CN109504747A - 基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒 - Google Patents
基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开基于Taqman‑MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，其包括有以下针对三个位点中的至少一个的引物和探针：针对UGT1A1*6的如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物和如SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.4所示的探针；针对UGT1A1*28位点的如SEQ ID NO.5‑SEQ ID NO.6所示的引物和如SEQ ID NO.7‑SEQ ID NO.8所示的探针；针对UGT1A1‑3156G>A位点的如SEQ ID NO.9‑SEQ ID NO.10所示的引物和如SEQ ID NO.11‑SEQ ID NO.12所示的探针；所述探针的5’端标记有荧光基团，5’端标记有淬灭基团。本发明能同时检测*28、211G>A和‑3156G>A三个SNP位点，结果易于判读。本发明所设计的探针在错配碱基识别与信噪比方面具有很好的效果，大大提高了检测结果的灵敏度、特异性和重复性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒和方法。
背景技术
伊立替康(Irinotecan)是一种半合成喜树碱衍生物，对大多数的癌症都具有有效的抗癌活性，是最普遍的化疗处方药物之一。伊立替康作为前体药物，在体内经过羧酸酯酶转化为活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，SN-38通过抑制人体细胞DNA复制所必须的拓扑异构酶Ⅰ，诱导DNA单链损伤，阻断DNA复制而产生细胞毒性。临床研究表明，伊立替康最主要的副作用为减少中性粒细胞和引起迟发型腹泻，后者为剂量限制性毒副作用，严重时可致命。40％以上接受伊立替康治疗的患者可出现3～4级迟发型腹泻，约10％患者可出现严重的中性粒细胞减少，从而导致化疗方案中止。
具有药物活性的SN-38的主要清除途径，是通过肝脏UGT1A1的糖基化作用转变为无活性的SN-38G，后者通过尿液、胆汁排出体内。研究表明，在许多实体肿瘤中UGT1A1的表达水平是高度可变的，由此引起不同患者间伊立替康活性代谢产物SN-38葡萄糖醛酸化反应的速率相差最高达50倍，UGT1A1基因功能缺陷可导致活性代谢产物SN-38的显著增加，从而发生腹泻/中性粒细胞减少的几率显著增加。
UGT1A1基因常见有*6(211G>A)、*28(6TA/7TA)和*93(-3156G>A)三种多态性位点。国内大量的实验研究表明，UGT1A1*6突变型(G/A和A/A)与野生型G/G相比，可以增加患者发生3级以上中性粒细胞减少和腹泻的风险，与多项在日本的临床研究结果一致。各种研究及临床试验表明，UGT1A1*28的突变型(TA6/7和TA7/7)与野生型TA6/6相比，可以增加患者发生3级以上血小板减少的风险，但不会增加患者发生3级以上白细胞减少和中性粒细胞减少的风险。在大肠癌病患者的研究中发现，具有UGT1A1-3156G>A基因型的患者，有50％在接受伊立替康后出现毒副作用，而带有正常的基因型的病患，只有12.5％产生毒副作用。同时也发现这两种基因型的患者在出现毒副作用的时间上并不相同，UGT1A1-3156G>A的患者比正常基因型患者更早出现副作用。
综合临床、科研以及文献，UGT1A1*93(-3156G/A)，UGT1A1*28(6TA/7TA)和UGT1A1*6(211T/G)这三个位点都有个体化用药指导意义。为此，本发明针对UGT1A1基因的这三个基因位点多态性所设计的试剂盒，从而更好地指导临床医生优化化疗方案，以达到个体化医疗的目的。
UGT1A1基因多态性位点目前常见的检测方法主要有测序法、荧光PCR法、HRM(高分辨融解曲线)法和毛细管电泳法。但作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，它的临床推广存在一定的困难。毛细管电泳法则会有灵敏度较低等缺点。
另外，国内外已有多个相关的检测试剂盒，如Third Wave推出的InvaderUGT1A1MolecμLar Assay，主要用来检测UGT1A1*28等位基因；源奇生物推出的UGT1A1基因型检测试剂盒采用PCR毛细管电泳法对人类基因组DNA UGT1A1*28基因型进行定性检测。苏州为真生物推出的UGT1A1基因多态性检测试剂盒采用qPCR-HRM法用于检测人类组织细胞中UGT1A1基因的基因型情况，可检测UGT1A1基因中的*6和*28两个位点的基因型。但大都是只检测单个或2个位点的试剂盒。
荧光PCR用于检测基因多态性，已经得到广泛的研究和应用，但是对于能真正实现UGT1A1基因多个位点的同时检测，并非简单就能实现，特别是位点UGT1A1*28具有明显多态性，其正常野生型为6个TA重复序列(TA6)，而*28型则含7个TA重复序列(TA7)，根据TA重复序列的多少，可以分为*1/*1、*1/*28和*28/*28。UGT1A1*28纯合突变型在非洲人和高加索人中频率较高达到12～27％和5～15％，在亚洲人中，仅为1.2～5％，因而单就该单一位点检测因其重复序列如此之多，设计引物就十分困难，同时三个位点检测更是难上加难。
除此之外，涉及到基于Taqman-MGB探针，对于MGB探针，SNP位点两侧可能只有7～8bp，一个碱基的不匹配足以让探针退火失败，而且MGB探针设计不好的话，分辨率会和普通的Taqman探针差不多，但是MGB探针又远贵于普通Taqman探针，因此，要实现基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性PCR检测，需要创造性的的摸索和设计。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，用于同时检测人UGT1A1基因UGT1A1*28、UGT1A1*6和UGT1A1-3156G>A三个位点的多态性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，包括有以下针对三个位点中的至少一个的引物和探针：针对UGT1A1*6的如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的引物和如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的探针；针对UGT1A1*6位点的如SEQ ID NO.5-SEQ IDNO.6所示的引物和如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的探针；针对UGT1A1-3156G>A位点的如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示的引物和如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示的探针；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有缓冲液、镁离子、dNTP、Taq酶。
