DE60023269T2

DE60023269T2 - Entwicklung eines Screeningverfahrens für ein physiologisch aktives Pyrrol-Imidazol-Derivat

Info

Publication number: DE60023269T2
Application number: DE60023269T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Chiyoda-ku SUGIYAMA; Isao Kyoto-shi SAITO; Hirokazu Bunkyo-ku IIDA
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2020-11-14
Also published as: WO2001036677A1; US20030099998A1; EP1152061A1; US7378237B2; EP1152061A4; US6974668B1; EP1152061B1; DE60023269D1; JP2001136974A

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren einer Wirkung auf Substanzen, die DNA oder RNA enthalten, wie z.B. Zellen, unter Verwendung einer chemischen Spezies mit einer chemischen Struktur, die nicht-natürliche Basen enthält und die Basensequenzen von natürlicher DNA oder RNA erkennen kann, ein Kit dafür und eine dafür zu verwendende Platte.
Hintergrund
Als ein Ergebnis der Studien, die durch das Human Genome Project durchgeführt werden, werden die Basensequenzen des vollen Satzes der Gene, "ein Entwurf des menschlichen Lebens", innerhalb weniger Jahre aufgeklärt sein. Es ist bekannt, dass sich Krankheiten oder Alterung entwickeln werden, wenn der Entwurf lückenhaft oder fehlerhaft ist. Als Ergebnis der Entwicklungen des Human Genome Project können viele Krankheiten einschließlich Krebs auf der DNA-Ebene beleuchtet werden, und es wird davon ausgegangen, dass die gesamte medizinische Wissenschaft, die hauptsächlich in Diagnose und Prävention besteht, eine revolutionäre Veränderung erfahren wird. Obschon wir große Erwartungen in die Entwicklung eines therapeutischen Verfahrens auf der Grundlage eines Verständnisses der DNA-Ebene von Krankheiten und das pharmazeutische Anzielen der Verursachergene der Krankheiten oder ihrer Produkte setzen, sind Studien zur Grundlagenforschung, die zu klinischen Studien führen, gerade erst aufgenommen worden. Die derzeit verwendeten Antitumormittel sind in erster Linie Antibiotika, die durch Screening ausgewählt werden, und sind nicht das ursprünglich durch Mikroorganismen zum Zwecke der Abtötung von Tumorzellen erzeugte Produkt. Bisher sind wenige Arzneimittel, die auf der molekularbiologischen Kenntnis von Tumoren basieren, bekannt. Wird die Expression eines intrazellulären spezifischen Gens extrazellular frei kontrollierbar, so kann schließlich eine therapeutische Methode auf der Genebene gefunden werden.
Dieser Nutzen ist in WO-A-9849142 genannt, welches kleinmolekülige Polyamide betrifft, die an eine zuvor festgelegte Sequenz im menschlichen Genom binden können und denen ein potenzieller Nutzen in der Biologie und Humanmedizin zugesprochen wird. Insbesondere wird von der Bindung der Polyamide eine Modulation der Genexpression angenommen, indem sie die Bindung von DNA-bindenden Proteinen wie RNA-Polyamiden verändern.
Wir haben vor kurzem festgestellt, dass ein antibiotisches Duocarmycin ein Heterodimer mit anderen Molekülarten wie Distamycin bilden könnte, um gemeinsam die molekulare Erkennung der DNA zu übernehmen und außerdem wirksam die Alkylierung an einer Basensequenz zu vollziehen, die von Duocarmycin allein verschieden ist (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14405, 1996). Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie gelang uns die Synthese eines Moleküls, das selektiv DNA an einer beliebigen Position ihrer Basensequenz alkylieren konnte, indem Pyrrol-Imidazol-Polyamid als einer Erkennungsstelle für DNA an die aktive Alkylierungsstelle von Duocarmycin gebunden wird, und haben daraufhin ein Patent angemeldet (JP-A-10-260710).
Die Verbindungen jedoch, in denen das Pyrrol-Imidazol-Polyamid als einer DNA-Erkennungsstelle lediglich an die aktive Alkylierungsstelle von Duocarmycin gebunden ist, sind nicht nur hinsichtlich ihrer Alkylierungsaktivität unzureichend, sondern auch nur zur Erkennung einer einzelsträngigen Basensequenz in der Lage. Folglich untersuchten wir die Alkylierungsmechanismen zwischen diesen Molekülen und der DNA, wie z.B. die Molekulardynamik dieser Verbindungen, unter Anwendung eines Computermodells ausführlich und haben festgestellt, dass doppelsträngige DNA durch Einführen eines Linkers, z.B. einer Vinylgruppe, in die Cyclopropan-Komponente (Segment A), einer aktiven Stelle von Duocarmycin, gleichzeitig alkyliert und gespalten werden konnte (JP- A-11-83591 und WO 00/58312, obschon die internationale Anmeldung ein Zwischendokument darstellt).
Aus der Tatsache, dass diese künstliche chemische Spezies, die Basensequenzen von natürlicher DNA und RNA erkennen konnte, eine spezifische Basensequenz der natürlichen DNA und RNA erkannte und eine Wirkung des Segments A an der spezifischen Stelle der DNA und RNA erbrachte, haben wir erkannt, dass diese künstliche chemische Spezies anstelle einer Teilsequenz der natürlichen DNA und RNA verwendet werden könnte.
Beschreibung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Screeningverfahrens auf die Wirkung des Segments A (chemische Spezies A) auf Substanzen, die DNA oder RNA enthalten, wie z.B. Zellen, unter Verwendung dieser künstlichen chemischen Spezies.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren einer Wirkung einer chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält, unter Verwendung der chemischen Spezies, die eine Basensequenz der DNA erkennen kann, dargestellt durch die allgemeine Formel (I): B-L-A (I)worin B eine chemische Struktur ist, die nicht-natürliche Basen enthält, welche von substituiertem oder unsubstituiertem Pyrrol und/oder substituiertem oder unsubstituiertem Imidazol abgeleitet ist und welche eine Basensequenz der DNA erkennen kann,
A eine chemische Struktur ist, die eine Wechselwirkung mit DNA zeigt,
und L ein Linker ist, welcher chemische Strukturen von A und B miteinander verbinden kann,
welches Verfahren das Bereitstellen der Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), welche eine Basensequenz von DNA oder RNA erkennen kann, in jede Vertiefung einer Platte, bestehend aus einer Vielzahl von Vertiefungen, das Einführen einer Substanz, die DNA oder RNA enthält, in jede Vertiefung dieser Platte, das vollständige Umsetzen der Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), mit der Substanz, die DNA oder RNA enthält, und das Untersuchen des Zustands der Substanz, die DNA oder RNA enthält, umfasst.
