CN114507274A

CN114507274A - 可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114507274A
Application number: CN202210135057.7A
Authority: CN
Inventors: 李洪涛; 邬文峰; 金瑞; 杨婧; 何红梅
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2022-02-14
Filing date: 2022-02-14
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2042-02-14
Also published as: CN114507274B

Abstract

本发明公开了可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白及其应用，突变蛋白为野生型链酶亲和素的44‑47位氨基酸残基为VATR，并将链酶亲和素27位的丝氨酸突变为苏氨酸，或120位的色氨酸突变为组氨酸。突变后的蛋白与Strep tagⅡ结合力增加，提高了其对单Strep和TwinStrep融合蛋白的纯化能力，同时与Biotin的结合减弱，使得Biotin与其作用变得可逆，洗脱后用缓冲液进行简单洗涤再生可再次利用，因此能够更好的用于Biotin修饰蛋白和StreptagⅡ标签蛋白纯化。

Description

可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及链酶亲和素突变蛋白，经突变后能够可逆结合Strep tagⅡ标签、Twinstrep和生物素，因此能够用于蛋白纯化，再生后并重复利用。

背景技术

链霉亲和素(即Streptavidin)对生物素(Biotin)具有超强的非共价结合力，野生型链霉亲和素结合生物素的解离平衡常数K_d在10^-14mol/L，是目前自然界中已知的最强非共价相互作用，因此在分子生物学领域具有广泛运用，其应用领域包括：亲和层析、活细胞荧光成像、蛋白组学、生物素化酶的固定等。虽然链霉亲和素应用领域很广，但是具体到每一个应用，对链霉亲和素的性质更为细化的要求，例如亲和层析要求较低的亲和力和较高的解离常数，才能有效地将目的分子从含有链霉亲和素的微球上洗脱。由于野生型链霉亲和素会和生物素(Biotin)修饰的蛋白结合非常牢固，需要在非常剧烈的条件下，在含有高浓度的生物素(Biotin)的缓冲溶液中95℃加热才能将部分蛋白洗脱下来，因此其不能用于对生物素(Biotin)修饰的蛋白进行非变性亲和层析；野生型链霉亲和素的亲和纯化应用是利用其与长度为38个氨基酸的肽段SBP(氨基酸序列MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)的强亲和力，解离平衡常数K_d为10^-9mol/L，将SBP肽段作为亲和纯化标签融合于目的蛋白N段或C端，并用Biotin进行竞争洗脱，但该应用的缺点仍在于Biotin与野生型链霉亲和素超强的结合力，导致野生型链霉亲和素无法有效再生，限制了SBP标签的应用。为了扩大对链霉亲和素的应用范围，需要对链霉亲和素进行改造以减弱其与Biotin的结合力。

Voss等对链霉亲和素的44-47位氨基酸突变得到StrepTactin突变体(44-47位氨基酸具有以下序列：Val-Thr-Ala-Arg，野生型链霉素亲和素在15位至139位的截短序列)，其能特异性结合短肽Strep tagⅡ(肽段序列：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)，其结合Strep tagⅡ的解离平衡常数K_d在10^-7mol/L，但其对生物素的解离平衡常数K_d仍在10^-11～10^-12mol/L，使得其与Biotin的结合仍不可逆；Wong等将野生型链霉亲和素的27位的丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala)(S27A)，48位的甘氨酸(Gly)突变为苏氨酸(Thr)(G48T)得到SAVSBPM18突变体，该突变体对Biotin的解离平衡常数K_d升高10^-8mol/L，使得Biotin与SAVSBPM18的结合变得可逆。

由于SBP标签长度较长，因此其应用有限，目前应用最广的是StrepTactin与Strep标签，但是单独的Strep tagⅡ与StrepTactin结合仍然不够强，因此实际使用过程中将两个Strep tagⅡ串联(即Twinstrep标签，肽段序列：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys，其编码的核苷酸如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)使得解离平衡常数K_d达到10^-9mol/L，大大增强其结合力。然而StrepTactin在用于纯化Strep tagⅡ标签的融合蛋白时，仍然具有以下缺点，特别是用生物素洗脱后会造成StrepTactin难以再生使用，并且用变性剂、强酸、强碱等进行重生，降低其使用寿命；洗脱目的蛋白时常常使用较为昂贵的脱硫生物素代替生物素对目的蛋白进行洗脱(Schmidt et al，2007)，但因为脱硫生物素的价格远高于生物素，使用浓度较高，所以又造成了使用成本上升，不利于工业生产。

