KR20020086078A

KR20020086078A - 미세부수체 불안정성 측정용 진단 킷트

Info

Publication number: KR20020086078A
Application number: KR1020010025785A
Authority: KR
Inventors: 김호근; 김남균
Original assignee: 김호근; 김남균
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2002-11-18

Abstract

본 발명은 미세부수체 불안정성-양성 종양 (Microsatellites instability positive tumor)의 예측 및 진단방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 hRAD50 유전자내에 존재하는 단반복 염기서열의 프레임쉬프트 돌연변이를 분석함으로써 MSI-양성 종양을 진단하는 방법, 상기 진단에 유용한 염기서열 및 진단용 킷트를 제공한다. 본 발명의 진단방법은 PCR 등의 유전자 증폭방법을 이용하여 신속하고 간편하게 MSI-양성 종양을 측정하므로서 특정 종류의 종양에 맞는 맞춤 의료 서비스를 제공하는데 유효하게 사용될 수 있다.

Description

미세부수체 불안정성 측정용 진단 킷트{Diagnostic Kits For The Detection Of Microsatellite Instability}

본 발명은 미세부수체 불안정성-양성 종양 (Microsatellites instability positive tumor; 이하, MSI-양성 종양)의 예측 및 진단방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 DNA 손상 교정 관련 유전자인 RAD50의 단염기 반복서열(mononucleotide repeats)에서 프레임쉬프트 돌연변이를 분석함으로써 MSI-양성 종양을 예측 내지 진단하는 방법에 관한 것이다.

미세부수체 (Microsatellites)란 인간 유전자의 전역에 걸쳐 분포하는 짧은 단순 반복 염기서열을 말한다. 미세부수체는 약 100,000 염기쌍마다 한 개 정도의확률로 분포한다. 미세부수체 불안정성 (Miscrosatellites instability: MSI)이란 상기 미세부수체에 돌연변이, 특히 짧은 염기 결손 (deletion) 또는 삽입(insertion)이 일어난 것을 말하며, 여러 종류의 종양 환자들에게서 이러한 표현형이 발견되고 있다 (Thibodear et al., Science, 260, 816-819 (1993); 국제특허공개공보 WO 94/19492). 미세부수체 불안정성은 염기증폭 방법, 예를 들어, PCR (polymerase chain reaction)로 DNA를 증폭한 후 증폭된 산물을 전기영동에 의해 순차적으로 분리하여 그 염기서열의 길이변화를 측정함으로써 검출할 수 있다.

미세부수체 불안정성은 종양 세포에서의 DNA 복제 오류 (DNA-replication error)가 그 원인인 것으로 알려져 있다. 연구자들은 DNA 복제 오류 교정 유전자의 결함에 의해 암유발 유전자 (oncogenes)와 종양억제 유전자 (tumor suppressor genes)의 돌연변이가 유발되어 종양형성이 촉진된다고 보고하고 있다 (Thibodeau et al., Cancer Res., 56, 4836-4840 (1996); Loeb, L. A., Cancer Res., 54, 5059-5063 (1994)).

이와 같이 미세부수체 불안정성을 보이는 종양을 미세부수체 불안정성-양성 종양 (Microsatellites instability positive tumor) 또는 복제 오류-양성 종양 (replication error-positive)이라고 한다. HNPCC (hereditary non-polyposis colon cancer)계의 산발성 위장관련 종양 (sporadic colorectal tumor)이 그 대표적인 예이며, 이외에도 췌장암 (Han et al., Cancer Res., 53, 5849-5852 (1993)), 위암 (Han et al., Cancer Res., 53, 5849-5852 (1993); Peltomaki et al., Cancer Res., 53, 5853-5855 (1993); Mironov et al, Cancer Res., 54, 41-44 (1994);Rhyu et al., Oncogene, 9, 29-32 (1994); Chong et al., Cancer Res., 54, 4595-4597 (1994)), 전립선암 (Gao et al., Oncogene, 9, 2999-3003 (1994)), 자궁내막암 (Risinger et al., Cancer Res., 53, 5100-5103 (1993); Peltomaki et al., Cancer Res., 53, 5853-5855 (1993)) 및 유방암 (Patel et al., Oncogene, 9, 3695-3700 (1994)) 등에서 미세부수체 불안정성 표현형이 발견되고 있다 (Aaltonen et al., Science, 260, 812-816 (1993)).