在其中一个实施例中，所述探针5’端的荧光基团为FAM、VIC、或HEX中的一种，3’端的淬灭基团为NFQ。
本发明的另一个目的是提供一种基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测方法。
实现上述目的技术方案如下。
基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测模板的DNA；
(2)配制反应液，在缓冲液中加入镁离子、dNTP、上述引物和探针、Taq酶，
(3)将骤(1)得到的待测模板DNA分别加入到所述PCR反应液中，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器进行PCR反应，
(3)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
在其中一个实施例中，采用的荧光定量PCR反应条件为；95℃15分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃35秒，45-50个循环。
荧光定量PCR程序结束后，得到对应的扩增曲线图，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成扩增曲线，有则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。
本发明的主要优点包括以下：
一、本发明能一次性同时检测*28、211G>A和-3156G>A三个SNP位点，且整个反应体系中基本上不存在交叉反应，特异性好，该方法操作简便，一步加样闭管检测，避免了PCR污染；周期短，一次反应耗时1小时左右；结果判读简单明了，且仪器普及程度较高，便于在临床检测的开展。
二、本发明所设计的引物和探针在错配碱基识别与信噪比方面具有很好的效果，大大提高了检测结果的灵敏度、特异性和重复性。本发明所设计的TagMan-MGB荧光探针具有片段较短的特性，更易快速找到目的片段基因，进一步增强所述检测方法的特异性。
三、本发明技术方案中的检测引物与特异性的Taqman MGB探针相配合，可在有效降低非特异性扩增的同时，使得检测基因突变的灵敏度和准确性得到大幅度提高，且只需根据扩增曲线图就可判读不同基因型，实验结果的判读和分析更加直观。
附图说明
附图1是B86258样本UGT1A1基因*28型位点试剂盒荧光定量PCR检测图；
附图2是B80858样本UGT1A1基因*28型位点试剂盒荧光定量PCR检测图；
附图3是B87879样本UGT1A1基因211G>A型位点试剂盒荧光定量PCR检测图；
附图4是B91750样本UGT1A1基因211G>A型位点试剂盒荧光定量PCR检测图；
附图5是B93892样本UGT1A1基因-3156G>A型位点试剂盒荧光定量PCR检测图；
附图6是B85132样本UGT1A1基因-3156G>A型位点试剂盒荧光定量PCR检测图。
图7为实施例3中UGT1A1*28引物筛选结果；
图8为实施例3中UGT1A1 211G>A引物筛选结果；
图9为实施例3中UGT1A1-3156G>A引物筛选结果；
图10为实施例3中：SEQ ID NO.4探针与SEQ ID NO.27探针检测结果的比较；
图11为实施例3中：SEQ ID NO.3探针与SEQ ID NO.26探针检测结果的比较；
图12为实施例3中：SEQ ID NO.8探针与SEQ ID NO.31探针测结果的比较；
图13为实施例3中：SEQ ID NO.7探针与SEQ ID NO.28探针测结果的比较；
图14为实施例3中：SEQ ID NO.12探针与SEQ ID NO.36探针测结果的比较；
图15为实施例3中：SEQ ID NO.11探针与SEQ ID NO.34探针测结果的比较。
具体实施方式
下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
实施例1
本实施例所述的基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，试剂盒中包括UGT1A1*28、UGT1A1*6和UGT1A1-3156G>A三个位点的多态性特异性PCR反应液，其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP、Taq酶等物质外，还对应的包含下述特异性检测引物与探针：
表2 UGT1A1基因延伸引物序列与探针
所述探针5’端的荧光基团为FAM、VIC、或HEX中的一种，本实施例中的荧光基团为FAM和HEX，3’端的淬灭基团为NFQ。
实施例2
本发明实施例提供了一种如实施例1所述的基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，分别对组织DNA样本进行分型检测，包括以下步骤：
(1)DNA模板的提取
推荐使用商业化的试剂盒提取待测人的组织DNA；
(2)PCR反应体系配置
取19μL UGT1A1*28PCR反应液到一个PCR反应管中、取19μL UGT1A1 211G>A PCR反应液到另外一个PCR反应管中、取19μL UGT1A1-3156G>A PCR反应液到另外一个PCR反应管中，分别向3个PCR反应管中加入同一个步骤(1)中提取的DNA 1μL；
(3)荧光PCR检测
将配置好的PCR体系在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行荧光定量PCR检测，采用的荧光定量PCR反应条件为；95℃15分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃35秒，45-50个循环；
(4)基因分型判读
通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。荧光定量PCR程序结束后，得到对应位点的扩增曲线图，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成扩增曲线，则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。
实验结果：
UGT1A1 211G>A分型判读：
| 样本编号 | UGT1A1 211G>A实验结果 | UGT1A1 211G>A二代测试结果 |
| B87879 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B91646 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B85132 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B91750 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B91748 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B85135 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B91642 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B91641 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B85238 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B93803 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
