CN104203280A

CN104203280A - 纤维化的治疗

Info

Publication number: CN104203280A
Application number: CN201380016888.1A
Authority: CN
Inventors: I·鲁梅诺娃康斯坦丁诺娃; A·C·皮尔斯
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2012-03-27
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2014-12-10
Also published as: EP2830659A1; US20150050240A1; WO2013144758A1

Abstract

本发明属于治疗纤维化的领域。具体而言，它涉及使用N-钙黏着蛋白抗体治疗IPF。该抗体可以是适于治疗性用途的拮抗性或中和性N-钙黏着蛋白的任意抗体。

Description

纤维化的治疗

技术领域

本发明属于使用N-钙黏着蛋白的拮抗剂治疗纤维化的领域。具体而言，它涉及使用N-钙黏着蛋白抗体治疗特发性肺纤维化(IPF)。这种抗体可以是适于治疗性用途的拮抗性或中和性N-钙黏着蛋白抗体的任意抗体。

背景

肺纤维化–病理学和病因学

特发性肺纤维化(IPF)是最常见形式的间质性肺病。它是一种进行性、末期病状，世界范围内侵袭5百万患者(Gharaee-Kermani和Phan,2005；Meltzer和Noble，2008)。IPF患者的长期存活不良，5年存活率仅20％(Scotton和Chambers，2007)。IPF的病理学以杂乱的胶原蛋白纤维和其他胞外基质组分过度沉积和积累为特征，导致组织僵硬、丧失灵活性和肺功能进行性下降。IPF的预后已经与许多种恶性肿瘤的预后比较，诊断后中位数存活期仅为2至3年(Scotton和Chambers，2007)。尽管研究超过50年，但迄今不存在IPF的有效疗法，肺移植是证实延长存活的唯一措施(Walter等人，2006)，并且患者在诊断后数年逐渐进展至致命结果。

已经将IPF视做主要是炎症过程并且因此治疗的天然选择在历史上曾是使用皮质类固醇和其他免疫抑制性药物(Douglas等人，2000；Selman等人，1998)。然而，当前基于改变炎性组分的疗法仅略微有效，不存在长期改善的证据并且它们具有严重的副作用(Mapel等人，1996；Selman等人，2001)。

目前正在评价针对成纤维细胞增殖和胞外基质积累的疗法。这样两种药剂是吡非尼酮和干扰素。吡非尼酮在来自IPF患者的肺成纤维细胞中减少胶原蛋白合成并阻断促纤维化细胞因子的促有丝分裂作用(Kaneko等人，1998；Raghu等人，1999)。在一项采用IPF患者的II期试验中，存活率改善，肺功能试验在一些患者中稳定化或改善并且不存在严重副作用。但是，胸部放射摄影未改善，数据难以解释并需要额外研究以评估有效性(Raghu等人，1999)。来自一项III期临床试验的结果表明吡非尼酮可能在IPF患者中积极地影响肺功能(Bouros，2011)，并且最近，它在欧洲、日本和印度获得批准，不过其精确作用机制不清楚。FDA要求额外的临床试验以在批准前评价吡非尼酮有效性。

尽管存在令人鼓舞的相似体外研究，但是采用抵抗皮质类固醇或免疫抑制疗法的IPF患者的基于干扰素的临床试验未显示改善。在采用小群体IPF患者的另一项研究中，与泼尼松组合的情况下存在针对干扰素γ的有利反应(Ziesche等人，1999)。一项采用干扰素的更新近临床试验在2007中断，原因在于与接受安慰剂的患者相比，无效和患者死亡率略微增加。

在此刻，吡非尼酮是规定用于IPF的唯一药物，它可能延迟肺功能下降并改善肺功能。

因此，对总体上治疗纤维化和尤其治疗IPF的疗法，存在未满足的医疗需要。

发明概述

现在已经发现N-钙黏着蛋白介导的信号传导在患有IPF的受试者中促成纤维化。本发明因此提供一种抑制或中和N-钙黏着蛋白活性的N-钙黏着蛋白拮抗剂用于治疗或预防纤维化。在一种实施方式中，N-钙黏着蛋白拮抗剂是抗N-钙黏着蛋白抗体。在另一个实施方案中，N-钙黏着蛋白抗体用于治疗或预防特发性肺纤维化。

本发明也提供抑制或中和N-钙黏着蛋白活性的N-钙黏着蛋白拮抗剂在制备用于治疗或预防纤维化的药物中的用途。在一个实施方案中，使用抗N-钙黏着蛋白抗体。在另一个实施方案中，该用途是在制备用于治疗或预防特发性肺纤维化的药物中的用途。

本发明也提供一种治疗或预防纤维化的方法，所述方法由向有需求的受试者施用抑制或中和N-钙黏着蛋白活性的N-钙黏着蛋白拮抗剂组成。在一个实施方案中，该方法包括施用抗N-钙黏着蛋白抗体。在另一个实施方案中，该方法用于治疗或预防特发性肺纤维化。

