物进行消化,去除体系内多余的dNTP。每个反应体系中加入0.5U的碱式磷酸酶,用配套的10*Tris-Buffer调节缓冲液浓度,每个反应加入10*Tris-Buffer 0.5ul。然后在预热的水浴锅内进行37℃消化处理45分钟,然后85℃加热变性5分钟,最后冰浴10分钟。
(5)进行单碱基延伸反应
配制单碱基延伸反应体系,按照表4的反应体系配置。取2ul配制好的单碱基延伸反应的反应液加入到前步消化反应的体系内,然后按照表5的反应程序进行单碱基延伸反应。
表4
5ul/ul | |
10*iPLEX buffer | 0.5 |
iPLEX ddNTP | 0.2 |
iPLEX延伸引物CYP3A4(rs2242480)E(25uM) | 0.2 |
iPLEX延伸引物CYP3A4(rs2740574)E(25uM) | 0.2 |
iPLEX延伸引物CYP4A5(rs776746)E(25uM) | 0.2 |
iPLEX延伸引物CYP4A5(rs4646450)E(25uM) | 0.2 |
iPLEX延伸引物MDR1(rs1045642)E(25uM) | 0.2 |
iPLEX延伸引物MDR1(rs1128503)E(25uM) | 0.2 |
iPLEX延伸引物MDR1(rs2032582)E(25uM) | 0.2 |
iPLEX单碱基延伸酶 | 0.2 |
10*Tris Buffer | 2.7 |
表5
(6)产物脱盐纯化及核酸质谱上机前处理
(a)在树脂板上铺好待用树脂,风干5-10分钟;
(b)向样本板的反应孔中加入待测的样本,补充25ul ddH2O,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(c)除去封口膜,将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定,然后将样本板和树脂板一起翻转,使风干的树脂落入样本板的反应孔内,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(d)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟,再3000转/分钟离心5分钟,然后点样上机,用核酸质谱仪进行检测。
(7)核酸质谱仪上机及软件数据分析
按照仪器的操作规程进行上机检测操作,待样品检测完毕,对检测结果进行软件处理分析,最终得到检测结果,核酸质谱分析图具体见图1。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括如下步骤:
(1)针对CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因设计特异性引物;
(2)利用特异性PCR扩增出包含CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的目的片段;
(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段;
(4)进行单碱基延伸反应;
(5)进行脱盐纯化处理;
(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因CYP3A4、CYP3A5、和MDR1的基因序列。
2.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对,所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1、SEQ IDNos:3,和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2、SEQ ID Nos:4,包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5、SEQ ID Nos:7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6、SEQID Nos:8,还包含三条MDR1基因的正向引物SEQ ID Nos:9、SEQ ID Nos:11、SEQ ID Nos:13,和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10、SEQ ID Nos:12、EQ ID Nos:14。
3.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中特异性PCR扩增的反应程序为:98℃热启动,10分钟;95℃变性,30秒;55℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增40个循环;72℃终延伸,5分钟。
4.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,其特征在于,所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为:37℃消化处理45分钟,85℃加热变性5分钟,冰浴10分钟。
5.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,其特征在于,所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。
6.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,其特征在于,所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物,所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15、SEQ IDNos:16,所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:17、SEQ ID Nos:18,所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:19、SEQ ID Nos:20、EQ ID Nos:21。
7.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,其特征在于,所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为:95℃热启动,1分钟;95℃变性,5秒;56℃退火,5秒;80℃延伸,5秒;扩增40个循环;72℃终延伸,3分钟。
8.根据权利要求1所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测方法,其特征在于,所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为:
(1)在树脂板上铺好待用树脂,风干5-10分钟;
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本,补充25ul ddH2O,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(3)除去封口膜,将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定,然后将样本板和树脂板一起翻转,使风干的树脂落入样本板的反应孔内,用封口膜密封,3000转/分钟瞬时离心;
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟,再3000转/分钟离心5分钟,然后点样上机,用核酸质谱仪进行检测。
9.一种他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒,其特征在于,包括用于扩增CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的特异性引物对,所述特异性引物对包含两条CYP3A4基因的正向引物SEQ ID Nos:1、SEQ ID Nos:3,和两条CYP3A4基因的反向引物SEQ ID Nos:2、SEQ ID Nos:4,包含两条CYP3A5基因的正向引物SEQ ID Nos:5、SEQ ID Nos:7和两条CYP3A5基因的反向引物SEQ ID Nos:6、SEQ ID Nos:8,还包含三条MDR1基因的正向引物SEQID Nos:9、SEQ ID Nos:11、SEQ ID Nos:13,和三条MDR1基因的反向引物SEQ ID Nos:10、SEQ ID Nos:12、EQ ID Nos:14。
10.根据权利要求9所述的他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括CYP3A4、CYP3A5、和MDR1基因的单碱基延伸引物,所述CYP3A4基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:15、SEQ ID Nos:16,所述CYP3A5基因的单碱基延伸引物包含两条单碱基延伸正向引物SEQ ID Nos:17、SEQ IDNos:18,所述MDR1基因的单碱基延伸引物包含三条单碱基延伸引物SEQ ID Nos:19、SEQ IDNos:20、EQ ID Nos:21。
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