UGT1A1-3156G>A分型判读：
| 样本编号 | UGT1A1-3156G>A实验结果 | UGT1A1-3156G>A二代测试结果 |
| B90706 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B87879 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B85136 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B93892 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B91646 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B85132 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B91750 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B91748 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B85135 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B80813 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
UGT1A1*28分型判读：
| 样本编号 | UGT1A1*28基因分型结果 | UGT1A1*28Sanger测试结果 |
| B96409 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B80858 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B86258 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B96410 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B85164 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B81040 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B68726 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B84746 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B79214 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
| B86256 | 杂合型突变子 | 杂合型突变子 |
| B96414 | 野生纯合子 | 野生纯合子 |
上述所有检测样本的qPCR分型检测结果均经过DNA测序验证，测序结果与本发明方法检测结果一致；证明本发明方法检测的结果准确可靠。
附图举例：
附图1是B86258样本UGT1A1基因*28型位点试剂盒荧光定量PCR检测图，检测图显示其只有野生型探针荧光信号形成扩增曲线，则判断该样本为UGT1A1*28野生型纯合子。
附图2是B80858样本UGT1A1基因*28型位点试剂盒荧光定量PCR检测图，检测图显示其野生型探针和突变型探针荧光信号均形成扩增曲线，则判断该样本为UGT1A1*28杂合型突变子。
附图3是B87879样本UGT1A1基因211G>A型位点试剂盒荧光定量PCR检测图，检测图显示其只有野生型探针荧光信号形成扩增曲线，则判断该样本为UGT1A1 211G>A野生型纯合子。
附图4是B91750样本UGT1A1基因211G>A型位点试剂盒荧光定量PCR检测图，检测图显示其野生型探针和突变型探针荧光信号均形成扩增曲线，则判断该样本为UGT1A1 211G>A杂合型突变子。
附图5是B93892样本UGT1A1基因-3156>A型位点试剂盒荧光定量PCR检测图，检测图显示其只有野生型探针荧光信号均形成扩增曲线，则判断该样本为UGT1A1-3156G>A野生型纯合子。
附图6是B85132样本UGT1A1基因-3156>A型位点试剂盒荧光定量PCR检测图，检测图显示其野生型探针和突变型探针荧光信号均形成扩增曲线，则判断该样本为UGT1A1-3156G>A杂合型突变子。
实施例3 UGT1A1基因突变检测特异性引物序列的选择的对比
以UGT1A1基因突变的3个常见基因突变位点为例，分别设计特异性的引物序列，以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对UGT1A1基因*28位点、UGT1A1基因211G>A和UGT1A1基因-3156>A型位点的野生型和突变型设计特异性探针序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物和探针序列以及2条(或大于2条)备选的特异性引物和探针序列，如表3、4所示。
表3引物序列
表4特异性探针序列
本发明在研发阶段先筛选到一系列引物及探针，然后经PCR条件及体系优化最终筛选到一组特异性最强，扩增效率最优的引物和探针。
根据实施例2所述的检测方法进行检测。
引物组合：*28-1为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；*28-2为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.15；*28-3为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15；*28-4为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.16；*28-5为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.19；*28-6为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19
211-1为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；211-2为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.21；211-3为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.22；211-4为SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21；211-5为SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.22；211-6为SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.6