本发明也提供抗体、用途或方法，其中抗体与可药用载体配制。

本发明也提供抗体、用途或方法，其中将抗体与吡非尼酮或干扰素依次或同时共施用。

附图目录

图1.人肺成纤维细胞之间的细胞-细胞接触诱导FMT。A.来自HLF的SMA、N-钙黏着蛋白和OB-钙黏着蛋白的蛋白质印迹，所述HLF以低细胞密度(LCD)和高细胞密度(HCD)在TGFβ不存在或存在下接种。B.HLF培养物中N-钙黏着蛋白和SMA的共染色。将叠加区域内的加方框区放大以显示共染色。

图2.N-钙黏着蛋白在体外参与人肺成纤维细胞至肌成纤维细胞转变。A.来自HLF的SMA和β-肌动蛋白的蛋白质印迹，所述HLF在TGFβ不存在或存在下接种，以Fc对照或N-钙黏着蛋白-Fc刺激。B.HLF中使用阴性对照siRNA和N-钙黏着蛋白siRNA，通过RT-PCR测量的N-钙黏着蛋白敲减，和siRNA转染的HLF中SMA的蛋白质印迹。C.在TGFβ不存在或存在下，来自HLF的SMA的蛋白质印迹，所述HLF用小鼠IgG或N-钙黏着蛋白阻断性抗体(GC-4)处理。

图3.N-钙黏着蛋白敲减抑制人肺成纤维细胞中的促纤维化功能性影响。A.分别使用N-钙黏着蛋白-Fc或N-钙黏着蛋白siRNA时，N-钙黏着蛋白功能的增益和损失对HLF迁移的影响。B.N-钙黏着蛋白敲减对血清诱导的和生长因子诱导的HLF增殖的影响。阴性对照siRNA的影响由黑色棒代表并且N-钙黏着蛋白siRNA的影响由白色棒代表。C.N-钙黏着蛋白敲减对来自HLF的胶原蛋白分泌的影响。*表示p-值<0.05时的统计显著性，并且**表示p-值<0.001时的统计显著性。

图4.人肺成纤维细胞中的N-钙黏着蛋白下游信号传导。A.在TGFβ不存在或存在下来自HLF的p-Ser552β-联蛋白和总β-联蛋白的蛋白质印迹。B.来自HLF的p-Ser552β-联蛋白和总β-联蛋白的蛋白质印迹，所述HLF用阴性siRNA和N-钙黏着蛋白siRNA转染。

图5.人肺成纤维细胞中N-钙黏着蛋白至OB-钙黏着蛋白转变。A.HLF中使用阴性对照siRNA和OB-钙黏着蛋白siRNA，通过RT-PCR测量的OB-钙黏着蛋白敲减。B.来自TGFβ不存在或存在下阴性siRNA转染的和OB-钙黏着蛋白siRNA转染的HLF的SMA和N-钙黏着蛋白的蛋白质印迹。C.使用OB-钙黏着蛋白siRNA时，OB-钙黏着蛋白损失功能对HLF迁移的影响。

图6.上皮至间充质转变的标志物。在TGFβ或TGFβ+IL-1β不存在或存在下的A549细胞中通过RT-PCR测量的EMT标志物N-钙黏着蛋白水平、波形纤维蛋白水平和E-钙黏着蛋白水平。

图7.N-钙黏着蛋白功能的损失阻止EMT。A.在TGFβ不存在或存在下来自A549细胞和HBEC的N-钙黏着蛋白，波形纤维蛋白和E-钙黏着蛋白的蛋白质印迹。B.来自TGFβ不存在或存在下用阴性对照siRNA或N-钙黏着蛋白siRNA转染的A549细胞的N-钙黏着蛋白和波形纤维蛋白的蛋白质印迹。C.使用N-钙黏着蛋白-Fc时，N-钙黏着蛋白功能的增益对EMT的影响。D.使用N-钙黏着蛋白中性抗体时，N-钙黏着蛋白功能的损失对EMT的影响。

图8.IPF动物模型中和IPF患者衍生的肺成纤维细胞中的N-钙黏着蛋白表达。A.使用石棉模型的时程实验中来自第14日的小鼠肺切片的N-钙黏着蛋白免疫组织化学染色。使用PBS和TitO2作为阴性对照。B.与非IPF患者衍生(健康)的HLF相比，通过蛋白质印迹法测量并使用光密度测量法定量的IPF患者衍生的HLF中的N-钙黏着蛋白表达水平。

图9.IPF患者肺组织中的N-钙黏着蛋白表达。与非IPF患者(健康)肺活组织检查样品相比，通过蛋白质印迹法测量并使用光密度测量法定量的IPF患者肺活组织检查样品中的N-钙黏着蛋白表达水平。SDS-PAGE图像上方的每个编号表示不同的患者。统一每位健康供体的数据。RUL，右上叶；RML，右中叶；RLL，右下叶；LUL，左上叶；LML，左中叶；LLL，左下叶。