发明内容

鉴于此，本发明的目的之一在于提供可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白；本发明的目的之二在于提供含有所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白与微球的固定复合物；本发明的目的之三在于提供所述链霉亲和素突变蛋白或所述固定复合物在纯化Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白中的应用；本发明的目的之四在于提供所述链霉亲和素突变蛋白或所述固定复合物在纯化生物素修饰蛋白中的应用；本发明之五在于提供利用所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白固定合复物纯化Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白的方法；本发明之六在于提供利用所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白固定合复物纯化生物素修饰蛋白的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白，所述突变蛋白为野生型链酶亲和素的44-47位氨基酸具有以下序列：Val-Thr-Ala-Arg的蛋白，以及在链酶亲和素的第27位或第120位突变，27位的丝氨酸突变为苏氨酸记为S27T，120位的色氨酸突变为组氨酸记为W120H。

优选的，所述突变体的氨基酸序列如下：

S27T氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

W120H氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2、所述链霉亲和素突变蛋白或所述固定复合物在纯化Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白中的应用。

3、所述链霉亲和素突变蛋白或所述固定复合物在纯化生物素修饰蛋白中的应用。

所述编码突变体核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5。

4、利用所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白纯化Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白的方法，将表达含Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白的裂解液与含链霉亲和素突变蛋白固定复合物结合，用缓冲液冲洗，最后用5-10mM Biotin缓冲液洗脱，收集洗脱液。

优选的，Biotin缓冲液洗脱后还包括再生利用，具体为：向纯化过Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白的固定复合物用缓冲液洗涤即可再次使用。

5、利用所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白纯化生物素修饰蛋白的方法，将含链霉亲和素突变蛋白固定复合物平衡后，与含生物素修饰蛋白的裂解液结合，用缓冲液冲洗，最后用10-50mM Biotin缓冲液洗脱，收集洗脱液。

优选的，所述Biotin缓冲液洗脱后还包括再生利用，具体为：向纯化过生物素修饰蛋白的固定复合物用缓冲液洗涤即可再次使用。

本发明的有益效果在于：可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白，野生型链酶亲和素的44-47位氨基酸具有以下序列：Val-Thr-Ala-Arg，以及在链酶亲和素的第27位或第120位突变，27位的丝氨酸突变为苏氨酸记为S27T；120位的色氨酸突变为组氨酸记为W120H；突变后的蛋白与Strep tagⅡ结合力增加，提高了其对单Strep和TwinStrep融合蛋白的纯化能力，同时与Biotin的结合减弱，使得Biotin与其作用变得可逆，洗脱后进行洗涤再生可再次利用，因此能够更好的用于Biotin修饰蛋白和Strep tagⅡ标签蛋白纯化，用Biotin对生物素修饰的蛋白进行洗脱，洗脱后用Tri-HCl缓冲液，PBS缓冲液或其它缓冲液对StrepTactin mut进行洗涤再生即可再次利用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为StepTactin Beads和S27T、W120H Beads纯化Twinstrep-eGFP的效果对比图(A：S27T、W120H Beads纯化Twinstrep-eGFP，对比图StrepTactin1-3：StepTactin Beads纯化Twinstrep-eGFP的重生三次实验；S27T 1-3：S27T Beads纯化Twinstrep-eGFP的重生三次实验；W120H 1-3：Beads纯化Twinstrep-eGFP的重生三次实验)。

图2为S27T Beads和W120H Beads纯化Twinstrep-eGFP重复利用图(A：S27T Beads纯化重复利用图；1-6：S27T Beads纯化Twinstrep-eGFP，并重生六次实验；B：W120H Beads纯化重复利用图，1-6：W120H Beads纯化Twinstrep-eGFP，并重生六次实验)。