Beim oben beschriebenen Verfahren betrifft die vorliegende Erfindung noch genauer ein Verfahren gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, worin die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung in jeder Vertiefung eine Verbindung ist, die einen Unterschied in der Basensequenz von DNA oder RNA der Substanz, die DNA oder RNA enthält, erkennen kann, wobei die DNA oder RNA enthaltende Substanz, die in jede Vertiefung eingebracht ist, dieselbe Substanz ist.
Weiterhin betrifft beim oben beschriebenen Verfahren die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, worin die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung in jeder Vertiefung eine Verbindung ist, die einen spezifischen Typ von Basensequenz von DNA oder RNA der Substanz, die DNA oder RNA enthält, erkennt, wobei die DNA oder RNA enthaltende Substanz, die in jede Vertiefung eingebracht ist, eine unterschiedliche Substanz ist.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zum Nachweisen oder Identifizieren der Wirkung der chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält, um die verschiedenen, im vorangegangenen beschriebenen Verfahren auszuführen.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zum Nachweisen oder Identifizieren der Wirkung der chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält, bestehend in einer chemischen Spezies, die eine Basensequenz der DNA erkennen kann, dargestellt durch die allgemeine Formel (I): B-L-A (I)worin B eine chemische Struktur ist, die nicht-natürliche Basen enthält, welche von substituiertem oder unsubstituiertem Pyrrol und/oder substituiertem oder unsubstituiertem Imidazol abgeleitet ist und welche eine Basensequenz der DNA erkennen kann, A eine chemische Struktur ist, die eine Wechselwirkung mit DNA zeigt, und L ein Linker ist, welcher chemische Strukturen von A und B miteinander verbinden kann; und die Ausrüstung oder Reagenzien zum Untersuchen eines Zustands der Substanz, die DNA oder RNA enthält, nach der Behandlung.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung einer chemischen Spezies der allgemeinen Formel (I), wie hierin definiert, zum Nachweisen oder Identifizieren der Wirkung einer chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Fotographie anstelle einer Zeichnung, die das Ergebnis einer Reaktion von ImPyLDu86 der vorliegenden Erfindung und DNA zeigt.
2 zeigt eine Basensequenz von DNA und die chemische Struktur von ImPyLDu86, wie im Experiment der 1 verwendet.
3 zeigt ein Screeningverfahren für Antitumormittel, die für Tumorzellen spezifisch sind, unter Verwendung der Platte der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt die Überlebensraten von Tumorzellen bei Konzentrationen von 100 nM der Verbindungen 1–16 der vorliegenden Erfindung.
5 zeigt ein Verfahren zum gleichzeitigen Testen eines Falls, bei dem die Verbindungen der vorliegenden Erfindung alleine verwendet werden, und eines Falls bei dem Gemische davon verwendet werden.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die chemische Struktur B, die nicht-natürliche Basen enthält und die eine Basensequenz von DNA erkennen kann, in der zuvor gezeigten allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Erfindung, ist vorzugsweise eine von Pyrrol und/oder Imidazol abgeleitete chemische Struktur, die wahlweise Substituenten aufweisen kann. Beispiele der Substituenten von Pyrrol und Imidazol sind nicht beschränkt, solange sie die Erkennung einer Basensequenz von DNA nicht behindern, und sind gerade oder verzweigte Alkylgruppen mit 1–10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1–5 Kohlenstoffatomen, einschließlich zum Beispiel Alkoxygruppen, die von dieser Alkylgruppe, Hydroxylgruppe, Aminogruppe, N-Alkyl-substituierten Aminogruppe, die von der Alkylgruppe abgeleitet ist, N-Acyl aminogruppe, die von organischen Carbonsäuren abgeleitet ist, Guanidin- und substituierte Guanidingruppen. Spezifischer sind N-Methylpyrrol, N-Methylimidazol, 3-Hydroxypyrrol, N-Methyl-3-hydroxypyrrol und ähnliches einbezogen.
Diese nicht-natürlichen Basen, die eine natürliche Basensequenz erkennen können, können wahlweise in einer Hauptkette lokalisiert sein oder können wahlweise an einer Hauptkette hängend sein. Sind diese nicht-natürlichen Basen in einer Hauptkette lokalisiert, so können diese nicht-natürlichen Basen als solche funktionelle Gruppen zum Konstruieren der Hauptkette aufweisen, zum Beispiel eine Carboxylgruppe an einem Ende und eine Aminogruppe am anderen Ende der nicht-natürlichen Base, wobei diese Basen eine Polyamidstruktur bilden können. Die die Hauptkette bildende Struktur ist nicht auf die obige Polyamidstruktur beschränkt und kann eine solche sein, die eine Polyesterstruktur, Polyiminstruktur und ähnliches bildet.
Hängen die nicht-natürlichen Basen an einer Hauptkette, so können sie an einer Polysaccharidstruktur, wie z.B. natürlicher DNA oder RNA, hängen oder können an einer Struktur aus einem synthetischen Polymer hängen.
Ein bevorzugtes Beispiel der chemischen Struktur B, die nicht-natürliche Basen enthält und die eine Basensequenz von DNA erkennen kann, ist spezifischer eine Pyrrol-Imidazol-Polyamid-Verknüpfung. Die Zahlen (Längen) der Pyrrole und Imidazole sind nicht beschränkt und betragen vorzugsweise etwa 2–30 Einheiten, bevorzugter etwa 24–16 Einheiten, und noch bevorzugter etwa 4–16 Einheiten.
Eine chemische Struktur A, die eine Base in DNA binden kann, kann einer Vielzahl von chemischen Spezies angehören, solange sie mit DNA oder RNA wechselwirken kann. Ein Beispiel einer bevorzugten Struktur der chemischen Spezies (Segment A) ist eine Struktur einer chemischen Substanz mit einer Antitumoraktivität. Ein Beispiel einer chemischen Substanz mit einer Antitumoraktivität ist vorzugsweise ein Alkylierungsmittel, das an DNA aktiv werden kann. Bevorzugter ist dies eine chemische Struktur mit einem Cyclopropan-Ring, und noch bevorzugter eine Alkylierungskomponente von Duocarmycin.
Die Linkerkomponente L, die an die chemischen Strukturen A und B binden kann, kann vorzugsweise eine Struktur sein, die das Segment A und das Segment B bei einem geeigneten Abstand trennen kann und darüber hinaus die Alkylierungsaktivität nicht inaktiviert. Ein bevorzugtes Beispiel ist eine chemische Struktur mit einer Vinylgruppe.
Die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung kann einzeln oder als ein Gemisch aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen verwendet werden. Werden zwei oder mehrere der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindungen als ein Gemisch verwendet, so können verschiedene Mischungsmuster zugrundegelegt werden. Allgemein ist ein Gemisch aus chemischen Spezies mit voneinander verschiedenen chemischen Spezies B (Segment B) bevorzugt, doch nicht darauf beschränkt.