发明概述

IPF的初始事件大多未知，不过认为它代表正常修复途径的异常激活。在正常伤口愈合期间，在损伤部位处的受损细胞造成促炎细胞因子局部升高，导致召集炎性细胞以清除感染并召集成纤维细胞以修复受损的组织。与细胞分化和活化组合的生长因子的局部上调导致伤口区域周围的组织重塑。最后，炎症消退并且修复过程失活(Hinz等人，2007；Tomasek等人，2002b；Werner和Grose，2003)。认为纤维化因炎症期或修复途径激活的慢性化形成或消退的失败而引起(Follonier等人，2008；Gharaee-Kermani和Phan，2005)。IPF与其他组织(包括皮肤、肝和肾)中的纤维化共有许多相似性(Border和Noble，1994)。但是，在大部分病例中，肺纤维化不随其他器官中的纤维化一起共诊断，表明局部环境在造成并维持纤维化中发挥至关重要的作用(Meltzer和Noble，2008)。

纤维增生性疾病，包括肺纤维化、系统性硬化病、肝硬化和进行性肾脏疾病，共有共同的细胞成纤维机制和组织重塑异常。大多数纤维变性的病症通常具有刺激物，所述刺激物维持产生生长因子、蛋白水解酶、血管生成性因子和成纤维性细胞因子(包括TGFβ)的，它们一起刺激肌成纤维细胞分化、增殖和结缔组织组分沉积，这逐渐重塑并摧毁正常组织构造(Tomasek等人，2002a；Friedman，2004；Chatziantoniou和Dussaule，2005)。因此，干扰以上过程的N-钙黏着蛋白阻断剂可以不仅用于治疗IPF，还用于治疗其他纤维变性的病症。

成纤维细胞和肌成纤维细胞在纤维化中的重要性

成纤维细胞是间质谱系的细胞，其主要功能是为组织提供结构性支撑维持胞外基质稳态。成纤维细胞分泌胞外基质的主要组分，胶原蛋白。与纤维化中过多胶原蛋白产生的重要性一致，成纤维细胞是纤维变性的疾病进展中的关键细胞并且在纤维变性的组织的损伤中发现其数目增加(Hinz，2007；Tomasek等人，2002b)。认为纤维变性的损伤中的成纤维细胞源自3个可能来源：首先，常驻性成纤维细胞增殖并迁移至纤维变性的病灶(Zhang等人，1994)。第二，成纤维细胞据信通过上皮细胞在称作上皮细胞-间充质细胞转变(EMT)的过程中反分化而形成(Kim等人，2006；Willis等人，2005)并且第三，据信招募了称作纤维细胞的循环型间充质祖细胞(Abe等人，2001；Hinz，2007；Phillips等人，2004)。这些过程中每一个过程在IPF形成中的相对作用仍待确定。除成纤维细胞数目增加之外，细胞的表型还改变。这些细胞正常情况下是相对静息的，然而在纤维化部位处，成纤维细胞呈现过度增殖、过度分泌和促炎，更为能动并更有收缩性并且抵抗凋亡(Horowitz等人，2004；Horowitz等人，2006；Raghu等人，1988；Zhang和Phan，1999；Zhang等人，1994)。实现这些表型改变的机制之一是成纤维细胞在称作成纤维细胞-肌成纤维细胞转变(FMT)的过程中反分化成肌成纤维细胞。肌成纤维细胞以表达收缩性细胞骨架蛋白平滑肌肌动蛋白为特征。平滑肌肌动蛋白提供更大的机械强度，导致细胞促迁移和促收缩(pro-migratory andpro-contractile)(Hinz等人，2003；Hinz和Gabbiani，2003a；Tomasek等人，2002b)。

此外，相对于静息的成纤维细胞，肌成纤维细胞具有促增殖性和促分泌性(Sebe等人，2008)。在正常伤口愈合过程期间，FMT由分泌型介质如TGFβ诱导，肌成纤维细胞迁移至伤口部位中，在那里它们介导组织重塑并且随后发生凋亡。在IPF中，肌成纤维细胞具有上文描述的促纤维变性的表型，高度富集于纤维变性的损伤中并发现它们抵抗凋亡(Horowitz等人，2004；Vittal等人，2005；Zhang和Phan，1999)。