MSI-양성 종양 발생의 분자생물학적 메카니즘은 아직 자세히 알려져 있지 않다. 그러나, 연구자들은 기존의 여러 가지 실험 결과를 종합하여 볼 때 DNA 부정합 오류 교정 유전자 (DNA mismatch repair gnens)인 hMLH1, hMSH2, hPMS1, hPMS2, hMSH3, hMSH6 등에서의 결함이 그 주요 원인인 것으로 생각하고 있다 (Bronner et al., Nature, 368, 258-261 (1994); Fishel et al., Cell, 75 , 1027-1038 (1993); Leach et al., Cell, 75, 1215-1225 (1993). 나아가, 연구자들은 DNA 부정합 오류 교정 유전자의 결함에 의해 세포증식 조절 유전자인 TGFβ1, IGF(Ⅱ), BAX 등의 반복서열에서 변이가 일어나고 이들이 MSI-양성 종양의 다단계 진행에 관여할 것이라고 예측하고 있다 (Markowitz et al., Science, 268, 1336-1338 (1995); Souza et al., Nat. Genet., 14, 255-257 (1996); Rampino et al., Science, 275, 967-969 (1997); Yamamoto et al., Cancer Res., 57, 4420-4426 (1997)).

최근 DNA 부정합 오류 교정 단백질 (DNA MSImatch repair proteins)들이 DNA 수선에 관여하는 다른 유전자들과 복합체를 형성한다는 것이 알려져 있다. 즉, DNA 손상 수선 단백질군 (DNA damage repair proteins; hMSH2, hMSH6, hMLH1, ATM및 BLM)과 hRAD50-hMRE11-NBS1 단백질 복합체 및 DNA 복제인자 C (DNA replication factor C)가 BRCA1과 결합하여 DNA 손상에 대한 감지역할을 하는 거대 복합체인 BASC를 형성하는데, 이들 유전자중 일부는 암호화 부위 내에 단염기 반복서열 (mononucleotide repeat)을 포함하고 있다 (Yamamoto et al., Cancer Res., 57, 4420-4426 (1997); Malkohosyan et al., 382, 499-500 (1996); Calin et al., Cancer Res., 58, 3777-3781 (1998)).

이에 본 발명자들은 암의 진단을 위한 표지자를 연구하던 중 RAD50 유전자 의 단염기 반복서열에 내에 위치하는 프레임 쉬프트 돌연변이가 종양 세포의 미세부수체 불안정성 (MSI)의 생물학적 표지자로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 MSI-양성 종양을 측정하는데 유용한 핵산서열을 제공한다. 상기 핵산서열은 RAD50의 단염기 반복서열을 포함한다.

본 발명은 RAD50의 단염기 반복서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 MSI-양성 종양 진단용 킷트 및 이를 사용하여 MSI-양성 종양을 측정하는 방법을 제공한다.

도 1은 MSI-양성 종양에서 hRAD50 유전자내 단백질 지령부위의 폴리데옥시아데노신 단염기 반복수의 변화를 PCR로 측정한 결과를 나타낸 사진이다 (A: 대장암, B:위암, N:정상조직에서 추출한 DNA, T: 종양조직에서 추출한 DNA)

도 2는 MSI-양성 위암에서 유래한 hRAD50 유전자에 대한 대표적인 클론의 염기서열 분석 결과를 나타낸 사진이다 (▼: 염기결실, ▲: 염기삽입).

본 발명은 미세부수체 불안정성-양성 종양을 측정하는데 유용한 핵산서열을 제공한다. 본 명세서에 사용된 "미세부수체 (Microsatellites)"란 진핵세포 (eukaryotes) 유전자 전역에 걸쳐 분포하는 모노-, 디-, 트리- 및 테트라뉴클레오타이드 형태의 짧은 반복 염기서열을 의미한다. 일반적으로 이러한 반복 서열은 염색체 내에서 10 내지 40 번 정도 단순반복 (tandem repeat)된 형태로 존재한다.

