CN114410768A

CN114410768A - 检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN114410768A
Application number: CN202111582590.XA
Authority: CN
Inventors: 倪世明; 郝宇; 丘力功; 陈宋彬; 李慧贤; 赵海莲
Original assignee: Guangzhou Baiyushan Baidi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Baiyushan Baidi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-04-29

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，公开了检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用。该试剂，包含：检测cyp2c19*2基因的探针和/或用于扩增cyp2c19*2基因的引物对；其中，检测cyp2c19*2基因的探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰，锁核酸2’‑O，4’‑C位通过不同的缩水作用构成的亚甲基桥形成了刚性的缩合结构，增加了核酸磷酸骨架的局部结构的稳定性；同时，锁核酸修饰的核酸应用于荧光定量PCR探针检测时，可有效提高检测反应退火温度并同时缩短检测所需探针的长度，并且较普通探针具有灵敏度更高，特异性更强等优势。

Description

检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用。

背景技术

在多种治疗手段中，相关药品在正常使用及推荐用量下依然会出现相当数量与用药目的无关的不良反应，对用药患者极易造成二次伤害，故具有严重危害性。

对于大多数药物而言，其显性副作用已得到广泛重视，但隐性副作用如肝、肾慢性伤害，心、肺功能慢性衰减等尚未引起足够关注。另一方面，由药物引起对身体的隐性损害通常持续较久且其前、中期难以检测出相应症状。因此，当患者出现症状至医院就诊时，其伤害大多已经是不可逆的严重损伤。一项针对上海市17家二甲以上综合医院的调查显示，急性肾功能衰竭病因约1/3为药物使用。

研究表明，年龄、性别、体重与伴随疾病等原因均可引起药物反应个体差异。另外，遗传因素，基因突变作为造成药物作用个体差异更加重要的成因却尚未得到足够重视。基于此，自2006年起，用于个体化用药指导的基因检测产品包括cyp2c9，cyp2d6等系列的药物代谢酶基因多态性检测试剂已于多国获批并上市使用。

进一步，国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心于2019年11月12日发布了《CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂注册技术审查指导原则》，其将CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂的主要应用范围做出说明，即①正在服用或将要服用氯吡格雷进行抗血小板治疗的冠心病患者；②主要为急性冠脉综合征(ACS)且进行经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的患者；③PCI术后血栓高危且计划调整P2Y12抑制剂治疗方案的患者；④缺血高风险或出血高风险患者等。对于上述需将氯吡格雷作为主要治疗药物的患者，应接受外周静脉全血或口腔拭子等样本基因组DNA中cyp2c19基因多态性的体外定性检测用于氯吡格雷的用药指导。

除此之外，关于以奥美拉唑为代表的质子泵抑制剂药物，有研究报道，CYP2C19酶弱代谢者、中等代谢者和强代谢者药物的代谢剂量分别为平均剂量的60％、100％和110％。另外，对于抗抑郁药如艾司西酞普兰等，临床药物基因组学实施联盟(CPIC)与2016年发布了基于cyp2c19和cyp2d6基因型与三环类抗抑郁药物剂量的指南。指出对于携带cyp2c19基因突变患者服用常规剂量药物时，血药水平易于出现超治疗窗的情况，最终可导致毒性增加或治疗失败。尤其是，CYP2C19酶慢代谢型患者建议起始剂量降低50％，并密切监测患者血药浓度调整剂量。同时，另有研究数据表明，关于抗癫痫药如丙戊酸及苯妥英钠等，cyp2c19野生基因型携带者的血药浓度平均值明显低于cyp2c19基因突变等位基因携带者，CYP2C19酶代谢活性降低导致丙戊酸、苯妥英钠代谢减慢，此时应减少药物剂量，以减少药物不良反应的发生和药物资源的浪费。

目前关于cyp2c19基因单核苷酸多态性的检测方法主要包括基因测序法、普通荧光定量PCR法、基因芯片检测法等等。然而上述方法均具有操作复杂，检测周期长，所需检测的仪器设备复杂等缺点，且检测结果特异性及灵敏度均较低。

发明内容

本发明的第一方面的目的，在于提供一种检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂。

本发明的第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂的应用。

本发明的第三方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂的试剂盒。

本发明的第四方面的目的，在于提供本发明第三方面的试剂盒的应用。

本发明的第五方面的目的，在于提供一种非疾病诊断治疗目的的检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂，包含：检测cyp2c19*2基因的探针和/或用于扩增cyp2c19*2基因的引物对；

