CN103131788B

CN103131788B - 慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针和引物、及其试剂盒

Info

Publication number: CN103131788B
Application number: CN201310079019.5A
Authority: CN
Inventors: 陈栋; 汪黎明; 张洁; 冯坤
Original assignee: SHANGHAI STOMATOLOGICAL DISEASE CENTER
Current assignee: SHANGHAI STOMATOLOGICAL DISEASE CENTER
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: CN103131788A

Abstract

本发明提供了慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针和引物、及其试剂盒。本发明的慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针与引物，包括单核苷酸多态性位点rs2891168的特异性扩增引物对、单核苷酸多态性位点rs1800796的特异性扩增引物对、单核苷酸多态性位点rs2891168的检测探针，以及单核苷酸多态性位点rs1800796的检测探针。本发明还进一步提供了采用所述慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针与引物制备的试剂盒。本发明的探针、引物及试剂盒特别适用于中国汉族人群慢性牙周炎的单核苷酸多态性研究。

Description

慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针和引物、及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用的探针和引物、芯片及试剂盒。

背景技术

慢性牙周炎是牙周疾病中发病率最高的一类疾病，也是难治性牙周疾病之一，临床上具有病程长、诊断治疗复杂、临床治疗效果不一等特点。传统的慢性牙周炎诊断方法主要根据临床体征表现作为依据，通过测定牙周指数、牙槽骨附着丧失程度、牙齿松动度、牙周袋深度等指标，对慢性牙周炎进行诊断、分类和分型，并根据各项指标的严重程度，确定牙周炎的发展阶段，实施不同类别的治疗。此种诊断方法比较直观简单、易于掌握，但由于主要是依据临床体征来诊断，对于早期牙周炎的诊断较为困难，缺乏对牙周炎发病机制的了解，特别是缺乏对个体基因背景在牙周炎发病过程中的作用的了解，无法预测个体牙周炎的进展和预后。

随着人类基因组计划的完成以及HapMap计划和蛋白质组计划的实施，寻找慢性牙周炎这类多基因遗传疾病相关基因的研究在不断发展，定位克隆、定位候选克隆、基因表达谱研究、候选基因分析以及目前基于家系和大规模病例对照的全基因组关联研究等研究也在不断深入，这些研究对于发现慢性牙周炎等复杂疾病关联基因发挥了重要的作用。

各国学者研究发现:人群中存在牙周炎的关联个体，他们常常携带某些牙周炎的关联基因，这些关联基因主要有:IL-6、CSF1、FPR1、CDKN2BAS、TNF-α、VDR等。其致病机理主要是通过调控IL-6、TNF-α蛋白的产生、影响其致损伤作用而影响牙周炎的发生和发展，或提高该基因所在启动子的活性，增加其转录合成;而维生素D受体Bsml、Apall酶切位点所在区域的内在特性通过影响mRNA的稳定性来影响VDR基因的调控，使VDR的数量、增强子对靶部位的亲和力等发生改变，从而促进牙周炎的发生和发展。Denisf等认为:牙周炎是一种多个等位基因(5-8种)共同作用的多因素疾病，单一的基因多态性很难影响疾病的发展，患有该病的个体也不必携带所有的等位基因。然而，以上研究均基于单个基因或少数基因，由于牙周炎是一种由遗传-环境因素相互作用所导致的具有高度异质性和复杂性的多基因遗传性疾病，单个基因研究具有很大的限制性。近年来，已有学者开始致力于研究某几种基因连锁对牙周炎发生、发展的影响。庞若愚曾提出TNF-α的某些等位基因与MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ区的特定单倍体型存在不平衡连锁现象。加大对HLA特定单倍体型的连锁分析，将有助于发现TNFA基因多态性与牙周炎的关系。但是，这些目前的易感基因研究依然缺乏在整体水平上对疾病的分析，也未能对基因-基因、基因-环境的相互作用进行深入探讨。