图3为S27T Beads和W120H Beads纯化Bio-eGFP和Bio-BSA对比图(In：加入的蛋白总量；S27T 1-3:S27T Beads洗脱下来的蛋白；W120H 1-3：W120H Beads洗脱下来的蛋白)：

图4为S27T Beads纯化Bio-eGFP重复利用图(1-7：S27T Beads纯化Bio-eGFP，并重复利用7次；Beads：重复使用7次后的Beads上残留的蛋白)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明中为了提升链霉亲和素突变体StrepTactin与Strep tagⅡ的结合能力，降低StrepTactin与生物素(Biotin)的结合能力，综合StrepTactin与其配体的结合位点，对StrepTactin与生物素形成氢键的关键氨基酸进行定点突变，目的在于保留原来的产品优点的同时弥补其不足之处，减弱生物素与StrepTactin的结合，来获得可与生物素可逆结合的StrepTactin突变体StepTactin mut。因此将StrepTactin的27位的丝氨酸(Ser)突变为苏氨酸(Thr)(S27T)，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸如SEQ ID NO.4所示；120位的色氨酸(Trp)突变为组氨酸(His)(W120H)，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例1、StrepTactin mut的制备

1)取5μL抽提的含上述设计的含StrepTactin mut的质粒(含StrepTactin mut的质粒是以PIISA-His-StrepTactin为模板，设计引物对其进行定点突变，PIISA-His-StrepTactin是由公司合成而得，PIISA-His-StrepTactin如SEQ ID NO.10)加入至100μL的BL21 codon plus(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，再在冰上静置2min涂，加入900μL的LB培养基在37℃、200rpm的摇床内复苏1h，布于含100μg/mL的氨苄抗性的平板上，37℃恒温过夜培养；

2)第二天从过夜培养的平板上挑取一个单菌落至10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养12h，将培养后的10mL菌液转接至1L含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养，当OD₆₀₀达到1.5时，将菌液冷却至0℃；冷却下来的菌液加入终浓度1mM的IPTG后于16℃、220rpm培养18h；培养结束后于大容量低温离心机内4℃、3500rpm离心20min收集所有大肠杆菌，倒净所有上清，用25mL 50mMPBS(pH 7.4)缓冲液重悬大肠杆菌，加入终浓度1mM的PMSF；

3)将重悬的大肠杆菌使用超声破碎仪破碎，低温条件下以40％的功率，超声3s，停7s，超声20min，超声后的菌液在60℃加热15min，加热后的菌液在4℃、15000rpm、离心20min，取上清，并将上清液用0.45μm滤膜抽滤到一个干净50mL离心管内，放置于冰上；

4)用50mL 50mM PBS(pH 7.4)缓冲液平衡处理好的Ni-IDA beads，平衡完毕加入上一步中抽滤好的大肠杆菌上清液，收集从柱内流出的裂解液重复上样一次；

5)上样结束后，用含5mM咪唑的50mM PBS(pH 7.4)冲洗Ni柱，总计冲洗100mL；

6)用含40mM咪唑的50mM PBS(pH 7.4)缓冲液冲洗Ni柱，总计冲洗50mL；

7)用20mL的含250mM咪唑的50mM PBS(pH 7.4)缓冲液洗脱目的蛋白，洗脱结束将洗脱的蛋白放置于冰上；

8)向洗脱后的蛋白加入8.72g硫酸铵，震荡溶解硫酸铵，待硫酸铵溶解后放置于冰上30min沉淀His-StrepTactin mut蛋白；

9)将上一步中的蛋白在4℃、15000rpm、离心10min，离心结束弃上清，沉淀用2mL的含5mM EDTA的10mM NaHCO₃缓冲液溶解，溶解后的蛋白再次在4℃、15000rpm、离心10min，离心结束保留上清。

实施例2、StrepTactin mut的交联固定

1)取2mL纯化后的His-StrepTactin mut蛋白，将蛋白在2L的200mM NaHCO₃、500mMNaCl缓冲液中透析，每隔2h更换透析液一次，总计更换透析液两次；