所述检测cyp2c19*2基因的探针包括野生型探针和突变型探针；

所述野生型探针的序列如SEQ ID NO.21所示；

所述突变型探针的序列如SEQ ID NO.22所示；

所述野生型探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；

所述突变型探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；

所述用于扩增cyp2c19*2基因的引物对的序列如SEQ ID NO.7、8所示。

优选地，所述野生型探针的5’端起第4位和第10位中的至少一个碱基被锁核酸修饰；进一步优选地，所述野生型探针的5’端起第4位和第10位的碱基被锁核酸修饰。

优选地，所述突变型探针的5’端起第4位和第10位中的至少一个碱基被锁核酸修饰；进一步优选地，所述突变型探针的5’端起第4位和第10位的碱基被锁核酸修饰。

优选地，所述野生型探针和突变型探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

进一步优选地，所述野生型探针的5’端标记的荧光报告基团不同于突变型探针的5’端标记的荧光报告基团。

优选地，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、ROX和Cy5中的至少一种。

优选地，所述荧光淬灭基团为BHQ1、TAMRA、BBQ-650、BHQ2和BHQ3中的至少一种。

优选地，所述野生型探针的5’端标记有FAM，所述突变型探针的5’端标记有HEX。

优选地，所述野生型探针和突变型探针的3’端标记有BHQ1。

本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的试剂在(1)～(2)中任一种中的应用；

(1)制备检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的产品中的应用；

(2)非疾病诊断治疗目的的cyp2c19*2基因单核苷酸多态性检测。

本发明的第三方面，提供一种包含第一方面的试剂的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包含Taq酶、dNTPs、Mg²⁺和缓冲液中的至少一种。

本发明的第四方面，提供第三方面的试剂盒在(1)～(2)中任一种中的应用；

(1)制备检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的产品中的应用；

(2)非疾病诊断治疗目的的cyp2c19*2基因单核苷酸多态性检测。

本发明的第五方面，提供一种非疾病治疗诊断目的的检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的方法，包括采用本发明第一方面的试剂或本发明第三方面的试剂盒的步骤。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)样本提取：取待测样本，提取基因组；

(2)将步骤(1)的基因组与上述用于扩增cyp2c19*2基因的引物对、检测cyp2c19*2基因的探针、Taq酶、dNTPs、Mg²⁺和缓冲液混合，进行qPCR反应检测，读取检测信号。

优选地，步骤(2)中所述qPCR反应程序为：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s，循环40～50次。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂，包含：检测cyp2c19*2基因的探针和/或用于扩增cyp2c19*2基因的引物对；其中，检测cyp2c19*2基因的探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰，锁核酸2’-O，4’-C位通过不同的缩水作用构成的亚甲基桥形成了刚性的缩合结构，增加了核酸磷酸骨架的局部结构的稳定性；并且锁核酸作为一种新的修饰后核酸，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好和体内无毒性等特点；同时，锁核酸修饰的核酸应用于荧光定量PCR(qPCR)探针检测时，可有效提高检测反应退火温度并同时缩短检测所需探针的长度，并且较普通探针具有灵敏度更高，特异性更强等优势。

本发明提供的非疾病诊断治疗目的的检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的方法，采用本发明提供的检测cyp2c19*2基因的探针和用于扩增cyp2c19*2基因的引物对，可检测低至5拷贝的样品。

附图说明

图1是实施例1中cyp2c19*2基因的候选引物对扩增产物的电泳图。

图2是实施例3中cyp2c19*2纯合野生型样本检测结果图。

图3是实施例3中cyp2c19*2纯合突变型样本检测结果图。

图4是实施例3中cyp2c19*2杂合突变型样本检测结果图。

图5是实施例3中cyp2c19*2纯合野生型样本扩增循环50次后的检测结果图。

图6是实施例3中cyp2c19*2纯合野生型样本扩增循环50次后的检测结果图：其中，A是实施例3中cyp2c19*2纯合野生型样本用候选探针对NO.1扩增循环50次后的检测结果图；B是实施例3中cyp2c19*2纯合野生型样本用普通探针扩增循环50次后的检测结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

术语解释：

(1)Taqman探针：Taqman探针是一种寡核苷酸探针，其5’-末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’-端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

(2)锁核酸：锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)是一种新型、特殊的双环状寡核苷酸衍生物。其结构中核酸的2’-O，4’-C位通过不同的缩水作用形成的亚甲基桥形成了刚性的缩合结构，增加了核酸磷酸骨架的局部结构的稳定性。