新近发展起来的以第三代DNA多态位点——单核苷酸多态位点（Single nucleotidepolymorphism,SNPs）为标记的基于全基因组的关联研究策略，是一种不基于假设的、无偏倚的、全面筛选新基因的策略，从而克服了以往方法存在的局限性，所利用的多态位点SNPs在基因组中分布广、密度高、易于分型，对于鉴定复杂疾病的关联基因具有巨大的潜力。通过连锁或关联分析定位疾病关联基因后，应用SNPs技术在复杂疾病的早期预测、早期预防、早期诊断和早期治疗方面具有重大应用价值。随着多重PCR-INVADER、MassARRAY MALDI-TOFSystem和Affymetrix GeneChip等高通量基因型鉴定技术的发展，使得采用数千个甚至几十万个标记位点在全基因组中扫描疾病相关变异成为可能，为在分子水平上研究慢性牙周炎的发生和发展机制开辟了全新的思路。SchimrigkS[12]和Scapoli C[13]等分别通对940个样本的100000个单核苷酸多态性和对198个样本DNA的微卫星巨阵大范围分析基因位点，探索和筛查影响牙周炎进展的关联基因。这种方法节省了大量的人力、物力，也使牙周炎关联基因的广泛筛查成为可能。

国外诸多研究已得出大量的牙周炎与基因多态性相关的阳性结果，但由于群体差异而造成的SNPs频率差异，其中部分表现在牙周炎相关的阳性位点上，提示牙周炎存在人群遗传异质性，在不同群体中可能存在发病机制上的差异。目前在国内，大多数的研究只集中在某一方面（细胞因子，免疫受体，蛋白质，结构分子等等），在数量方面受到很大限制，尚无报告应用SNPs技术来揭示中国人牙周炎与易感基因多态性位点的相关性研究。这种状况提示在中国人群中开展牙周炎关联基因研究（特别是大样本的SNPs研究）及其发病机制研究有着不可替代的意义。

在我们的前期研究中发现在中国汉族人群中存在慢性牙周炎的易感基因，即染色体9p21.3区域的CDKN2BAS，其单核苷酸多态性位点rs2891168与慢性牙周炎有显著关联，但对CDKN2BAS基因以及其他潜在的易感基因是否存在其他多个SNPs位点及其在牙周炎发展中的作用机理尚不明确（陈栋，冯坤，汪黎明，等.上海地区汉族慢性牙周炎患者与基因组单核苷酸多态性的关联研究.上海口腔医学，2010，19（6）:561-564）。还有研究表明，中国汉族人群中IL6572位点与慢性牙周炎有显著关联（管泽民，刘京津，马欣，吴东红，鱼洁，黄国强白细胞介素6基因．572位点多态性与重度慢性牙周炎易感性的相关分析，中华口腔医学杂志2008年7月底43卷第7期）。目前对于利用单核苷酸多态性协助临床诊断慢性牙周炎易感性尚为空白。

发明内容

本发明的目的为克服现有技术中的缺陷，提供一种慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针和引物、及其试剂盒。

本发明首先提供了一组慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针与引物，包括单核苷酸多态性位点rs2891168及rs1800796（即IL6572位点）的特异性扩增引物对、单核苷酸多态性位点rs2891168的检测探针，以及单核苷酸多态性位点rs1800796的检测探针。

其中，rs2891168的特异性扩增引物对包括：

上游引物：5’-AGTCCACTTGTAACCACATGTCA-3’（SEQ ID NO:1）

下游引物：5’-ACATAAACCTAAAAGGGCTTGC-3’（SEQ ID NO:2）；

rs1800796的特异性扩增引物对包括：

上游引物：5’-ACTGGCAGCACAAGGCAAAC-3（SEQ ID NO:3）

下游引物：5’-AAGCCTGGGATTATGAAGAAGGTA-3’（SEQ ID NO:4）

rs2891168的检测探针包括：

5’端wild（野生型）探针：CTCTAACAAAAGATGTCCTGTTTGGAACA（SEQ ID NO:5）

5’端mut（突变型）探针：CTCTAACAAAAGATGTCCTGTTTGGAACG（SEQ ID NO:6）

3’端common探针（通用探针）：CCAACTCTGTATCAGTTACTTCAGACACTTTC（SEQ ID NO:7）；

rs1800796的检测探针包括：

5’端wild探针：GCCAGGCAGTTCTACAACAGCCC（SEQ ID NO:8）

5’端mut探针：GCCAGGCAGTTCTACAACAGCCG（SEQ ID NO:9）

3’端common探针：CTCACAGGGAGAGCCAGAACACAGA（SEQ ID NO:10）。

进一步的，所述rs2891168的3’端common探针及rs1800796的3’端common探针5’端携带荧光基团。

所述荧光基团选自：Cy3。

进一步的，所述慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针与引物还包括rs2891168野生型、rs2891168突变型、rs1800796野生型及rs1800796突变型的Zip探针。