2)透析结束的His-StrepTactin mut蛋白测定其在280nm波长的紫外吸收值，按每毫克蛋白吸收值为2.84计算透析后的蛋白浓度和蛋白总质量；

3)按每毫升NHS微球(NHS Beads)交联固定12mg StrepTactin mut蛋白量交联，用5倍Beads体积的1mM HCl溶液活化NHS Beads，活化后用5倍Beads体积的200mM NaHCO₃、500mM NaCl缓冲液平衡NHS Beads，平衡结束加入透析好的蛋白，在4℃旋转交联12h；

4)交联结束后，用5倍Beads体积的100mM Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液冲洗Beads一次，再用5倍Beads体积的100mM Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液封闭Beads上未反应的NHS基团，4℃旋转封闭12h；

5)封闭结束后，用5倍Beads体积的50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mMEDTA缓冲液冲洗Beads一次，将交联后的StrepTactin mut保存于一倍Beads体积的50mMTris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.03％NaN₃缓冲液中，存储于4℃。

实施例3、TwinStrep-eGFP的表达及裂解液制备

1)取5μL抽提的含TwinStrep-eGFP的质粒，TwinStrep-eGFP的核苷酸序列如SEQID NO.7所示(TwinStrep-eGFP的质粒由pIISA-TwinStrep质粒用限制性内切酶BsaI酶切，将eGFP通过BsaI酶切位点用T4连接酶与载体连接，pIISA-TwinStrep质粒由扩增的TwinStrep序列连入pIISA的BsaI酶切位点而得)，分别加入至100μL的BL21 codon plus(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，再在冰上静置2min，加入900μL的LB培养基在37℃、200rpm的摇床内复苏1h，涂布于含100μg/mL的氨苄抗性的平板上，37℃恒温过夜培养；

2)第二天从过夜培养的平板上挑取一个单菌落至10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养12h，从培养后的10mL菌液取1mL菌液转接至100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养，当OD₆₀₀达到0.6时，将菌液冷却至25℃；冷却下来的菌液加入终浓度1mM的IPTG后于25℃、220rpm培养10h；培养结束后于大容量低温离心机内4℃、3500rpm离心20min收集所有大肠杆菌，倒净所有上清，用10mL 50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl缓冲液重悬大肠杆菌，加入终浓度1mM的PMSF；

3)将重悬的大肠杆菌使用超声破碎仪破碎，低温条件下以40％的功率，超声3s，停7s，超声5min，超声后的菌液在4℃、15000rpm、离心20min，取上清，并将上清液用0.45μm滤膜抽滤到一个干净15mL离心管内，放置于冰上；得到TwinStrep-eGFP裂解液。

实施例4、StrepTactin mut Beads对TwinStrep-eGFP的纯化

1、Strep-eGFP和TwinStrep-eGFP的表达及裂解液制备

1)取15μL StrepTactin mut Beads，用200μL 20mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mMNaCl、1mM PMSF缓冲液平衡beads，4℃、3000rpm离心1min，弃上清；

2)取100μL上述制备的TwinStrep-eGFP裂解液加入至StrepTactin mut交联固定的Beads中，4℃旋转结合30min；

3)结合结束，用200μL 20mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5％Triton-X100缓冲液洗涤beads 3次，再用200μL 20mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mMEDTA缓冲液洗涤beads 2次，每次洗涤5min，然后在4℃、3000rpm离心1min，弃上清；

4)用20μL 50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、5mM Biotin缓冲液洗脱beads上的蛋白，洗脱液加入至beads中后，先静置5min，然后4℃、3000rpm离心1min，收集离出的液体，洗脱3次；

5)纯化结束对每一步中的样品取样，加入5×SDS Loading Buffer(含DTT)，95℃加热5min后进行16.5％聚丙烯凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色。结果显示，StrepTactin mut均可纯化出TwinStrep-eGFP，表明StrepTactin mut在富集Twinstrep融合蛋白上表现突出，5mM的Biotin就能对Twinstrep融合蛋白进行洗脱。本实施例中用含5-10mM Biotin缓冲液洗脱均可。

2、StrepTactin mut Beads纯化TwinStrep-eGFP后再生利用

1)向纯化过TwinStrep-eGFP的15μL StrepTactin mut Beads中加入200μL 20mMTris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA缓冲液洗涤beads 3次，每次洗涤5min，然后在4℃、3000rpm离心1min，弃上清，经过3次洗涤后StrepTactin mut Beads即可再次使用；