Beispiele einer bevorzugten Verbindung der vorliegenden Erfindung, wie dargestellt durch die allgemeine Formel (I), sind die durch die folgende Formel dargestellten Verbindungen (im Folgenden bezeichnet als "PyPyLDu86"):
oder die Verbindung, wie dargestellt durch die folgende Formel (im Folgenden als "ImPyLDu86" bezeichnet):
Die oben beschriebenen Verbindungen können Sequenzen erkennen, wie etwa eine Basensequenz TGACG, oder einen Komplementärstrang dazu entsprechend ImPyLDu86.
Weiterhin ist eine Verbindung, wie dargestellt durch die allgemeine Formel (II), mit der Struktur {Py oder Im}{Py oder Im}Ldu86 der folgenden Formel, die aus der Grundstruktur PyPyLDu86 besteht:
worin X und Y jeweils unabhängig -CH= oder -N= ist, oder ein Gemisch davon im Verhältnis 1:1, umfasst.
Für die nachstehenden Erläuterungen sind diese Verbindungen oder Gemische davon wie folgt nummeriert:
Eine Verbindung, worin X ist CH und Y ist CH, ist bezeichnet als Verbindung 1;
eine Verbindung, worin X ist CH und Y ist N, ist bezeichnet als Verbindung 2;
eine Verbindung, worin X ist N und Y ist CH, ist bezeichnet als Verbindung 3;
eine Verbindung, worin X ist N und Y ist N, ist bezeichnet als Verbindung 4;
ein Gemisch aus Verbindung 1 und Verbindung 2 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 5;
ein Gemisch aus Verbindung 1 und Verbindung 3 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 6;
ein Gemisch aus Verbindung 1 und Verbindung 4 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 7;
ein Gemisch aus Verbindung 2 und Verbindung 3 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 8;
ein Gemisch aus Verbindung 2 und Verbindung 4 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 9; und
ein Gemisch aus Verbindung 3 und Verbindung 4 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 10.
Weiterhin ist eine Verbindung, wie dargestellt durch die allgemeine Formel (III), mit der Struktur {Py oder Im}{Py oder Im}{Py oder Im}Ldu86 der folgenden Formel, die aus der Grundstruktur PyPyPyLDu86 besteht:
worin X, Y und Z jeweils -CH= oder -N= sind, oder ein Gemisch davon im Verhältnis 1:1, umfasst.
Für die nachstehenden Erläuterungen sind diese Verbindungen oder Gemische daraus wie folgt nummeriert:
Eine Verbindung, worin X ist CH, Y ist N und Z ist N, ist bezeichnet als Verbindung 11;
eine Verbindung, worin X ist CH, Y ist N und Z ist CH, ist bezeichnet als Verbindung 12;
eine Verbindung, worin X ist CH, Y ist CH und Z ist CH, ist bezeichnet als Verbindung 13;
ein Gemisch aus Verbindung 11 und Verbindung 12 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 14;
ein Gemisch aus Verbindung 11 und Verbindung 13 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 15; und
ein Gemisch aus Verbindung 12 und Verbindung 13 im Verhältnis 1:1 ist bezeichnet als Verbindung 16.
Diese Verbindungen 1–16 werden in den nachstehend beschriebenen Experimenten verwendet.
Die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung kann gemäß bekannter Methoden hergestellt werden. Das heißt, die Verbindung kann durch Erzeugen des Segments A und des Segments B mittels herkömmlicher Methoden; sukzessives Binden des Linker-Segments L daran; und dann weiteres Binden der verbliebenen Segmente daran, hergestellt werden.
Beispiele der Verfahren zur Erzeugung von ImPyLDu86 (7a) und PyPyLDu86 (7b), wie im Vorangegangenen beschrieben, sind im folgenden chemischen Reaktionsschema veranschaulicht. Die Nummern unter jeder Verbindung im Reaktionsschema geben die Nummer der Verbindung wieder.
Im Reaktionsschema bedeutet: a) die Behandlung mit einer Lösung von Benzotriazol-1-yl-oxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) in THF, gefolgt von einer NaBH₄-Behandlung; b) die Behandlung mit MnO₂ in THF; c) die Behandlung mit Triethylphosphonacetat und NaH in THF; d) die Behandlung mit Natriumhydroxid in wässrigem Methanol; e) die Behandlung mit 1,1-Carbonyldiimidazol in DMF; und f) die Behandlung von Du86 mit dem Segment A unter Verwendung von Natriumhydrid in DMF.
Die Reaktivitäten der so synthetisierten PyPyLDu86 und ImPyLDu86 mit DNA wurden bestimmt. Das Ergebnis der Alkylierung durch ImPyLDu86 ist in 1 gezeigt. Die im vorliegenden Experiment verwendete DNA und ImPyLDu86 sind in 2 gezeigt.
In 1 zeigt das linke Migrationsmuster das Ergebnis für den oberen Strang von dop pelsträngiger DNA, und zeigt das rechte Migrationsmuster das Ergebnis für den unteren Strang von doppelsträngiger DNA. Die Lokalisationen der Alkylierung können mittels Erhitzung als Spaltbande beobachtet werden. Als Folge wurde die doppelsträngige DNA hauptsächlich an Stelle 1 und Stelle 2 bei einer geringen Konzentration gespalten, und es war erkennbar, dass die Alkylierung in der doppelsträngigen DNA gleichzeitig erfolgte. Bisher war keine Verbindung bekannt, die solch eine Spaltung erzeugte, weshalb diese sicherlich als künstliches Restriktionsenzym bezeichnet werden kann. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass sich die Spaltung in einem hohen Verhältnis von 70% vollzog, was eine sehr hohe Effizienz im Vergleich zu zuvor synthetisierten Verbindungen bedeutete (JP-A-10-260710).
Als Beispiel einer Substanz, die DNA oder RNA enthält, ist die Verwendung lebender Zellen bevorzugt, obschon DNA oder RNA als solche verwendet werden kann. Wird ein Antitumormittel als Segment A verwendet, so können Tumorzellen eingesetzt werden.
In dem Fall, dass Methylpyrrol (Py) und Methylimidazol (Im) als nicht-natürliche Basen im Segment B der allgemeinen Formel (I) verwendet werden, kann, da bekannt ist, dass ein C-G-Basenpaar durch Py-Im erkannt wird; ein G-C-Basenpaar durch Im-Py erkannt wird; und ein A-T- oder ein T-A-Basenpaar durch Py-Py erkannt wird, eine tatsächliche Basensequenz durch geeignetes Kombinieren von Methylpyrrol (Py) und Methylimidazol (Im) erkannt werden. Im Einzelnen kann eine Sequenz aus drei natürlichen Basen unter Verwendung dreier Einheiten (Trimer) Methylpyrrol (Py) und Methylimidazol (Im) erkannt werden, und eine Sequenz von vier natürlichen Basen kann unter Verwendung von vier Einheiten (Tetramer) Methylpyrrol (Py) und Methylimidazol (Im) erkannt werden.