"미세부수체 불안정성 (Microsatellites instability; MSI)" 이란 상기 미세부수체 유전자에 짧은 염기 결손 또는 삽입에 의한 돌연변이가 일어난 것으로, 주로 DNA 부정합 수선 시스템의 결함에 의해 유발되는 미세부수체의 유전적 불안정성을 의미한다. "유전적 불안정성(genomic instability)" 이란 DNA의 손상, 변화 및 변이가 축적되어 정상 세포가 종양 세포로 형질변환 되는 것을 의미한다.

"미세부수체 불안정성-양성 종양" 이란 미세부수체 불안정성을 나타내는 종양을 의미하며 미세부수체 내의 변이된 유전자의 발현으로 인해 정상세포의 구조적, 기능적 특성이 종양 세포로 변화된 것을 의미한다.

본 발명에서 의미하는 미세부수체 불안정성-양성 종양을 측정하는데 유용한 핵산서열이란 구체적으로 RAD50 유전자 지령 부위내의 단염기 반복서열로서, MSI 표현형 개체에 있어서 1개 또는 2개 염기서열의 결실 또는 삽입에 의해 프레임쉬프트 돌연변이가 생성되는 핵산서열 부위이다. 상기 단염기 반복서열은 hRAD50 유전자의 경우 아미노산 코돈 719에서 722에 해당하는, (A)₉반복 부위를 말한다.

본 발명에서는 위암과 대장암에서 MSI-양성 종양의 빈도를 조사하였는데, 대장암 230례 중 39례 (17%) 및 위암 414례 중 36례 (9%)에서 MSI-양성 종양이 검출되었다 (실시예 1). 상기 종양들을 대상으로 6개 유전자 (hRAD50;(A)₉, BLM;(A)₉, hMSH6;(C)₈, BRCA1;(A)₈, ATM;(T)₇, NBS1;(A)₇)의 프레임 쉬프트 돌연변이를 PCR반응을 통하여 분석한 결과 다양한 양상의 돌연변이 패턴이 발견되었다. 예를 들어, 75례의 MSI-양성 종양 중에서 44례 (59%)는 1개 이상의 유전자에서 돌연변이가 발견되었는데, 그 중 15례는 2개의 유전자에 돌연변이가 있었으며, 29례는 1개의 유전자에서만 돌연변이가 있었다. hRAD50 유전자와 BLM 유전자의 돌연변이는 상호간에 배타적이지 않았다. hRAD50 유전자에 돌연변이를 가지는 23례와 BLM 유전자에 돌연변이를 가지는 16례 중, 5례는 동시에 두 유전자의 돌연변이가 나타났다.

hRAD50 유전자의 프레임쉬프트 돌연변이는 MSI-양성 대장암과 위암에서 모두 나타났으며, 대장암 13례 (33%)와 위암 10례 (28%)로 DNA 수선 체계에 속하는 다른 유전자들보다 높은 돌연변이 빈도를 나타내었다. 본 발명자들은 단염기 반복서열인 상기 (A)₉을 포함하는 서열, 즉, 아미노산 코돈 704에서 733에 해당하는 서열번호 16으로 표시된 핵산서열을 증폭하고 그 염기 서열을 분석하므로서, MSI-양성 종양에 있어서 hRAD50에 프레임쉬프트 돌연변이가 일어남을 확인하였다 (도 1 및 도 2).