(3)cyp2c19基因：CYP2C19药物代谢酶的编码基因为cyp2c19基因，位于人类10号染色体。cyp2c19基因含有42个等位基因，cyp2c19*1为野生型等位基因，其编码的酶具有正常活性。cyp2c19*2(rs4244285，c.681G>A)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636G>A)编码的CYP2C19药物代谢酶活性降低，是中国人群中存在的2种主要的等位基因，发生频率分别为23.1-35％及2-7％。cyp2c19基因的遗传变异导致CYP2C19药物代谢酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(UM)、快代谢者(EM)、中间代谢者(IM)和慢代谢者(PM)4种表型。因此，在针对药物使用时，患者或出现由于药物代谢紊乱导致的副作用增强或药效不足等情况，无法获得正常治疗效果。

(4)单核苷酸多态性：单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。

(5)荧光定量PCR：实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。qPCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

本实施例中采用的cyp2c19*2纯合野生型样品由苏州泓迅生物科技股份有限公司构建：用NdeI和XhoI酶切pET-28a(+)(SEQ ID NO.29)，插入基因序列(SEQ ID NO.27)，得到cyp2c19*2纯合野生型样品。

本实施例中采用的cyp2c19*2纯合突变型样品由苏州泓迅生物科技股份有限公司构建：用NdeI和XhoI酶切pET-28a(+)(SEQ ID NO.29)，插入基因序列(SEQ ID NO.28)，得到cyp2c19*2纯合突变型样品。

本实施例中采用的cyp2c19*2杂合突变型样品由cyp2c19*2纯合野生型样品和cyp2c19*2纯合突变型样品按1：1混合得到。

实施例1 cyp2c19*2基因引物对的设计与筛选

(1)cyp2c19*2基因引物对的设计

设计10对候选引物(cyp2c19*2基因的候选引物对为No.1～10，具体如表1所示)。设计原则一般为：引物序列与模板序列紧密互补，且上下游引物之间不会形成稳定的二聚体或发夹结构；同时，引物不会引发错配反应。

表1 cyp2c19*2基因的候选引物对信息

(2)筛选引物

采用Thermo Fisher PowerUp^TMSYBR^TMGreen Master Mix及上述10对候选引物对对DNA样品(cyp2c19*2纯合野生型样品)进行qPCR，qPCR反应体系如下：2X PowerUp SYBRGreen Master Mix 10μL，正向引物(10μM)0.6μL，反向引物(10μM)0.6μL，DNA样品(100ng)0.4μL，ddH₂O 8.4μL；qPCR反应程序如下：酶激活50℃2min；预变性95℃2min；变性95℃15s，退火55℃15s，延伸72℃1min，循环40次；得到扩增产物。得到的扩增产物进行核酸电泳检测，结果如图1所示：由右至左第4泳道的候选引物对NO.4扩增效果最佳。

实施例2 cyp2c19*2基因探针的设计与筛选

(1)探针设计

cyp2c19*2基因探针包括野生型探针和突变型探针。设计3对cyp2c19*2基因探针，分别为13bp、15bp与17bp三种不同长度探针，具体如表2所示。

表2 cyp2c19*2基因的候选探针对信息

注：表中，/LNA_T/表示LNA修饰T碱基，/LNA_G/表示LNA修饰G碱基，/LNA_A/表示LNA修饰A碱基，野生型探针的荧光基团修饰为FAM，突变型探针的荧光基团修饰为HEX，野生型探针和突变型探针的淬灭基团为BHQ-1。

(2)筛选探针

不同cyp2c19*2探针检测效果：采用金斯瑞

II Multiplex ProbeOne-Step qRT-PCR SuperMix UDG试剂盒、候选引物对NO.4以及候选探针对NO.1～3对DNA样品(cyp2c19*2纯合野生型样品、cyp2c19*2纯合突变型样品和cyp2c19*2杂合突变型样品)，qPCR体系如下：反应混合液(PerfectStart^TM Probe One-Step qPCR SuperMix(2×))10μL，酶混合液(

II Probe One-Step RT/RI Enzyme Mix)0.8μL，正向引物(10μM)0.8μL，反向引物(10μM)0.8μL，探针(10μM)各0.2μL，DNA样品(10ng/μL)0.8μL，ddH₂O6.6μL；反应混合液中包括dNTPs，Mg²⁺，以及qPCR反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括Taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环40次。结果如表3所示；除13bp长度探针(候选探针对NO.1)外，15bp及17bp长度探针(候选探针对NO.2、3)均存在不同程度的非特异性结合，可见，在LNA修饰下，13bp长度探针(候选探针对NO.1)特异性最优。