Weiterhin kann eine Verbindung mit der Sequenz des Segments B als ein Gemisch aus zwei oder mehr Arten davon verwendet werden.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Wirkung der chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält, durch Untersuchen des Zustands der Substanz, die DNA oder RNA enthält, nachgewiesen oder identifiziert werden, nachdem die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung vollständig mit einer Substanz, die DNA oder RNA enthält, umgesetzt worden ist.
Bei einer Methode zur vollständigen Umsetzung der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindung mit einer Substanz, die DNA oder RNA enthält, kann die Reaktion durch Inkubieren beider in einem geeigneten Puffer vollzogen werden. Als Methode zur Untersuchung des Zustands einer Substanz, die DNA oder RNA enthält, nach der Inkubation können verschiedene Markierungs- oder Färbemethoden angewendet werden. Diese Methoden lassen sich in Abhängigkeit von dem Zustand einer Substanz, die DNA oder RNA enthält, geeignet auswählen.
Werden lebende Zellen als der Substanz, die DNA oder RNA enthält, verwendet und ihr Zustand anhand ihrer Überlebensrate nachgewiesen, so stellt eine Färbemethode der Zellen eine einfache und bevorzugte Methode dar. Die Quantifizierung der Zahl der lebenden Zellen kann mittels eines handelsüblichen Zellzählungs-Kit oder durch Kombinieren des Kits mit der Lichtabsorption in der Anfärbung erzielt werden.
Im Folgenden werden Anwendungsformen der vorliegenden Erfindung konkret erläutert.
3 veranschaulicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die linke Abbildung in 3, die als Karopapier dargestellt ist, zeigt eine aus einer Vielzahl von Vertiefungen (Wells) bestehende Platte, wobei jedes Quadrat für eine Vertiefung steht. In diesem Beispiel ist eine Platte von 96 Wells gezeigt. In jeder Vertiefung ist die durch die allgemeine Formel (I) der vorliegenden Erfindung dargestellte chemische Spezies vorhanden. Zunächst wird ein Fall erörtert werden, bei dem die durch die allgemeine Formel (I) der vorliegenden Erfindung dargestellte chemische Spezies in jeder Vertiefung voneinander verschiedene Basensequenzen erkennt.
Im Falle eines Tetramers zum Beispiel werden nicht-natürliche Basen, bestehend aus Methylpyrrol (Py) und Methylimidazol (Im), in der Komponente des Segments B der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten chemischen Spezies verwendet, wobei ein Basensatz, der drei unterschiedliche Basen erkennen kann, unter Ausnutzung der Strukturen aller Austäusche und Kombinationen, die mit Py und Im möglich sind, wie etwa Py-Py-Py-Py, Py-Py-Py-Im, Py-Py-Im-Py und Im-Im-Im-Py, verwendet werden kann (in diesem Fall können 16 Kombinationsmöglichkeiten erzielt werden). Ein Alkylierungsmittel wird an das Segment A der allgemeinen Formel (I) gebunden, woraufhin die resultierende Verbindung an die Vinylgruppe geknüpft wird, die den Linker L enthält.
Darauf werden sechzehn Typen von chemischer Spezies mit unterschiedlichen Strukturen im Segment B in jedes Well der in der linken Abbildung der 3 gezeigten Platte eingebracht. Anschließend werden jedem Well Tumorzellen hinzugefügt und diese für mehrere Stunden bis mehrere Tage inkubiert. Als Folge erkennt die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte chemische Spezies eine spezifische Region der Basensequenzen der Tumorzellen und reagiert mit der DNA der Tumorzellen und alkyliert sie, was die Tumorzellen abtötet. In der rechten Abbildung der 3 sind die Inhaltsstoffe jedes Wells nach Abschluss der zuvor genannten Inkubation angefärbt. Lebendzellen sind durch Färbemittel angefärbt und sind in 3 in schwarzer Farbe gezeigt, wohingegen abgetötete Zellen nicht angefärbt werden können und als Leerfeld (weiß) in 3 gezeigt sind. Das in 3 gezeigte Beispiel zeigt den Fall, bei dem ein Octamer als Segment B verwendet wird, und es ist zu erkennen, dass die Krebszellen bei drei Typen von nicht-natürlichen Basensequenzen abgetötet sind. Da die in jedem Well vorhandene nicht-natürliche Basensequenz im Voraus bekannt ist, kann aus diesem Test erkannt werden, bei welchen Sequenzen die Tumorzellen abgetötet werden.
Bei dem in 3 gezeigten Fall wird ein Octamer verwendet. Folglich sind von der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten chemischen Spezies 2⁸, d.h. 256 Arten von Segment B-Komponenten in jedem Well vorhanden. In diesem Fall wird beobachtet, dass drei Sequenztypen davon die Tumorzellen spezifisch abtöten können. Diese drei Sequenzen sind die folgenden:
PyImPyPyPyImPyPy,
PyImPyPyPyImImPy, und
ImImPyPyPyImPyPy.
Da Tumorzellen abhängig vom Typus und Organismus verschieden sind, können Antitumormittel mit einer spezifischen Wirkung gegen Tumorzellen in einer untersuchten Probe gemäß der bei der vorliegenden Erfindung beschriebenen Methode innerhalb kurzer Zeit in einfacher Weise rückgewonnen werden. Außerdem können Tumorzellen sogar im gleichen Gewebe in Abhängigkeit von ihrem Zustand mutiert werden. Selbst in diesem Fall kann ein für die mutierten Tumorzellen spezifisches Antitumormittel mittels der Methode der vorliegenden Erfindung in bequemer Weise rückgewonnen werden. Außerdem kann gemäß der hierin beschriebenen Methode der vorliegenden Erfindung die Wirkung des Antitumormittels auf periphere normale Zellen der Tumorgewebe ebenfalls mittels derselben Methode untersucht werden.
Folglich bietet die Methode der vorliegenden Erfindung eine bequeme Screeningmethode für ein Antitumormittel mit einer spezifischen Wirkung auf tatsächliche Tumorzellen, ohne dabei normale Zellen zu beeinträchtigen, das innerhalb kurzer Zeit ausführbar ist.
Weiterhin wurden die im Vorangegangenen genannten Verbindungen 1–16 auf ihre Aktivitäten untersucht.
Zytotoxizitätstests wurden unter Verwendung der aus insgesamt 2 oder 3 Pyrrol-(Py)- und Imidazol-(Im)-Amid-Komponenten bestehenden Verbindungen vorgenommen. Die Ergebnisse der durch die Überlebensraten der Zellen unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verbindungen 1–16 angezeigten Wirkungen sind in 4 gezeigt. Gleichzeitige Screeningtests unter Verwendung der humanen Tumorzellen LCL-wt, HLC-2 und der humanen Leukämiezelle Jurkat ergaben, dass lediglich Verbindung 14 eine hohe Zytotoxizität gegen LCL-wt zeigte und keine nützliche Wirkung gegen Jurkat und HLC-2 nachgewiesen wurde.