RAD50 단백질은 hMRE11, NBS1과 함께 결합하여 세포내 DNA 손상에 반응하는 단백질이다. 사람의 RAD50 단백질 (hRAD50)은 성장인자, 호르몬 수용체 유전자들과 함께 염색체 5q에 위치하고 있으며, 효모에 존재하는 RAD50는 이중나선 붕괴 (double strand break)의 재조합수선에 관계하는 것으로 알려져 있다 (Firnemich et al., Mol. Cell Biol, 15, 1620-1627 (1995)). 사람으로부터 기원하는 hRAD50의 서열은 문헌에 공지되어 있다 (Dolganov, et al., Mol. Cell Biol., 16, 4832-4841 (1996)). 서열 분석에 기초한 hRAD50 단백질의 구조를 살펴보면, hRAD 단백질은 N-말단에 워커 A-타입의 ATP 결합 도메인을 가지고 있고 C-말단에 워커 B-타입의 DA 박스를 지니고 있으며 세 개의 잠재적 핵 위치지정 시그날을 가지고 있다. hRAD50 단백질은 코일-코일 구조를 가지고 있으며, ATP-의존적 DNA 결합 활성을 가지는 염색체 유사 단백질이다.

이와 같이 hRAD50는 hMRE11, NBS1과 함께 결합하여 세포내 DNA 손상에 반응하는 유전자로 알려져 있지만, 아직까지 hRAD50 유전자의 돌연변이가 MSI-양성 종양과 관련되었다는 사실은 밝혀진 바 없었다. 이에, 본 발명자들이 MSI-양성 종양과 관련하여 새로이 발견한 hRAD50의 돌연변이 부위는 단염기 서열이 반복된 (A)₉부위이다. hRAD 단백질은 이 반복 서열의 위쪽에 위치하는 N-말단과 752번째 아미노산 사이에 BRCA1 결합부위를 가지고 있다 (Raymond, W. E. and Kleckner, N., Nucleic Acids Res., 21, 3851-3856 (1993); Zhong et al., Science, 285, 747-750 (1999)).

hRAD50 유전자는 hMRE11, NBS1과 결합하여 상동 재조합, 세포 주기 검사점의 활성화, 비상동 말단 결합, 감수분열 재조합 및 텔로미어 유지에 관여하는데 (Haber, J. E., Cell, 95, 583-586 (1998); Petrini, J. H., Am. J. Hum. Genet., 64, 1264-1269 (1999)), 상술한 RAD50의 구조적 및 기능적 특성에 기초하여 볼 때, RAD50 유전자의 돌연변이로 인해 세포에서 생성되는 절단형의 단백질들은 다른 단백질과의 복합체 형성을 방해하고 DNA 수선 결함을 촉진시킬 것으로 추측되며, 이는 유전체 불안정성을 증가시켜 종양의 형성과 진행에 영향을 주는 것으로 생각된다. 본 발명은 그러한 돌연변이가 생성되는 부분이 RAD50의 단염기 반복서열 부위, 특히 사람 RAD50 (hRAD50)의 경우 아미노산 코돈 719-722에 해당하는 염기서열 부분임을 실험을 통하여 확인하였다 (도 1).

MSI-양성 종양을 진단하는데 사용되는 서열은 상기 단염기 반복서열 부분인 (A)₉단편, 바람직하게는 상기 단편을 포함하는 100bp 내외의 서열단편이다. 본 발명의 실시예에서는 (A)₉단편을 포함하는 87bp의 서열 부분 (서열 16) (hRAD50의 아미노산 코돈 704-733에 해당하는 핵산서열)을 증폭하여, PCR을 수행한 결과, 프레임 쉬프트 돌연변이가 대장암 33%, 위암 28%의 높은 빈도로 나타남을 확인하였다 (표 1). 또한, 상기 프레임 쉬프트 돌연변이의 염기서열을 분석한 결과, 돌연변이의 형태가 hRAD50 단백질 지령 부위내의 (A)₉반복 염기서열에서 1개 또는 2개의 염기가 결실 또는 삽입된 것임을 확인하였다 (도 2).

본 발명은 MSI-양성 종양을 진단하는 진단용 킷트 및 이를 사용하여 미세부수체 불안정성을 측정하는 방법을 제공한다. 구체적으로 MSI-양성 종양 진단용 킷트는 RAD50 유전자의 증폭을 위한 프라이머(primer) 및 PCR 반응 혼합물 (PCR reaction mixture)로 구성되어 있다.