伤口愈合和纤维化中的细胞-细胞接触

胞间黏附由涉及特定分子复合体的细胞-细胞接触介导，所述分子复合体在细胞-细胞通讯中发挥特殊作用(Gumbiner，2005a；Gumbiner，2005b；Nelson和Nusse，2004)。这些连接复合物限定细胞-细胞粘附的强度和功能。最常见类型的胞间连接之一是黏着连接。黏着连接以存在称作钙黏着蛋白的钙依赖性黏附分子为特征，所述钙依赖性黏附分子通过跨细胞同型相互作用直接介导细胞-细胞接触(Gumbiner，2005b；Patel等人，2003)。经典的钙黏着蛋白，其包括E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白，在它们的相互作用方面显示高水平的特异性，与相邻细胞上的相同钙黏着蛋白同工型偏好地结合，并在细胞识别和组织维持中发挥重要作用(Takeichi，1991)。通过激活联蛋白并且通过直接相互作用并与RTK交互作用，钙黏着蛋白与对RTK信号传导、细胞骨架重排和基因表达的多种效应偶联(Nelson和Nusse，2004)。不同的钙黏着蛋白导致对信号传导途径的差异性影响并且因此对增殖反应、迁移反应和其他细胞反应赋予不同的影响(Gumbiner，2005b；Takeichi，1991)。N-钙黏着蛋白在神经元中高度表达，形成相对弱的短寿嗜同性相互作用并因此与细胞迁移增加相关，而E-钙黏着蛋白在上皮细胞中表达，形成紧密的较长寿的嗜同性相互作用并且因此与不迁移和维持上皮屏障功能相关。OB-钙黏着蛋白在成骨细胞中高度表达，形成紧密和稳定的黏附作用并偶联于促增殖性信号传导途径以响应于骨萎缩或损伤而增强骨(Nelson和Nusse，2004；Williams等人，1994)。钙黏着蛋白表达的转换与获得和丧失这些细胞特征相关并且这些所谓“钙黏着蛋白转换”限定了发育期间和成年组织中功能转换方面的关键阶段。例如，这类转换是E-钙黏着蛋白在不同发育阶段转变成N-钙黏着蛋白和当血管生成期间需要血管系统塑性时内皮细胞中VE-钙黏着蛋白转变成N-钙黏着蛋白(Luo和Radice，2005；Takeichi，1991；Thiery等人，2009)。此外，钙黏着蛋白已经与众多疾病的病理学相关。OB-钙黏着蛋白与类风湿性关节炎中的骨及关节重塑相关(Farina等人，2009)。上皮细胞中从E-钙黏着蛋白向N-钙黏着蛋白的转换与EMT相关，所述EMT导致许多肿瘤中增加的侵袭力和转移(Cavallaro等人，2002；Thiery等人，2009)，并且从VE-钙黏着蛋白向N-钙黏着蛋白的转换与肿瘤进展中的血管生成相关(Blaschuk和Rowlands，2000；Luo和Radice，2005)。先前已经显示在伤口愈合期间，胞间通讯在组织修复中发挥关键作用(Follonier等人，2008；Scotton和Chambers，2007)。

伤口中增加的活化型肌成纤维细胞密度导致细胞-细胞接触数目增加和使胞外基质收缩的机械性力发生性胞间网络的形成，从而封闭伤口。在健康肺中，成纤维细胞散在胞外基质的各处，调节基质蛋白沉积和降解之间的平衡。因此，在正常条件下成纤维细胞很少靠近到足以形成细胞-细胞接触。黏着连接不存在于不形成应力纤维的正常组织成纤维细胞中(Welch等人，1990)。一项先前报道已经提出，肌成纤维细胞分化伴随协调细胞收缩性的黏着连接的形成(Hinz等人，2003；Hinz和Gabbiani，2003b；Hinz等人，2004)。又一项研究展示，不同于不形成黏着连接的正常成纤维细胞，肌成纤维细胞显示明显较高的收缩协调作用(Follonier等人，2008)。

纤维化的临床前模型

已经开发几个动物模型以研究肺纤维化并且已经用它们来鉴定可能参与人IPF形成的关键细胞、分子和过程。这些模型系统各自具有优点和缺点，但是它们均未清晰和充分地概括这些机制和人类疾病表现(Moore和Hogaboam，2008)。

IPF的博来霉素模型是最常使用和表征最充分的鼠模型。这种抗生素的施用在大量动物–小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬和灵长类中导致肺毒性、肺损伤和纤维化。初始病变影响肺内皮，这允许药物抵达肺泡，在肺泡中，病理学反应包括肺泡上皮损伤、液体和血浆泄漏在肺泡腔中、I型肺泡细胞坏死和II型肺泡细胞组织变形。炎性和间充质细胞浸润、改变的上皮细胞-间充质细胞相互作用和纤维化迹象在胸膜下区域内明显。随后，清除炎性细胞，成纤维细胞增殖并合成胞外基质(Phan等人，1980；Thrall等人，1979)。将积累的胶原蛋白作为所致纤维化的标志计量(Muggia等人，1983)。这个模型的缺点是，纤维化不在全部动物中形成，该过程是株系依赖的(Schrier等人，1983)，并且纤维化具有自限性并消退而非缓慢进展和不可逆(Phan等人，1983)。因此，人IPF的最关键特征之一不存在于这个模型中。

