DE60016405T2

DE60016405T2 - Neurodegenerative-erkrankung verwandtes gen

Info

Publication number: DE60016405T2
Application number: DE60016405T
Authority: DE
Inventors: Wayne Roger DAVIES; Philip Anthony PAYNE; Graham Roger SUTCLIFFE
Original assignee: University of Glasgow
Current assignee: University of Glasgow
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: AU2932100A; GB9905218D0; JP2003511346A; DE60016405D1; EP1189631A1; ATE283703T1; WO2000053218A1; EP1189631B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polynucleotidfragments, das für den Typ I von Proteinkinase C (PKC Typ I) sowie für Fragmente davon kodiert, mutierte Polynucleotidfragmente des Polynucleotidfragments, einen rekombinanten Vektor, der solch ein Polynucleotidfragment oder mutiertes Polynucleotidfragment umfasst, eine Wirtszelle, die das Polynucleotidfragment oder mutierte Polynucleotidfragment umfasst, eine Wirtszelle, die einen rekombinanten Vektor, umfassend das Polynucleotidfragment oder mutierte Polynucleotidfragment, umfasst, ein rekombinantes oder synthetisches Polypeptids dazu, die Verwendung von Antikörpern, die für dieses Polypeptid spezifisch sind, Antisense-Oligonucleotide, die zum Polynucleotidfragment oder mutierten Polynucleotidfragment komplementär sind, pharmazeutische Zusammensetzungen, die das rekombinante oder synthetische Polypeptid umfassen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Antisense-Oligonucleotide umfassen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Polynucleotidfragment umfassen, zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder als therapeutischer Wirkstoff bei Tieren, insbesondere bei Menschen, sowie Verwendungen des Polynucleotidfragments oder mutierten Polynucleotidfragments, der Antisense-Oligonucleotide, Antikörper und/oder Polypeptide in diagnostischen und/oder Screening-Tests.
Degenerative Erkrankungen des Nervensystems, wie beispielsweise die Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Huntington-Krankheit, stellen seit einigen Jahren sowohl in der Grundlagenforschung als auch in klinischen Zusammenhängen eine Herausforderung dar. Ein zentrales Problem war bisher der Mangel an Tiermodellen, die die klinischen Leiden exakt nachbilden, da ein Großteil der Forschung anfänglich an Tieren durchgeführt wird, in denen eine bestimmte Erkrankung durch experimentelle Manipulation des Zentralnervensystems (ZNS) hervorgerufen wurde. Beispiele für experimentelle Manipulation des ZNS auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit umfassen Studien an Nagetieren, die auf dem Verursachen von Läsionen im nigrostriatalen System, beispielsweise mit dem Toxin 6-Hydroxydopamin, basierten. Es existieren mehrere genetische Mausmodelle von Erkrankungen des Bewegungsapparats, wobei sich jedoch die Mehrheit solcher Mutanten nur schlecht fortpflanzen und eine reduzierte Lebenserwartung haben, was deren Effizienz für Studien der langfristigen Entwicklung der verschiedenen Erkrankungszustände einschränkt. Ein solches Modell, die Weaver Maus, weist eine Defizienz in ihren dopaminergen Systemen auf und wurde daher als ein Modell für die Parkinson-Krankheit erwogen. Diese Mutante weist jedoch auch schwere zerebellare Anormalitäten auf, und die daraus resultierenden Verhaltensmuster können jene überlagern, die durch die Parkinson-artige Dopamindefizienz hervorgerufen werden.
Ein mutierten Rattenstamm (AS/AGU), der spontan in einer geschlossenen Zuchtkolonie von Albino-Swiss- (AS-) Ratten im Departement of Anatomy, Glasgow University (AGU) aufgetreten ist, wurde ursprünglich von Clarke & Payne, European Journal of Neuroscience 6, 885–888 (1994), beschrieben. Die mutierte Ratte zeigte eine Erkrankung des Bewegungsapparates, die sich primär in einer Schwierigkeit ausdrückte, eine Bewegung anzusetzen, sowie in einer taumelnden Gangart und einer Steifigkeit in den Hinterläufen. Die Tiere waren in gutem allgemeinen Gesundheitszustand und waren fruchtbar. Erfolgreiches Züchten zwischen erkrankten Tieren resultierte nach mehreren Generationen darin, dass die gesamte Nachkommenschaft dieselben motorischen Defizite aufwies. Anschließende genetische Analyse zeigte, dass die Mutation eine autosomale rezessive Mutation ist. Die Störungen des Bewegungsablaufes wurde das erste Mal etwa am 10. postnatalen Tag beobachtet und wurde allmählich gravierender. Die Lebenserwartung dieser Tiere liegt bei etwa 18 Monaten, im Vergleich mit dem verwandten Albino-Swiss-Stamm, deren Lebenserwartung sich auf mehr als 2 Jahre beläuft, etwas verkürzt.
Ein 60%iges Defizit an der Substantia nigra pars compacta in dopaminergen Zellkörpern wurde in den AS/AGU-Mutanten, die mit den AS-Kontrollen im 12. Lebensmonat verglichen wurden, nachgewiesen. Dies lieferte den Beweis für die Einbindung der Basalganglien und ließ darauf schließen, dass die Erkrankung in ihrer Pathologie der menschlichen Parkinson-Krankheit sehr ähnlich sein könnte, die durch den Verlust von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) charakterisiert ist.
Weitere Forschung unter Verwendung des Mikropunchverfahrens zeigte im Vergleich mit gleichaltrigen Kontrollen einen Abbau von Dopamin im Gewebe (präsynaptisch und freigesetzt kombiniert) im dorsalen und lateralen Striatum um 30 % bzw. 20 % bei 12 Monate alten AS/AGU-Mutanten (Campbell et al., Neuroscience Letters 213, 173–176 (1996). Dies war eine erwartete Folge des Verlusts oder der verminderten Funktion von dopaminergen Neuronen in der SNpc, die bis zum Striatum vorragen.
Bei der Durchführung einer Altersgruppenstudie an Ratten, die 3, 6, 9 und 12 Monate alt waren, wurde herausgefunden, dass der Abbau von Gewebedopamin im dorsalen und lateralen Striatum von AS/AGU-Mutanten ab einem Alter von 6 Monaten zu steigen begann, was zeigte, dass die Erkrankung eine fortschreitende war (Campbell et al., Neuroscience Letters 239, 54–56 (1997)).
Extrazelluläre Konzentrationen an Dopamin und seinem Metaboliten 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) wurden mittels Mikrodialyse im Corpus striatum von AS/AGU-mutierten Ratten bei Bewusstsein gemessen. Für extrazelluläre Konzentrationen an Dopamin wurde herausgefunden, dass sie sehr signifikant reduziert waren – etwa um 80 % bei 9-Monate-alten AS/AGU-Ratten im Vergleich zu gleichaltrigen AS-Kontrollen. Dieser Prozentsatz stieg auch über einen Altersbereich an. Die extrazellulären Konzentrationen des Abbauprodukts von Dopamin, d.h. DOPAC, waren bei AS/AGU-Ratten im Vergleich zu AS-Kontrollratten in allen Altersgruppen erhöht (Campbell et al., Neuroscience 10, 1963–1967 (1998)).
Wurde den AS/AGU-Ratten L-Dopa verabreicht, so zeigte sich, dass dies die Fähigkeit der AS/AGU-Ratten, zahlreiche Bewegungsabläufe, wie z.B. das Aufrichten (auf die Hinterläufe) und das Abwärtslaufen entlang einer geneigten Rampe, durchzuführen, bedeutend steigerte. Dies wurde auch beobachtet, wenn fötale Mittelhirnzellen in das Striatum transplantiert wurden. L-Dopa-Behandlung und fötale Mittelhirntransplantate sind dafür bekannt, den symptomatischen Zustand menschlicher Parkinson-Krankheits-Patienten zu verbessern. Dieses Resultat zeigte auf, dass der Großteil der Bewegungseinschränkungen und somit des neurodegenerativen Schadens bei den AS/AGU auf den Verlust der dopaminergen Neuronenfunktion in der SNpc zurückzuführen ist (Payne et al., Movement Disorders 13, 832–834 (1998)).
All diese Forschungsarbeit lässt darauf schließen, dass die AS/AGU-Ratte als ein phänotypisches Modell für Parkinson-Krankheit gut geeignet wäre. Es gab jedoch keinen Hinweis darauf, wie die AS/AGU-Ratte auf genetischer Ebene beeinflusst werden kann.
Das PKCγ-Gen, das für das Isoenzym der Proteinkinase C vom Typ I (PKC Typ I) kodiert, wurde bereits an Mäusen untersucht, denen der Typ I Subtyp fehlte, und transgene Mäuse wurden gebildet (Abeliovich et al., Cell 75, 1253–1262 (1993)). Die mit Nullmutation gebildeten Mäuse zeigten nur geringe oder keine Verhaltensbeeinträchtigungen.
Für eine Mutation des PKCγ-Gens in Menschen wurde gezeigt, dass sie mit der Erkrankung Retinitis pigmentosa (RP) in Verbindung steht (siehe Al-Maghtheh et al., Am. J. Hum. Genetics 62, 1248–1252 (1998)). Es gab jedoch keinen Hinweis darauf, dass die Mutation mit irgendeiner zusätzlichen neurologischen Erkrankung wie beispielsweise Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder Huntington-Krankheit in Verbindung stünde.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung der Erfinder, dass eine oder mehrere Mutation(en) innerhalb des PKCγ-Gens, das für den Typ I-Subtyp von Proteinkinase C kodiert, mit der AS/AGU-Mutantenratte assoziiert ist/sind.
Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt die Verwendung eines Polynucleotidfragments, welches das PKCγ-Gen umfasst, das für den Typ I-Subtyp von Proteinkinase C kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polypeptids bereit, das Proteinkinase C vom Typ I umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung bereit.
Typischerweise kann das Medikament zur Behandlung von Säugetieren, insbesondere von Menschen, eingesetzt werden. Die neurodegenerative Erkrankung kann eine degenerative Erkrankung des Zentralnervensystems, wie beispielsweise Alzheimer-Krankheit, oder insbesondere eine neurodegenerative Erkrankung in Verbindung mit dopaminergem Zellabbau und/oder Bewegungseinschränkungen sein, wie beispielsweise Parkinson-Krankheit oder Huntington-Krankheit/Chorea, Demens mit Lewy-Körpern, Multiple-System-Atropie (umfassend striatonigrale Degenerierung, sporadische olivopontozerebellare Atrophie und Shy-Drager-Syndrom), progressive supranukleare Lähmung, kortikal-basale ganglionische (kortikobasale) Degenerierung, vaskulärer Parkinsonismus und Ballismus.
"Polynucleotidfragment", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine polymere Form von Nucleotiden jeder beliebigen Länge, sowohl auf Ribonucleinsäuresequenzen als auch auf Desoxyribonucleinsäuresequenzen. Prinzipiell bezieht sich diese Bezeichnung auf die Primärstruktur des Moleküls, wodurch dieser Begriff doppelsträngige und einsträngige DNA sowie doppel- und einsträngige RNA und Modifikationen davon einbindet.
Im Allgemeinen bezieht sich die Bezeichnung "Polypeptid" auf eine Molekülkette aus Aminosäuren mit biologischer Aktivität. Sie bezieht sich auf keine spezifische Länge des Produkts, und das Polypeptid kann, falls erforderlich, in vivo und/oder in vitro, beispielsweise durch Glykosylierung, Myristoylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung, modifiziert werden; somit sind unter anderem Peptide, Oligopeptide und Proteine unter diesem Begriff zusammengefasst. Die hierin geoffenbar ten Polypeptide können beispielsweise durch Synthese- oder Rekombinationsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten werden.