상기 "프라이머"는 hRAD50 유전자의 코돈 719과 722 사이에 위치한 (A)₉반복을 포함하는 핵산서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucle otide)를 의미한다. hRAD50의 (A)₉을 증폭하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머가 본 발명의 프라이머 범위에 포함된다. 본 발명 프라이머의 일 예는 하기서열번호 17과 서열번호 18로 표시된 올리고뉴클레오티드이다. 상기 "PCR 반응 혼합물"은 DNA 폴리머라제 및 완충용액을 포함하여 PCR를 수행하기 위해 사용되는 분자생물학적 시약 (molecular biological reagent)을 의미한다.

본 발명 MSI-양성 종양 진단 킷트를 사용한 미세부수체 불안정성 측정방법은 생물학적 시료로부터 DNA를 분리하고 분리한 DNA를 본 발명의 진단용 킷트를 사용하여 증폭한 다음 전기영동하여 돌연변이를 분석하는 것이다. 생물학적 샘플은 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 샘플, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 샘플 또는 이로부터 유래된 세포 및 그 자손이 포함된다. 또한, 상기 샘플들은 시약처리, 가용화된 샘플 또는 배양세포, 세포 상등액 및 세포 용해물도 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 목적상 생물학적 샘플은 종양 조직 또는 종양성으로 생각되는 조직을 포함하며, 예컨대 절제수술, 생검, 흡인법 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 얻어진다.

본 발명 미세부수체 불안정성 진단 킷트 및 이를 이용한 진단방법은 MSI-양성 종양의 초기 진단 및 예측에 사용할 수 있으며, 종양환자의 치료에 있어서 항암요법 (chemotherapy)의 형태를 결정하는데 응용할 수 있다.

나아가, 본 발명의 돌연변이된 RAD50 유전자로부터 발현되는 펩타이드는 면역반응을 유발하는 항원으로써 사용할 수 있다. 사람 RAD50 프레임 쉬프트 돌연변이는 154Kd의 정상 hRAD50 단백질에 비해 약 83Kd 정도의 절단된 단백질을 생성할 것으로 예측된다. 따라서, 상기 단백질을 항원으로 하여 돌연변이 형태의 hRAD50 단백질에만 특이적으로 결합하는 면역학적으로 결합하는 항체를 만들어 변이된 단백질의 검출 및 분리에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1

대장암과 위장암에서의 MSI-양성 종양의 빈도조사

대장암과 위장암에서의 MSI-양성 종양의 빈도를 조사하기 위하여 암세포 DNA 및 동일환자의 정상세포 DNA를 획득한 다음 PCR로 증폭한 후 전기영동을 실시하여 증폭된 DNA 산물을 순차적으로 분리하였다.

암세포 DNA 및 정상세포 DNA는 1996년 12월부터 1999년 11월까지 연세의료원의 위장관련 종양 조직은행을 통해 230례의 대장암 (colorectal carcinoma)과 414례의 위암 (gastric carcinoma) 환자로부터 일괄적으로 수집하였다. 모든 증례는 병리학자에 의해 조직학적으로 선암 (adenocarcinoma)임을 확인한 후, 동결절편제작 장비 내에서 현미경하에 암세포를 선택적으로 미세 절제하였다.

상기 분리한 DNA에서 5개의 미세부수체 부위 (BAT26, BAT25, D2S123, D5S346 및 D17S250)를 선별하여 PCR로 증폭하였다. 미세부수체 부위인 BAT26, BAT25, D2S123, D5S346 및 D17S250은 각각 공지된 염기서열 (Medline accession numberAX047933 (서열 1), Medline accession number 12730800 (서열 2), Medline accession number Z16551 (서열 3), UniSTS number 14692 (서열 4) 및 UniSTS number 51318 (서열 5))을 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 각각의 염기서열 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같다.