3156-1为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；3156-2为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.24；3156-3为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；3156-4为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.10；3156-5为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.10；3156-6为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.24
检测结果例举如下：
图7为UGT1A1*28引物筛选结果，*28-1组合扩增效率最好；
图8为UGT1A1 211G>A引物筛选结果，211-1组合扩增效率最好；
图9为UGT1A1-3156G>A引物筛选结果，3156-1组合扩增效率最好。
相同条件下不同探针的比较(如图10～15所示)
图10：SEQ ID NO.4探针，野生型有扩增曲线，突变型没有，分型明确；SEQ IDNO.27探针，野生型和突变型均有扩增，分型不明确；说明*28野生型探针SEQ ID NO.4特异性优于SEQ ID NO.27。
图11：SEQ ID NO.3探针，突变型有扩增曲线，野生型没有，分型明确；SEQ IDNO.26探针，野生型和突变型均有扩增，分型不明确；说明*28突变型探针SEQ ID NO.3特异性优于SEQ ID NO.26。
图12：SEQ ID NO.8探针，野生型有扩增曲线，突变型没有，分型明确；SEQ IDNO.31探针，野生型和突变型均有扩增，分型不明确；说明211G>A野生型探针SEQ ID NO.8特异性优于SEQ ID NO.31。
图13：SEQ ID NO.7探针，突变型有扩增曲线，野生型没有，分型明确；SEQ IDNO.28探针，野生型和突变型均有扩增，分型不明确；说明211G>A突变型探针SEQ ID NO.7特异性优于SEQ ID NO.28。
图14：SEQ ID NO.12探针，野生型有扩增曲线，突变型没有，分型明确；SEQ IDNO.36探针，野生型和突变型均有扩增，分型不明确；说明3156G>A野生型探针SEQ ID NO.12特异性优于SEQ ID NO.36。
图15：SEQ ID NO.11探针，突变型有扩增曲线，野生型没有，分型明确；SEQ IDNO.34探针，野生型和突变型均有扩增，分型不明确；说明3156G>A突变型探针SEQ ID NO.11特异性优于SEQ ID NO.34。
可见，本发明所述的针对UGT1A1*6的如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的引物和如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的探针；针对UGT1A1*28位点的如SEQ ID NO.5-SEQ IDNO.6所示的引物和如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的探针；针对UGT1A1-3156G>A位点的如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示的引物和如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示的探针，具有扩增效率最优，检测特异性最强的优势。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacattaact tggtgtatcg attggt 26
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcaggccca ggacaagt 18
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgccatatat atatatatat aagtagga 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgccatata tatatatata agtagga 27
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tagcacctga cgcctcgtt 19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcccgagac taacaaaaga ctct 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacatcagag acagagcatt 20
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcagagacg gagcatt 17
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccagaatgg ctagagggta aga 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctgggcaca gaaaattcag a 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatgagctta gacaggtg 18
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgagcttgg acaggt 16
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctgaaagtg aactccctgc t 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacttggtgt atcgattggt ttttg 25
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagaggttcg ccctctccta c 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggatcaacag tatcttccca gca 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctctgaaag tgaactccct gcta 24
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccctgctacc tttgtggact ga 22