表3 cyp2c19*2基因的候选探针检测结果

注：“+”表示存在非特异性结合荧光信号，“-”表示不存在非特异性结合荧光信号。

实施例3 cyp2c19*2基因引物/探针组合检测效果

(1)cyp2c19*2纯合野生型样品检测

采用金斯瑞

II Multiplex Probe One-Step qRT-PCR SuperMix UDG试剂盒、候选引物对NO.4以及候选探针对NO.1分别检测DNA样品(其中，阳性样品为cyp2c19*2纯合野生型样品，阴性对照为cyp2c19*2质粒空载体(pET-28a(+))，空白对照为无菌ddH₂O)，qPCR体系如下：反应混合液(PerfectStart^TM Probe One-Step qPCR SuperMix(2×))10μL，酶混合液(

II Probe One-Step RT/RI Enzyme Mix)0.8μL，正向引物(10μM)0.8μL，反向引物(10μM)0.8μL，探针(10μM)各0.2μL，DNA样品(10ng/μL)0.8μL，ddH₂O 6.6μL；反应混合液中包括dNTPs，Mg²⁺，以及qPCR反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括Taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环50次。结果如图2所示：阳性样品中，仅有野生型探针于qPCR反应中出现相应荧光信号；而突变型探针不会出现荧光信号(阴性对照与空白对照均无荧光信号，因此，未提供图片)。

(2)cyp2c19*2纯合突变型样品检测

采用金斯瑞

II Multiplex Probe One-Step qRT-PCR SuperMix UDG试剂盒、候选引物对NO.4以及候选探针对NO.1分别检测DNA样品(其中，阳性样品为cyp2c19*2纯合突变型样品，阴性对照为cyp2c19*2质粒空载体(pET-28a(+))，空白对照为无菌ddH₂O)，qPCR体系如下：反应混合液(PerfectStart^TM Probe One-Step qPCR SuperMix(2×))10μL，酶混合液(

II Probe One-Step RT/RI Enzyme Mix)0.8μL，正向引物(10μM)0.8μL，反向引物(10μM)0.8μL，探针(10μM)各0.2μL，DNA样品(10ng/μL)0.8μL，ddH₂O 6.6μL；反应混合液中包括dNTPs，Mg²⁺，以及qPCR反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括Taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环50次。结果如图3所示：阳性样品中，仅有突变型探针于qPCR反应中出现相应荧光信号；同时野生型探针不会出现荧光信号(阴性对照与空白对照均无荧光信号，因此，未提供图片)。

(3)cyp2c19*2杂合突变型样品检测

采用金斯瑞

II Multiplex Probe One-Step qRT-PCR SuperMix UDG试剂盒、候选引物对NO.4以及候选探针对NO.1分别检测DNA样品(其中，阳性样品为cyp2c19*2杂合突变型样品，阴性对照为cyp2c19*2质粒空载体(pET-28a(+))，空白对照为无菌ddH₂O)，qPCR体系如下：反应混合液(PerfectStart^TM Probe One-Step qPCR SuperMix(2×))10μL，酶混合液(

II Probe One-Step RT/RI Enzyme Mix)0.8μL，正向引物(10μM)0.8μL，反向引物(10μM)0.8μL，探针(10μM)0.2μL，DNA样品(10ng/μL)0.8μL，ddH₂O 6.6μL；反应混合液中包括dNTPs，Mg²⁺，以及qPCR反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括Taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环50次。结果如图4所示：阳性样品中，野生型与突变型探针于qPCR反应中出现相应荧光信号(阴性对照与空白对照均无荧光信号，因此，未提供图片)。

(4)cyp2c19*2基因引物/探针组合检测灵敏度

采用金斯瑞

II Multiplex Probe One-Step qRT-PCR SuperMix UDG试剂盒、候选引物对NO.4以及候选探针对NO.1/普通探针对(与候选探针对NO.1相比，区别仅在于未进行锁核酸修饰)分别检测DNA样品(cyp2c19*2纯合野生型样品)，qPCR体系如下：反应混合液(PerfectStart^TM Probe One-Step qPCR SuperMix(2×))10μL，酶混合液(

II Probe One-Step RT/RI Enzyme Mix)0.8μL，正向引物(10μM)0.8μL，反向引物(10μM)0.8μL，探针(10μM)各0.2μL，DNA样品(10ag/μL)0.8μL(根据cyp2c19*2纯合野生型样品的浓度及碱基数，折算基因拷贝数为5拷贝)，ddH₂O 6.6μL；反应混合液中包括dNTPs，Mg²⁺，以及qPCR反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括Taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环50次。结果如图5、6所示：候选探针对NO.1在相同反应体系下荧光值高于普通探针对，并且在反应体系相同，底物拷贝数约为5拷贝时仅有候选探针对NO.1出现荧光，而普通探针对未出现荧光。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州白云山拜迪生物医药有限公司

