CN116640192A - 链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白及其应用，所述Y43A突变蛋白为链霉亲和素突变体StrepTactin的43位酪氨酸突变为丙氨酸，所述Y43A突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，突变后的蛋白与Biotin的结合减弱，使得Biotin与其作用变得可逆，用Y43A突变蛋白富集生物素标记蛋白，Y43A突变蛋白显示出较高的洗脱率，树脂残留低，能够用于生物素标记蛋白的纯化和富集。
Description
技术领域
本发明涉及生物素纯化蛋白领域，具体涉及链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白，还涉及Y43A突变蛋白的应用。
背景技术
链霉亲和素(Streptavidin)对生物素(Biotin)具有超强的非共价结合力，野生型链霉亲和素结合生物素的解离平衡常数Kd在10-14mol/L，是目前自然界中已知的最强非共价相互作用，因此在分子生物学领域具有广泛运用，可以应用于生物素标记蛋白的富集，介质固定化和功能化以及形成聚合物或桥接分子等。
生物素-链霉亲和素系统是利用链霉亲和素与生物素的牢固结合而建立的一种生物反应放大系统。链霉亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，不易发生对生物素信号的富集损失，如此可将混合多样的生物素标记的大分子进行充分富集，在实现对信号高灵敏度的同时，减少非特异性干扰。
链霉亲和素系统也有一定的缺陷。亲和素、野生型链霉亲和素树脂等，由于与生物素的亲和力太强，虽然富集效果非常好，但存在洗脱困难的问题。一种情况下通常利用SDS等剧烈变性加上95℃高温煮树脂使蛋白脱落，这样处理一方面存在引入了一些非特异性结合的蛋白、树脂介质的问题，另一方面SDS的使用为后续的质谱鉴定带来了一定的困难。第二种方法是富集之后采用胰蛋白酶柱上酶切的方式形成肽段进行鉴定，这样处理除了引入非特异性蛋白之外还存在生物素标记肽段丢失的问题。现有的对于生物素标记肽段的富集介质有MonoAvidin、NeutrAvidin和生物素抗体树脂等，在一定条件下可实现对生物素标记肽段的可逆结合，但存在挂柱回收率低的问题，并且对于生物素标记蛋白的富集能力较差。如果能够将蛋白从树脂上特异性的洗脱下来，可能极大地降低非特异性背景并能够保留蛋白质完整的肽段信号。公开号为
因此，因此亟需一种对生物素标记蛋白富集效率高且可逆洗脱效果优良的链霉亲和素突变体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白；本发明的目的之二在于提供含有所述Y43A突变蛋白的微球固定复合物；本发明的目的之三在于提供所述Y43A突变蛋白或所述微球固定复合物在纯化生物素标记蛋白中的应用；本发明的目的之四在于提供利用所述Y43A突变蛋白纯化生物素标记蛋白的方法；本发明的目的之五在于提供所述Y43A突变蛋白或所述微球固定复合物在富集TurboID标记的生物素标记蛋白中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白，所述Y43A突变蛋白为链霉亲和素突变体StrepTactin的43位酪氨酸突变为丙氨酸，所述Y43A突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明优选的，编码所述Y43A突变蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2、含有所述Y43A突变蛋白的微球固定复合物。
本发明优选的，所述微球为NHS微球。
3、所述Y43A突变蛋白或所述微球固定复合物在纯化生物素标记蛋白中的应用。
4、利用所述Y43A突变蛋白纯化生物素标记蛋白的方法，包括如下步骤：将含Y43A突变蛋白交联NHS微球形成微球固定复合物，然后用HCl溶液活化，再用平衡缓冲液平衡，加入含生物素修饰蛋白的裂解液结合，再用Elution缓冲液洗脱，收集洗脱液。
本发明优选的，所述HCl溶液的浓度为1mM；所述平衡缓冲液为浓度200mM的NaHCO3、500mM的NaCl。