4 zeigt die Testergebnisse der Zytotoxizitäten der Verbindungen 1–16 gegen LCL-wt und Jurkat bei einer Konzentration von 100 nM.
Wie oben gezeigt, wurde erkennbar, dass Gemische von 2 oder mehr der durch die allgemeine Formel (I) der vorliegenden Erfindung dargestellten Verbindungen spezifische Aktivitäten zeigten. Die verschiedenen Fälle von Testmethoden unter Verwendung dieser Gemische sind in 5 gezeigt. In 5 ist ein Test unter Verwendung von 8 × 8 = 64 Wells gezeigt.
Es sind Fälle mit 3 Erkennungsstellen im Segment B gezeigt. Werden Pyrrol (Py) und Imidazol (Im) als den Erkennungskomponenten verwendet, so können Kombinationen von 2³ Typen, d.h. 8 Typen, angewendet werden. Diese 8 Typen wurden zu jeweils 25 μl der Länge nach und der Breite nach eingebracht. So wurden zum Beispiel 8 Typen der Verbindungen in jede Zeile bzw. Reihe der Wells in einer Weise eingebracht, bei der Py-Py-Py zu jeweils 25 μl in die erste Zeile und die erste Reihe der Platte eingebracht wurde, dann Py-Im-Py zu jeweils 25 μl in die zweite Zeile und die zweite Reihe der Platte eingebracht wurde, weiterhin Py-Py-Im zu jeweils 25 μl in die dritte Zeile und die dritte Reihe der Platte eingebracht wurde. Auf diese Weise wurde lediglich ein Typ von Verbindung in die Wells auf der Diagonalen der Platte eingebracht, und aus zwei Arten von Verbindungen bestehende Gemische wurden in einem Verhältnis von 1:1 in die anderen Wells als die der Diagonale eingebracht. Die Ergebnisse der Inkubation mit Tumorzellen, wie mittels der in 3 gezeigten Methode vorgenommen, und die Behandlung mit Färbemitteln sind in 5 dargestellt.
Bei dem in 5 gezeigten Fall wird der Tod der Tumorzellen im Well der dritten Zeile und der dritten Reihe, den Wells der zweiten Zeile und der sechsten Reihe und der sechsten Reihe und der zweiten Zeile, und den Wells der vierten Reihe und der achten Zeile und der achten Reihe und der vierten Zeile beobachtet. Da das Well der dritten Zeile und der dritten Reihe auf der Diagonale liegt, kann festgestellt werden, dass Py-Py-Im alleine die Tumorzellen abtötet. Da die Wells der zweiten Zeile und der sechsten Reihe und der sechsten Reihe und der zweiten Zeile, ebenso wie die Wells der vierten Zeile und der achten Reihe und der achten Reihe und der vierten Zeile in symmetrischen Positionen zur Diagonale lokalisiert sind, stellt ersteres ein 1:1-Gemisch aus Py-Im-Py und Im-Py-Im und letzteres ein 1:1-Gemisch von Py-Im-Py und Im-Im-Im dar. In diesen Fällen wird gezeigt, dass die Verbindung oder die Gemische mit diesen Segmenten B spezifisch wirksam gegen diese Tumorzellen sind.
Weiterhin zeigt dieser experimentelle Fall einen wichtigen Punkt auf, dass nämlich, obschon die Wirksamkeit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) gegen Tumorzellen nicht nachweisbar ist, wenn die Verbindung alleine verwendet wird, ein Fall vorliegt, bei dem die Wirksamkeit lediglich bei Verwendung in einem Gemisch mit einer anderen Verbindung nachgewiesen wird.
Gemäß der Testmode der vorliegenden Erfindung können Ergebnisse unter alleiniger Verwendung der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindung erhalten werden, und parallel dazu außerdem die Ergebnisse unter Verwendung dieser Verbindungen als einem Gemisch erhalten werden.
In obigem Fall handelt es sich um eine Methode zur Gewinnung eines für Tumorzellen spezifischen Antitumormittels. Außerdem wird eine chemische Spezies mit der durch die allgemeine Formel (I) der vorliegenden Erfindung dargestellten Segment B-Komponente entsprechend der Basensequenz, von der eine Wirksamkeit an einer spezifischen Lokalisation in der Basensequenz bekannt ist, unter Verwendung von Tumorzellen als der Substanz, die DNA oder RNA enthält, präpariert, wobei eine Vielzahl von Typen der durch die allgemeine Formel (I) der vorliegenden Erfindung dargestellten chemischen Spezies, die an verschiedene Kandidatenverbindungen eines Antitumormittels gebunden sind und hinsichtlich ihrer Segment-A-Komponenten voneinander verschieden sind, in jedem Well bereitgestellt und daraufhin diese chemischen Spezies mit Tumorzellen inkubiert werden, wie zuvor beschrieben, wodurch Wirkungen der Kandidatenverbindungen in den Segment-A-Komponenten erzielt werden können.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Screeningmethode für eine Antitumorwirkung an Tumorzellen durch Binden der Kandidatenverbindung eines Antitumormittels an die Segment-A-Komponente der allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Kit zum Nachweisen oder Identifizieren einer Wirkung der chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält, zur Durchführung der verschiedenen, im Vorangegangenen beschriebenen Methoden der vorliegenden Erfindung bereit.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Kit zum Nachweisen oder Identifizieren einer Wirkung der chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält, bereit, bestehend aus der chemischen Spezies, die eine Basensequenz von DNA erkennen kann, wie dargestellt durch die allgemeine Formel (I): B-L-A (I)worin B eine chemische Struktur ist, die nicht-natürliche Basen enthält, die eine Basensequenz von DNA erkennen kann, A eine chemische Struktur ist, die eine Wechselwirkung mit DNA zeigt, und L ein Linker ist, der chemische Strukturen von A und B miteinander verbinden kann;
und Vorrichtungen oder Reagenzien zur Untersuchung eines Zustandes der Substanz, die DNA oder RNA enthält, nach der Behandlung. Wie im Vorangegangenen beschrieben, kann die Verbindung der allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Erfindung alleine verwendet werden oder kann zu einem Gemisch aus zwei oder mehreren Arten von Verbindungen zubereitet werden.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine Platte bereit, bestehend aus einer Vielzahl von Vertiefungen (Wells), die die chemische Spezies enthalten, welche eine Basensequenz von DNA erkennen kann, wie dargestellt durch die allgemeine Formel (I): B-L-A (I)worin B eine chemische Struktur ist, die nicht-natürliche Basen enthält, die eine Basensequenz von DNA erkennen kann, A eine chemische Struktur ist, die eine Wechselwirkung mit DNA zeigt, und L ein Linker ist, welcher chemische Strukturen von A und B miteinander verbinden kann;
in jedem Well der Platte, bestehend aus einer Vielzahl von Wells. Genauer gesagt ist die Platte der vorliegenden Erfindung eine Platte zum Nachweisen oder Identifizieren der Wirkung der chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält.