所述Zip探针为：随机组合的长度为24bp的寡核苷酸片段，所述寡核苷酸序列与所述rs2891168的特异性扩增引物对扩增的目的基因及rs1800796的特异性扩增引物对扩增的目的基因的同源性最低（同源性计算方法：将所述寡核苷酸序列利用NCBI网站上提供的BLAST功能与基因组序列进行同源性比较，选出与基因组序列同源性程度最低的一组作为芯片上的Zip探针序列）。

所述rs2891168野生型、rs2891168突变型、rs1800796野生型及rs1800796突变型的Zip探针的序列各不相同。

进一步的，所述rs2891168野生型、rs2891168突变型、rs1800796野生型及rs1800796突变型的Zip探针选自:

5’-GCAAGTCTACCTAATCTCTGAGCC-3’（SEQ ID NO:11）

5’-ACCTGTCTAATCGCAAAGCCTCTG-3’（SEQ ID NO:12）

5’-ACCTGTCTGCAATCTGAGCCAATC-3’（SEQ ID NO:13）

5’-AGCCGTGCGAGTCTGTATACCCAT-3’（SEQ ID NO:14）。

所述rs28911685’端wild探针、rs28911685’端mut探针、rs18007965’端wild探针及rs18007965’端mut探针的末端连接有cZip寡核苷酸片段。

所述rs28911685’端wild探针、rs28911685’端mut探针、rs18007965’端wild探针及rs18007965’端mut探针的末端连接的cZip寡核苷酸片段分别与rs2891168野生型Zip探针、rs2891168突变型Zip探针、rs1800796野生型Zip探针及rs1800796突变型Zip探针的序列相互补。

所述cZip寡核苷酸片段连接于所述5’端wild探针及5’端mut探针的5’端。

如实施例列举，所述rs2891168野生型、rs2891168突变型、rs1800796野生型及rs1800796突变型的Zip探针及其对应的cZip序列分别为：

rs2891168野生型的Zip探针：5’-GCAAGTCTACCTAATCTCTGAGCC-3’（SEQ ID NO:11）

rs2891168的5’端wild探针的cZip：5’-GGCTCAGAGATTAGGTAGACTTGC-3’（SEQ IDNO:15）

rs2891168突变型的Zip探针：5’-ACCTGTCTAATCGCAAAGCCTCTG-3’（SEQ ID NO:12）

rs2891168的5’端mut探针的cZip：5’-CAGAGGCTTTGCGATTAGACAGGT-3’（SEQ IDNO:16）

rs1800796野生型的Zip探针：5’-ACCTGTCTGCAATCTGAGCCAATC-3’（SEQ ID NO:13）

rs1800796的5’端wild探针的cZip：5’-GATTGGCTCAGATTGCAGACAGGT-3’（SEQ IDNO:17）

rs1800796突变型的Zip探针：5’-AGCCGTGCGAGTCTGTATACCCAT-3’（SEQ ID NO:14）

rs1800796的5’端mut探针的cZip：5’-ATGGGTATACAGACTCGCACGGCT-3’（SEQ IDNO:18）

本发明的探针与引物可用于制备慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用试剂盒，尤其是制备中国汉族人群慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用试剂盒。

本发明第二方面，提供了一种慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用试剂盒，包括：基因芯片，所述基因芯片的基片表面不同位置分别固定有rs2891168野生型、rs2891168突变型、rs1800796野生型及rs1800796突变型的Zip探针；