在啮齿类动物肺中施用矿物纤维导致与人类中与职业性暴露于矿物粉尘和气溶胶后所形成的损伤相似的纤维变性的区域发生。这用来形成IPF的石棉模型。这个模型中的反应以支气管肺泡灌洗液中纤维变性的区域和炎性浸润为特征。石棉不从肺清除并且因此纤维化刺激具有持续性(Davis等人，1998b；Davis等人，1998a)。但是，这种反应是株系依赖性的并且抗炎疗法无效(Barbarin等人，2005)。

其他模型包括FITC诱导型、照射诱导型纤维化模型和病毒靶向的转基因模型。FITC滴注导致炎性浸润和上皮增生，但是纤维变性的变化仅在FITC沉积的区域中明显(Roberts等人，1995)。照射模型是株系依赖的(Sharplin和Franko，1989)。病毒转基因剂诱导的纤维化没有持续性并且优势地影响上皮细胞(Engelhardt等人，1994)。

总之，IPF的动物模型代表了研究和验证可能促成疾病细胞、介质和过程的良好研究工具，但是尚未作为人类疾病的预示性临床前模型建立，并且最近已经描述了动物模型中和临床试验中药物效果的主要差异(Moeller等人，2008；Perel等人，2007)。

在本申请的情况下，因此通过体外实验采用源自健康供体和IPF患者二者的原代疾病相关性人肺成纤维细胞(HLF)以及采用II型肺泡细胞系(A549)获得最有预示性的数据。这些包括目的基因表达水平比较、功能的损失和增益对HLF中的FMT、增殖、迁移和存活的影响和对A549细胞中的EMT的影响。相似的功能性数据广泛地在科学文献和药物发现中用来预测潜在IPF靶的抗纤维变性的作用(King,Jr.等人，2011；Moeller等人，2008；Selman等人，2001)。

使用这些方法(见实施例)，我们已经展示以高细胞密度培养时，体外在人肺成纤维细胞(HLF)中形成胞间接触。这些细胞表达N-钙黏着蛋白并且这种表达与SMA表达相关。我们显示N-钙黏着蛋白在调节成纤维细胞至肌成纤维细胞转变，胶原蛋白分泌、成纤维细胞增殖与迁移和PI3-K、Akt依赖性存活途径中发挥作用。另外，N-钙黏着蛋白表达在TGFβ和IL-1β诱导的上皮细胞-间充质细胞转变期间增加，并且针对N-钙黏着蛋白的siRNA抑制EMT。发现N-钙黏着蛋白在IPF的石棉临床前小鼠模型和来自IPF患者的肺的成纤维细胞中上调。综上，这些数据表明N-钙黏着蛋白在成纤维细胞-肌成纤维细胞转变、成纤维细胞功能和上皮细胞-间充质细胞转变中的新作用并且表明N-钙黏着蛋白和细胞-细胞黏附作用调节纤维变性的表型的形成。N-钙黏着蛋白是用于治疗IPF和其他纤维变性的病症的重要新靶。

这些研究结果清晰指出，N-钙黏着蛋白参与驱动伴随纤维化(IPF)的组织重塑，并且抗N-钙黏着蛋白疗法将是用于患有IPF或其他纤维增生性疾病的受试者的可用治疗。

人成熟N-钙黏着蛋白多肽具有如下序列。胞外结构域加下划线。

MCRIAGALRTLLPLLAALLQASVEASGEIALCKTGFPEDVYSAVLSKDVHEGQPLLNVKFSNCNGKRKVQYESSEPADFKVDEDGMVYAVRSFPLSSEHAKFLIYAQDKETQEKWQVAVKLSLKPTLTEESVKESAEVEEIVFPRQFSKHSCHLQRQKRDWVIPPINLPENSRGPFPQEL VRIRSDRDKNLSLRYSVTGPGADQPPTGIFIINPISGQLSVTKPLDREQIARFHLRAHAV DINGNQVENPIDIVINVIDMNDNRPEFLHQVWNGTVPEGSKPGTYVMTVTAIDADDPNAL NGMLRYRIVSQAPSTPSPNMFTINNETGDIITVRAGLDREKVQQYTLIIQATDMEGNPTY GLSNTATAVITVTDVNDNPPEFTAMTFYGEVPENRVDIIVANLTVTDKDQPHTPAWNAVY RISGGDPTGRFAIQTDPNSNDGLVTVVKPIDFETNRMFVLTVAAENQVPLAKGIQHPPQS TATVSVTVIDVNENPYFAPNPKIIRQEEGLHAGTMLTTFTAQDPDRYMQQNIRYTKLSDP ANWLKIDPVNGQITTIAVLDRESPNVKNNIYNATFLASDNGIPPMSGTGTLQIYLLDIND NAPQVLPQEAETCETPDPNSINITALDYDIDPNAGPFAFDLPLSPVTIKRNWTITRLNGD FAQLNLKIKFLEAGIYEVPIIITDSGNPPKSNISILRVKVCQCDSNGDCTDVDRIVGAGL GTGAIIAILLCIIILLILVLMFVVWMKRRDKERQAKQLLIDPEDDVRDNILKYDEEGGGEEDQDYDLSQLQQPDTVEPDAIKPVGIRRMDERPIHAEPQYPVRSAAPHPGDIGDFINEGLKAADNDPTAPPYDSLLVFDYEGSGSTAGSLSSLNSSSSGGEQDYDYLNDWGPRFKKLADMYGGGDD