Die im Vorangegangenen durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung kann ein Typ oder zwei oder mehrere Typen sein, die in jedem Well der Platte immobilisiert sind. Diese Verbindungen können im Zustand einer Lösung oder eines Gels vorliegen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand von konkreten Beispielen ausführlicher erläutert werden, ist jedoch nicht auf diese konkreten Beispiele beschränkt.
Beispiele
Beispiel 1 (Beurteilung der Antitumorwirkung mittels Zytotoxizitätstest)
Humane Tumorzellen LCL-wt und HLC-2, humane Leukämiezellen, Jurkat, und humane Gebärmutterhalskrebszellen HeLa-Zelle wurden als Tumorzellen verwendet. Für LCL-wt und Jurkat wurden PRMI 1640 (Gibco BRL) + 10% fötales Rinderserum (JRH BIOCIENCES) + 100 μU/ml Penicillin G – 100 μU/ml Streptomycinsulfat (Gibco BRL) als das Medium für die Inkubation verwendet. Für HLC-2 wurden MEM + 10% fötales Rinderserum (JRH BIOCIENCES) + 100 μU/ml Penicillin G – 10 μU/ml Streptomycinsulfat (Gibco BRL) als das Medium für die Inkubation verwendet. Für HeLa-Zellen wurden RBMI + 10% fötales Rinderserum (JRH BIOCIENCES) + 100 μU/ml Penicillin G – 100 μU/ml Streptomycinsulfat (Gibco BRL) als das Medium für die Inkubation verwendet. Die jeweiligen Zellen wurden inkubiert und jene Zellen mit einer logarithmischen Wachstumsphase suspendiert und für das Screening verwendet.
Das Screening wurde wie folgt ausgeführt. Eine auf die anfänglichen Zellzählungen von etwa 2 × 10⁵ Zellen/ml eingestellte Zellsuspension wurde separat in die 96 Wells der Multi-Well-Platte zu 50 μl/Well eingebracht. Die Testlösung der Testverbindung (100 μM, Medium + 0,1% DMSO) wurde dem zugegeben und bei 37°C unter einer 5% CO₂-Konzentration für 2 Tage im Inkubator inkubiert und dann die Zellzählungen durchgeführt.
Die Zellzählungen wurden unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (MPR-A4i, TOSOH) und eines Hämozytometers berechnet. Bei einem Assay unter Verwendung des Mikroplatten-Lesegeräts wurde der Zellzähl-Kit-8 (DOJINDO) verwendet, und die Lichtabsorption wurde bei 450 nm (Referenzwellenlänge 600 nm) gemessen. Die Zählungen der lebensfähigen Zellen und der nicht-lebensfähigen Zellen wurden durch den Farbausschlusstest unter Verwendung von Trypanblau unter einen Mikroskop vorgenommen. Basierend auf den Messergebnissen unter Verwendung des Mikroplatten- Lesegeräts und des Hämozytometers wurde die Überlebensrate anhand der folgenden Formel berechnet: Überlebensrate = 100 np/na worin n_p die Zählung der lebensfähigen Zellen bei Zugabe von Probe und n_a die Kontrollzählung der lebensfähigen Zellen ist.
Beispiel 2 (Zytotoxizitätstest)
Gleichzeitig wurden Screeningtests unter Verwendung der humanen Tumorzellen LCL-wt, HLC-2 und der humanen Leukämiezellen Jurkat mit der Platte der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verbindungen 1–16 durchgeführt.
Die Ergebnisse wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, und die Überlebensrate jeder Zelle wurde berechnet.
In 4 sind die Ergebnisse für die Testverbindungen bei einer Konzentration von 100 nM gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Verbindung 14 eine hohe zytotoxische Wirkung lediglich gegen LCL-wt zeigt.
Beispiel 3 (Synthese der Verbindungen)
Die Synthesemethode für Verbindung 13 ist nachfolgend veranschaulicht.
Als Reagenzien für die Reaktionen und die Reinigungen und als Lösungsmittel wurden handelsübliche Materialien verwendet. Für die protonenkernmagnetischen Resonanzspektren (NMR) wurde Nihon Denshi JNM-A500 verwendet. Als eine interne Standardsubstanz wurde Tetramethylsilan (TMS) verwendet, und die chemischen Verschiebungen wurden durch δ-Werte (ppm) angegeben. Die Abkürzungen für die Signale sind wie folgt: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), m (Multiplett), br (breit) und br s (breites Singulett). Die Abkürzungen für die Reagenzien und Lösungsmittel sind wie folgt: Dimethylformamid (DMF), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Carbonyldiimidazol (CDI), 4-(Dimethyl)aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDCI) und Tetrahydrofuran (THF). Die Reaktionen wurden, sofern nicht spezifiziert, unter einer Argonatmosphäre oder einer Stickstoffatmosphäre vorgenommen.
(1) 1-Methyl-4-nitropyrrol-2-aldehyd (22)
Acetanhydrid-(25 ml)-Lösung von rauchender Salpetersäure (1,5 ml, 37,5 mmol) wurde bei –30°C gekühlt. Acetanhydrid (10 ml)-Lösung von 1-Methylpyrrol-2-carboxyaldehyd (21) (3,27 g, 30,0 mmol) wurde unter derselben Temperatur zugetropft, und das Gemisch wurde bei derselben Temperatur für 5 Stunden gerührt. Der ausgefällte Feststoff wurde zum Erhalt der Nitroverbindung (22) filtriert (860 mg, 19%). Das Lösungsmittel des Filtrats wurde in vacuo entfernt, und der erhaltene Rückstand wurde auf eine Kieselgel-Chromatographiesäule aufgegeben, wodurch zusätzliches (22) (650 mg, 14%) aus Hexan-Ethylacetat-(4:1, v/v)-Eluat erhalten wurde.
¹H NMR (CDCl₃) δ: 4,00(3H, s), 7,40(1H, d, J = 2,0 Hz), 7,65(1H, d, D = 2,0 Hz), 9,61(1H, s);
IR (KBr) ν 1678, 1535, 1508, 1423, 1406, 1311, 1100, 864, 814, 770, 754 cm^–1.
(2) Py-L-CO₂Et (23)
Natriumhydrid (83 mg, 2,1 mmol) wurde THF (15 ml)-Lösung von Triethylphosphonacetat (0,39 ml, 2,0 mmol) unter Eiskühlung zugegeben und 10 Minuten gerührt. THF (5 ml)-Lösung der Nitroverbindung (22) wurde bei derselben Temperatur zugetropft und bei derselben Temperatur für weitere 45 Minuten gerührt. Wasser wurde dem Reaktionsgemisch zugegeben und dieses mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und durch Zugabe von anhydrischem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in vacuo herausdestilliert, und der erhaltene Rückstand wurde auf eine Kieselgel-Chromatographiesäule aufgegeben, um Ester (23) (225 mg, 77%) aus Hexan-Ethylacetat-(1:4, v/v)-Eluat zu erhalten.