前述rs2891168的特异性扩增引物对、rs1800796的特异性扩增引物对、rs2891168的检测探针、及rs1800796的检测探针。

所述rs2891168的3’端common探针及rs1800796的3’端common探针末端携带荧光基团，所述rs2891168的5’端wild探针、rs2891168的5’端mut探针、rs1800796的5’端wild探针及rs1800796的5’端mut探针末端分别连接有与rs2891168野生型Zip探针、rs2891168突变型Zip探针、rs1800796野生型Zip探针及rs1800796突变型Zip探针序列互补的cZip寡核苷酸片段。

所述基因芯片的基片可为各种常用制备基因芯片的基片，如玻片、硅片或膜等。各Zip探针固定于芯片的方法可采用常规。

本发明试剂盒中可使用的Zip探针还可以有其它随机寡核苷酸片段，根据本发明记载的Zip探针设计原理，本领域的技术人员可利用现有技术设计获得其他适用的Zip探针及与其互补的cZip。

进一步的，所述试剂盒中还可以选择性地包括DNA抽提通用试剂、PCR扩增通用试剂、连接酶检测（LDR）反应通用试剂、杂交反应通用试剂、蛋白酶K、芯片洗涤液等。

所述DNA抽提通用试剂、PCR扩增通用试剂、LDR反应通用试剂及杂交反应通用试剂并非本试剂盒特有，可采用各种本领域熟知的通用试剂。

DNA抽提通用试剂，可采用各种现有在售基因组DNA抽提试剂盒中的试剂。

PCR扩增通用试剂，如选自：Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs或Taq PCR MasterMix等常用PCR反应试剂。

LDR反应通用试剂，如选自：Taq连接酶缓冲液、Taq DNA连接酶等常用LDR反应试剂。

杂交反应通用试剂，如选自：杂交液、20×SSC、鲑鱼精ssDNA等常用杂交反应试剂。

由于此类DNA抽提通用试剂、PCR通用试剂、LDR反应通用试剂、杂交反应通用试剂均可经市场途径单独购得或者根据现有技术自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

进一步的，所述基因芯片上还可以选择性地固定有阴性对照与阳性对照。

所述阴性对照为随机组合的长度为24bp的寡核苷酸片段，所述阴性对照不会与所述rs2891168的特异性扩增引物对扩增的目的基因及rs1800796的特异性扩增引物对扩增的目的基因杂交，也不会与任一前述cZip寡核苷酸片段杂交。

如实施例列举的，所述阴性对照为一单链多核苷酸片段，其序列为：

5’-ATCGACCTGGTAATCGTGCGCAGC-3’(SEQ ID NO:19)

所述阳性对照为末端带有荧光基团的随机组合的长度为24bp的寡核苷酸片段，所述阳性对照不会与所述rs2891168的特异性扩增引物对扩增的目的基因及rs1800796的特异性扩增引物对扩增的目的基因杂交，也不会与任一前述cZip寡核苷酸片段杂交。

如实施例列举的，所述阳性对照为5’端带有Cy3荧光信号的单链多核苷酸片段，其序列为：

5’-Cy3-CAAAGTTCATAGTGGACCCTTTTT-3’(SEQ ID NO:20)

本试剂盒适用的样本为血液样本、基因组DNA样本，组织样本等。

本发明的试剂盒适用于诊断或非诊断目的地样本检测。

本发明还进一步公开了一种诊断或非诊断目的使用本发明试剂盒的方法，包括下列步骤：

1）提取样本DNA；

2）分别采用rs2891168特异性扩增引物对与rs1800796特异性扩增引物对对样本DNA进行PCR扩增；

3）将步骤2）获得的样本的DNA扩增产物与rs2891168的检测探针及rs1800796的检测探针进行LDR反应；

4）将各LDR反应液点样于所述基因芯片上进行杂交，并清洗杂交后的芯片；

5）杂交后的芯片用激光共聚焦微阵列扫描仪进行扫描，并分析获得各样本对应Zip探针点的AMSI值（absolute median signal intensities）；