可用于实施本发明的拮抗剂

原则上，抑制或中和N-钙黏着蛋白活性的任何拮抗剂，如LMW拮抗剂、siRNA拮抗剂或生物治疗性拮抗剂，例如抗体，可以用于本发明中。可用于实施本发明的这类拮抗剂的例子在以下文献中公开：

第一种测试用于治疗癌症的N-钙黏着蛋白拮抗剂是ADH-1，一种含有组氨酸-丙氨酸-缬氨酸(HAV)N-钙黏着蛋白胞外结构域识别基序的环状五肽。用于癌症治疗的N-钙黏着蛋白肽拮抗剂的例子在WO2004048411、WO2004044000、US20090291967、WO2006116737、WO2009055937中描述。已经提交了关于ADH-1的具有改善效力的LMW类似物的众多专利申请，但是尚无临床进展报道(Burden-Gulley等人，2009)。

用于诊断、评价和治疗癌症的N-钙黏着蛋白抗体在WO2007109347、WO2009124281、WO2010054377和WO2011119888中描述。一篇最新论文描述了N-钙黏着蛋白抗体在治疗前列腺癌临床前模型中的用途(Tanaka等人，2010))。WO2011071543公开了用于治疗多种非纤维变性的疾病的额外N-钙黏着蛋白抑制剂。

可以通过测量促纤维变性的功能性影响(FMT、增殖、胶原蛋白分泌、迁移、存活等)评估体外N-钙黏着蛋白活性的抑制或中和，如先前(Hinz等人，2007；King,Jr.等人，2011；Phan，2002；Raghu等人，2011；Scotton和Chambers，2007；Zhang等人，1994)和本申请中所描述。在优选的实施方案中，本发明的抗N-钙黏着蛋白抗体(IgG、沉默型IgG、Fab或其他)以小于10nM、5nM、2.5nM、1.0nM、0.5nM或更小的IC₅₀抑制促纤维变性的功能性反应。

如本文所用，术语“抗体”意指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，其中所述抗体如上文所述特异性结合并识别表位，例如在N-钙黏着蛋白上存在的表位。因此，术语“抗体”包括完整抗体(如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体)，包括单链完整抗体，和其抗原结合片段。术语“抗体”包括结合抗原的抗体片段，包括单链抗体，其可以包含单独的或与以下多肽元件的全部或部分组合的可变区：抗体分子的铰链区、CH₁域、CH₂域和CH₃域。在该定义内部还包括可变区和铰链区、CH₁域、CH₂域和CH₃域的任何组合。抗体片段例如包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)₂、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含V_L域或V_H域的片段。例子包括(i)Fab片段，一种由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989；Muyldermans等人,TIBS 24:230-235,2001)；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。术语“抗体”包括单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、胞内抗体、双抗体、三链抗体(triabody)、四体抗体(tetrabody)、v-NAR和双-scFv(见，例如，Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology,23,9,1126-1136(2005))。抗体的抗原结合部分可以移植至基于多肽(如纤连蛋白III型(Fn3))的支架中(见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽单体抗体)。可以将抗原结合部分并入单链分子中，其中所述单链分子包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)；和美国专利号5,641,870)。

优选地，在本发明中使用的抗体与N-钙黏着蛋白特异性结合。优选地，在本发明中使用的抗体不与除N-钙黏着蛋白之外的抗原交叉反应。

如本文所用，“与N-钙黏着蛋白特异性结合”的抗体意指以1x10^-8M或更小、1x10^-9M或更小或1x10^-10M或更小的K_D与N-钙黏着蛋白结合的抗体。如本文所用，“与非N-钙黏着蛋白的抗原交叉反应”的抗体意指以0.5x10^-8M或更小、5x10^-9M或更小或2x10^-9M或更小的K_D与该抗原结合的抗体。

在一个备选实施方案中，在本发明中使用的抗体是交叉阻断一种或多种上文提及的抗体的一种抗体。通过“交叉阻断”，意指干扰另一种抗体与N-钙黏着蛋白结合的抗体。这种干扰可以例如使用竞争测定法，利用Biacore或ELISA检测到，这类竞争测定法在WO2008/133722中描述。