¹H NMR (CDCl₃) δ: 1,28(3H, t, J = 7,5 Hz), 3,75(3H, s), 4,24(2H, q, J = 7,5 Hz), 6,28(1H, d, J = 16,0 Hz), 7,09(1H, d, J = 2,0 Hz), 7,47(1H, d, J = 16,0 Hz), 7,54(1H, d, J = 2,0 Hz);
¹³C NMR (CDCl₃) δ: 14,3, 35,4, 60,8, 106,1, 118,4, 125,3, 129,8, 130,1, 136,7, 166,5;
IR (KBr) ν: 1709, 1632, 1510, 1427, 1412, 1373, 1315, 1282, 1176 cm^–1
(3) Py-Py-L-CO₂Et (24)
Zu einer Methanollösung (45 ml) des Esters (23) (1,12 g, 5,0 mmol) wurden 10% Pal ladiumkohle (250 mg) bei Raumtemperatur zugegeben. 1 N Natriumborhydrid (8 ml) wurde dem Gemisch bei derselben Temperatur zugegeben und dieses für weitere 10 Minuten gerührt. Nach Zugabe von Aceton (2 ml) wurde die Suspension durch Kieselgur passiert und das Präzipitat entfernt. Das Lösungsmittel des Filtrats wurde in vacuo herausdestilliert, und Ethylacetat wurde dem erhaltenen Rückstand zugegeben. Die Lösung wurde mit wässriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und durch Zugabe von anhydrischem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in vacuo herausdestilliert. Der erhaltene Rückstand wurde in Methylenchlorid (45 ml) gelöst und für die anschließende Reaktion verwendet. 1-Methyl-4-nitro-2-trichloracetylpyrrol (2,35 g, 7,0 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (1,31 ml, 7,5 mmol) wurden der Lösung bei Raumtemperatur nach und nach zugegeben und dies bei derselben Temperatur für 3 Stunden gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurde Wasser zugegeben und dies mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit wässriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und durch Zugabe von anhydrischem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in vacuo herausdestilliert. Der erhaltene Rückstand wurde auf eine Kieselgel-Chromatographiesäule aufgegeben, um Bispyrrol (24) (483 mg, 28%) aus dem Ethylacetat-Eluat zu erhalten.
¹H NMR (CDCl₃ + DMSO-d₆) δ: 1,23(3H, t, J = 7,0 Hz), 3,59 (3H, s), 3,94 (3H, s), 4,14(2H, q, J = 7,0 Hz), 6,01(1H, d, J = 15,5 Hz), 6,57(1H, d, J = 2,0 Hz), 7,27(1H, br s), 7,45(1H, d, J = 15,5 Hz), 7,46(1H, d, J = 1,5 Hz), 7,50(1H, d, J = 2,0 Hz), 9,59(1H, br s).
(4) Py-Py-Py-L-CO₂ET (26)
Der Suspension von Bispyrrol (24) (173 mg, 0,50 mmol) in Methanol-Ethylacetat (10 ml–10 ml) wurde 10% Palladiumkohle (50 mg) bei Raumtemperatur zugegeben. 1 N Natriumborhydrid (1,5 ml) wurde dem Gemisch bei derselben Temperatur zugegeben und dieses für weitere 2 Minuten gerührt. Die Suspension wurde durch eine Kieselgel-Chromatographiesäule zur Entfernung des Präzipitats passiert. Das Lösungsmittel wurde in vacuo herausdestilliert. Der erhaltene Rückstand wurde in DMF (10 ml) gelöst und für die anschließende Reaktion verwendet. 4-Acetamino-1-methylpyrrol-2-carboxylat-HOBt-Ester (25) [Z.-F. Tao, et al. J. Am. Chem. Soc. 121, 4961–4967 (1999)] (209 mg, 0,70 mmol) und DMAP (85 mg, 0,70 mmol) wurden der Lösung nach und nach zugegeben, und das Gemisch wurde bei derselben Temperatur für 3 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo herausdestilliert, und der erhaltene Rückstand wurde einer Kieselgel-Säulenchromatographie unterzogen. Tris-Pyrrol (26) (120 mg, 50%) wurde aus Methanol-Ethylacetat-(1:9, v/v)-Eluat erhalten.
¹H NMR (CDCl₃) δ: 1,29(3H, t, J = 7,0 Hz), 2,06(3H, s), 3,59(3H, s), 3,81(3H, s), 3,84(3H, s), 4,20(2H, q, J = 7,0 Hz), 5,99(1H, d, J = 15,5 Hz), 6,51(1H, s), 6,58(1H, s), 6,61(1H, s), 6,94(1H, d, J = 2,0 Hz), 7,13(1H, s), 7,32(1H, d, J = 2,0 Hz), 7,47(1H, d, J = 15,5 Hz), 7,78(1H, s), 7,98(1H, s), 8,36(1H, s)
(5) Py-Py-Py-L-CO₂Im (27)
Wässrige 1 N Natriumhydroxidlösung (1,5 ml) wurde einer Methanol-THF (10 ml–10 ml)-Lösung von Tris-Pyrrol (26) (24 mg, 0,050 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben und bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo herausdestilliert. Wässrige 10% Essigsäurelösung wurde dem erhaltenen Rückstand zugegeben, und das Präzipitat wurde filtriert, um das Hydrolysat zu erhalten (13,5 mg). Das Hydrolysat wurde im nächsten Reaktionsschritt ohne weitere Reinigung verwendet. CDI (24,3 mg, 0,15 mmol) wurde DMF (1,5 ml)-Lösung des Hydrolysats (12,8 mg) bei Raumtemperatur zugegeben und bei derselben Temperatur über Nacht gerührt. Wasser wurde zugegeben und das Präzipitat filtriert, um Imidazolester (27) (13,5 mg, 54%) zu erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 1,96(3H, s), 3,77(3H, s), 3,82(3H, s), 3,85(3H, s), 6,85(1H, s), 7,08(1H, s), 7,09(1H, s), 7,12(1H, d, J = 15,0 Hz), 7,14(1H, s), 7,22(1H, s), 7,24(1H, s), 7,47(1H, s), 7,87(1H, d, J = 15,0 Hz), 7,90(1H, s), 8,66(1H, s), 9,80(1H, s), 9,89(1H, s), 10,03(1H, s)
(6) Py-Py-Py-L-Du86 (11)
60% Natriumhydrid (2,0 mg, 0,050 mmol) wurde einer DMF-(2 ml)-Lösung von Du86-A-Segment (28) [S. Nakamura, et al., J. Med. Chem. 40, 972–979 (1999)] (6,2 mg, 0,024 mmol) unter Eiskühlung zugegeben und bei derselben Temperatur für 10 Minuten gerührt. Dann wurde DMF-(1 ml)-Lösung dem Imidazolester (27) (12,9 mg, 0,026 mmol) bei derselben Temperatur zugegeben und bei dieser Temperatur für weitere 5 Stunden gerührt. Nach Zugabe von Natriumphosphat-Puffer (pH 6,86) wurde Wasser zugegeben und mit Methylenchlorid extrahiert. Das Lösungsmittel wurde in vacuo herausdestilliert, und der erhaltene Rückstand wurde einer Kieselgel-Säulenchromatographie unterzogen. Py-Py-Py-L-Du86 (11) (7,7 mg, 46%) wurde aus Methanol-Chloro form-(1:9, v/v)-Eluat erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 1,29–1,31 (1H, m), 1,97(3H, s), 2,07–2,11(1H, m), 2,47(3H, s), 3,72(3H, s), 3,78(3H, s), 3,82(3H, s), 3,83(3H, s), 4,17–4,22(1H, m), 4,27–4,32(1H, m), 6,57(1H, d, J = 15,0 Hz), 6,83–6,85(br s), 6,86(1H, s), 6,90(1H, s), 7,06(1H, s), 7,15(1H, s), 7,24(1H, s), 7,39(1H, s), 7,57(1H, d, J = 15,0 Hz), 9,80(1H, s), 9,89(1H, s), 9,94(1H, s), 12,36(1H, s)