6）根据同一位点野生型和突变型Zip探针点的绝对强度比值，确定基因型。

步骤3）中，样本的DNA扩增产物与rs2891168的检测探针及rs1800796的检测探针的LDR反应可以在同一体系中进行也可以分别进行。

进一步的，如实施例列举的，步骤2）中，PCR扩增的反应条件为：94℃起始5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，退火温度每个循环降0.5℃，循环14次；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。

进一步的，步骤2）后还可加入蛋白酶K，在蛋白酶K活性温度下反应合适的时间以去除杂质蛋白，随后灭活蛋白酶K。

进一步的，如实施例列举的，步骤3）LDR反应条件为94℃变性30s，65℃退火4min，循环40次。

进一步的，如实施例列举的，步骤4）杂交反应条件为杂交前95℃加热变性5min并冷却，而后65℃杂交2小时以上。

进一步的，步骤4）可采用常规杂交芯片清洗液清洗，如实施例具体列举的，可采用0.3×SSC/0.1%SDS（0.1gSDS/100ml）和0.06×SSC清洗杂交后的芯片。

步骤5）中，同一位点野生型和突变型Zip探针点的绝对强度比值大于10:1，则该位点为纯合野生型，若比值小于1:10，则该位点为纯合突变型；若比值为1:2～2:1，则该位点为杂合型。

其中，纯合突变型或杂合型判定为慢性牙周炎易感。

本发明基于对汉族慢性牙周炎的单核苷酸多态性的研究，选择了将rs2891168及rs1800796位点作为组合诊断慢性牙周炎的单核苷酸多态性检测位点，采用基于连接酶检测反应与通用芯片技术相结合的分型方法，针对牙周炎患者的两个热点突变位点，每个位点设计3条特异性探针，两条位于突变位点5’端，分别带有野生型碱基和突变型碱基，一条位于突变位点3’端，称为common探针，末端携带荧光基团。只有当位点两端的探针序列均与模板完全配对，连接酶才会将两条探针连接起来，如果存在错配碱基，连接反应则不能进行。因此，只有与模板基因型相同的5’端探针才能和common探针连接在一起，从而发出荧光信号。芯片片基上固定有Zip探针，5’端特异性探针末端具有与Zip探针序列互补的cZip序列，所以当LDR反应后的产物与芯片杂交时，cZip序列就能引导反应产物与Zip探针杂交，在芯片的特定位置可以检测到荧光信号，从而分析模板的基因型。本发明的试剂盒操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，可正确区分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；时间短，从片段扩增到得到扫描结果可在一个工作日内完成；采用通用芯片技术，成本低，适用于临床患者基因突变检测、正常人杂合子携带者检测等。

附图说明

图1显示为rs2891168芯片分型结果图

a:分型为AA的样本检测结果

b：分型为AG的样本检测结果

c：分型为GG的样本检测结果

阴：阴性对照（第5-8行的第3列）

阳：阳性对照（第5-8行的第4列）

图2显示为rs2891168不同基因型的AMSI值（S-B_Median-532）即绝对信号强度比较

图3显示为rs1800796芯片分型结果图

a:分型为CC的样本检测结果

b：分型为CG的样本检测结果

c：分型为GG的样本检测结果

阴：阴性对照（第5-8行的第3列）

阳：阳性对照（第5-8行的第4列）

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法、试剂均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术或常规试剂。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明所采用的探针及引物均由Takara合成。

实施例中所采用的探针及引物序列：

rs2891168的特异性扩增引物对，包括：

上游引物：5’-AGTCCACTTGTAACCACATGTCA-3’（SEQ ID NO:1）

下游引物：5’-ACATAAACCTAAAAGGGCTTGC-3’（SEQ ID NO:2）；

rs1800796的特异性扩增引物对，包括：

上游引物：5’-ACTGGCAGCACAAGGCAAAC-3（SEQ ID NO:3）

下游引物：5’-AAGCCTGGGATTATGAAGAAGGTA-3’（SEQ ID NO:4）；

rs2891168的检测探针，包括：

5’端wild探针：CTCTAACAAAAGATGTCCTGTTTGGAACA（SEQ ID NO:5）

末端带cZip的5’端wild探针：

GGCTCAGAGATTAGGTAGACTTGCCTCTAACAAAAGATGTCCTGTTTGGAACA(SEQ ID NO:21)