Somit ist dies ein sehr weiter Begriff, der beispielsweise Polypeptide abdeckt, die aus verschiedenen Transkripten und Spleißvarianten dieser Transkripte aus dem PKCγ-Gen erhalten werden können. Darüber hinaus können funktionelle Domänen im Protein beobachtet werden, und isolierte Polypeptide, die mit diesen funktionellen Domänen in Zusammenhang stehen, können von besonderem Nutzen sein. Beispielsweise wurden eine Regulationsdomäne, eine Kinasedomäne und eine ATP-Bindedomäne im PKC-Typ-I-Polypeptid beobachtet. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polynucleotidfragmente, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die für solche funktionelle Domänen-Polypeptide kodiert.
Es versteht sich, dass es hinsichtlich der PKCγ-Nucleotid- und -Polypeptidsequenzen, auf die hierin Bezug genommen wird, zwischen einzelnen Tieren natürliche Varianten geben kann. Diese Varianten können mittels Aminosäureunterschieden in der Gesamtsequenz oder mittels Deletionen, Substitutionen, Insertionen oder Inversionen von Aminosäuren in dieser Sequenz nachgewiesen werden. Alle dementsprechenden Varianten liegen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, ermöglicht die Degeneration des genetischen Codes Basensubstitutionen in einem Codon, was zu einem unterschiedlichen Codon führt, das für dieselbe Aminosäure kodiert. Demzufolge ist es eindeutig, dass jede derartige derivatisierte Nucleotidsequenz, die auf den hierin geoffenbarten Sequenzen basiert, ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegt.
Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch Nucleotidsequenzen, die den hierin geoffenbarten Polynucleotidsequenzen ähnlich sind. Selbstverständlich umfassen ähnliche Sequenzen solche Sequenzen, die an die Polynucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung unter stringenten Bedingungen hybridisiert bleiben. Typischerweise werden eine ähnliche Testsequenz und eine Polynucleotidsequenz der vorlie genden Erfindung für eine bestimmte Zeitspanne im Allgemeinen bei einer Temperatur zwischen 50 und 70 °C in Doppelstärken-SSC- (2 × NaCl 17,5 g/l und Natriumcitrat (SC) bei 8,8 g/l) gepufferter Salzlösung, die 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, aneinander hybridisieren gelassen, woraufhin Spülen des Substrats bei derselben Temperatur folgt, jedoch mit einem Puffer, der eine reduzierte SSC-Konzentration aufweist. Je nach Ähnlichkeitsgrad der Sequenzen sind solche Puffer mit reduzierter Konzentration typischerweise Einzelstärken-SSC, die 0,1 % SDS enthalten, Halbstärken-SSC, die 0,1 % SDS enthalten und Zehntelstärken-SSC, die 0,1 % SDS enthalten. Sequenzen mit dem höchsten Grad an Ähnlichkeit sind jene, deren Hybridisierung durch Waschen in Puffern mit reduzierter Konzentration am wenigsten beeinflusst wird. Am meisten bevorzugt ist es, dass sich die ähnlichen Sequenzen und Sequenzen der Erfindung so ähnlich sind, dass die Hybridisierung zwischen ihnen durch Waschen oder Inkubation in einem Einzehntelstärken-SSC, einschließlich 0,1 % SDS, im Wesentlichen nicht beeinflusst wird.
Weiters sind auch Fragmente in der vorliegenden Erfindung eingebunden, die vom PKCγ-Gen oder PKC-Typ-I-Protein abgeleitet sind und stets PKCγ-spezifische Eigenschaften oder PKC-Typ-I-spezifische Eigenschaften aufweisen. "PKCγ-spezifische Eigenschaften" beziehen sich auf biologische Funktionen, die natürlich vorkommendem PKCγ-Gen zuzuschreiben sind, und "PKC-Typ-I-spezifische Eigenschaften" beziehen sich auf biologische Funktionen, die natürlich vorkommendem PKC-Typ-I-Protein zuzuschreiben sind. Dies kann auch Fusionsproteine umfassen.
Alle deratigen zuvor erwähnten Modifikationen, die zu solchen Derivaten von PKCγ führen, sind durch die vorliegende Erfindung abgedeckt, solange die charakteristischen PKCγ-Eigenschaften in ihren Grundlagen im Wesentlichen unbeeinflusst bleiben.
Die Erfinder der vorliegenden Beschreibung brachten genetische Kartierungsverfahren zum Einsatz, um unter Verwendung des Verfahrens der "Positionsklonierung" (Collins, Nature Genetics 1, 3–6 (1992)) die genotypische Variante zu ermitteln, die in der AS/AGU-Ratte vorhanden ist. Dieses Kartieren zeigte, dass die AS/AGU-Mutation in großer Nähe zum genetischen Marken R158 lag (Serikawa et al., Genetics 137, 701–721 (1992)). Nucleotidsequenzierung wurde anschließend durchgeführt, was im Rahmen eines Vergleichs mit Wildtyp-AS-Sequenzen eine, Mutation im PKCγ-Gen aufzeigte.
Eine Punktmutation wurde an Nucleotid 841 der Ratten-PKCγ-Messenger-RNA-Sequenz (gezeigt in 1, worin die Nucleotidnummerierung so beschaffen ist, dass Base A des ATG-Startcodons Nr. 1 ist) in folgender Form beobachtet: eine Guaninbase in der AS-Gensequenz war zu einer Thyminbase in der AS/AGU-Mutantensequenz mutiert. Diese Transversionsmutation resultiert in der Bildung eines Stoppcodons innerhalb des Rasters, das bei Translation des PKCγ-Gens zu einem verfrüht abgeschlossenen Protein führen würde, dessen Länge sich auf 280 Aminosäuren belaufen würde. Es wird angenommen, dass dieses trunkierte Protein einige der Domänen nicht aufweisen würde, die im Wildtyp-Protein vorhanden sind. Das bedeutet, dass die Regulationsdomäne im trunkierten Protein vorhanden sein würde, jedoch nicht die Kinase- oder ATP-Bindedomänen.
Da diese genotypische Mutation mit der phänotypischen Bewegungseinschränkung in Verbindung steht, die bei den AS/AGU-Mutantenratten beobachtet wurde, kann die Beobachtung einer solchen Mutation in PKCγ in einem Präventivtest für neurodegenerative Erkrankungen, wie beispielsweise Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder Huntington-Krankheit, verwendet werden. Alternativ dazu können die Messwerte für PKC-Typ-I-Protein-Konzentrationen und/oder -Aktivität für einen Präventiv- oder Diagnosetest für neurodegenerative Erkrankungen nützlich sein.
Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Testen eines Tieres bereit, von dem angenommen wird, dass es eine Veranlagung zu einer neurodegenerativen Erkrankung hat, wobei das Verfahren das Nachweisen der Gegenwart einer Mutation im PKCγ-Gen und/oder seines assoziierten Promotors umfasst.
Typischerweise kann/können die Mutation(en) zur Bildung eines trunkierten Produkts aus dem PKCγ-Gen führen. Insbesondere kann die Mutation in der 5'-Hälfte des Gens liegen. Beispielsweise kann die Mutation eine Punktmutation beispielsweise an Position 841 des Ratten-PKCγ-Gens oder in einer ähnlichen Region des PKCγ-Gens einer anderen Spezies liegen. Fachleuten wird sofort ersichtlich sein, dass die hierin dargelegte Information in Bezug auf das Ratten-PKCγ leicht mit einer ähnlichen Mutation an einer entsprechenden Stelle im PKCγ-Gen einer anderen Spezies, wie beispielsweise Menschen, verglichen oder in Verbindung gebracht werden kann. Somit stellt die vorliegende Erfindung das Mittel bereit, mit Hilfe dessen Menschen auf eine ähnliche Mutation im menschlichen PKCγ-Gen getestet werden können und somit vorhergesagt werden kann, ob die Testperson eine neurodegenerative Erkrankung wie beispielsweise Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder Huntington-Krankheit hat oder zumindest eine genetische Veranlagung zur Entwicklung einer solchen Erkrankung aufweist.
Typische Verfahren zur Detektion der Mutation können Restriktionsfragments-Längenpolymorphismus, Hybridisierungsverfahren, DNA-Sequenzieren, Exonucleasebeständigkeit, Mikrosequenzierung, Festphasenverlängerung unter Verwendung von ddNTP, Verlängerung in Lösung unter Verwendung von ddNTP, Oligonucleotid-Ligationstests, Verfahren zum Nachweisen einzelner Nucleotidpolymorphismen wie beispielsweise dynamische Allel-spezifische Hybridisierung, Ligationskettenreaktion, Minisequenzierung, DNA-"Chips", Allel-spezifische Oligonucleotidhybridisierung mit einzeln oder doppelt markierten Sonden, fusioniert mittels PCR oder Molekül-Beacons, und dergleichen umfassen.
Veränderte Konzentrationen der mRNA-Transkripte, die für das trunkierte PKC-Typ-I-Polypeptid kodieren wurden beobachtet. Somit kann die Detektion veränderter Konzentrationen des mRNA-Transkripts oder der mRNA-Vorläufer, wie beispielsweise naszierende RNA, verwendet werden, um zu diagnostizieren, ob die Versuchsperson an einer neurodegenerativen Erkrankung leidet oder eine Veranlagung hat, daran zu erkranken.
Die hierin dargelegte Information kann auch verwendet werden, um das Wildtyp-PKCγ-Gen, mutierte PKCγ-Gen oder Derivate davon genetisch zu manipulieren, beispielsweise um das Gen durch Rekombinations-DNA-Verfahren, die im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zu klonieren. Das Klonieren homologer Gene aus einer anderen Säugetierspezies kann mit dieser Information mittels durchwegs bekannter Verfahren durchgeführt werden; beispielsweise können geeignete Primer zu einer Consensus-Region und/oder zu funktionellen Domänen der in 2 gezeigten Sequenz modelliert werden, und solche Primer können als Sonden zum Klonieren homologer Gene aus anderen Organismen verwendet werden.
Darüber hinaus werden mutierte Säugetier-PKCγ- und Wildtyp-Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise an Expressionskontrollsequenzen gebunden. Solche Kontrollsequenzen können Promotoren, Operatoren, Induktoren, Ribosom-Bindungsstellen usw. umfassen. Für einen bestimmten Wirt geeignete Kontrollsequenzen können durchschnittliche Fachleute leicht auswählen.
Eine Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit verschiedenen Expressions-steuernden DNA-Sequenzen ligiert werden, was zu einem so genannten rekombinanten Nucleinsäuremolekül führt. Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Expressionsvektor, der eine exprimierbare PKCγ-Mutanten- oder Wildtyp-Nucleotidsequenz umfasst. Dieses rekombinante Nucleinsäuremolekül kann dann zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden.
Solche rekombinante Nucleinsäuremoleküle sind vorzugsweise von beispielsweise Plasmiden oder von Nucleinsäuresequenzen abgeleitet, die in Bakteriophagen oder Viren vorhanden sind und als Vektormoleküle bezeichnet werden.
Spezifische Vektoren, die verwendet werden können, um Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung zu klonieren, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (z. B. Rodriguez & Denhardt (Hrsg.), Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths (1988)).
Die Verfahren, die zur Konstruktion eines rekombinanten Nucleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung zu verwenden sind, sind Fachleuten bekannt und unter anderem in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbour Laborstory (1989), beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine transformierte Zelle, die das mutierte oder das Wildtyp-Nucleinsäure-Molekül in einer exprimierbaren Form umfasst. "Transformation" wie hierin verwendet bezieht sich auf das Einführen einer heterologen Nucleinsäuresequenz in eine Wirtszelle in vivo, ex vivo oder in vitro, unabhängig vom verwendeten Verfahren, beispielsweise durch Calciumphosphat-Cofällung, direkter Aufnahme oder Transduktion.