5、所述Y43A突变蛋白或所述微球固定复合物在富集TurboID标记的生物素标记蛋白中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白，将StrepTactin第43位的酪氨酸(Tyr)突变成丙氨酸，突变后的蛋白与Biotin的结合减弱，使得Biotin与其作用变得可逆。用Y43A突变蛋白富集生物素标记蛋白，Y43A突变蛋白显示出较高的洗脱率，树脂残留低，能够用于生物素标记蛋白的纯化和富集。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为利用单生物素化的GFP(Bio-GFP)和多生物素化的BSA(Bio-BSA)对常用的富集纯化生物素的商业化Beads进行洗脱测试(A：Streptavidin和MonoAvidin对5μg Bio-GFP和5μg Bio-BSA蛋白的洗脱对比；In：60μL体系里5μg Bio-GFP和5μg Bio-BSA蛋白，E：60μL洗脱的蛋白质；B：Beads用60μL缓冲液重悬；B：Streptavidin、StrepTactin、SA(SBP mut)、SA(8loop mut)和Biotin Antibody对5μg Bio-GFP和5μg Bio-BSA蛋白的洗脱对比)。
图2为StrepTactin和Y43A突变体对Biotin、SDS、Urea的耐受实验(A：StrepTactin对不同浓度生物素、不同浓度SDS和不同浓度Urea的耐受；B：Y43A对不同浓度生物素、不同浓度SDS和不同浓度Urea的耐受)。
图3为WB实验测试StrepTactin和Y43A突变体对微量生物素标记蛋白的富集与洗脱能力(A：StrepTactin和Y43A突变体对0.5μg Bio-GFP、0.5μg Bio-BSA蛋白的洗脱和残留对比，Input：60μL体系里0.5μg Bio-GFP和Bio-BSA蛋白，E：60μL洗脱的蛋白质，B：Beads用60μL缓冲液重悬；B：StrepTactin和Y43A突变体对0.05μg Bio-GFP、0.05μg Bio-BSA蛋白的洗脱和残留对比，Input：60μL体系里0.5μg Bio-GFP和Bio-BSA蛋白，E：60μL洗脱的蛋白质；B：Beads用60μL缓冲液重悬)。
图4为Biotin Antibody、StrepTactin和Y43A突变体对TurboID-GFP的富集洗脱实验(A：Biotin Antibody、StrepTactin和Y43A突变体对TurboID-GFP的富集洗脱。40μLBeads结合200μL裂解液，并用200μL Elution缓冲液洗脱，其中Bio-Ab表示Biotin-Antibody；Anti-Biotin表示一抗是Biotin；B：Y43A对TurboID-GFP富集洗脱的重复实验。20μLBeads结合400μL裂解液，并用400μL Elution缓冲液洗脱，Elution缓冲液为50mM Biotin in 50mMTris；C：优化洗脱方案洗脱和Beads残留蛋白；D：Y43A树脂的洗脱效率)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、对生物素标记蛋白可逆洗脱的链霉亲和素介质的筛选
将常用的富集纯化生物素的Beads，利用单生物素化的GFP(Bio-GFP)和多生物素化的BSA(Bio-BSA)进行富集与洗脱测试。包括MonoAvidin(购于Thermo，货号53146)、野生型链霉亲和素(Streptavidin)(购于Thermo，货号53113)、链霉亲和素44-47突变体StrepTactin(购于生工，货号C600698-0001)、链霉亲和素突变体SAVSBPM18(以下简称链霉亲和素突变体(SBP mut))(购于Kerafast，货号EUC012)、链霉亲和素突变体(8loop mut)(8-aa-loop-H127C)(参见O'Sullivan V J,Barrette-Ng I,Hommema E,etal.Development of atetrameric streptavidin mutein with reversible biotinbinding capability:engineering a mobile loop as an exit door for biotin[J].PloS one,2012,7(4):e35203.)、生物素抗体树脂(购于世联博研，货号MBS330044)等。具体操作如下：
分别在500μL体系中加入10μL Beads，随后每管中就加入5μg Bio-GFP和5μg Bio-BSA蛋白，4℃过夜结合。使用Wash缓冲液充分振荡冲洗Beads，体积1mL每次，共三次。然后使用50mM Tris-HCl pH 8.0平衡之后，使用50mM Biotin Elution缓冲液进行洗脱，洗脱20μL/次共三次总体积60μL。Beads用60μL Elution buffer重悬。SDS-PAGE胶分析蛋白洗脱和Beads残留，结果如图1中A和B所示。
野生型链霉亲和素结合效率很高，Beads富集蛋白量几乎等同于Input的蛋白量，但其洗脱效率低。MonoAvidin的树脂残留蛋白比野生型链霉亲和素略少，其生物素特异性可逆洗脱的效率高于野生型链霉亲和素；SA(SBP mut)和SA(8loop mut)突变体Beads上几乎无残留蛋白，可见部分洗脱下来的Bio-GFP和Bio-BSA蛋白，说明SA(SBP mut)和SA(8loopmut)突变体能够实现对生物素标记蛋白的可逆洗脱，但是它们的富集效果差。而生物素抗体Beads上几乎无生物素标记蛋白的残留，却存在很多非特异结合的蛋白，其可逆洗脱的蛋白中也出现非特异蛋白，且整体富集效率较于StrepTactin还是偏低。综合对比各生物素结合Beads的富集与洗脱效率，StrepTactin对生物素标记蛋白的富集能力和洗脱效率综合最高。