5’端mut探针：CTCTAACAAAAGATGTCCTGTTTGGAACG（SEQ ID NO:6）

末端带cZip的5’端mut探针：

CAGAGGCTTTGCGATTAGACAGGTCTCTAACAAAAGATGTCCTGTTTGGAACG（SEQ ID NO:22）

3’端common探针：CCAACTCTGTATCAGTTACTTCAGACACTTTC（SEQ ID NO:7）；其5’末端携带Cy3荧光基团

rs1800796的检测探针，包括：

5’端wild探针：GCCAGGCAGTTCTACAACAGCCC（SEQ ID NO:8）

末端带cZip的5’端wild探针：

GATTGGCTCAGATTGCAGACAGGTGCCAGGCAGTTCTACAACAGCCC（SEQ ID NO:23）

5’端mut探针：GCCAGGCAGTTCTACAACAGCCG（SEQ ID NO:9）

末端带cZip的5’端mut探针：

ATGGGTATACAGACTCGCACGGCTGCCAGGCAGTTCTACAACAGCCG（SEQ ID NO:24）

3’端common探针：CTCACAGGGAGAGCCAGAACACAGA（SEQ ID NO:10），其5’末端携带Cy3荧光基团

阴性对照：5’-ATCGACCTGGTAATCGTGCGCAGC-3’(SEQ ID NO:19)

阳性对照：5’-Cy3-CAAAGTTCATAGTGGACCCTTTTT-3’(SEQ ID NO:20)

实施例1试剂盒的装配

试剂盒的制备：

步骤一，片基处理及点样

将玻片用双蒸水洗净，在碱液中浸泡过夜，取出后用双蒸水清洗3遍，再于体积分数为1%的HCl中浸泡30分钟，清洗后置于玻片缸中待用。将清洁后的玻片经过体积比2%的4-氨丁基三乙氧基硅烷水溶液氨基化处理，再经1mmol/L苯异硫氰酸酯水溶液进行异硫氰基化处理，用氮气吹干后，放于4℃避光保存。

芯片Zip探针是随机组合的长度为24bp的寡核苷酸片段，将这些寡核苷酸序列利用NCBI网站上的BLAST功能与目的基因组序列进行同源性比较，参照NCBI上BLAST功能选择其中同源性程度最低的一组（作为Zip探针序列）。

将合成好的Zip探针溶解于点样液中，将探针溶液转移到对应的96孔板内，使用GMS417点样仪，运行相应程序将探针点到活化好的片基上，置于37℃，90%湿度的恒温恒湿箱中过夜，使探针与玻片充分交联。固定好的片基在氨水中封闭反应的活性基团，可以储存于4℃以备下步杂交实验用。

同样从随机组合的长度为24bp的寡核苷酸片段中选出不会与所述rs2891168的特异性扩增引物对扩增的目的基因及rs1800796的特异性扩增引物对扩增的目的基因杂交，也不会与任一前述Zip探针的互补片段杂交的寡核苷酸片段作为阴性对照与阳性对照，参考Zip探针点样于片基上。本例所选阴性对照与阳性对照如下，本领域技术人员也可采用前述选择标准选择其他序列的寡核苷酸片段作为阴性对照与阳性对照：

阴性对照：5’-ATCGACCTGGTAATCGTGCGCAGC-3’（SEQ ID NO:19）

阳性对照：5’-Cy3-CAAAGTTCATAGTGGACCCTTTTT-3’（SEQ ID NO:20）

步骤二、

将rs2891168的特异性扩增引物对（包括上游引物与下游引物）、rs1800796的特异性扩增引物对（包括上游引物与下游引物）、rs2891168的检测探针（包括末端带cZip的5’端wild探针、末端带cZip的5’端mut探针、3’端common探针）、rs1800796的检测探针（包括末端带cZip的5’端wild探针、末端带cZip的5’端mut探针、3’端common探针）、分别独立包装，与基因芯片一并装配试剂盒。