Die heterologe Nucleinsäuresequenz kann durch autonome Replikation aufrechterhalten oder alternativ dazu in das Genom des Wirts integriert werden. Die rekombinanten DNA-Moleküle werden vorzugsweise mit geeigneten Kontrollsequenzen bereitgestellt, die mit dem ausgewählten Wirt kompatibel sind und die Expression der insertierten Nucleinsäuresequenz steuern können.
Die am häufigsten verwendeten Wirte zur Expression von rekombinanten Nucleinsäuremolekülen sind Bakterien, Hefe, Insektenzellen und Säugetierzellen. Jedes System birgt seine Vor- und Nachteile in Bezug auf den verwendeten Vektor, die mögliche Leichtigkeit von Herstellung und Reinigung eines rekombinanten Polypeptids und die Authentizität des Produkts in Bezug auf Tertiärstruktur, Glykosylierungszustand, biologische Aktivität und Stabilität und wird von Fachleuten passend ausgewählt werden.
Zusätzlich zur Förderung von Expression eines PKC-Typ-I-Polypeptids in Zellen kann es unter bestimmten Umständen von Vorteil sein, die Expression oder Aktivität der nativen PKC Typ I in einem Wirt im Wesentlichen zu unterbinden oder reduzieren, beispielsweise im Falle der Herstellung eines Tiermodells zur Verwendung beim Wirkstoff-Screening, oder insbesondere, wenn die native PKC vom Typ I eine mutierte Form ist.
Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Antisense-Nucleotidfragment bereitgestellt, das komplementär zu einer PKC-Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung ist. Unter dem Begriff "Antisense-Nucleotidfragment" wird auch die Verwendung von synthetischen Oligonucleotidsequenzen oder entsprechenden chemischen Einheiten, die Fachleuten bekannt sind, verstanden, beispielsweise Peptidnucleinsäuren. Weiters können solche Sequenzen als Teil von Ribozym- und/oder Tripelhelix-Sequenzen verwendet werden, die auch nützlich sein können, um die Genregulierung zu steuern. Auch wird ein Nucleotidfragment bereitgestellt, das einen Nucleotidsequenz umfasst, die, wenn sie von der Zelle transkribiert wird, solch ein Antisense-Fragment produziert. Typischerweise werden Antisense-RNA-Fragmente bereitgestellt, die sich an komplementäre PKCγ-mRNA-Fragmente binden, um RNA-Doppelhelices zu bilden, was es der RNase H ermöglicht, das Molekül zu spalten und es unfähig zu machen, von der Zelle zu Polypeptiden translatiert zu werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Antkörper bereit, die für das PKC-Typ-I-Polypeptid oder trunkierte Polypeptid, wie hierin definiert, oder für Epitope davon spezifisch sind. Die Herstellung und Reinigung von Anitkörpern, die für ein Antigen spezifisch sind, ist ein auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Vorgang, und die zu verwendenden Verfahren sind Fachleuten bekannt. Die Bezeichnung Antikörper kann polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAb), humanisierte oder chimäre Antikörper, einkettige Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente, Fragmente, die durch eine Fab-Expressionsbibliothek produziert werden, anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper und Epitope, die alle der zuvor genannten Fragmente binden, umfassen, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Solche Antikörper können zur Modulierung der Expression oder Aktivität des Volllängen- oder trunkierten PKC-Typ-I-Polypeptids oder zur Detektion dieses Polypeptids in vivo oder in vitro verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein rekombinantes oder synthetisches PKC-Typ-I-Polypeptid zur Herstellung von Reagenzien zur Verwendung als prophylaktische oder therapeutische Mittel an Säugetieren bereit. Insbesondere stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend das rekombinante oder synthetische PKC-Typ-I-Polypeptid zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür, bereit.
Gemäß einem wiederum anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Polypeptids oder einer Nucleinsäuresequenz wie hierin zuvor beschrieben zur Förderung der Degeneration des Nervensystems beispielsweise zur Verwendung bei der Herstellung von Tiermodellen, die zum Wirkstoff-Screenen herbeigezogen werden können, bereitgestellt.
Auch wird die Verwendung eines Polypeptids oder einer Nucleinsäuresequenz wie hierin zuvor beschrieben zur Prävention, Verzögerung, Behandlung oder Hemmung von Degeneration des Nervensystems bereitgestellt. Weiters wird ein Verfahren zur Prävention, Verzögerung, Behandlung oder Hemmung von Degeneration des Nervensystems bereitgestellt, umfassend das Verabreichen von PKC-Typ-I-Polypeptid an eine Person, die an Degeneration des Nervensystems leidet oder von der angenommen wird, dass sie daran erkranken könnte. Solch ein Verfahren kann besondere Anwendung bei der Behandlung von degenerativen Erkrankungen des Zentralnervensystems, wie beispielsweise Alzheimer-Krankheit, oder insbesondere von neurodegenerativen Erkrankungen finden, die mit Bewegungseinschränkungen einhergehen, wie beispielsweise Parkinson-Krankheit oder Huntington-Chorea.
Auch wird ein Verfahren zur Prävention, Verzögerung, Behandlung oder Hemmung von Degeneration des Nervensystems bereitgestellt, das eine Person mit einer Nucleotidsequenz oder einem Antikörper versieht, die/der Expression oder Aktivität eines mutierten PKC-Typ-I-Polypeptids im Wesentlichen unterbindet oder reduziert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung von Polypeptiden oder Nucleinsäuresequenzen wie hierin zuvor beschrieben zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen des Nervensystems wie beispielsweise Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder Huntington-Krankheit bereit. Eine solche erwogene Behandlung kann mittels so genannter Gentherapie erfolgen, worin ein Wildtyp-PKCγ-Gen einer Person eingeführt wird, die ein mutiertes PKCγ-Gen aufweist, um den Wirkungen des mutierten PKCγ-Gens entgegenzuwirken. Dies kann durch Implantation von Zellen wie beispielsweise Fibroblasten erfolgen, die menschliches oder Säugetier-PKCγ exprimieren, das mit Herpesvirus-VP22-Protein fusioniert ist, das sich selbst und PKCγ in benachbarte Neuronen überträgt. Die Transformation der zu implantierenden Zellen kann in vitro mittels beliebig vieler Verfahren erfolgen, umfassend physikalische Mittel wie Mikroinjektion, Elektroporation, bioballistischen oder Teilchenbeschuss, Strahlinjektion oder andere; chemische Mittel wie die Verwendung von Calciumphosphat, DEAE-Dextran, Polylysinkonjugaten, "Straburst"-Dendrimerkonjugaten oder Polybren-dimethylsulfoxid. Das PKCγ-Gen selbst, das innerhalb eines geeigneten Vektors an ein geeignetes Expressionssystems endverbunden ist, kann direkt über Rezeptor-vermittelte Aufnahmesysteme wie beispielsweise Asialoglykoprotein und Transferrin, Liposome, virusähnliche Teilchen, intrazelluläre Targeting-Liganden und andere; und durch biologische Mittel, umfassend retrovirale Vektoren wie Moloney-Maus-Leukämievirus, Adenovirusvektoren und Adeno-assoziierte Virusvektoren, Herpes-Simplex-Virusvektoren, Semliki-Forest-Virusvektoren, Sindbis-Virusvektoren und andere zugeführt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur prognostischen und diagnostischen Bewertung verschiedener degenerativer Erkrankungen des Nervensystems und zur Erkennung von Personen, die eine Veranlagung für solche Erkrankungen haben, beispielsweise die Bestimmung von Allelvarianten durch Bestimmung der PKCγ-Nucleotidsequenz in einer Person und/oder die Bestimmung trunkierter Transkripte, die vom PKCγ-Gen abgeleitet sind, unabhängig davon, ob sie mRNA oder Polypeptid sind, oder Messungen von PKC-Typ-I-Konzentrationen und/oder -Aktivität. Weiters stellt die Erfindung Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit von Wirk stoffen für solche Erkrankungen und zur Beobachtung des Fortschrittes von Patienten bereit, die in klinische Versuche für die Behandlung solcher Erkrankungen eingebunden sind.
Die Erfindung stellt weiters Verfahren zur Erkennung von Verbindungen bereit, die die Expression eines mutierten oder Wildtyp-PKCγ-Gens und/oder die Aktivität des/der Produkts/Produkte solch einer Mutante oder eines Wildtyp-PKCγ-Gens, das in relevante Prozesse von degenerativen Erkrankungen des Nervensystems eingebunden sind, modulieren. Solche Verbindungen können Agonisten umfassen, die als Verbindungen definiert sind, die die Expression eines mutierten oder Wildtyp-PKCγ-Gens und/oder die Aktivität des Produkts / der Produkte solch eines mutierten oder Wildtyp-PKCγ-Gens steigern, und/oder Antagonisten, die als Verbindungen definiert sind, die die Expression eines mutierten oder Wildtyp-PKCγ-Gens und/oder die Aktivität des Produkts / der Produkte solch eines mutierten oder Wildtyp-PKCγ-Gens mindert. Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Agonisten und/oder Antagonisten bereit.
Die biologische Funktion des PKCγ-Gens kann unter Verwendung relevanter In-vivo- und In-vitro-Systeme direkter bestimmt werden. In-vivo-Systeme können Tiersysteme, die auf natürliche Weise Symptome von Nervensystemerkrankungen aufweisen, oder solche, die bearbeitet wurden, um solche Symptome aufzuweisen, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Weiters können solche Systeme transgene Tiersysteme umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In-vitro-Systeme können zellbasierte Systeme einschließen, umfassend PKCγ-Gen/PKC-Typ-I-Proteinexprimierende Zelltypen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Zellen können Wildtyp-Zellen oder Nicht-Wildtyp-Zellen sein, die Modifikationen aufweisen, von denen bekannt ist oder erwartet wird, dass sie an der Erkrankung von Interesse beteiligt sind.
Zur weiteren Charakterisierung der biologischen Funktion der PKCγ-Mutante oder des Wildtyp-Gens kann die Expression der PKCγ-Mutante oder des Wildtyp-Gens in nerhalb der In-vivo- und/oder In-vitro-Systeme moduliert werden, d.h. entweder in transgenen Tieren und/oder Zelllinien über- oder unterexprimiert werden, und die dadurch entstehende Wirkung auf das System kann anschließend untersucht werden. Alternativ dazu kann die Aktivität des Produkts des identifizierten Gens entweder durch Erhöhen oder Senken des Aktivitätsniveaus im In-vivo- und/oder In-vitro-System von Interesse moduliert und die dadurch entstehende Wirkung untersucht werden.
Die durch solche Charakterisierungen erhaltenen Informationen können auf relevante Verfahren für die Behandlung oder Kontrolle von Nervensystemerkrankungen schließen lassen. Beispielsweise kann eine relevante Behandlung eine Modulation von Genexpression und/oder Genproduktaktivität einbinden. Charakterisierungsverfahren, wie sie hierin beschrieben sind, können darauf hinweisen, ob solche Modulationen positive oder negative Auswirkungen haben. Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "positive Modulation" auf eine Steigerung der Genexpression oder -aktivität des Gens oder Genprodukts von Interesse. "Negative Modulation" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Senkung der Genexpression oder -aktivität.