通过对比多种生物素结合Beads的富集与洗脱效率，已经明确StrepTactin对生物素标记蛋白富集与可逆洗脱的优异性。进一步在StrepTactin的基础上设计突变，从而筛选得到对生物素标记蛋白能够有效富集与可逆洗脱的突变体。
实施例2、构建PIISA-3His-StrepTactin Y43A载体
根据公司合成的含StrepTactin质粒(PIISA-His-StrepTactin由公司合成而得，PIISA-His-StrepTactin序列如SEQ ID NO.1所示)设计特异扩增StrepTactin的单突变Y43A突变体质粒。
上游引物Y43A-F：5’-gtaccgccgtcacggcccgtggcaac-3’(SEQ ID NO.2)；
下游引物Y43A-R：5’-ccgtgacggcggtaccggtcagggcg-3’(SEQ ID NO.3)；
然后以PIISA-His-StrepTactin载体为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为引物进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共16个循环；72℃延伸5分钟，4℃保存。
将扩增的DNA产物转化到大肠杆菌克隆感受态细胞，经测序确认，获得PIISA-His-StrepTactin Y43A质粒，编码Y43A的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
实施例3、StrepTactin和Y43A蛋白的制备
1)分别取1μL质粒PIISA-His-StrepTactin和PIISA-His-StrepTactin Y43A加入至100μL的BL21 codon plus(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，再在冰上静置2min，加入900μL的LB培养基在37℃、200rpm的摇床内复苏30min，涂布于含100μg/mL的氨苄抗性的平板上，37℃恒温过夜培养；
2)第二天从过夜培养的平板上挑取一个单菌落至10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养12h，将培养后的10mL菌液转接至1L含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养，当OD600达到0.8时，将菌液冷却至4℃；冷却下来的菌液加入终浓度0.5mM的IPTG后于16℃、220rpm培养18h；培养结束后于大容量低温离心机内4℃、3500rpm离心20min收集所有大肠杆菌，倒净所有上清，用25mL50mM PBS(pH 7.4)缓冲液重悬大肠杆菌，加入终浓度1mM的PMSF；
3)将重悬的大肠杆菌使用超声破碎仪破碎，低温条件下40％的功率，超声3s，暂停7s，总超声时长20min，超声后的菌液在60℃加热15min，加热后的菌液在4℃、16000rpm、离心20min，取上清，并将上清液用0.45μm滤膜抽滤到一个干净50mL离心管内，放置于冰上；
4)用50mL50mM PBS(pH 7.4)缓冲液平衡处理好的Ni-IDABeads，平衡完毕加入上一步中抽滤好的大肠杆菌上清液，收集从柱内流出的裂解液重复上样两次；
5)上样结束后，用含5mM咪唑的50mM PBS(pH 7.4)冲洗Ni柱，总计冲洗200mL；
6)用50mM PBS(pH 7.4)缓冲液冲洗Ni柱，总计冲洗50mL；
7)用20mL的含400mM咪唑的50mM PBS(pH 7.4)缓冲液洗脱目的蛋白，洗脱结束将洗脱的蛋白放置于冰上；
8)向洗脱后的蛋白加入8.72g硫酸铵，震荡溶解硫酸铵，待硫酸铵溶解后放置于冰上30min沉淀StrepTactin和Y43A蛋白；
9)将上一步中的蛋白在4℃、16000rpm、离心10min后弃上清，沉淀用2mL的含5mMEDTA的10mM NaHCO3缓冲液溶解，溶解后的蛋白再次在4℃、16000rpm、离心10min，离心结束保留上清。
实施例4、StrepTactin和Y43A的交联固定
1)取2mL硫酸铵沉淀后的StrepTactin和Y43A蛋白，将蛋白在2L的200mM NaHCO3、500mM NaCl缓冲液中透析，每隔2h更换透析液一次，总计更换透析液两次；
2)透析结束的StrepTactin和Y43A蛋白测定其在280nm波长的紫外吸收值，按每毫克蛋白吸收值为2.84计算透析后的蛋白浓度和蛋白总质量；