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt eine Screeningmethode für eine Substanz, die spezifisch an spezifischen Zellen wirkt, mittels einer einfachen Methode innerhalb kurzer Zeit bei hoher Empfindlichkeit als auch mit preiswerten Mitteln, ein Kit und eine Platte dafür bereit. Gemäß der Methode der vorliegenden Erfindung sind Wirkstoffe, die spezifisch an Zellen von Patienten, zum Beispiel Tumorzellen, wirken, innerhalb von kurzer Zeit bekannt. Folglich können maßgeschneiderte Wirkstoffe für eine Behandlung, die für die Tumorzellen des einzelnen Patienten spezifisch ist, geschaffen und Heilmittel mit geringeren Nebenwirkungen und einer höheren Wirksamkeit für den Patienten angeboten werden.
Außerdem können gemäß der Methode der vorliegenden Erfindung Substanzen, die an DNA oder RNA wirken, in bequemer Weise bei hoher Empfindlichkeit und ohne großen Kostenaufwand gescreent werden. Darüber hinaus kann eine aktive Stelle in DNA und RNA für die Substanz, von der eine Wirkung auf DNA oder RNA bekannt ist, mittels der Methode der vorliegenden Erfindung ohne weiteres erkannt werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren der Wirkung einer chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält, unter Verwendung einer chemischen Spezies der allgemeinen Formel (I), welche eine Basensequenz der DNA erkennen kann: B-L-A (I)worin: B eine chemische Struktur ist, die nicht-natürliche Basen enthält, welche von substituiertem oder unsubstituiertem Pyrrol und/oder substituiertem oder unsubstituiertem Imidazol abgeleitet ist und welche eine Basensequenz der DNA erkennen kann; A eine chemische Struktur ist, die eine Wechselwirkung mit DNA zeigt; und L ein Linker ist, welcher chemische Strukturen von A und B miteinander verbinden kann, welches Verfahren das Bereitstellen der Verbindung der Formel (I) in jeder Vertiefung einer Platte, bestehend aus einer Vielzahl von Vertiefungen, das Einführen einer Substanz, die DNA oder RNA enthält, in jede Vertiefung der Platte, das vollständige Umsetzen der Verbindung der Formel (I) mit der Substanz, die DNA oder RNA enthält, und das Untersuchen des Zustands der Substanz, die DNA oder RNA enthält, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel (I), die in jeder Vertiefung vorhanden ist, die Basensequenz der DNA oder RNA, die in jede Vertiefung eingebracht wird, erkennen kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA oder RNA, die durch die Verbindung der Formel (I), die in jeder Vertiefung vorhanden ist, erkannt werden kann, von der DNA oder RNA, die in jede Vertiefung eingebracht wird, verschieden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung der Formel (I) in der Vertiefung immobilisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei B mindestens zwei aufeinanderfolgende Basen in natürlicher DNA oder RNA in der Substanz, die DNA oder RNA enthält, erkennen kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei, in B, die von dem Pyrrol und/oder Imidazol abgeleitete chemische Struktur in einer Hauptkette lokalisiert ist oder an einer Hauptkette hängend ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die chemische Spezies A die Struktur eines Antitumormittels aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Antitumormittel ein Alkylierungsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Alkylierungsmittel einen Cyclopropan-Ring umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Linker eine Vinylgruppe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Verbindung der Formel (I) ist:
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Substanz, die DNA oder RNA enthält, eine Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei eine Maßnahme zur Untersuchung des Zustands der Substanz, die DNA oder RNA enthält, eine Methode zum Detektieren des Überlebens oder Todes der Substanz ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Methode zum Detektieren des Überlebens oder Todes der Substanz im Färben der Substanz besteht.
Kit zum Nachweisen oder Identifizieren der Wirkung einer chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält, um ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 durchzuführen.
Kit nach Anspruch 16, umfassend eine chemische Spezies, welche eine Basensequenz von DNA erkennen kann, der allgemeinen Formel (I): B-L-A (I)worin: B eine chemische Struktur ist, die nicht-natürliche Basen enthält, welche von substituiertem oder unsubstituiertem Pyrrol und/oder substituiertem oder unsubstituiertem Imidazol abgeleitet ist und welche eine Basensequenz der DNA erkennen kann; A eine chemische Struktur ist, die eine Wechselwirkung mit DNA zeigt; und L ein Linker ist, welcher chemische Strukturen von A und B miteinander verbinden kann; und Vorrichtungen oder Reagenzien zur Untersuchung eines Zustandes der Substanz, die DNA oder RNA enthält, nach der Behandlung.
Verwendung einer chemischen Spezies der allgemeinen Formel (I): B-L-A (I)worin: B eine chemische Struktur ist, die nicht-natürliche Basen enthält, welche von substituiertem oder unsubstituiertem Pyrrol und/oder substituiertem oder unsubstituiertem Imidazol abgeleitet ist und welche eine Basensequenz der DNA erkennen kann; A eine chemische Struktur ist, die eine Wechselwirkung mit DNA zeigt; und L ein Linker ist, welcher chemische Strukturen von A und B miteinander verbinden kann, zum Nachweisen oder Identifizieren der Wirkung einer chemischen Spezies A auf eine Substanz, die DNA oder RNA enthält.