In-vitro-Systeme können so entworfen sein, dass sie Verbindungen identifizieren, die in der Lage sind, die PKCγ-Mutanten- oder Wildtyp-Gen-Produkte der Erfindung zu binden. Identifizierte Verbindungen könnten beispielsweise zur Modulation der Aktivität von Wildtyp- oder Mutanten-PKCγ-Gen-Produkten nützlich sein, könnten zur Ausarbeitung der biologischen Funktion der PKCγ-Gen-Produkte nützlich sein oder könnten normale PKCγ-Genprodukt-Wechselwirkungen unterbrechen oder verstärken, beispielsweise die Aktivatoren oder Inhibitoren vom PKC-Typ-I-Protein, wie sie in Keenan et al., FEBS Letters 415, 101–108 (1997), beschrieben sind. Solche Verbindungen können in Hinblick auf deren Verwendung zur Behandlung oder Erleichterung von motorischen Einschränkungen und/oder dopaminergen Zelldegenerationserkrankungen untersucht werden.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden nun anhand von Beispielen und unter Bezug auf die beiliegenden Figuren näher beschrieben, die Folgendes zeigen:
1 ist ein Diagramm, das die Region des Rattengenoms veranschaulicht, die ausgewählt wurde, da sie Rekombinationsereignisse und genetische Marken enthält, die verwendet werden, um Schautafeln von Rückkreuzungs-Nachkommenschaft zu erstellen, die im Intervall rekombinant sind, welches das mutierte PKCγ-Gen, das hiernach als nng3 bezeichnet wird, enthält. Die drei Rückkreuzungen (BN × NNG3) F1 × NNG3, (F344 × NNG3) F1 × NNG3 und (DA × NNG3) F1 × NNG3 sind mit BN, F344 bzw. DA markiert;
2 ist ein Sequenzabgleich von Sequenzen, die aus dem PKCγ-Gen in Rattenstämmen NNG3 und AS erhalten wurden. Sequenzen sind zur Ratten- (Rattus rattus-) mRNA-Sequenz angeordnet, die von NCBI (Zugriffsnummer: X07287) erhalten wurde. Die Punktmutation, die innerhalb der nng3-Sequenz identifiziert ist, ist bei Nucleotid 841 fett und unterstrichen dargestellt. Die Stelle des Translationsstartpunkts ist unterstrichen gezeigt, und der Mikrosatellit, der den Marken R158 definiert (innerhalb der 3'UTR), ist kursiv gezeigt. Die Primer, die den Marken R158 definieren, sind unterstrichen und durch Pfeile hervorgehoben gezeigt. Die normale Translationsstoppstelle ist bei Nucleotid 2093 fett und unterstrichen dargestellt;
3 ist ein Abgleich der PKCγ-DNA-Sequenz, wie in 2 veranschaulicht, mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz. Die veranschaulichte Sequenz stammt aus dem Rattenstamm Rattus rattus, und die in der in 2 veranschaulichten Sequenz sichtbare Nucleotidumwandlung ist in Fettdruck dargestellt, nachstehend die Sequenz von Aminosäure Nr. 281. Die normalen Translationsstart- und -stoppcodons sind in Fettdruck gezeigt. Die Stelle, an der ein Codon, das für die Aminosäure Glu kodiert, durch die Mutation eines stoppcodons mutiert ist, was zu einem Polypeptidterminator führt, ist auch angegeben und in Fettdruck dargestellt;
Die 4(a) und (b) sind Immunzytochemie-Färbungen von Rattengehirnen mit Anti-PKCγ-Antikörper. 4(a) veranschaulicht AS-Kontroll-Rattengehirn, das mit PKCγ gefärbt ist, wobei die Purkinje-Zellschichten 10 und Körnerzellschichten 15 angegeben sind. 4(b) veranschaulicht NNG3-Rattengehirne, die mit Anti-PKCγ-Antikörper gefärbt sind.
5 veranschaulicht einen Western-Blot aller Gehirnproteine der NNG3- und AS-Stämme, die mit einem Anti-PKCγ-Antikörper sondiert wurden. Der Spurmarker (M) enthält eine BENCHMARK^TM-vorgefärbte Proteinleiter (GibcoBRL), und die Größen der Banden sind an der linken Seite angegeben. Die AS- und NNG3-markierten Spuren enthalten Proteine, die aus Gehirngewebe von AS- bzw. NNG3-Rattenstämmen isoliert wurden; und
6 veranschaulicht eine In-situ-Hybridisierungs-Untersuchung des PKCγ-mRNA-Transkripts in den mit NNG3 und AS markierten Rattenstämmen. Die Gehirnschnitte von jedem Stamm wurden nacheinander durchgeführt, und alle Schnitte wurden gleichzeitig sondiert.
7 veranschaulicht einen Abgleich der AS-Klon-17-Sequenz (unten) mit der Sequenz aus Ratten-mRNA-Protein-Kinase-C-γ aus der NCBI-Datenbank (Zugriffsnummer: X07287) (oben). Ein schwarzer Punkt zwischen den Sequenzen bezeichnet identische Basen. Die Start- und Stoppcodons sind in Fettdruck angegeben.
8 veranschaulicht einen Abgleich der vom Klon (Klon 28) menschlicher Volllängen-cDNA erhaltenen Sequenz mit Sequenzen, die aus der NCBI-Datenbank erhalten wurden (Zugriffsnummern: 215114, H.sapiens-mRNA von Proteinkinase-C-γ (partiell) und M13977, Menschliche (Klon-γ-hPKC-γ6) Proteinkinase-C-γ (PRKGCG).
9 ist ein Vergleich der DNA-Sequenz von Ratten-PKCγ-cDNA und NNG3-cDNA. Die Ratten-PKCγ-Sequenz ist oben dargestellt, die NNG3-Sequenz unten. Die Start- und Stoppcodons sind in Fettdruck dargestellt. In der NNG3-Sequenz ist an Base 1281, nach dem Stoppcodon, ein Basenfehler vorhanden.
10 ist ein Vergleich der Aminosäurensequenzen der translatierten PKCγ- und NG3-DNA. Die NNG3-Sequenz ist zuoberst gezeigt, während die Ratten-PKCγ-Sequenz darunter dargestellt ist.
11 veranschaulicht einen Western-Blot von Rattengehirnprotein. (Primärantikörper: RBI polyklonal PKC-γ bei einer Verdünnung von 1:1.000, Sekundärantikörper-Verdünnung: 1:1.000).
12 veranschaulicht die Resultate des Tests mit geneigter Rampe aus zwei unabhängigen Experimenten. Planke 1 ist 120 mm breit, Planke 2 ist 100 mm breit, Planke 3 ist 70 mm breit, Planke 4 ist 50 mm breit, Planke 5 ist 20 mm breit und Planke 6 ist 10 mm breit. Den Kontrolltiere wurde nichts injiziert. Das Vektortier erhielt pRcCMV2 ohne Insert. DNA bezieht sich auf eine Injektion von Ratten-PKCγ in pRcCMV2. 1 μg Vektor oder DNA wurde in PEI bei einem Beladungsverhältnis von entweder 1:100 oder 1:1.000 wie angegeben zugeführt.
Experiment 1 - Genetische Feinkartierung der nng3-Mutation durch Gendiagnose von Rückkreuzungsnachkommenschaft mit R158
Die Erfinder der vorliegenden Beschreibung brachten Verfahren zur Genkartierung zum Einsatz, um die im AS/AGU-Stamm vorhandene genotypische Variante unter Verwendung von "Positionsklonierung" (Collins, Nature Genetics 1, 3–6 (1992)) zu ermitteln. Die Anwendung dieses Ansatzes beruhte zuerst auf der Bestimmung der chromosomalen Lokalisierung des Gens durch Nachweisen von Verbindungen zu bekannten Markengenen. Diesem Schritt folgte zusätzliche Feinkartierung, um die das Gen enthaltende genetische Region einzuschränken, woraufhin entweder Sequenzieren der Region oder Auswahl von mRNA-Transkripten aus der Region erfolgte.
Genetische Verbindung ist eine direkte Folge der physikalischen Verbindung von zwei oder mehreren Genen mit demselben Paar von DNA-Molekülen, die eine bestimmten Satz von Chromosom-Homologen innerhalb des diploiden Genoms definieren (Silver, Mouse Genetics: Concepts and Applications, Oxford University Press (1995)). Im Allgemeinen tritt Crossing-over an zufällig ausgewählten Stellen entlang aller Chromosomen im Säugetiergenom auf. Eine direkte Folge dieser Zufälligkeit ist, dass es, je weiter zwei verbundene Stellen voneinander entfernt sind, umso wahrscheinlicher ist, dass ein Crossover-Ereignis irgendwo innerhalb der Länge des Chromosoms stattfindet, das zwischen diesen zwei Stellen liegt (Silver, 1995). Somit liefert die Häufigkeit von Rekombination eine relative Abschätzung der genetischen Distanz zwischen einem bekannten Markergen und einem davor unbekannten Gen.
Drei Rückkreuzungen wurden für den NNG3-Stamm und die Stämme F344, BN und DA gebildet (Festing, Inbred Strains in Biomedical Research, London: The MacMillan Press Ltd. (1979)), um das Kartieren des nng3-Gens zu ermöglichen. Die F344-, BN- und DA-Rattenstämme wurden ausgewählt, da sie im Vergleich zum NNG3-Stamm die stärkste Variation innerhalb von Mikrosatellitensequenzen aufwiesen (Shiels et al., Mammalian Genome 6, 214–215 (1995)). Mikrosatellitensequenzen sind als Tandemwiederholungen von einfachen Dinucleotid- oder anderen DNA-Sequenzen definiert, die in Allelformen unterschiedlicher Länge auftreten. Sie werden als gute genetische Macker erachtet und werden durch Bewerten der Länge eines kurzen Polymerasekettenreaktions-Produkts, das den Mikrosatelliten enthält, unter Verwendung von Gel-Elektrophorese untersucht.
Um eine Rückkreuzung zu bilden, wurde jeder relevante Stamm (DA, F344 und BN) mit dem NNG3-Stamm gekreuzt, und die resultierende heterozygote F1-Nachkommenschaft wurde mit dem NNG3-Stamm rückgekreuzt. Die resultierende Rückkreuzungsnachkommenschaft wurde anschließend genotypisiert, um festzustellen, ob ein Crossover-Ereignis zwischen dem Gen von Interesse und einem beliebigen genetischen Marken stattgefunden hatte. Dies ermöglichte das Positionieren des Gens innerhalb einer bestimmten chromosomalen oder subchromosomalen Region.
Insgesamt wurden aus den drei Rückkreuzungen 3.188 Rückkreuzungsnachkommenschaften produziert. Ein vollständiger Genomscan wurde mit 73 Mikrosatellitenmarkern durchgeführt, umfassend das Genotypisieren von zumindest einem informativen Marken pro Rattenchromosom. Alle diese Marken wurden auf Verbindungen zur nng3-Mutation getestet. Genetische Verbindungen wurden mit dem Marken R33 beobachtet (Serikawa et al., Genetics 131, 701–721 (1992)), der an Chromosom 1 lokalisiert und etwa 30 cM vom nng3-Gen kartiert wurde. Eine Reihe an Markern von innerhalb dieser chromosomalen Region wurde anschließend verwendet, um die gesamte Rückkreuzungsnachkommenschaft zu genotypisieren. Die engsten Marker-Stellen, die die nng3-Mutation umklammerten, wurden ausgewählt, um ein Chromosom-Intervall zu erstellen, innerhalb dessen präzise Kartierung durchgeführt wurde. Dieses Intervall war für jede Rückkreuzung unterschiedlich, wie in 1 ersichtlich ist. Dies ermöglichte Feinkartierung der Region und identifizierte Rekombinationsereignisse zwischen Markern. Die verwendeten Marken sind für die drei Rückkreuzungen (BN X NNG3) F1 X NNG3, (F344 X NNG3) und (DA X NNG3) F1 X NNG3 in 1 gezeigt.
Jegliche Nachkommenschaft, für die im Rahmen der Untersuchung erkannt wurde, dass sie Rekombinationsereignisse innerhalb des Intervalls aufwies, wurde unter Verwendung des Genmarkers R158 genotypisiert (Serikawa et al., 1992). Der Genmarker R158 besteht aus einem Paar von PCR-Primern, die eine (CA)₂₆-Mikrosatellitenwiederholung aus der 3'UTR des PKCγ-Gens amplifizieren. Für die drei Rattenstämme BN, F344 und DA wurde gezeigt, dass sie für R158 informativ waren, was bedeutet, dass für die Länge des Mikrosatelliten gezeigt wurde, dass sie im Vergleich zum NNG3-Rattenstamm bei den verschiedenen Stämmen unterschiedlich ist. Das Genotypisieren wurde an genomischer DNA mittels PCR durchgeführt, wie im folgenden experimentellen Teil beschrieben wird. Die PCR-Produkte wurden dann mittels Gel-Elektrophorese entweder auf 6%igem Acrylamid oder auf 4%igem Metaphor- (Flowgen-) Agarosegelen aufgelöst.