<120> 检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用

<130>

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atattgtatc tataccttta ttaaatgctt 30

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggttgttga tgtccatcga ttcttggtgt 30

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tataccttta ttaaatgctt ttaatttaat 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgttgatgtc catcgattct tggtgttctt 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtatctatac ctttattaaa tgcttttaat 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatgtccatc gattcttggt gttcttttac 30

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<213> 人工序列

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attgtatcta tacctttatt aaatgctttt aattt 35

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<212> DNA

<213> 人工序列

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catcgattct tggtgttctt ttactttctc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ataaattatt gttttctctt agatatgcaa 30

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<212> DNA

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gtccatcgat tcttggtgtt cttttacttt 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tattgttttc tcttagatat gcaataattt 30

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<212> DNA

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tcttggtgtt cttttacttt ctccaaaata 30

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taaattattg ttttctctta gatatgcaat 30

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ccatcgattc ttggtgttct tttactttct 30

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atgcttttaa tttaataaat tattgttttc 30

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atcgattctt ggtgttcttt tactttctcc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcttttaatt taataaatta ttgttttctc 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

attcttggtg ttcttttact ttctccaaaa 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttaatttaat aaattattgt tttctcttag 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttcttggtgt tcttttactt tctccaaaat 30

<210> 21

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttatttcccg gga 13

<210> 22

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttatttccca gga 13

<210> 23

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

attatttccc gggaa 15

<210> 24

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

attatttccc aggaa 15

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gattatttcc cgggaac 17

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gattatttcc caggaac 17

<210> 27

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

catatggcat attgtatcta tacctttatt aaatgctttt aatttaataa attattgttt 60

tctcttagat atgcaataat tttcccacta tcattgatta tttcccggga acccataaca 120

aattacttaa aaaccttgct tttatggaaa gtgatatttt ggagaaagta aaagaacacc 180

aagaatcgat ggacatcaac aaccctcctc gag 213

<210> 28

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

catatggcat attgtatcta tacctttatt aaatgctttt aatttaataa attattgttt 60

tctcttagat atgcaataat tttcccacta tcattgatta tttccccgga acccataaca 120

aattacttaa aaaccttgct tttatggaaa gtgatatttt ggagaaagta aaagaacacc 180

aagaatcgat ggacatcaac aaccctcctc gag 213

<210> 29

<211> 5369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160

ggtcgcggat ccgaattcga gctccgtcga caagcttgcg gccgcactcg agcaccacca 5220

ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc 5280

caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt 5340

tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 5369

Claims

1.一种试剂，包含：检测cyp2c19*2基因的探针和/或用于扩增cyp2c19*2基因的引物对；

所述检测cyp2c19*2基因的探针包括野生型探针和突变型探针；

所述野生型探针的序列如SEQ ID NO.21所示；

所述突变型探针的序列如SEQ ID NO.22所示；

所述野生型探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；

所述突变型探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：

所述野生型探针和突变型探针的5’端起第4位和第10位中的至少一个碱基被锁核酸修饰；

优选地，所述野生型探针和突变型探针的5’端起第4位和第10位的碱基被锁核酸修饰。

3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：

所述野生型探针和突变型探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

所述野生型探针的5’端标记的荧光报告基团不同于突变型探针的5’端标记的荧光报告基团。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：

所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、ROX和Cy5中的至少一种；

5.权利要求1～4中任一种所述的试剂在(1)～(2)中任一种中的应用；

(1)制备检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的产品中的应用；

(2)非疾病诊断治疗目的的cyp2c19*2基因单核苷酸多态性检测。

6.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～4中任一种所述的试剂。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含Taq酶、dNTPs、Mg²⁺和缓冲液中的至少一种。

8.权利要求6或7所述的试剂盒在(1)～(2)中任一种中的应用；

(1)制备检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的产品中的应用；

(2)非疾病诊断治疗目的的cyp2c19*2基因单核苷酸多态性检测。

9.一种非疾病治疗诊断目的的检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的方法，包括采用权利要求1～4中任一种所述的试剂或权利要求6或7所述的试剂盒的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述方法包括如下步骤：

(1)样本提取：取待测样本，提取基因组；

(2)将步骤(1)的基因组与权利要求7中所述的用于扩增cyp2c19*2基因的引物对、检测cyp2c19*2基因的探针、Taq酶、dNTPs、Mg²⁺和缓冲液混合，进行qPCR反应检测，读取检测信号。