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctttgctcct gccagaggtt c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acctgacgcc tcgttgtaca t 21
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcccgagact aacaaaagac tctt 24
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgcccgaga ctaacaaaag actct 25
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agagggtaag aggcagaggg a 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggaaccttg gtcagcagct 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caagcagaag ggctagagag ga 22
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcctacttat atatatatat atatggca 28
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcctacttat atatatatat atggcaa 27
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agagacagag catttta 17
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agagacggag catttta 17
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atcagagacg gagcatttta 20
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acatcagaga cggagcatt 19
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
catcagagac ggagcat 17
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aggaatgagc ttggacagg 19
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aggaggaatg agcttaga 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aggaggaatg agcttgga 18
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
atgagcttgg acaggtg 17
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgagcttgga caggt 15
Claims (8)
1.基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包括有以下针对三个位点中的至少一个的引物和探针：针对UGT1A1*6的如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的引物和如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的探针；针对UGT1A1*28位点的如SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.6所示的引物和如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的探针；针对UGT1A1-3156G>A位点的如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示的引物和如SEQ ID NO.11-SEQ IDNO.12所示的探针；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包括有针对UGT1A1*6、UGT1A1*28和UGT1A1-3156G>A三个位点的引物和探针。
3.根据权利要求1所述的基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有缓冲液、镁离子、dNTP、Taq酶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述探针5’端的荧光基团为FAM、VIC、或HEX中的一种，3’端的淬灭基团为NFQ。
5.基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测模板的DNA；
(2)配制反应液，在缓冲液中加入镁离子、dNTP、权利要求1所述的引物和探针、Taq酶；
(3)将骤(1)得到的待测模板DNA分别加入到所述PCR反应液中，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器进行PCR反应；
(4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
6.根据权利要求5所述的基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测方法，其特征在于，采用的荧光定量PCR反应条件为；95℃15分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃35秒，45-50个循环。
7.基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测引物和探针，其特征在于，
包括有以下针对三个位点中的至少一个的引物和探针：针对UGT1A1*6的如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示的引物和如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的探针；针对UGT1A1*28位点的如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的引物和如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的探针；针对UGT1A1-3156G>A位点的如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示的引物和如SEQ IDNO.11-SEQ ID NO.12所示的探针。
8.根据权利要求7所述的基于Taqman-MGB探针的人UGT1A1基因多态性检测引物和探针，其特征在于，包括有针对UGT1A1*6、UGT1A1*28和UGT1A1-3156G>A三个位点的引物和探针。
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