JP2010233496A - Ugt1a1遺伝子多型検出法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、イリノテカンの副作用の重篤性に関わるUGT1A1遺伝子の複数の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、よりハイスループットで検出することを課題とする。具体的には、UGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に(simultaneous)検出することを課題とする。
【解決手段】上記課題を解決するために、本件発明はTaqMan PCR法に用いるプライマーの設計方法、並びに、TaqManPCR法に用いるプライマー及びプローブの配列を提供する。
【選択図】図4
Description
同時に:本明細書において「同時に」検出する、「同時に」使用する、などという場合は、時間的に「同じ時刻」という意味ではなく、例えば、同一PCRチューブ内の同一PCR反応液からの複数波長の蛍光を検出する、あるいは、同一PCRチューブ内の同一PCR反応液に複数のプライマーを使用する、などの意味で用いる。
ホモ:遺伝学の通常の用語の意味で用いるが、特に、2つの相同染色体の両方に特定の多型が存在することを意味する。
ヘテロ:遺伝学の通常の用語の意味で用いるが、特に、2つの相同染色体の一方のみに特定の多型が存在することを意味する。
野生型:多型は全て野生型と呼ぶことも出来るが、本明細書においては、特定の集団の中で最も頻繁に観察される多型を野生型と呼ぶ。
変異型:多型は全て野生型と呼ぶことも出来るが、本明細書においては、特定の集団の中で最も頻繁に観察される多型以外の多型を変異型と呼ぶ。
多型:名詞的に使用する場合は、ゲノム塩基配列における集団内の個体差(バリエーション)又はその配列を意味する。形容詞的に使用する場合は、ゲノム塩基配列の特定箇所に集団内の個体差(バリエーション)が存在することを意味する。
多型を検出する:本明細書で「多型を検出する」という場合には、「特定の個体由来のサンプル中に注目する多型の変異型が存在することを検出すること」を意味する場合の他に、「当該注目する多型の遺伝型を決定すること」を意味する場合もある。
遺伝型:ある個体が特定の「遺伝型」を有するとは、注目される多型部位(単数又は複数)についてその個体が特定の多型の組み合わせ(複数の多型部位又は2つの相同染色体)を有することを意味する。
UGT1A1*6多型:UGT1A1遺伝子のアミノ酸置換を伴う多型(一般的に、211G>Aと表される。)を意味する。多型の位置に関しては、Saiet al. Yakugaku Zasshi. 2008 Apr;128(4):575-84. Reviewを参照。
UGT1A1*28多型部位:UGT1A1*28多型が存在する塩基又は塩基対の場所を意味する。省略してUGT1A1*28部位と言うこともある。
UGT1A1*6多型部位:UGT1A1*6多型が存在する塩基又は塩基対の場所を意味する。省略してUGT1A1*6部位と言うこともある。
UGT1A1*28多型領域:UGT1A1*28部位を含むゲノム配列上の領域を意味する。
UGT1A1*6多型領域:UGT1A1*6部位を含むゲノム配列上の領域を意味する。
UGT1A1*28 野生型:ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*28 野生型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回であることを意味する。
UGT1A1*6 野生型:ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*6 野生型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子にアミノ酸置換を伴う多型(一般的に、211G>Aと表される。)が存在しない(当該塩基がGである。)ことを意味する。
UGT1A1*28 変異型:ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*28 変異型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回ではなく7回であることを意味する。
UGT1A1*6 変異型:ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*6 変異型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子にアミノ酸置換を伴う多型(一般的に、211G>Aと表される。)が存在する(当該塩基がAである。)ことを意味する。
UGT1A1*28:UGT1A1*28多型又はUGT1A1*28多型部位を意味する。
UGT1A1*6:UGT1A1*6多型又はUGT1A1*6多型部位を意味する。
TaqMan PCR法の原理:本件発明において「TaqMan PCR法の原理」という場合には、PCRで増幅する領域に、5’末端側を標識した相補的なDNAプローブをデザインし、このDNAプローブ存在下でPCRを行い、Taqポリメラーゼの持つ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により、PCRの進行と共にプローブが分解され、この分解されたプローブから得られる標識シグナルがアンプリコンの量に比例することを基礎としてテンプレートDNAの定量をする原理をいう。
<ヒトゲノムDNA>
ヒトゲノムDNAの抽出はQIAamp DNA Mini kit(Cat. No.51304, QIAGEN)により行った。ヒトゲノムDNA抽出用の血液は積水メディカル株式会社社内ボランティアから取得した。血液採取に当たっては社内倫理規定を遵守した。提供されたプロトコルに従い、200μlの血液から約3μgのゲノムDNAを得た。
PCR反応に使用したプライマーの作製には、SIGMA社のカスタムオリゴDNA合成サービスを利用した。精製グレードはカートリッジ精製(逆相カートリッジ(RP1))を選択した。
プライマー設計ソフトウェアには、Primer Express 3.0 (Applied Biosystems)を用いた。提供されたマニュアルに従い、設計パラメーターにはprimerprobe toolのDocument Type TaqMan Allelic Discriminationを用いた。選定基準として、Tm値:58〜60℃、塩基数:20mer、GC含量:30〜80%を目安に設計した。条件を満たす11個のプライマーを合成して実際の増幅効率及び特異性を試験し、それらの中から優れたものを選んだ。
TaqManプローブの作成には、オペロン バイオテクノロジー 株式会社の受託合成サービスを利用し、全て蛍光色素と消光剤で二重標識されたものを購入した。精製グレードはHPLC精製を選択した。
プローブ設計ソフトウェアには、Primer Express 3.0 (Applied Biosystems)を用いた。提供されたマニュアルに従い、設計パラメーターには、primerprobe toolのDocument Type TaqMan Allelic Discriminationを用いた。選定基準として、Tm値:65〜68℃、塩基数:30〜40mer、GC含量:30〜80%を目安に設計した。