BAT26 ; 5'-TGACTACTTTTGACTTCAGCC-3' (서열 6)

5'-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3' (서열 7)

BAT25 ; 5'-TCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3' (서열 8)

5'-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3' (서열 9)

D2S123 ; 5'-AAACAGGATGCCTTA-3' (서열 10)

5'-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3' (서열 11)

D5S346 ; 5'-ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3' (서열 12)

5'-AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT-3' (서열 13)

D17S250 ; 5'-GGAAGAATCAAATAGACAAT-3' (서열 14)

5'-GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3' (서열 15)

PCR 반응을 위해 최종부피 20㎕가 되도록 1.5mM MgCl₂, 20pmol primer, 0.2mM의 dATP, dGTP, dTTP, 5μM dCTP, 1μCi의 [α-³²P]dCTP (3000 Ci/mmol; DuPont New England Nuclear, Boston, MA), 50ng의 시료 DNA, 1X PCR 완충용액, 1.25 unit의Taq DNA 폴리머라제 (Life technologies, Inc., Grand Island, NY)를 혼합하였다. 상기 혼합액을 95℃ 에서 5분간 변성시킨 다음 95 ℃ 에서 30초간 변성, 55-60℃ 에서 30초 동안 재결합, 72℃ 에서 15초 동안 신장과정을 25-30회 반복하였다.

획득한 PCR 산물을 5.6M의 요소 (urea)가 포함된 6%의 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동시킨 다음, X-ray 필름에 노출시킨 후 PCR 산물의 이동 변화를 측정하였다.

각 종양조직에서 불안정성을 나타내는 표지자의 수를 기준으로, 5개의 표지자중 2개 이상의 표지자에서 불안정성을 보이는 경우를 MSI-H (high MSI), 1개의 표지자에서 양성을 보이는 경우를 MSI-L (low MSI), 불안정성이 없는 경우를 MSS (MSI stable)로 구분하7였고, MSI-H 종양은 MSI-양성으로, MSI-L과 MSS 종양은 MSI-음성으로 분류하였다. 실험 결과, 미세부수체 불안정성 양성 종양의 빈도는 위암에 비해 대장암이 높게 나타났으며 대장암 230례 중 39례(17%), 위암 414례 중 36례(9%)에서 발견되었다. (P=0.002, χ²테스트)

실시예 2

DNA 교정 관련 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이 분석

상기 실시예 1에서 MSI-양성 종양으로 선별된 대장암 39례와 위암 36례를 대상으로 DNA 교정 관련 유전자중 유전자 단백질 지령 부위내에 단염기 반복서열을포함하고 있는 6개 유전자 (hRAD50;(A)₉, BLM;(A)₉, hMSH6;(C)₈, BRCA1;(A)₈, ATM;(T)₇, NBS1;(A)₇)의 프레임 쉬프트 돌연변이를 PCR반응을 통하여 분석하였다.

hRAD50 유전자 (NM_005732)의 프레임 쉬프트 돌연변이는, hRAD50의 아미노산 코돈 719과 722 사이에 위치한 (A)₉반복을 포함하는 핵산서열 87bp의 부위 (코돈 704-733 부위, 서열 16)를 RAD50F (5'-AACTGCGACTTGCTCCAGAT-3'; 센스, 서열 17)와 RAD50R (5'-CAAGTCCCAGCATTTCATCA-3'; 안티센스, 서열 18) 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

ATM 유전자의 경우 코돈 213과 215 사이에 존재하는 (T)₇반복을 포함하는 핵산서열 88bp의 부위 (코돈 191-221 부위, 서열 19)를 ATMF (5'-CATGCTGTTACC AAAGGATGC-3'; 센스, 서열 20)와 ATMR (5'-TCGCACACTGAATAGCCTTG-3'; 안티센스, 서열 21) 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

NBS1 유전자는 코돈 464와 466사이에 존재하는 (A)₇반복을 포함하는 핵산서열 81bp의 부위 (코돈 450-466 부위, 서열 22)를 NBS1F (5'-AGCAGACCAAC TCCATCAGA-3'; 센스, 서열 23)와 NBS1R (5'-CAGAGACATGAGAGAAGTTATC-3'; 안티센스, 서열 24) 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

BRCA1, BLM과 hMSH6 에서 단백질 지령 부위내 반복염기서열의 프레임 쉬프트 돌연변이는 이전에 문헌에 보고된 프라이머를 이용하였다 (Yamamoto et al, Cancer Res., 57, 4420-4426 (1997); Calin et al., Cancer Res., 58, 3777-3781 (1998)). DNA 변성, 전기영동 및 방사능 사진 촬영은 실시예 1에서 기재한 방법과 동일하게수행하였다.