2)按StrepTactin mut Beads对TwinStrep-eGFP的纯化步骤测试再生后的StrepTactin mut Beads的纯化效果，纯化结束按再生步骤进行再生，如此重复3次，结束后对每一次纯化的样品取样，加入5×SDS Loading Buffer(含DTT)，95℃加热5min后进行16.5％聚丙烯凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色，结果如图1所示。结果显示，S27T和W120H在洗脱后用Tri-HCl(pH 7.4)缓冲液或PBS缓冲液对突变体进行洗涤再生即可再次利用，而StrepTactin如果只简单用Tri-HCl(pH 7.4)缓冲液重生后对Twinstrep融合蛋白几乎无富集能力。并且本实施例中，PBS缓冲液或TE缓冲液等洗涤均可再次使用，因此适应缓冲液范围广。

按照上述方法将S27T和W120H再生6次，结束后对每一次纯化的样品取样，加入5×SDS Loading Buffer(含DTT)，95℃加热5min后进行16.5％聚丙烯凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色，结果如图2所示。结果显示，再生6次后对S27T和W120H的载量依旧能维持在相对稳定的水平。

上述结果表明，结果S27T和W120H在富集Twinstrep融合蛋白上表现突出，两个突变体对Twinstre-eGFP的载量大约为4.8mg/ml，S27T和W120H这两个突变体与Biotin的结合能力减弱，使得Biotin与其作用变得可逆，能够用低浓度的Biotin将Twinstrep融合蛋白洗脱，再者S27T和W120H的重生利用性好，只需要用5-10mM的Biotin就能对Twinstrep融合蛋白进行洗脱，洗脱后用Tri-HCl(pH 7.4)缓冲液、PBS缓冲液或TE对突变体进行洗涤再生即可再次利用，而StrepTactin如果只简单用Tri-HCl(pH 7.4)缓冲液重生后对Twinstrep融合蛋白几乎无富集能力，S27T和W120H的载量依旧能维持在相对稳定的水平。

实施例5、StrepTactin mut Beads纯化Biotin修饰蛋白的应用

1、生物素修饰的eGFP(Bio-eGFP)的表达及裂解液制备

生物素可以在生物素连接酶(BirA)的作用下特异性的修饰于Avi标签中的赖氨酸残基上即生成生物素化的Avi标签。

1)取5μL抽提的含CBD-BirA质粒，CBD-BirA基因序列如SEQ ID NO.8所示(含CBD-BirA质粒由限制性内切酶XhoI和NcoI酶切PET28a-CBD，将BirA通过XhoI酶切位点用T4连接酶连接，PET28a-CBD由BSAI酶切位点将CBD与PET28a载体链接)和含Avi-eGFP的质粒，Avi-eGFP基因序列如SEQ ID NO.9所示(含Avi-eGFP的质粒由限制性内切酶BamHI和XhoI酶切PET22b-avi质粒，将eGFP通过BamHI和XhoI酶切位点用T4连接酶连接，PET22b-avi质粒通过重组将avi与PET22b连接)，然后加入至100μL的BL21 codon plus(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，再在冰上静置2min，加入900μL的LB培养基在37℃、200rpm的摇床内复苏1h，涂布于含100μg/mL的氨苄和50μg/mL的卡那霉素抗性的平板上，37℃恒温过夜培养；

2)第二天从过夜培养的平板上挑取一个单菌落至10mL含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养12h，从培养后的10mL转接至1L含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床中培养，当OD₆₀₀达到0.6时，将菌液冷却至25℃；冷却下来的菌液加入终浓度1mM的IPTG和1mM的Biotin后于25℃、220rpm培养10h；培养结束后于大容量低温离心机内4℃、3500rpm离心20min收集所有大肠杆菌，倒净所有上清，用30mL 50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl缓冲液重悬大肠杆菌，加入终浓度1mM的PMSF；

3)将重悬的大肠杆菌使用超声破碎仪破碎，低温条件下以40％的功率，超声3s，停7s，超声20min，超声后的菌液在4℃、15000rpm、离心20min，取上清，并将上清液用0.45μm滤膜抽滤到一个干净50mL离心管内，放置于冰上，即得Bio-eGFP裂解液。