リアルタイムPCR反応(TaqMan PCR)は表3に示した条件で行った。テンプレートDNAには、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)、あるいはゲノムDNAを使用した。プラスミドコントロールは、105〜107コピー数になるよう調整し、全量が50μLになるように水の量を調節した。ゲノムDNAは10〜20ngになるように量を調製し、全量が50μLになるように水の量を調節した。ExTaqとしてはPremix Ex Taq(TaKaRa)を使用し、PCR反応チューブにはMultiplate PCR Plates Low96-wellclear(BIO RAD)を用いた。サーマルサイクラーにはPTC-200(Bio-Rad Laboratories, Inc.)を用いた。PCR反応は表4に示すとおり、98℃で15秒、65℃で1分の2ステップ反応で行った。
リアルタイムPCRの蛍光検出にはChromo4 Real-Time PCR Detector(BIO RAD)を用いた。実際には、上記リアルタイムPCR反応と同時に蛍光検出を行った。提供されたマニュアルに従い、OpticonMonitorVersion3.1プログラムを用いてデータを解析した。蛍光励起及び蛍光検出の条件は以下の通りである;波長(蛍光励起範囲:1チャンネル450〜490nm 2チャンネル500〜535nm 3チャンネル555〜585nm 4チャンネル620〜650nm、 蛍光検出範囲:1チャンネル515〜530nm 2チャンネル560〜580nm 3チャンネル610〜650nm 4チャンネル675〜730nm)。
[参考例1]
[TaqManPCR法を用いたUGT1A1*28及びUGT1A1*6多型の同時検出-1]
テンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー(28F4、28R4、6F2及び6R2)、並びに、4種の検出プローブ(UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型)を用いて、TaqMan PCR法によりUGT1A1*28多型及びUGT1A1*6多型を同時に検出した結果を図2-1Aに示す。28F4-28R4プライマーペアはUGT1A1*28多型領域の149bpのアンプリコンを増幅し、6F2-6R2プライマーペアはUGT1A1*6多型領域の133bpのアンプリコンを増幅する。
上記参考例1の結果が満足の行くものではなかったため、本発明者らはUGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に(simultaneous)検出することが出来る方法の開発を目指して、鋭意検討を重ねた。
テンプレートDNAとしてUGT1A1*28及びUGT1A1*6部位の配列が既知のヒトゲノムDNAを20ng又は10ngを用い、かつ、28F4-6R2プライマーペア、並びに、既出の4種の検出プローブを同時に用いて多型検出を行った結果を図4に示す。また、各検体についてUGT1A1*28及びUGT1A1*6部位の配列が野生型又は変異型の何れであったかを纏めたのが表5である。
Promoter プロモーター領域
Exon エクソン領域
28R4 UGT-28TprimerR4
6F2 UGT-6TprimerF2
6R2 UGT-6TprimerR2
6F7 UGT-6TprimerF7
6R7 UGT-6TprimerR7
Endpoint,HEX HEXの最大蛍光値
Endpoint,FAM FAMの最大蛍光値
Endpoint,Cy5 Cy5の最大蛍光値
Endpoint,TXR TXRの最大蛍光値
Homo ホモ
Hetero ヘテロ
WT 野生型
+/- 注目される多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
-/- 注目される多型部位において、2つの相同染色体ともに野生型であること
*28/*28 UGT1A1*28多型部位において、2つの相同染色体ともに変異型であること
*28/*6 UGT1A1*28多型部位において一方の相同染色体が変異型でありかつ他方の相同染色体が野生型であり、更に、UGT1A1*6多型部位において一方の相同染色体が変異型でありかつ他方の相同染色体が野生型であること;なお、UGT1A1*28多型とUGT1A1*6多型は別の染色体にある(別のハプロタイプである)ことに注意されたい。
*6/*6 UGT1A1*6多型部位において、2つの相同染色体ともに変異型であること
*28/- UGT1A1*28多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
*6/- UGT1A1*6多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
Claims (5)
- 以下の全ての条件を満たす、UGT1A1*28及びUGT1A1*6の2種類の多型を同時に検出するための方法。
(a) TaqMan PCR法の原理を用いる
(b) TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアを含む
(c) 上記TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28多型領域又はUGT1A1*6多型領域の一方のみをアンプリコンとして増幅するプライマーペアを含まない
(d) 上記TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28 野生型を検出するためのプローブ、UGT1A1*28 変異型を検出するためのプローブ、UGT1A1*6野生型を検出するためのプローブ、及び、UGT1A1*6変異型を検出するためのプローブの4種のプローブを含む - UGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアが、配列番号2及び配列番号5の配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 上記4種のプローブが、それぞれ、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び、配列番号11の配列を有し、かつ、UGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアが、配列番号2及び配列番号5の配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 上記4種のプローブが、それぞれ、配列番号8、配列番号9、配列番号10、又は、配列番号11の配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 以下の全てを含む、UGT1A1*28及びUGT1A1*6の2種類の多型を同時に検出するためのキット。
(a) 配列番号2及び配列番号5の配列を有する2種の多型領域増幅用オリゴヌクレオチド
(b) 配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び、配列番号11の配列を有する4種の多型検出用オリゴヌクレオチド
ここで、当該4種の多型検出用オリゴヌクレオチドは、いずれも、5’末端又は3’末端が蛍光色素で修飾され、他端が消光剤で修飾されている
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