“纤维化”，“纤维变性的疾病”或“纤维增生性疾病”意指当损伤时修复过程中形成过多的纤维结缔组织。瘢痕化是消除受累器官或组织构造的持续纤维化的结果。作为不清理形成的瘢痕组织的异常修复过程的结果，纤维化进一步发展。纤维化可以存在于多种组织中，包括肺、肝、皮肤和肾。纤维化的例子包括肺纤维化、肝硬化、系统性硬化病和进行性肾脏疾病。

“特发性肺纤维化(IPF)”是特发性间质性肺炎(IIP)(一种类型的间质性肺病)的特定表现。间质性肺病，也称作弥散性实质性肺病(DPLD)，指一组影响间质的肺疾病。在微观上，来自IPF患者的肺组织显示称作普通间质性肺炎(UIP)的组织学特征的特征性集合。UIP因此是IPF的病理展示。

其他形式的IIP包括非特异性间质性肺炎(NSIP)、剥脱性间质性肺炎(DIP)和急性间质性肺炎(AIP)。间质性肺病的已知病因的例子包括肉样瘤病、过敏性肺炎、肺朗格汉斯细胞组织细胞增多症、石棉肺和胶原蛋白血管疾病如硬皮病及类风湿性关节炎。

词“治疗”指其结局是病情至少部分逆转，即纤维化至少部分逆转的疗法。

词“防止”指其结局是停止或至少减缓病情进展，即至少减缓纤维化进展的疗法。

药物组合物

在本发明中使用的抗体通常配制为含有与可药用载体配制在一起的一种单克隆抗体或单克隆抗体组合的组合物，例如，药物组合物。例如，在本发明中使用的药物组合物可以包含与N-钙黏着蛋白上不同表位结合或具有互补活性的抗体的组合。

在本发明中使用的药物组合物也可以在联合疗法中施用，即，与其他药剂组合。例如，联合疗法可以包括与吡非尼酮或干扰素组合的抗-N-钙黏着蛋白抗体。这类组合可以同时或依次地施用。如果依次施用，在施用每种药物之间的时间可以是一周或更短(例如一日或更短时间、12小时或更短时间、6小时或更短时间、1小时或更短时间、30分钟或更短时间)。该组合物优选地在生理pH配制。

如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容性的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂等。载体应当适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)可以包覆于保护该化合物免遭可能使这种化合物失活的酸和其他天然条件作用的材料内。

这类药物组合物可以还包含可药用的抗氧化剂。可药用抗氧化剂的例子包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

这些组合物也可以含有辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的消毒方法和通过纳入多种抗菌剂和抗真菌剂例如，对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止存在微生物。还可能想要将等渗剂如糖、氯化钠等纳入所述组合物。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过纳入延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶而实现。

可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于现场制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域已知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况下之外，构思了所述介质或试剂在本发明药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可以并入组合物中。

治疗性组合物一般必须是无菌和在制备和储存条件下稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)的分散介质，及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。在许多情况下，可以在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶而实现。

可以通过将活性化合物以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合加入到合适的溶剂中，根据需要，随后无菌微量过滤，制备无菌可注射溶液剂。通常，通过将所述活性化合物并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和来自上文所列举那些成分中的所要求的其他成分。在用于现场制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末情况下，制备方法是真空干燥法和冷冻干燥(冻干)法，所述方法产生有效成分的粉末，该粉末还含有来自先前无菌过滤的溶液中的任何额外的想要的成分。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分的量将根据正在治疗的受试者和具体施用模式变动。可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分的量通常将是组合物的产生治疗效果的量。总体上，以100％计，这个量将是与可药用载体组合时约0.01％至约99％的有效成分，约0.1％至约70％，或约1％至约30％的有效成分。

调整剂量方案以提供最佳的想要的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次快速浓注，可以随时间推移施用几个分开的剂量，或可以如治疗情况的危急性所示，按比例减少或增加该剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于剂量的施用和均匀性。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理分立的单元；每个单元含有预定量的活性化合物和所需要的药用载体，所述的预定量经计算产生所需的治疗效果。用于本发明剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果以及本领域配药法的内在局限性所决定并且完全取决于此，所述内在局限性例如是所述用于治疗的活性化合物的个体敏感性。

为了施用抗体，剂量是约0.0001mg/kg宿主体重至约100mg/kg宿主体重和更常见地约0.01mg/kg宿主体重至约5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是约0.3mg/kg体重、约1mg/kg体重、约3mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约20mg/kg体重、约30mg/kg体重或在约1-约30mg/kg或约1-约10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要施用约每周一次、约每两周一次、约每三周一次、约每四周一次、约每月一次、约每三个月一次、约每三个月至六个月一次、约每六个月一次或约每年一次。用于本发明抗N-钙黏着蛋白抗体的剂量方案包括通过静脉内施用约1mg/kg体重或约3mg/kg体重，同时使用以下给药方案之一给予抗体：约每四周给予六个剂量，随后约每三个月；约每三周；约3mg/kg体重一次，随后每三周约1mg/kg体重。