制备Bio-BSA，称取664.5mg BSA蛋白用缓冲液溶解，称取34.1mg Biotin-NHS至溶解后的BSA中，25℃过夜反应后透析到200mM NaHCO₃、500mM NaCl缓冲液。

2、S27T和W120H富集Biotin修饰的蛋白的测试

1)分别取15μL S27T Beads和W120H Beads，用200μL 20mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM PMSF缓冲液平衡beads，4℃、3000rpm离心1min，弃上清；

2)取100μL上述制备的Bio-eGFP裂解液加入至Beads中，4℃旋转结合30min；

4)用20μL 50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、10mM Biotin缓冲液洗脱beads上的蛋白，洗脱液加入至beads中后，先静置5min，然后4℃、3000rpm离心1min，收集离出的液体，洗脱3次；

5)纯化结束对每一步中的样品取样，加入5×SDS Loading Buffer(含DTT)，95℃加热5min后进行16.5％聚丙烯凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色，结果如图3所示。结果显示，S27TBeads和W120H Beads能够纯化Biotin修饰蛋白。

本实施例中用含10-50mM Biotin的缓冲液洗脱均可。

3、S27T和W120H Beads纯化Bio-eGFP的再生利用

1)向纯化过Bio-eGFP的15μL S27T Beads中加入200μL 20mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1mM EDTA缓冲液洗涤beads 3次，每次洗涤5min，然后在4℃、3000rpm离心1min，弃上清，经过3次洗涤后S27T Beads即可再次使用；也可以使用PBS缓冲液或其他缓冲液，如TE洗涤；

2)按S27T Beads对Bio-eGFP的纯化步骤测试再生后的S27T Beads的纯化效果，纯化结束按再生步骤进行再生，如此重复6次以上，结束后对每一次纯化的样品取样，加入5×SDS Loading Buffer(含DTT)，95℃加热5min后进行16.5％聚丙烯凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色，结果如图4所示。

上述结果表明，S27T与W120H对多Biotin修饰的蛋白的富集能力与相当，并且在纯化中能够用较低浓度的生物素就能把目的蛋白洗脱，降低了生产成本，增加目的蛋白的洗脱效率，降低beads上蛋白的残留量。其中用510-50mM的Biotin对生物素修饰的蛋白进行洗脱，洗脱后用Tri-HCl缓冲液，PBS缓冲液或其他缓冲液TE对其进行洗涤再生即可再次利用，简化了重生条件。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 84

<212> DNA

<213> Twinstrep

<400> 1

tggagccatc cacagtttga aaaaggagga ggttcaggtg gtggatctgg aggtggatca 60

tggagtcacc ctcaattcga gaaa 84

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> Twinstrep

<400> 2

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 3

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggcatca ccggcacctg gtacaaccag ctcggcacca ccttcatcgt gaccgcgggc 60

gccgacggcg ccctgaccgg tacctacgtc acggcccgtg gcaacgccga gagccgctac 120

gtcctgaccg gtcgttacga cagcgccccg gccaccgacg gcagcggcac cgccctcggt 180

tggacggtgg cctggaagaa taactaccgc aacgcccact ccgcgaccac gtggagcggc 240

cagtacgtcg gcggcgccga ggcgaggatc aacacccagt ggctgctgac ctccggcacc 300

accgaggcca acgcctggaa gtccacgctg gtcggccacg acacgttcac caaggtgaag 360

ccgtccgccg ccaagtccta a 381

<210> 4

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Thr Thr Phe Ile

1 5 10 15

Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala

20 25 30

Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser

35 40 45

Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala

50 55 60

Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly

65 70 75 80

Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu

85 90 95

Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly

100 105 110

His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Lys Ser

115 120 125

<210> 5

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggcatca ccggcacctg gtacaaccag ctcggctcga ccttcatcgt gaccgcgggc 60