根据需要，试剂盒中还可选配的包括：DNA抽提通用试剂、PCR扩增通用试剂、LDR反应通用试剂、杂交反应通用试剂、蛋白酶K、芯片洗涤液等。

实施例2试剂盒的检测

步骤一，样品准备

准备各病例的唾液样品，用采用常规苯酚-氯仿方法从唾液的口腔脱落细胞中提取基因组DNA。

步骤二，PCR扩增

分别以各样本的基因组DNA为模板，分别用rs2891168的特异性扩增引物对及rs1800796的特异性扩增引物对进行PCR扩增。

PCR反应成分（15μl体系）：20ng基因组DNA，2×Taq PCR Master Mix，0.4μM各引物，RNase-free water补足。

Touch-down PCR反应条件为：94℃起始5min，94℃变性30s，64℃退火30s（每个循环降0.5℃），72℃延伸1min，循环14次；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min。

反应完成后在反应混合液中加入1μl蛋白酶K，70℃反应10min，随后94℃20min灭活蛋白酶K。

步骤三，连接反应

蛋白酶K消化后的扩增产物，立刻进行LDR反应。

在反应液中依次加入10×Taq ligase buffer2μl，探针混合液3μl，各探针浓度均为1μM，Taq DNA ligase0.25μl，补水至总体积20μl。

反应条件为94℃变性30s，65℃退火4min，循环40次。

步骤四，杂交

向20μl LDR反应液中加入15μl双蒸水和35μl2×杂交液，混匀后于95℃加热变性5min，迅速放于冰上冷却，离心待用。

将杂交框粘帖于基因芯片的点样区域，吸取65μl杂交液添加到杂交框中，封闭好置于65℃杂交箱中杂交2小时以上。

杂交结束后，去掉杂交框，将芯片分别放于0.3×SSC/0.1%SDS和0.06×SSC中各洗脱1min，离心甩干。

步骤五，扫描与分析

杂交后的芯片用激光共聚焦微阵列扫描仪进行扫描，得到的图像用软件进行分析。最终获得各个样本点的荧光信号强度值和背景值，扣除背景值影响后得到该点的AMSI值（absolutemedian signal intensities）。根据同一位点野生型和突变型探针点的绝对强度比值，确定基因型。

1.芯片特异性检测

对rs2891168，首先确定所有阳性对照信号值大于2000，阴性对照信号值小于200。然后根据信号值的WT/MU比值来确定位点的基因型，其中，WT为检测位点野生型4个重复spot的信号平均值，MU为检测位点突变型4个重复spot的信号平均值，对应rs2891168位点中，WT/MU即为A:G。若WT/MU>10:1，则该位点为纯合野生型AA；若WT/MU<1:10，则该位点为纯合突变型GG；若WT/MU=1:2～2:1，则该位点为杂合型AG。

对rs1800796，首先确定所有阳性对照信号值大于2000，阴性对照信号值小于200。然后根据信号值的WT/MU比值来确定位点的基因型，其中，WT为检测位点野生型4个重复spot的信号平均值，MU为检测位点突变型4个重复spot的信号平均值，对应rs1800796位点中，WT/MU即为C:G。若WT/MU>10:1，则该位点为纯合野生型CC；若WT/MU<1:10，则该位点为纯合突变型GG；若WT/MU=1:2～2:1，则该位点为杂合型CG。

图1和图3分别为rs2891168及rs1800796芯片分型结果图

图2为rs2891168不同基因型的AMSI值（S-B_Median-532）即绝对信号强度比较。

获得的rs2891168数据如下表：

基因型	WT-A信号平均值	MU-G信号平均值	WT/MU比值	WT/MU参考标准
					88-AA	6099.25	358.5	17.01325	>10:1
116-AG	8345.875	8538.25	0.977469	=1:2～2:1
					111-GG	36.75	9140.375	0.004021	<1:10

获得的rs1800796数据如下表：

基因型	WT-C信号平均值	MU-G信号平均值	WT/MU比值	WT/MU参考标准
					50-CC	9343.325	-12.825	>10:1	>10:1
116-CG	4380.275	3409.025	1.284906	=1:2～2:1
					354-GG	-254.375	14966	<1:10	<1:10