실험 결과를 아래 표1에 나타내었다.

75례의 MSI-양성 위장관계 종양에서 DNA 교정에 관여하는 여섯 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이 빈도

유전자	염기반복형태	프레임 쉬프트 돌연변이 빈도(no. %)
유전자	염기반복형태	대장암	위암
hRAD50	(A)₉	13 (33)	10 (28)
BLM	(A)₉	7(18)	9 (25)
hMSH6	(C)₈	9(23)	7 (19)
BRCA1	(A)₈	1(3)	0
ATM	(T)₇	1(3)	2 (6)
NBS1	(A)₇	0	0

hRAD50 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이는 미세부수체 불안정성 대장암과 위암에서 모두 나타났으며, 대장암 13례 (33%)과 위암 10례 (28%)로 DNA 수선 체계에 속하는 다른 유전자들 보다 높은 돌연변이 빈도를 나타내었다.

BLM 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이는 7례의 대장암 (18%)와 9례의 위암 (23%)에서 나타났다. BLM 유전자의 변이는 모두 1-bp 결손이었으며 이는 서열 분석으로 확인되었다. hMSH6 유전자의 미세부수체 변화는 9례의 대장암 (23%)과 7례의 위암 (19%)에서 나타났다. BRCA1, ATM 및 NBS1 유전자의 단염기 반복서열에서는 돌연변이가 없거나 그 빈도가 낮음을 프레임 쉬프트 돌연변이 분석을 통해 밝혔다. BRCA1 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이는 1례의 대장암 (3%)에서만 발견되었다. ATM 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이는 1례의 대장암 (3%)과 2례의 위암 (6%)에서만 발견되었다. MSI-양성 대장암과 위암에서 NBS1 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이는 발견되지 않았다. 대조군으로 이용한 60례의 MSI-음성 종양에서는 어떠한 돌연변이도 발견되지 않았다.

조사된 6개 유전자에서의 전반적인 돌연변이 양상은 매우 다양하였다. 75례의 MSI-양성 종양 중에서 44례 (59%)는 1개 이상의 유전자에서 돌연변이가 발견되었는데, 그 중 15례는 2개의 유전자에 돌연변이가 있었으며, 29례는 1개의 유전자에서만 돌연변이가 있었다. hRAD50 유전자와 BLM 유전자의 돌연변이는 상호간에 배타적이지 않았다. hRAD50 유전자에 돌연변이를 가지는 23례와 BLM 유전자에 돌연변이를 가지는 16례 중, 5례는 동시에 두 유전자의 돌연변이가 나타났다.

발생한 돌연변이가 동형 혹은 이형 상태인지를 확인하기 위하여 정상과 비정상 밴드의 명암도를 비교하였다. 종양세포의 비율은 조직학 슬라이드를 이용하여 확인하였는데, 대략 50-90% 정도였다. 종양세포의 비율을 근거로 하였을 때, (A)₁₀반복을 가지는 TGF-βRII 유전자의 경우 75례의 MSI 양성 종양 중 58례에서 프레임 쉬프트 돌연변이가 발생하고, 그중 30례는 동형 돌연변이가 발생한 것으로 분류하였다. BASC 복합체를 구성하는 여섯 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이에서 동형 돌연변이는 매우 드물었다. 16례의 hMSH6 돌연변이 중 2례 에서만 동형 돌연변이가 발생했다. 다른 다섯 종류 유전자의 돌연변이는 모두 이형 돌연변이였다.