In diesem Experiment (n=3.188) wurde für kein Tier beobachtet, dass es ein Rekombinationsereignis zwischen der nng3-Mutation und dem Marken R158 enthielt. Dies positionierte die nng3-Mutation 0 ± 0,06 cM vom genetischen Marken R158 entfernt. Bei der Maus entspricht 0,06 cM etwa 60 kb Chromosomen-DNA-Länge. Diese Kartierungsexperimente zeigten, dass die nng3-Mutation (und das Gen) sehr nahe am R158-Mikrosatelliten liegt, der selbst innerhalb des Gens PKCγ, das für die Typ-I-Isoform von Proteinkinase C kodiert, liegt. Somit ist das nng3-Gen sehr wahrscheinlich PKCγ selbst oder ein unmittelbar benachbartes Gen.
Experiment 2 - Demonstration eines DNA-Sequenzunterschieds zwischen den Allelformen des PKCγ-Gens im Stamm und dem verwandten AS-Stamm
Der Genkartierungsbeweis band das PKCγ-Gen als die Stelle der nng3-Mutation ein. Sofern diese Einbindung korrekt ist, muss ein DNA-Sequenzunterschied zwischen den Allelformen des PKCγ-Gens um NNG3-Stamm und im AS-Stamm bestanden haben, wovon ausgehend der NNG3-Stamm durch spontane Mutation entstand. Somit wurde das folgende Experiment durchgeführt, um den Beweis für diesen Sequenzunterschied zu liefern.
RNA wurde aus 12 Monate alten Ratten sowohl aus den mutierten (NNG3) als auch den Kontroll- (AS-) Stämmen isoliert. RNA wurde unter Verwendung von TRI REAGENT^TM (Sigma) unter Berücksichtigung der Arbeitsvorschriften des Herstellers isoliert. RNA wurde aus 1 g Gehirngewebe isoliert und in 10 ml TRI REAGENT^TM homogenisiert. 1 μg RNA wurde anschließend verwendet, um cDNA unter Verwendung des Sets Oligo (dT)_12–18 Superscript^TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis von Gibco BRL zu synthetisieren. 50 ng cDNA wurden dann als Matrize bei einer PCR-Reaktion verwendet. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung 1 Einheit von Taq-DNA-Polymerase (Promega) in einem Reaktionsgemisch, das 1x Magnesium-freien Thermopuffer, 1 mM Magnesiumchlorid (alles mit Tag-Polymerase von Promega geliefert), 125 μM dNTPs (Promega) und Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit 5 ng/μl jeweils enthielt, durchgeführt. Bei der PCR-Reaktion wurde stets ein Warmstart durchgeführt. Die Sequenzen aller verwendeten PCR- sind in Tabelle 1 zusammen mit den PCR-Reaktionen, in denen sie verwendet wurden, angegeben.
Tabelle 1
Tabelle 1 - Die verwendeten PCR-. Die Sequenzen der verwendeten PCR-Primer sind zusammen mit den Reaktionen, in denen sie verwendet wurden, angegeben.
Die verwendeten PCR-Parameter für Taq-DNA-Polymerase waren wie folgt:
PCR-Produkte wurden dann auf einem 2%igen Agarosegel (Boehringer Mannheim) aufgelöst und anschließend vor dem Sequenzieren aus dem Gel unter Verwendung des Qiaquick^TM-Extraktionssets extrahiert.
Das Sequenzieren der PCR-Produkte erfolgte am automatischen ABI-373-Strecksequenzierer unter Verwendung der Big-Dye-Terminatorchemie (Perkin Elmer). 3,2 pmol eines Primers, der in der PCR-Reaktion verwendet wurde, wurden auch zum Sequenzieren eingesetzt.
PCR-Reaktionen wurden auch an genomischer Ratten-DNA durchgeführt, die aus beiden Rattenstämmen entnommener Rattenmilz isoliert worden war. DNA wurde unter Verwendung des Pure-Gene-DNA-Isolation-Sets (Gentra) isoliert. PCR-Reaktionen wurden wie zuvor durchgeführt, wobei 100 ng genomischer DNA als Matrize enthalten waren. Der anfängliche Denaturierungsschritt der PCR-Reaktion wurde auch auf 10 Minuten gesteigert.
PCR-Reaktionen wurden auch unter Verwendung von Proof-reading-DNA-Polymerase-Enzymen durchgeführt, um Fehler während der DNA-Polymerisation zu vermeiden. Die Enzyme und Modifikationen der PCR-Reaktionen waren wie folgt: Tli-Polymerase- (Promega) Reaktionen wurden mit 1,25 Einheiten des Enzyms durchgeführt, das sich bei 74 °C ausdehnt. Das High Fidelity- (HF-) Set von Clontech arbeitet mit automatischem Warmstart und führt bei 68 °C 3 Minuten lang gleichzeitig die Schritte des Annealings und der Verlängerung aus.
Drei verschiedene Populationen von cDNA wurden synthetisiert und PCR-Produkte wurden aus diesen Sequenzen erhalten (eine Zusammenfassung der experimentellen Resultate ist in Tabelle 2 zu sehen). Alle sequenzierten PCR-Produkte wiesen ein G-Nucleotid im AS-Rattenstamm an Position 841 und ein T-Nucleotid an derselben Position im NNG3-Rattenstamm auf, wie in 2 gezeigt ist. Diese Transversionsmutation schafft ein neues Terminations- oder Stoppcodon zur Translation von PKCγ, was in einem frühzeitig terminierten Protein resultiert (3). Wenn die Kinase-aktive Domäne des Proteins verloren geht, führt dies zu einem Verlust der Fähigkeit, die Zielproteinsubstrate zu phosphorylieren, was wiederum eine ganze Reihe an biologischen Folgen mit sich bringt. Dieser erwogene Funktionsverlust scheint im Einklang mit der rezessiven Natur der Mutation zu stehen.
Tabelle 2
Diese Kartierungs- und Sequenzierungsergebnisse zeigen, dass ein Sequenzunterschied zwischen den NNG3- und AS-Stämmen aufzutreten scheint. Es kann angenommen werden, dass diese Basenänderung (G zu T an Position 841, 2) im NNG3-Stamm lässt den Phänotyp entstehen, der in diesem Stamm beobachtet wird.
Experiment 3 - Detektion von PKCγ mittels Immunzytochemie
Es wurde vorausgesetzt, dass das Stoppcodon im PKCγ-Gen im NNG3-Stamm zu frühzeitiger Termination des PKC-Typ-I-Polypeptids führte. Dies würde zu einem Protein ohne Kinaseaktivität führen. Das Binden von Antikörpern, die gegen den Carboxy-Terminus des PKC-Typ-I-Proteins gezüchtet wurden (Boehringer Mannheim), an aus dem NNG3-Stamm isolierte Gehirne wurde nun untersucht.
PKCγ wurde durch Immunzytochemie unter Verwendung von Standardarbeitsvorschriften mit den folgenden Modifikationen nachgewiesen: Rattengehirne wurden 9 Monate alten männlichen Ratten entnommen und wurden über Nach in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Gehirne wurden dann geschnitten, auf einen Block platziert, und Schnitte wurden bei 50 μm unter Verwendung eines Vibratoms gesetzt. Gepaarte Schnitte wurden in Blockierungsserum (10 % NGS - normales Ziegenserum) eingebracht und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler platziert. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C in primären Antikörper eingelegt (Kanin chen-Anti-Peptid-Antikörper, hergestellt unter Verwendung eines synthetischen Peptids entsprechend den Aminosäuren 306–318 von Ratten-PKCγ, 1:100 bis 1:2.000, Boehringer Mannheim). Die Objektträger wurden anschließend dreimal in PBS jeweils 5 Minuten lang gewaschen. Die Schnitte wurden dann 1 Stunden lang in sekundären Antikörper ungelegt (biotinylierter Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, Vector). Die Schnitte wurden wiederum dreimal in PBS (jeweils 5 Minuten) gewaschen. Vecta-ABC-Farbkomplex (Vector) wurde dann den Schnitten 1 Stunde lang zugesetzt und, das Ganze wurde auf einem Schüttler platziert. Die Schnitte wurden wiederum dreimal in PBS (jeweils 5 Minuten lang) gewaschen und anschließend einmal in PB 5 Minuten lang gewaschen. 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) wurde auf die Schnitte für 5–10 Minuten aufgetragen. Die Schnitte wurden zweimal in PB (5 Minuten jeweils) gewaschen, und schließlich wurden sie dehydriert, gesäubert und als Präparat eingeschlossen.
Die 4(a) und (b) veranschaulichen den Unterschied zwischen dem NNG3-Stamm und dem verwandten AS-Stamm, von dem NNG3 abgeleitet ist.
Im Vergleich mit einer altersmäßig entsprechenden AS-Kontrolle wurde ein sehr erstaunlicher Abbau von PKCγ-positiven Zellen in Purkinje-Zellen des NNG3-Stamms beobachtet. Die Purkinje-Zellschicht ist im Vergleich zu den anderen PKC-Isoformen eine Region, in der hauptsächlich PKCγ exprimiert wird.
Dieses Resultate stimmen mit einem Verlust des Carboxy-terminalen Abschnitts oder des gesamten PKC-Typ-I-Proteins überein.
Experiment 4 - Western-Blot-Detektion von Typ-I-PKC in Rattengehirnprotein-Extrakten durch Antikörper Hybridisierung
Ein Western-Blot-Experiment wurde durchgeführt, um das Expressionsniveau des Typ-I-PKC-Proteins in Gehirnen von den Rattenstämmen AS und NNG3 zu bestimmen. Insbesondere wurden Antikörper, die gegen ein im Carboxy-Terminus der trun kierten Stelle im PKCγ-Typ-I-Protein des NNG3-Stamms angeordnetes Peptid gezüchtet wurden, verwendet, um fehlende Expression dieser Region des Proteins zu bestätigen.
Gesamt-Gehirnproteine wurden aus männlichen 9-Monate-alten Ratten sowohl aus den AS- als auch den NNG3-Stämmen extrahiert. Die Proteine wurden aus 0,2 g Gehirngewebe unter Verwendung von TRI-REAGENT^TM (Sigma) isoliert und in 2 SDS suspendiert. 50 μg gesamte Proteine wurden auf einem 10%igen SDS-PAGE (-Polyacrylamidgelelektrophorese-) Gel bei 200 V 45 Minuten lang aufgelöst. Die Proteine wurden dann in Nitrocellulose (Amersham Life Science) in einen Western-Blotter bei 30 V über Nacht übertragen. Die Nitrocellulose wurde dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur, in einer Lösung von Tris-gepufferter Salzlösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl), die 0,05 % Tween 20 (TEST) und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, geblockt. Die Nitrocellulose wurde dann in TBST plus 1 BSA mit 2 μg/ml Anti-PKCγ inkubiert (Kaninchen-Anti-Peptid-Antikörper, hergestellt unter Verwendung eines synthetischen Peptids entsprechend den Aminosäuren 306-318 von PKCγ, GibcoBRL). Der Blot wurde dann dreimal in TBST 10 Minuten jeweils gewaschen. Der Blot wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur in TBST, das Anti-Kaninchen-Ig, Peroxidase-gebundenen, Spezies-spezifischen Antikörper (vom Esel, Amersham Life Science) bei einer Verdünnung von 1:1.000 enthielt, inkubiert. Der Blot wurde dann wie zuvor detailliert erklärt gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Blot mit ECL Western-Blotting-Detektionsreagenzien (Amersham Pharmacia Biotech) inkubiert und anschließend damit Autoradiographie-Film (Fuji XR) belichtet.