选取临床经测序确定基因型的6例样本。采用本发明的试剂盒利用前述方法分析基因型，检测结果如下表：

	试剂盒检测	测序检测
			rs2891168位点为AA	1例	1例
rs2891168位点为AG	1例	1例
			rs2891168位点为GG	1例	1例
rs1800796位点为CC	1例	1例
			rs1800796位点为CG	1例	1例
rs1800796位点为GG	1例	1例

上述结果说明，本发明试剂盒分型准确度高，具有高度特异性。采用本发明的试剂盒，在初始做PCR扩增中所需的DNA模板量最低可到5ng，均能检测出芯片结果与测序结果一致，可以看出该芯片的特异性和灵敏度都非常高。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用试剂盒，包括：

单核苷酸多态性位点rs2891168的特异性扩增引物对：上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO:1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

单核苷酸多态性位点rs1800796的特异性扩增引物对：上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO:3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO:4；

单核苷酸多态性位点rs2891168的检测探针：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:5的5’端野生型探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:6的5’端突变型探针以及核苷酸序列为SEQ ID NO:7的3’端common探针；

单核苷酸多态性位点rs1800796的检测探针：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:8的5’端野生型探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:9的5’端突变型探针以及核苷酸序列为SEQ ID NO:10的3’端common探针；

基因芯片，所述基因芯片的基片表面不同位置分别固定有rs2891168野生型Zip探针、rs2891168突变型Zip探针、rs1800796野生型Zip探针及rs1800796突变型Zip探针；所述rs2891168的3’端common探针及rs1800796的3’端common探针末端携带荧光基团，所述rs2891168的5’端野生型探针、rs2891168的5’端突变型探针、rs1800796的5’端野生型探针及rs1800796的5’端突变型探针末端分别连接有与rs2891168野生型Zip探针、rs2891168突变型Zip探针、rs1800796野生型Zip探针及rs1800796突变型Zip探针序列互补的cZip寡核苷酸片段；所述rs2891168野生型Zip探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:11，rs2891168突变型Zip探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:12、rs1800796野生型Zip探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:13，rs1800796突变型Zip探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:14；所述单核苷酸多态性位点rs2891168的检测探针中，末端带cZip的5’端野生型探针序列为SEQ ID NO:21、末端带cZip的5’端突变型探针的序列为SEQ IDNO:22；所述单核苷酸多态性位点rs1800796的检测探针中，末端带cZip的5’端野生型探针序列为SEQ ID NO:23，末端带cZip的5’端突变型探针的序列为SEQ ID NO:24。

2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述cZip寡核苷酸片段连接于5’端野生型探针及5’端突变型探针的5’端。

3.如权利要求1-2任一权利要求所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自DNA抽提通用试剂、PCR扩增通用试剂、连接酶检测反应通用试剂、杂交反应通用试剂、蛋白酶K和芯片洗涤液中的一种或多种。

4.如权利要求1-2任一权利要求所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片上固定有阴性对照与阳性对照。

5.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为核苷酸序列为SEQ ID NO:19的单链多核苷酸片段；所述阳性对照为核苷酸序列为SEQ ID NO:20的5’端带有Cy3荧光信号的单链多核苷酸片段。

6.权利要求2-5任一权利要求所述试剂盒的非诊断目的使用方法，包括下列步骤：

1）提取样本DNA；

2）分别采用所述rs2891168的特异性扩增引物对与所述rs1800796的特异性扩增引物对对样本DNA进行PCR扩增；

5）杂交后的芯片用激光共聚焦微阵列扫描仪进行扫描，并分析获得各样本对应Zip探针点的AMSI值；

7.如权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤2）中，PCR扩增的反应条件为：94℃起始5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，退火温度每个循环降0.5℃，循环14次；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。

8.如权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤2）后加入蛋白酶K，在蛋白酶K活性温度下反应合适的时间以去除杂质蛋白，随后灭活蛋白酶K。

9.如权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤3）LDR反应条件为94℃变性30s，65℃退火4min，循环40次。

10.如权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤4）杂交反应条件为杂交前95℃加热变性5min并冷却，而后65℃杂交2小时以上。