3)按每毫升NHS微球(NHS Beads)交联固定12mg链霉亲和素蛋白量交联，用5倍Beads体积的1mM HCl溶液活化NHS Beads，活化后用5倍Beads体积的200mM NaHCO3、500mMNaCl缓冲液平衡NHS Beads，平衡结束加入透析好的蛋白，在4℃旋转交联12h；
4)交联结束后，用5倍Beads体积的100mM Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液冲洗Beads一次，再用5倍Beads体积的100mM Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液封闭Beads上未反应的NHS基团，4℃旋转封闭12h；
5)封闭结束后，用5倍Beads体积的50mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液冲洗Beads，将交联后的链霉亲和素树脂保存于一倍Beads体积的50mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.03％NaN3缓冲液中，存储于4℃。
实施例5、Bio-GFP和Bio-BSA生物素标记蛋白的制备
(1)单生物素化的GFP(Bio-GFP)的表达及裂解液制备
生物素可以在生物素连接酶(BirA)的作用下特异性的修饰于Avi标签中的赖氨酸残基上即生成生物素化的Avi标签。
1)取1μL抽提的含CBD-BirA质粒(CBD-BirA制粒参见公开号为CN114478726A的中国专利)和含Avi-GFP的质粒(参见公开号为CN114478726A的中国专利)，然后加入至100μL的BL21 codon plus(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，再在冰上静置2min，加入900μL的LB培养基在37℃、200rpm的摇床内复苏30min，涂布于含100μg/mL的氨苄和50μg/mL的卡那霉素抗性的平板上，37℃恒温过夜培养；
2)第二天从过夜培养的平板上挑取一个单菌落至10mL含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养12h，从培养后的10mL转接至1L含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养，当OD600达到0.6时，将菌液冷却至4℃；冷却下来的菌液加入终浓度0.5mM的IPTG和50μM的Biotin后于16℃、220rpm培养18h；培养结束后于大容量低温离心机内4℃、3500rpm离心20min收集所有大肠杆菌，倒净所有上清，用30mL 50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl缓冲液重悬大肠杆菌，加入终浓度1mM的PMSF；
3)将重悬的大肠杆菌使用超声破碎仪破碎，低温条件下以40％的功率，超声3s，暂停7s，超声20min，超声后的菌液在4℃、16000rpm、离心20min，取上清，并将上清液用0.45μm滤膜抽滤到一个干净50mL离心管内，放置于冰上，即得Bio-GFP裂解液。
(2)多生物素化的BSA(Bio-BSA)的制备
BSA的分子量为66.43KD，Bio-NHS探针的分子量为341.38Dal，称取1.285mg的Bio-NHS溶解于1mL DMF，50mg BSA蛋白溶解在9mL NaHCO3中，混合后4℃过夜孵育，然后用脱盐柱除去多余标签生物素后透析到200mM NaHCO3、500mM NaCl缓冲液，得到5mg/mL的Bio-BSA蛋白。
实施例6、StrepTactin和Y43A树脂在不同条件下的耐受情况
利用Bio-BSA和Bio-GFP对StrepTactin和Y43A树脂进行了对不同浓度Biotin、SDS和Urea的耐受实验，结果如图2所示。StrepTactin在1％的SDS浓度下能够很好的富集目的蛋白，而Y43A在0.1％的SDS存在下表现出低富集效果。StrepTactin和Y43A突变体对Urea的耐受情况一致，在8M Urea存在下依然能够较好的富集生物素标记蛋白。结果表明能在变复性条件下使用StrepTactin和Y43A树脂富集纯化生物素标记蛋白。
实施例7、突变体微量富集Bio-GFP和Bio-BSA生物素标记蛋白的筛选
利用0.5μg和0.05μg的Bio-GFP、Bio-BSA蛋白进行实验，通过WB实验检测StrepTactin及其突变体对微量生物素标记蛋白的富集与洗脱能力。
图3中A是StrepTactin和Y43A的10μLBeads对0.5μg Bio-GFP、0.5μg Bio-BSA蛋白的富集与洗脱。对比StrepTactin的洗脱与Beads残留，大部分的标记蛋白能够被洗脱下来，整个Beads残留不超过20％；Y43A突变体对标记蛋白的可逆洗脱效果优良，其残留较少。