Dieses Experiment wurde an Proteinen durchgeführt, die aus dem NNG3-Stamm und dem Kontroll-Rattenstamm (AS) extrahiert worden waren. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Eine Bande der vorhergesehenen Größe (80 kDa) wurde beim AS-Stammproteinextrakt erhalten, während für das NNG3-Stammproteinextrakt kein Signal erhalten wurde. Der Anti-PKCγ-Antikörper erkennt ein Epitop entsprechend den Aminosäuren 306–318 des Proteins. Für NNG3 wird vorausge setzt, dass ein trunkiertes Protein hergestellt wird, das an Aminosäure 281 endet; daher zeigen diese Resultate, dass das Epitop zur Antikörperbindung im NNG3-Protein nicht vorhanden ist, wie angenommen wurde.
Experiment 5 - Untersuchung zur In-situ-Hybridisierung des PKCγ-mRNA-Transkripts in AS- und NNG3-Ratten
Ein In-situ-Hybridisierungs-Experiment wurde durchgeführt, um das Expressionslevel von mRNA, die für die Typ-I-PKC kodiert, in den Rattenstämmen AS und NNG3 zu bestimmen.
Eine Antisense-Oligonucleotidsonde wurde für die 3'Region der PKCγ-mRNA (Nucleotide 2.085–2.326, die Zahlen sind 2 entnommen) entworfen und wurde durch HPLC (GibcoBRL) synthetisiert und gereinigt. Die Sequenz des Oligonucleotids war wie folgt:
Vollständige Gehirne wurden 8 Monate alten AS- und NNG3-Ratten entnommen. Diese Gehirne wurden als Präparat eingeschlossen und horizontal in 13-μm-Schnitte geschnitten, und die Schnitte wurden auf mit Poly-L-Lysin behandelte Mikroskopobjektträger fixiert (thaw-mounted). Die Schnitte wurden dann in 4 % Paraformaldehyd in 1× PBS (Phosphat-gepufferter Salzlösung, alle Lösungen wurden mit Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser hergestellt) 5 Minuten lang auf Eis fixiert, woraufhin PBS 2 Minuten lang folgte, anschließend in 70 % Ethanol 2 Minuten lang dehydratisiert, 5 Minuten lang in 95 % Ethanol dehydratisiert und in 100 % Ethanol bei 4 °C bis zur Verwendung gelagert.
Die In-situ-Hybridisierungssonden werden markiert und zur Hybridisierung auf folgende Weise vorbereitet: 40 ng des Oligonucleotids wurden in einem Reaktionsvolumen von 12,5 μl, hergestellt aus DEPC-Wasser, das 1 × Reaktionspuffer (ergänzt mit En zym), 25 μCi von S³⁵ α-dATP und 36 Einheiten vom terminaler Desoxynucleotidyltransferase (TdT, FPLC rein, Pharmacia) enthielt, markiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei 37 °C 1 Stunde lang inkubiert. Reinigungssäulen wurden in 1-ml-Kunststoffspritzen mit GF/C-Filterpapier, geschnitten mit einem Korkbohrer Nr. 2, erzeugt, auf den Boden der Spritze platziert, und die Spritze wurde mit G50 Sephadex (Pharmacia) gepackt. Die Säule wurde dann bei 2.000 U/min 1 Minute lang zentrifugiert, um das Sephadex zu packen. 87,5 μl DEPC-behandeltes Wasser wurde dann der Sonde zugesetzt, um 100 μl zu ergeben. Die Sonde wurde der Säule zugesetzt und eine weitere Minute bei 2.000 U/min in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen zu Sammeln zentrifugiert. Das Eluat wurde dann gesammelt und das Volumen gemessen. Die spezifische Aktivität der Sonde wurde durch Füllen von 2 μl der eluierten Sonde in einer Szintillationsphiole und Zusetzen von 5 ml Szintillationssubstanz bestimmt. Die spezifische Aktivität der Sonde wurde dann in einem Szintillationszähler unter Verwendung des Tritiumkanals gemessen. Die Sonde wurde dann standardisiert, um 2 × 10³ Zerfälle pro Minute/ml der Hybridisierungsmischung 50 % Formamid, 4 × SSC, 10 % Dextransulfat, 5 × Denhardts Lösung, 200 μg/ml sauer-basisch gereinigte Lachssperma-DNA, 100 μg/ml langkettige Polyadenylsäure, 120 μg/ml Heparin, 25 mm Natriumphosphat, pH 7, 1 mm Pyrophosphat und anschließend zugesetztem DDT zu einer Endkonzentration von 20 mm zu erhalten. Ein 100facher Überschuss an kaltem Oligonucleotid wurde der Kontrollhybridisierungsmischung auch zugesetzt.
Serielle Schnitte wurden zur Hybridisierung so ausgewählt, dass sie paarweise zusammen verwendet wurden und über das gesamte Gehirn verteilt waren. Die Schnitte wurden mit 200 μl der geeigneten Hybridisierungsmischung bedeckt und dann mit einem Parafilm-Deckfilm abgedeckt. Die Objektträger wurden dann über Nacht bei 42 °C inkubiert. Die darauffolgenden Tage wurden die Deckfilme mit 1 × SSC bei Raumtemperatur fortgespült, und die Schnitte wurden zweimal in einem geschüttelten Wasserbad bei 55 °C in 1 × SSC, das 4 mM DTT enthielt, 30 Minuten lang gewaschen. Die Schnitte wurden dann durch 1 × sSC 30 Sekunden lang, durch 0,1 × SSC 45 Sekunden lang, dann mit 70 % Ethanol 2 Minuten lang und schließlich mit 100 Ethanol 5 Minuten lang dehydratisiert. Die Objektträger wurden dann lufttrocknen gelassen. Nachdem sie getrocknet waren, wurden die Objektträger auf 3MM-Filterpapier aufgeklebt und damit Autoradiographie-Film (Kodak Bio-max MR-Film, einseitig beschichtet) bei Raumtemperatur 1 Woche lang belichtet.
Die Resultate des In-situ-Hybridisierungs-Experiments sind in 6 veranschaulicht. Es ist augenscheinlich, dass die Konzentration von PKCγ-mRNA im NNG3-Stamm im Vergleich zu altersgleichen Kontrollgehirnen vom AS-Stamm verändert zu sein scheint.
Experiment 6 - Isolierung von PKCγ-cDNA aus Ratten und Menschen
Volllängen-cDNA-Klone wurden für das PKCγ-Gen durch reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktions- (RT-PCR-) Amplifikation aus RNA isoliert, die aus dem Rattenstamm Albino Swiss (AS) und von Menschen isoliert worden war. Das Gehirn wurde aus einer 12-Monate-alten männlichen AS-Ratte nach Dekapitierung entfernt, und 1 g des Gewebes wurde entnommen. Gesamt-RNA wurde aus dem Gewebe unter Verwendung von TRI-REAGENT^TM (Sigma, Poole, Dorset) gemäß der Arbeitsvorschrift des Herstellers isoliert. Menschliche Gehirn-RNA von einem normalen Individuum wurde von Stratagene erhalten. 1 μg RNA je Probe wurde dann verwendet, um cDNA unter Verwendung des cDNA-Synthese-sets Oligo (dt)_12–18 Superscript^TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis von GibcoBRL (Inchinnan Business Park, Paisley) zu synthetisieren. 50 ng cDNA wurden dann als Matrize für PCR-Reaktionen verwendet. Alle PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung des Clontech-Advantage^®-HF-PCR-Sets gemäß den Anweisungen des Herstellers (Basingstoke, Hampshire) durchgeführt. Die Volllängen-AS-cDNA wurde unter Verwendung der Primer Neup 118E 5' -CCT TCC GAT CTC AGA GTC TGC GG- 3' und K3R 5'-TTC TAC AAC TGA AGT GGA GG-3' (PCR-Parameter: 94 °C 15 Sekunden lang, 25 Zyklen von 94 °C 10 Sekunden lang, 64 °C 4 Minuten lang, gefolgt von 68 °C 3 Minuten lang). Die menschliche Volllängen-cDNA wurde unter Verwendung der Primen Neup 144E 5'-TGA TCC TTC GAG TCT CCA GC-3' und Neup 144R 5'-ACG TTG GGG ACA CCT AGT GG-3' amplifiziert (PCR-Parameter: 94 °C 15 Sekunden lang, 25 Zyklen bei 94 °C 10 Sekunden lang, 68 °C 3 Minuten lang, gefolgt von 68 °C 3 Minuten lang). Die amplifizierten Fragmente wurden unter Verwendung des PCR-Kloniersets Zero Blunt^® ToPO^® (Invitrogen, CH Groningen, Niederlande) kloniert.
Sequenzanalyse wurde dann an den Klonen durchgeführt, um sie auf irgendwelche Fehler zu untersuchen, die während der PCR-Amplifikation eventuell eingebaut wurden. Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des BigDye-Terminatorsets (PE Biosystems, Birchwood science park, Warrington) in Gegenwart von 3,2 pmol eines Primers, der in der PCR-Reaktion verwendet wurde, durchgeführt. Die Reaktionen wurden in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System 9600 (Perkin Elmer, Birchwood science park, Warrington) wie folgt durchgeführt: 96 °C 2 Minuten lang, 25 Zyklen bei 94 °C 10 Sekunden lang, 50 °C 5 Sekunden lang und 60 °C 4 Minuten lang. Die Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem ABI 373 Anreicherungs-DNA-Sequenzierungsautomat aufgelöst. Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung der Seqed Software (PE Biosystems) analysiert.
Die Sequenzierungsresultate zeigten, dass im Vergleich zur Sequenz, die in der Datenbank gespeichert war (NCBI Zugriffsnummer: X07287), eine Basenänderung in der AS-Sequenz identifiziert werden konnte. Diese Basenänderung CAA→CAG (Base 201, 7) veränderte die Aminosäuresequenz nicht und kann einfach nur auf einen Polymorphismus hinweisen. Es gibt auch ein G, das in AS im Vergleich zur mRNA-Proteinkinase C-γ (Base 2.236) nicht vorhanden ist. Diese Basendeletion tritt nach dem Stoppcodon auf und kann auch einen Speziesunterschied darstellen.
Manche Unterschiede können auch im menschlichen cDNA-Klon festgestellt werden, wenn dieser mit den zwei Sequenzen verglichen wird, die in der NCBI-Datenbank gespeichert sind (Tab. 3 und 8), doch dies veränderte die Aminosäure wiederum nicht und kann auf einen Polymorphismus hinweisen. Tatsächlich wurde einer dieser Polymorphismen bereits von Al-Maghtheh et al. (Al-Maghtheh, M., Vithana, E.N., Inglehearn, C.F., Moore, T., Bird. A.C. & Bhattacharya, S.A.; Segregation of a PRKCG mutation in two PR11 families. American Journal of Human Genetics 62, 1248–1251(1988)), AAT 189AAC, beschrieben. Diese zwei in der Datenbank gespeicherten Sequenzen waren an dieser Base auch polymorph.
Tabelle 3
Experiment 7: Klonieren der NNG3-PKCγ-cDNA
PCR der Volllängen-cDNA wurde versucht, schlug jedoch fehl. Daher wurde PCR-Amplifikation der 5'- und 3'-Enden der NNG3-cDNA in zwei getrennten Reaktionen durchgeführt.