gccgacggcg ccctgaccgg tacctacgtc acggcccgtg gcaacgccga gagccgctac 120

gtcctgaccg gtcgttacga cagcgccccg gccaccgacg gcagcggcac cgccctcggt 180

tggacggtgg cctggaagaa taactaccgc aacgcccact ccgcgaccac gtggagcggc 240

cagtacgtcg gcggcgccga ggcgaggatc aacacccagt ggctgctgac ctccggcacc 300

accgaggcca acgcccacaa gtccacgctg gtcggccacg acacgttcac caaggtgaag 360

ccgtccgccg ccaagtccta a 381

<210> 6

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile

1 5 10 15

Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala

20 25 30

Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser

35 40 45

Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala

50 55 60

Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly

65 70 75 80

Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu

85 90 95

Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala His Lys Ser Thr Leu Val Gly

100 105 110

His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Lys Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 0

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

<210> 8

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggcaaata caccggtatc aggcaatttg aaggttgagt tctacaacag caatccttca 60

gatactacta actcaatcaa tcctcagttt aaggttacta ataccggaag cagtgcaatt 120

gatttgtcca aactcacatt gagatattat tatacagtag acggacagaa agatcagacc 180

ttctggtgtg accatgctgc aataatcggc agtaacggca gctacaacgg aattacttca 240

aatgtaaaag gaacatttgt aaaaatgagt tcctcaacaa ataacgcaga cacctacctt 300

gaaatcagct ttacaggcgg aactcttgaa ccgggtgcac atgttcagat acaaggtaga 360

tttgcaaaga atgactggag taactataca cagtcaaatg actactcatt taagtctgct 420

tcacagtttg ttgaatggga tcaggtaaca gcatacttga acggtgttct tgtatggggt 480

aaagaacccg gtggcagtgt agtaccatca acacagcctg taacaacacc acctgcaaca 540

acaaaaccac ctgcaacaac aataccgccg acagatgatc cgaatgcaga aaatctttat 600

ttccaaggta tgaaggataa caccgtgcca ctgaaattga ttgccctgtt agcgaacggt 660

gaatttcact ctggcgagca gttgggtgaa acgctgggaa tgagccgggc ggctattaat 720

aaacacattc agacactgcg tgactggggc gttgatgtct ttaccgttcc gggtaaagga 780

tacagcctgc ctgagcccat ccagttactt aatgctgaac agatattggg tcagctggat 840

ggcggtagtg tagccgtgct gccagttatt gactccacga atcagtacct tcttgatcgt 900

atcggagagc ttaaatcggg cgatgcctgt gttgcagaat accagcaggc tggccgtggt 960

cgccgggggc ggaaatggtt ttcgcctttt ggcgcaaact tatatttgtc gatgttctgg 1020

cgtctggaac aaggcccggc ggcggcgatt ggtttaagtc tggttatcgg tatcgtgatg 1080

gcggaagtat tacgcaagct gggagcagat aaagttcgtg tcaaatggcc taatgacctc 1140

tatctgcagg atcgcaagct ggcaggcatt cttgtggagc tgactggcaa aactggcgat 1200

gcggcgcaaa tagtcattgg agccgggatc aacatggcaa tgcgccgtgt tgaagagagt 1260

gtcgttaatc aggggtggat cacgctgcag gaagcgggga tcaatctcga tcgtaatacg 1320

ttggcggcca tgctaatacg tgaattacgt gctgcgttgg aactcttcga acaagaagga 1380

ttggcacctt atctgtcgcg ctgggaaaag ctggataatt ttattaatcg cccagtgaaa 1440

cttatcattg gtgataaaga aatatttggc atttcacgcg gaatagacaa acagggggct 1500

ttattacttg agcaggatgg aataataaaa ccctggatgg gcggtgaaat atccctgcgt 1560

agtgcagaaa aataa 1575

<210> 9

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggctagcc gtggtctgaa cgacatcttc gaggctcaga aaatcgaatg gcacgaaagt 60

cgttccaccc cgccgacccc gagcactcct cctaccggat ccgtgagcaa gggcgaggag 120

ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 180

ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 240

atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 300

ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 360

gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 420

aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 480

ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 540

agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggc caacttcaag 600

atccgccaca acatcgagga cggcggcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 660

cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 720

ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 780

gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagctcg agtaa 825

<210> 10

<211> 3997

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc 60

cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatcggc 120

tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaattcccc tctagaaata attttgttta 180

actttaagaa ggagatatac catgggcagc tcacatcatc atacaacacc aagcacaagc 240

ggcgggggaa gcggcatcac cggcacctgg tacaaccagc tcggctcgac cttcatcgtg 300

accgcgggcg ccgacggcgc cctgaccggt acctacgtca cggcccgtgg caacgccgag 360

agccgctacg tcctgaccgg tcgttacgac agcgccccgg ccaccgacgg cagcggcacc 420

gccctcggtt ggacggtggc ctggaagaat aactaccgca acgcccactc cgcgaccacg 480

tggagcggcc agtacgtcgg cggcgccgag gcgaggatca acacccagtg gctgctgacc 540

tccggcacca ccgaggccaa cgcctggaag tccacgctgg tcggccacga cacgttcacc 600

aaggtgaagc cgtccgccgc caagtcctaa taaatgacta atattccggc tgtgagatcc 660

ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact 720

agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgaagg gcctcgtgat 780

acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac 840

ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 900

gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 960

tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 1020

tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 1080

acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 1140

cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 1200

ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 1260

ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 1320

atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 1380

cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 1440

tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 1500

gcctgcagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 1560

ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 1620

ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtggctc 1680

tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 1740

cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 1800

ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 1860

tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 1920

gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 1980

caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 2040

accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 2100

ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt 2160

aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 2220

accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 2280

gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 2340

ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 2400

gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 2460

gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 2520

ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 2580

aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 2640

gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 2700

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 2760

agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcataaa 2820

ttccgacacc atcgaatggt gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga 2880

gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc 2940

cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa 3000

aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc 3060

acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct 3120

gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag 3180

cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa 3240

tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc 3300

cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca 3360

gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaggacggt acgcgactgg gcgtggagca 3420

tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc 3480

ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat 3540

agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct 3600

gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc 3660

aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata 3720

cgacgatacc gaggacagct catgttatat cccgccgtca accaccatca aacaggattt 3780

tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt 3840

gaagggcaat cagctgttgc ccgtttcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa 3900

tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 3960

ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaat 3997

Claims

1.可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白为野生型链酶亲和素第44至47位氨基酸残基为VATR，以及链酶亲和素的第27位或第120位突变，27位的丝氨酸突变为苏氨酸记为S27T，120位的色氨酸突变为组氨酸记为W120H。

2.根据权利要求1所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白的氨基酸序列如下：

S27T氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

W120H氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.含有权利要求1～2任一项所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白与微球的固定复合物。

4.权利要求1～2任一项所述链霉亲和素突变蛋白或权利要求3所述固定复合物在纯化Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白中的应用。

5.权利要求1～2任一项所述链霉亲和素突变蛋白或权利要求3所述固定复合物在纯化生物素修饰蛋白中的应用。

6.利用1～2任一项所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白纯化Strep tag Ⅱ标签或Twinstrep标签蛋白的方法，其特征在于：将表达含Strep tag Ⅱ标签或Twinstrep标签蛋白的裂解液与含链霉亲和素突变蛋白固定复合物结合，缓冲液冲洗，最后用5-10mMBiotin缓冲液洗脱，收集洗脱液。

7.根据权利要求6所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白纯化Strep tag Ⅱ标签或Twinstrep标签蛋白的方法，其特征在于：Biotin缓冲液洗脱后还包括再生利用，具体为：向纯化过Strep tag Ⅱ标签或Twinstrep标签蛋白的固定复合物加入缓冲液洗涤即可再次使用。

8.利用1～2任一项所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白纯化生物素修饰蛋白的方法，其特征在于：将含链霉亲和素突变蛋白交联复合物平衡后，与含生物素修饰蛋白的裂解液结合，缓冲液冲洗，最后用10-50mM Biotin缓冲液洗脱，收集洗脱液。

9.根据权利要求8所述可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白纯化生物素修饰蛋白的方法，其特征在于：所述Biotin缓冲液洗脱后还包括再生利用，具体为：向纯化过生物素修饰蛋白的固定复合物加入缓冲液洗涤即可再次使用。