图3中B是StrepTactin和Y43A的10μL Beads对0.05μg Bio-GFP、0.05μg Bio-BSA蛋白的富集与洗脱。对于0.05μg的标记蛋白量而言，StrepTactin和Y43A的Beads残留都很少，几乎检测不到，且与Input对比，在500μL的结合体系中，蛋白量减少后，StrepTactin和Y43A突变体的富集能力都有所下降。Y43A突变体对微量单生物素化蛋白的富集可见明显减弱，对微量的多生物素化蛋白的富集效果仍然良好。
两次实验相互对照，对比0.5μg和0.05μg标记蛋白可逆洗脱得到的蛋白总量，Y43A对标记蛋白的洗脱效果比StrepTactin更好。
实施例8、TurboID标记的生物素标记蛋白的制备
培养HEK 293T细胞，转染15μg的TurboID-GFP质粒到10cm细胞培养皿细胞中，转染24小时之后，更换新的细胞血清培养基并加入500μM Biotin反应4h，收集细胞并用细胞用PBS buffer清洗细胞五次，除去细胞培养基和其中的生物素。使用1mL Western裂解液裂解一盘细胞离心得到总蛋白。
实施例9、突变体富集TurboID标记的生物素标记蛋白的筛选
分别取40μLBiotin Antibody、StrepTactin、N23T(氨基酸SEQ ID NO.6)和Y43A突变体Beads结合200μL裂解液，并用总体积为200μL的Elution缓冲液洗脱，每次洗脱体积67μL，共洗脱3次，取40μL洗脱样品跑胶。Beads用200μL Elution缓冲液重悬制样跑胶。
如图4中A所示，Bio-Ab、StrepTactin和N23T树脂的洗脱率都不高，而Y43A的洗脱组有明显条带，显示出较高的洗脱率。图4中B是图4中A的统计结果，结果显示生物素抗体、StrepTactin和N23T的树脂残留基本超过70％，而Y43A的洗脱效率能达到50％。
通过减少结合Beads量，同时增大洗脱体积和洗脱次数，进一步优化Y43A的洗脱方案。本实验进一步使用20μL Beads结合400μL裂解液，并用400μL Elution缓冲液洗脱100μL/次共4次。结果如图4中C所示，优化洗脱方案之后，大部分的标记蛋白能够可逆洗脱，Beads残留的蛋白不超过四分之一，如图4中D所示，Y43A树脂的洗脱效率大约能达到80％。Y43A对于TurboID生物素标记蛋白的可逆洗脱效果优良。
本研究筛选出的Y43A突变体树脂对生物素标记的微量蛋白以及邻近标记蛋白的富集与鉴定都具有非常高的洗脱效率和回收率。通过可逆洗脱得到的蛋白质，一方面保留着原本的活性，可实现其后续的活性与修饰等功能；另一方面能够保留生物素修饰位点的信息，使得标记蛋白的筛选鉴定更为简单；同时通过特异性洗脱，可以减少非特异性蛋白，降低非特异性背景对质谱鉴定的干扰，为用质谱鉴定邻近标记蛋白提供了新的方案，同时可以用于蛋白质组学、动植物体内相互作用蛋白的富集鉴定。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (8)
1.链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白，其特征在于：所述Y43A突变蛋白为链霉亲和素突变体StrepTactin的43位酪氨酸突变为丙氨酸，所述Y43A突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白，其特征在于：编码所述Y43A突变蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.含有权利要求1或2所述Y43A突变蛋白的微球固定复合物。
4.根据权利要求3所述的微球固定复合物，其特征在于：所述微球为NHS微球。
5.权利要求1～2任一项所述Y43A突变蛋白或权利要求3～4任一项所述微球固定复合物在纯化生物素标记蛋白中的应用。
6.利用权利要求1～2任一项所述Y43A突变蛋白纯化生物素标记蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：将含Y43A突变蛋白交联NHS微球形成微球固定复合物，然后用HCl溶液活化，再用平衡缓冲液平衡，加入含生物素修饰蛋白的裂解液结合，再用Elution缓冲液洗脱，收集洗脱液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述HCl溶液的浓度为1mM；所述平衡缓冲液为浓度200mM的NaHCO3、500mM的NaCl。
8.权利要求1～2任一项所述Y43A突变蛋白或权利要求3～4任一项所述微球固定复合物在富集TurboID标记的生物素标记蛋白中的应用。
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