Rasche Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) an 5'
Gesamt-RNA aus NNG3-Rattengehirn wurde unter Verwendung von Tri-Reagens (Sigma) gemäß den Anweisungen der Hersteller präpariert. 1 mg dieser Gesamt-RNA wurde mit dem 5'-RAGE-System (Gibco BRL) verwendet. Die mit dem Set mitgelieferten Arbeitsvorschriften lauteten wie folgt. Gen-spezifischer 104R (5'-CTTA AACTTGCCCAGTTGCT – 3') wurden als GSP1 verwendet. Dies entspricht der Antisense-Sequenz zwischen den Basen 1.480 und 1.500 der PKCγ-cDNA (siehe die 7 und 9). Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von 0,4 μl des High-Fidelity-Enzyms Expand (Roche Diagnostics Ltd., Lewes, East Sussex) mit 1 μl 10 mM dNTPs, 5 μl Matrizen-cDNA, 5 μl 10 × expandiertem Puffer, 3 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl 10 μM gekürzter mit einer Region hoher Sequenzhomologie (5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG – 3') und 1 μl von 1 μM GSP1 durchgeführt. Die folgenden Bedingungen wurden für die PCR unter Einsatz eines Perkin Elmer GeneAmp PCR-Systems 9600 verwendet: 94 °C 2 Minuten lang, dann 30 Zyklen bei 94 °C 15 Sekunden lang, 50 °C 30 Sekunden lang, 72 °C 2 Minuten lang und schließlich 7 Minuten bei 72 °C.
Das Produkt dieser PCR war ein Schmier. Daher wurde die DNA 1:500 in T/E (10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA) verdünnt, und ein zweiter Durchgang von PCR wurde durchgeführt. Es wurden dieselben Reaktionsbedingungen wie zuvor verwendet, wobei jedoch der gekürzte mit einer Region hoher Sequenzhomologie durch den genspezifischen 118E (5' – CCTTCCGATCTCAGACT – 3') ersetzt wurde.
Ein Produkt der erwarteten Größe (1,3 kb) wurde aus diesem Durchgang erhalten und wurde unter Verwendung des PCR-Klonierungssets Zero Blunt^® TOPO^® (Invitrogen) und der Anweisungen des Herstellers direkt in den Vektor pCRbluntIITOPO kloniert. Dieses Produkte wurde als NNG3 5/12 bezeichnet.
3'-RACE
Gesamt-RNA aus NNG3-Rattengehirn wurde unter Verwendung von Tri-Reagens (Sigma) gemäß den Anweisungen der Hersteller präpariert. 1 mg dieser Gesamt-RNA wurde mit dem 3'-RACE-System (Gibco BRL) verwendet. Die mit dem Set gelieferten Arbeitsvorschriften wurden befolgt.
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen Bedingungen und Komponenten durchgeführt, wobei jedoch die durch den universellen Amplifikationsprimer (5'-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC – 3') und den genspezifischen 113E (5' – GCTACTCAAGGCTCCTGTGGATGG – 3'), der der Region der Basen 793 bis 816 der PKCγ-cDNA entspricht, (siehe die 7 und 9) ersetzt wurden.
Wiederum war das Produkt dieser PCR ein Schmier. Daher wurde die DNA 1:500 in T/E verdünnt, und ein zweiter PCR-Durchgang wurde durchgeführt. Dieselben Reaktionsbedingungen wie zuvor wurden verwendet, wobei jedoch der universelle Amplifikationsprimer durch einen zweiten genspezifischen 114R (5' – TGAGATTAC-ATGACGGGCACA – 3') ersetzt wurde, der der Region zwischen den Basen 2.077 und 2.096 der PKCγ-cDNA in entgegengesetzter Richtung entsprach (siehe die 7 und 9).
Ein Produkt von erwarteter Größe (1,3 kb) wurde aus diesem PCR-Durchgang erhalten und wurde unter Verwendung des PCR-Klonierungssets Zero Blunt^® TOPO^® (Invitrogen) und unter Berücksichtigung der Anweisungen der Hersteller direkt in den Vektor pCRbluntIITOPO kloniert. Dieses Produkt wurde als NNG3 3/9 bezeichnet.
Die zwei NNG3-Klone stellen sich überlappende Sequenzen zwischen den Basen 797 und 1.357 bereit. Eine einzelne BamHI-Restriktionsverdaustelle an der Base 1.112 wurde daher verwendet, um die zwei Fragmente miteinander zu verbinden.
NNG3 5/12 und NNG3 3/9 wurden mit HindIII (Promega) und BamHI (Promega) verdaut, um das 5'-NNG3-Fragment aus beiden Plasmiden freizusetzen. Die NNG3-5'-Fragmente wurden aus dem NNG3-5/12-Verdau gereinigt, während das Plasmid aus dem NNG3-3/9-Verdau gereinigt wurde. Agarosegelreinigung wurde unter Verwendung eines Qiaquick-Gelextraktionssets (Qiagen) durchgeführt.
Das aus NNG3-5/12 gereinigte Fragment könnte dann in NNG3-3/9 ligiert werden, um die Volllängen-NNG3-cDNA zu ergeben. Die DNA wurde dann sequenziert, um die Assemblierung zu überprüfen und um sicherzustellen, dass im Zuge der PCR keine Mutationen eingeführt wurden.
Die zwei Proteine wurden anschließend unter Verwendung der Seqed-Software (PE Biosystems) translatiert, und es könnte daran gesehen werden, dass das NNG3-Protein an Aminosäure 280 abgeschlossen ist (siehe 10).
Experiment 8 - Western-Blot von PKCγ
Gehirnproteinextrakte aus normalen AS-Ratten und NNG3-Ratten wurden durch Homogenisierung von 500 mg Gewebe in 2,5 ml eiskaltem 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,6, hergestellt. Die Homogenate wurden bei 1.000 g 15 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand aus jeder Probe wurde sorgfältig mit einer Spritze entfernt und bei –20 °C in Aliquoten gelagert.
Die Proteinkonzentration jeder Probe wurde unter Verwendung eines Bichinchoninsäureprotein-Testsets (Sigma) gemessen. 30 μg jeder Proteinprobe in Kombination mit einem entsprechenden Volumen an Probenpuffer (0,0625 M Tris, pH 6,8, 2 Natriumdodecylsulfat, 10 % Glycerin, 5 % β-Mercaptoethanol, 0,001 % Bromphenolblau) wurden dann auf ein 10%iges Polyacrylamidgel (28,2:0,8 Acrylamid:Bisacrylamid, 0,375 M Tris, pH 8,8, 0,1 % Natriumdodecylsulfat) mit einem 3%igen Sammelgel (28,2:0,8 Acrylamid:Bisacrylamid, 0,125 M Tris, pH 6,8, 0,1 % Natriumdodecylsulfat) geladen. Vorgefärbte Benchmark-Proteinstandards (Gibco BRL) wurden zusammen mit den Proteinproben geladen, um einen Vergleichswert für das Molekulargewicht des Proteins von Interesse bereitzustellen. Laufpuffer (0,025 M Tris (Base), 0,192 M Glycin, 0,1 % Natriumdodecylsulfat) wurde der Minigel-Vorrichtung (Biorad, Hemel Hempstead, Hertfordshire) zugesetzt, und eine Spannung von 200 V wurde mittels einer Elektrophorese-Stromversorgungseinheit Biorad Power Pack 300 an das Gel angelegt.
Nach 45 Minuten hatte die Farbfläche den unteren Teil des Gels erreicht, was darauf hinwies, dass die Elektrophorese des Gels abgeschlossen war. Die Gelvorrichtung wurde abgebaut, und das Gel wurde in eine Western-Blotting-Vorrichtung (Biorad) gegen ein Stück von PVDF-Membran (Roche) platziert. Die Proteine wurden unter Verwendung von Towbin-Puffer (12,11 g Tris (Base), 57,6 g Glycin, 800 ml Methanol, 1,2 ml Salzsäure in einem Volumen von 4 l) und einer Spannung von 40 V, die über Nacht, angelegt wurde, auf die Membran übertragen.
Die Membran mit gebundenen Proteinen wurde aus der Vorrichtung entfernt und in Blockierungslösung (10 % (Gew./Vol.) getrocknete Milch in PBS-T (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44g Na₂HPO₄, 0,24 g KH₂PO₄, eingestellt auf pH 7,4 und gesteigert auf 11, mit 0,1 % Tween 80) 30 Minuten lang eingetaucht. Ein zweiter Waschschritt von 30 Minuten wurde anschließend durchgeführt.
Antikörper, der spezifisch für PKCγ (Epitop-Aminosäuren 684–697) (RBI, Sigma, Poole, Dorset) ist, wurde in Blockierungslösung auf eine Konzentration von 1:1.000 verdünnt, und die Membran wurde drei Stunden lang unter sanftem Schütteln in diese Lösung eingelegt. Nach Inkubation wurde die Membran dreimal in Blockierungslösung gewaschen, wobei ein Waschschritt 10 Minuten dauerte. HRP-markierter sekundärer Antikörper, spezifisch für Kaninchen (Amersham, Buckinghamshire), verdünnt auf 1:1.000 in Blockierungslösung, wurde dann über die Membran gegossen, und Inkubation wurde unter sanftem Schütteln 1 Stunde lang fortdauern gelassen. Die Membran wurde schließlich dreimal in PBS-T gewaschen, wobei ein Waschschritt zehn Minuten dauerte.
Detektionsreagens wurde unter Verwendung eines entsprechenden Volumens von ECL-Reagens 1 und 2 (Amersham) hergestellt. Die Membran wurde darin 1 Minute lang inkubiert, wurde dann in Saran Wrap (Dow, Germany) gewickelt und Röntgenfilm (Konica; Tokyo, Japan) fünf Minuten lang ausgesetzt, bevor dieser unter Verwendung eines X2-Prozessors (Genetic Research Instrumentation, Dunmore, Essex) entwickelt wurde.
Der in 11 dargestellte Western-Blot zeigt, dass Vollfängen-PKCγ nicht im Gehirn der NNG3-Ratte exprimiert wird. Es ist jedoch nicht möglich zu bestimmen, ob eine trunkierte Form des Proteins exprimiert wird oder ob PKCγ im Gehirn der NNG3-Ratte vollständig fehlt.
Experiment 9 - Mikroinjektion von PKCγ, um Expression im Gehirn zu ermöglichen
Bei dieser Arbeit wurde eine Arbeitsvorschrift befolgt, die ursprünglich in Martes et al. (Martes, M-P., Demeneix, B., Hanoun, N., Hamon, M. & Giros, B.; Up-and-down-expression of the dopamine transporter by plasmid DNA transfer in the rat brain. European Journal of Neurosciences 10, 3607–3616 (1998)) beschrieben wurde. Die Volllängen-AS-cDNA, die wie zuvor beschrieben. isoliert wurde, wurde aus dem TOPO-Vektor durch Restriktionsverdau unter Verwendung von HindIII und XbaI entfernt und in den pRc/CMV2-Vektor (Invitrogen) kloniert. DNA wurde dann aus diesem Klon unter Verwendung des EndoFree Plasmid Giga-sets (Qiagen, Crawley, West Sussex) gemäß den Arbeitsvorschriften der Hersteller isoliert.
3 Ladungsäquivalente (unter Berücksichtigung, dass 1 μg DNA und 1 μl 0,1 M PEI 3 nmol Phosphat bzw. 100 nmol Aminstickstoff entsprechen) von Polyethylenimin (PEI), 25 kDa, (Aldrich, Poole, Dorset) wurden mit 1 μg DNA kombiniert und 30 Sekunden lang vor Injektion zentrifugiert.
Jedes Tier wurde unter Verwendung von Vetalar (Ketaminhydrochlorid; 100 mg/ml; Code VM 14851/4009 Pharmacia & Upjohn Ltd., Animal Health Division, Crawley RH10 2LZ) und Rompun (Xylazinhydrochlorid 2 %; Bayer plc, Animal Health Business Group, Eastern Way, Bury St. Edmunds, Suffolk IP32 7AH) in einem Verhältnis von 2:1 anästhesiert. Die Injektionen wurden intraperitoneal bei 1,1 ml/kg verabreicht.