실시예 3

hRAD 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이 염기서열 분석

hRAD의 돌연변이 염기서열 부위를 분석하였다. 상기 실시예 2의 방법에 따라 hRAD유전자 단반복 염기서열 부위 (서열 16)를 증폭하였다. PCR 반응조건은 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다. 획득한 PCR 산물을 동량의 로딩버퍼 (95% 포름아마이드, 20mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루, 0.05% 자일렌 시아놀)와 혼합한 다음 80℃에서 10분간 변성시켰다. 2.5㎕의 시료를 5.6M의 요소(urea)가 포함된 6% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동한 후 X-ray 필름에 노출시켜 PCR 산물의 이동변화를 측정하였다. 전기영동 후, 돌연변이 부위의 DNA 절편 밴드를 폴리아크릴아마이드 젤에서 잘라내었다. 잘라낸 DNA 절편 밴드를 100㎕의 증류수에서 10분간 끊여 DNA를 용출시킨 다음 RAD50F(서열 17)와 RAD50R 프라이머(서열 18)을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA를 pT7Blue 벡터 (Novagen, Madison, WI)에 클로닝하였다. T7 시퀀싱 킷트 (USB, Cleveland, OH)와 RAD50F 프라이머를 이용하여 pT7Blue 벡터에 클로닝 되어있는 DNA의 염기서열을 분석하였다. 획득한 염기서열분석 산물을 동량의 로딩버퍼 (95% 포름아마이드, 20mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루, 0.05% 자일렌 시아놀)와 혼합한 다음 80℃에서 10분간 변성시켰다. 2.5㎕의 시료를 5.6M의 요소가 포함된 8% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 X-ray 필름에 노출시켜 염기서열의 변이를 측정하였다.

실험결과, hRAD50 유전자의 경우 hRAD50 단백질 지령 부위내의 (A)₉반복내에서 1개 혹은 2개의 염기서열 결실이나 1개의 염기서열 삽입이 발견되었다 (도 1) 도 1의 A는 대장암, B는 위암 세포에서의 프레임 쉬프트를 나타낸다.

MSI-양성 위암 조직으로부터 유래하는 대표적 hRAD50 클론의 서열을 전기영동으로 분석하였다. 디옥시아데노신 반복부위에 염기의 결실(▼)이나 삽입(▲)이 나타남을 확인하였다 (도 2). BLM 유전자에서도 염기서열 결실을 확인하였으며 BRCA1 유전자는 종양 DNA에서 발견된 1개의 염기서열 결실을 확인하였고 종양 인접부위의 정상 점막 조직에서 추출한 DNA에서는 나타나지 않는 것으로 보아 이 돌연변이는 생식세포 돌연변이보다는 체세포 돌연변이에 의해 발생했음을 알 수 있었다.

따라서, hRAD50 유전자의 프레임 쉬프트 돌연변이가 MSI-양성 종양의 발생과 상관관계가 있음을 확인하였으며 특히 hRAD50 유전자가 MSI-양성 종양의 진단에 있어서 중요한 표적 유전자임을 확인하였다.

본 발명 RAD50 유전자내에 (A)₉을 포함하는 단반복 염기서열은 MSI-양성 종양의 생물학적 표지자로 사용될 수 있다. 본 발명은 상기 RAD50 유전자내 단반복 염기서열의 프레임쉬프트 돌연변이를 분석함으로써 MSI-양성 종양을 진단하는 방법, 진단에 유용한 염기서열 및 진단용 킷트를 제공한다. 이는 MSI-양성 종양의 초기 진단 및 예측에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

hRAD50 유전자의 아미노산 코돈 719에서 722에 해당하는 (A)₉단반복 핵산서열.
제 1항 기재의 (A)₉단반복 염기서열을 포함하는 약 100 bp 크기의 hRAD50 유전자
제 2항에 있어서, hRAD50의 아미노산 코돈 704에서 733에 해당하는 서열번호 16으로 표시된 핵산서열.
제 2항 기재의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머.
제 4항에 있어서, 서열번호 17과 서열번호 18로 표시된 올리고뉴클레오타이드로 구성된 것을 특징으로 하는 프라이머.
제 4항의 프라이머 및 PCR 반응 혼합물로 구성된 것을 특징으로 하는 미세부수체 불안정성(MSI)-양성 종양 진단 킷트.