Tiefe Betäubung wurde nach 5–10 Minuten unter Verwendung des "Pad-pinching"-Verfahrens (bei dem in den Fußballen gezwickt wird) festgestellt, wobei kein reflexartiges Zurückziehen des Fußes mehr beobachtet werden konnte, wenn der Zustand der Vollnarkose erreicht war. Ein kleiner Bereich am Kopf wurde dann unter Verwendung eines Elektrorasierers ausrasiert.
Das Tier wurde auf Ohrschienen in einem Thigmotaxis-Rahmen (Kopf, München, Deutschland) fixiert. Der Kopf wurde unter Verwendung von Zahnschienen und horizontal unter Verwendung einer Nasenschiene in Position gehalten.
Mittels einer Skalpellklinge wurde ein Schnitt gesetzt, und die Haut wurde vom Schädel unter Verwendung von Hautretraktoren (Merck Ltd., Hunter Boulevard, Magna Park, Lutterworth, Leicestershire LE17 4XN) zurückgespannt. Der Schädel wurde mittels einer Skalpellklinge abgeschabt, um das Bregma freizulegen, und der Bereich wurde gesäubert und unter Verwendung eines Wattestäbchens getrocknet. Das Bregma wurde mittels eines Bleistifts markiert und unabhängig bestätigt, bevor die Bregma-Koordinaten abgenommen wurden. Laterale Koordinaten und Längskoordinaten wurden unter Verwendung des Thigmotaxis-Rahmens abgenommen. Die ventrale Koordinate wurde zu diesem Zeitpunkt noch nicht abgelesen.
Die Koordinaten wurden unter Verwendung des Thigmotaxis-Gehirnatlas von Paxinos & Watson berechnet, und Mikroinjektion erfolgte längs (–3,8 mm), lateral (+1,8 mm) und ventral (–2,0 mm) im Vergleich zu den Koordinaten des Bregma.
Eine 1 μl-Hamilton-Mikrospritzennadel, die 2 μl entweder von pRc/CMV-PKCγ-DNA in PEI, von leerem pRc/CMV-Vektor in PEI oder Salzlösung enthielt, wurde direkt über den Gehirnbereich platziert, der diesen neuen Koordinaten entsprach. Diese Stelle wurde neuerlich mit einem Bleistift markiert und unabhängig bestätigt.
Die Spitze eines Bohrkopfs (1 mm) wurde über der Bleistiftmarkierung platziert, und ein Loch wurde in den Schädel gebohrt. Der Bereich wurde neuerlich unter Verwendung eines Wattestäbchens abgetrocknet. Die Mikrospritzennadel wurde dann über dem Loch platziert und langsam in das Loch abgesenkt. Die Nadel wurde dann in das Gehirn bis zu einer geeigneten Tiefe gemäß der berechneten ventralen Koordinate abgesenkt.
Die Nadel wurde 2 Minuten lang an dieser Stelle belassen, und dann wurden 1 μl Lösung injiziert. Die Nadel wurde eine weitere Minute in dieser Stelle belassen. Zu diesem Zeitpunkt wurden weitere 1 μl Lösung injiziert. Die Nadel wurde weitere 2 Minuten an der Injektionsstelle belassen, bevor sie langsam entfernt wurde.
Das Loch wurde dann mit Zahnzement (Redifast 250 ml, Code 002363, Wright Health group Ltd., Kingsway West Dundee) versiegelt, das Tier wurde sorgfältig vom Thigmotaxis-Rahmen genommen, und der Schnitt wurde unter Verwendung herkömmlicher Baumwollnähte geschlossen.
Dem Tier wurde dann eine subkutane Injektion von 0,1 ml Antisedan (Atipamezolhydrochlorid; 5 mg/ml; Code VM 0057/4111, Pfizer Ltd; Ramsgate Road, Sandwich, Kent CT13 9LU) verabreicht, und es wurde gewartet, bis es wieder bei Bewusstsein war, bevor es in den Käfig zurückgesetzt wurde.
Das Experiment wurde bei Mikroinjektion an den Koordinaten längs (–3,8 mm), lateral (+1,8 mm) und ventral (–3,5 mm) im Vergleich zu den Koordinaten von Bregma wiederholt.
Experiment 10 - Analyse des Tierverhaltens
Jedes Tier wurde 24 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff untersucht, um festzustellen, dass die zuvor beschriebene Mikroinjektion keine negativen Auswirkungen mit sich brachte. Tests am Bewegungsapparat ohne chirurgischen Eingriff wurden nach weiteren 24 Stunden durchgeführt und alle 48 Stunden bis zum Tag 7 wiederholt. Drei Testserien wurden an jedem Tier vor der Dekapitierung am siebenten Tag durchgeführt.
Der hierfür gewählte Test war der Test mit geneigter Rampe.
Test mit geneigter Rampe
Sechs Holzplanken, die 10–120 mm maßen, wurden verwendet. Diese verwendeten sechs Planken maßen 10, 20, 50, 70, 90 und 120 mm. Jede Ratte wurde auf jede dieser Planken gesetzt und auf ihre Fähigkeit getestet, ihr Gleichgewicht zu halten und bis zum Ende der Planke hinunterzugehen, ohne dabei von der Planke zu fallen. Dies wurde einmal durchgeführt. War die Ratte dieser Aufgabe gewachsen, so erhielt sie ein Ergebnis von 1, fiel sie jedoch von der Planke hinunter, so lautete das Testergebnis 0. Dies wurde auf jeder Planke wiederholt und auf Videoband aufgezeichnet.
Diese zwei Experimente zeigen, dass das Einführen von Wildtyp-PKCγ in das Gehirn von NNG3-Ratten es diesen Ratten ermöglicht, den Test mit geneigter Rampe besser durchzuführen, als es den Ratten ohne Injektionen gelang. Eine erste Erklärung hierfür schlägt vor, dass PKCγ-Expression helfen kann, den Parkinsonschen Phänotyp zu korrigieren.

Claims

Verwendung eines Polynukleotidfragments umfassend das PKCγ-Gen, welches für den Typ 1 Subtyp von proteinkinase C kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung.
Verwendung eines Polynukleotidfragments gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament zur Behandlung von Säugetieren verwendet wird.
Verwendung eines Polynukleotidfragments gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament zur Behandlung von Menschen verwendet wird.
Verwendung eines Polynukleotidfragments gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die degenerative Erkrankung eine degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems ist.
Verwendung eines Polynukleotidfragments gemäß Anspruch 4, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems Alzheimer'sche Krankheit ist.
Verwendung eines Polynukleotidfragments gemäß Anspruch 4, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems mit Degeneration dopaminerger Zellen assoziiert ist.
Verwendung eines Polynukleotidfragments gemäß Anspruch 4, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems eine mit Bewegungsbeeinträchtigung assoziierte neurodegenerative Erkrankung ist.
Verwendung eines Polynukleotidfragments gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei die neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Parkinson Krankheit, Huntington's Krankheit/Chorea, Dementia mit Lewy-Körpern, Multiple-System-Atropie, progressive supranukleare Lähmung, kortikal-basale ganglionische (kortikobasale) Degenerierung, vaskulärer Parkinsonismus und Ballismus.
Verwendung eines Polypeptids, welches Proteinkinase C von Typ 1 umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung.
Verwendung eines Polypeptids gemäß Ansprüchen 9 bis 11, wobei das Medikament zur Behandlung von Säugetieren verwendet wird.
Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 9, wobei das Medikament zur Behandlung von Menschen verwendet wird.
Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei eine degenerative Erkrankung eine degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems ist.
Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 12, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems Alzheimer'sche Krankheit ist.
Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 12, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems mit Degeneration dopaminerger Zellen assoziiert ist.
Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 12, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems eine mit Bewegungsbeeinträchtigung assoziierte neurodegenerative Erkrankung ist.
Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei die neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Parkinson Krankheit, Huntington's Krankheit/Chorea, Dementia mit Lewy-Körpern, Multiple-System-Atropie, progressive supranukleare Lähmung, kortikal-basale ganglionische (kortikobasale) Degenerierung, vaskulärer Parkinsonismus und Ballismus.
Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei das Polypeptid synthetisch ist.
verfahren zum Untersuchen eines Tieres, bei dem eine neurodegenerative Erkrankung vermutet wird, umfassend Delektieren der Gegenwart einer Mutation in dem PKCγ-Gen oder dem mit ihm assoziierten Promotor.
Verfahren zum Untersuchen eines Tieres, bei dem eine Prädisposition für eine neurodegenerative Erkrankung vermutet wird, umfassend Delektieren der Gegenwart einer Mutation in dem PKCγ-Gen oder dem mit ihm assoziierten Promotor.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei das Tier ein Säugetier ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 und 19, wobei die degenerative Erkrankung eine degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems Alzheimer'sche Krankheit ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems mit Degeneration dopaminerger Zellen assoziiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems eine mit Bewegungsneeinträchtigung assoziierte neurodegenerative Erkrankung ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 oder 25, wobei die neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Parkinson Krankheit, Huntington's Krankheit/Chorea, Dementia mit Lewy-Körpern, Multiple-System-Atropie, progressive supranukleare Lähmung, kortikal-basale ganglionische (kortikobasale) Degenerierung, vaskulärer Parkinsonismus und Ballismus.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Mutation zu einem verkürzten Produkt des produziert werdenden PKCγ-Gens führt.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die Mutation in der 5'-Hälfte des Gens auftritt.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Mutation eine Punktmutation an Position 841 des Ratten-PKCγ-Gens oder einem ähnlichen Bereich des PKCγ-Gens einer anderen Spezies ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei Detektion der Gegenwart der Mutation im PKCγ-Gen erreicht wird durch Detektion veränderter Gehalte des mRNA-Transkripts oder mRNA-Vorläufers.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Mutation im PKCγ-Gen detektiert wird unter Verwendung von Antikörpern, welche gegen das verkürzte PKC-Typ I-Polypeptid erzeugt wurden.
Verwendung eines verkürzten PKCγ-Polynukleotidfragments zum Fördern der Degenerierung des Nervensystems zur Produktion von Tiermodellen.
Verwendung eines verkürzten PKC-Typ I-Polypeptids zum Fördern der Degenerierung des Nervensystems zur Produktion von Tiermodellen.
Verwendung eines PKCγ-Polynukleotidfragments, welches für das PKC-Typ 1-Polypeptid kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zu Prävention, Verzögerung, Behandlung oder Inhibierung der Degenerierung des Nervensystems.
Verwendung eines PKC-Typ 1-Polypeptids bei der Herstellung eines Medikaments zu Prävention, Verzögerung, Behandlung oder Inhibierung der Degenerierung des Nervensystems.
Polynukleotidfragment, welches für das PKC-Typ I-Polypeptid kodiert, zur Verwendung bei Gentherapie.
Humanisierter monoklonaler Antikörper, welcher spezifisch für ein Epitop/Epitope ist, welche/s auf einem verkürzten Polypeptid angeordnet ist/sind, welches von dem PKC_γ-Gen erzeugt wurde.
Antikörper gemäß Anspruch 37, wobei das Epitop/die Epitope in der C-terminalen Hälfte des PKC-Typ (I-Polypeptids angeordnet ist/sind.
Antikörper gemäß Anspruch 38, wobei die C-terminale Hälfte des Polypeptids bei Aminosäure Nr. 282 beginnt und an dem C-Terminus des nativen Polypeptids endet.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 37 bis 39, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung eines Antikörpers gemäß Ansprüchen 37 bis 40 für die Herstellung eines Medikaments zu Prävention, Verzögerung, Behandlung oder Inhibierung der Degenerierung des Nervensystems.
Verwendung eines Antikörpers gemäß Ansprüchen 37 bis 40 in einem diagnostischen Assay zur Untersuchung eines Menschen, von dem vermutet wird, dass er eine neurale degenerative Erkrankung hat oder für diese prädisponiert ist.