在一些方法中，同时或依次施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下，施用的每种抗体的剂量落在所示的范围内。组合可以是抗IL4抗体与抗N-钙黏着蛋白抗体的组合。通常在多个时刻上施用抗体。单次剂量之间的间隔期可以例如是每周、每月、每三个月、每六个月或每年。间隔期也可以是不规则的，如通过测量患者中针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量以实现约1μg/ml-约1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中实现约25μg/ml-约300μg/ml的血浆抗体浓度。

可选地，抗体可以作为持续释放形式施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半寿期变动。通常，人抗体显示最长的半寿期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是否为预防性或治疗性而变动。在预防性应用中，相对低的剂量以相对地不频繁的间隔期在长的时间范围内施用。一些患者继续接受治疗持续其余生。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔期上相对高的剂量直至疾病的进展减低或终止或直至患者显示出部分或完全的疾病症状改善。此后，患者可以按预防性方案施用。

可以变动有效成分在本发明药物组合物中的实际剂量水平，从而以获得有效成分的量，其中对于特定患者、组合物和施用模型，所述的量有效实现想要的治疗反应，而对患者无毒。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的化合物的排泄速率、治疗的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域熟知的因素。

本发明的抗N-钙黏着蛋白抗体的“治疗有效剂量”导致疾病症状的严重性减低、无疾病症状期的频率和持续期增加或防止因疾病侵袭所致的损伤或致残。

可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径施用本发明中使用的组合物。如技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变动。施用本发明抗体的途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外和胸骨内(intrastemal)注射和输注。特别优选静脉内和皮下施用。

备选地，在本发明中使用的抗体可以通过非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部地施用。

吸入施用特别优选用于治疗肺纤维化，如IPF。

活性化合物可以连同将保护该化合物免于快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的多种方法是专利授权的或总体上是本领域技术人员已知的。见，例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编著,MarcelDekker,Inc.,New York,1978。

可以用本领域已知的医疗装置施用治疗组合物。例如，在一个实施方案中，该组合物可以用无针皮下注射装置如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中所示的装置施用。可用于本发明中的熟知植入物和模块的例子包括：US4,487,603，其显示用于以受控速率分配药物的可植入式微量输注泵；US4,486,194，其显示用于经皮肤施用药物的治疗装置；US4,447,233，其显示用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；US4,447,224，其显示用于连续递送药物的可变流量的可植入式输注装置；US4,439,196，其显示具有多腔区室的渗透性药物递送系统；和US4,475,196，其显示渗透性药物递送系统。这些专利通过引用的方式并入本文。许多其他的此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。

本发明也提供一种包含第一组分和第二组分的试剂盒，其中第一组分是如上文所述的抗-N-钙黏着蛋白抗体或药物组合物并且第二组分是说明书。在一种实施方式中，所述说明书教授了用于治疗纤维化的抗体的用途。该试剂盒还可以包括第三组分，所述第三组分包括以下一者或多者：注射器或其他递送装置、辅药或可药用的配制溶液。

关于治疗IPF的一般指导原则已经由美国胸科学会、欧洲呼吸学会和英国胸科学会公开(美国胸科学会，2000；B.T.SOCIETY和S.O.COMMITTEE，1999；Raghu等人，2011)。

概述

术语“包含”意指“包括”以及“由组成”，例如一种包含“X”的组合物可以完全由X组成或可以包括额外的某物，例如X+Y。

相对于数值x，术语“约”例如意指x+10％。

对两个氨基酸序列之间序列同一性百分数的提及意指，当比对时，这个百分数的氨基酸在比较两个序列中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人(编著)1987)附录30，第7.7.18部分中描述的那些软件程序，确定这个比对结果和同源性或序列同一性百分数。使用仿射空位检索法，采用空位开口罚分12和空位延伸罚分2，BLOSUM矩阵62，通过Smith-Waterman同源性检索算法确定优选的比对结果。Smith-Waterman同源性检索算法在Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489中公开。

实施例

材料和方法

细胞培养物和siRNA转染流程

将原代性人肺成纤维细胞(Promocell)在补充有10％热灭活FBS、1mM丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素的DMEM中维持，并且每4日用胰蛋白酶消化处理。通过nucleofection(Amaxa电穿孔系统)用siRNA电穿孔转染近汇合性HLF。

将IPF供体HLF(从密歇根大学获得)在相同条件下维持。

将A549上皮II型肺泡细胞(ATCC)在补充有10％热灭活FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中维持，并且每4日用胰蛋白酶消化处理。

近汇合性细胞用于全部功能测定法中的铺种。

RT-PCR、siRNA合成和实时RT-PCR

将总RNA从HLF提取，转录成cDNA并用于RT-PCR。验证过的TaqmanN-钙黏着蛋白、OB-钙黏着蛋白、波形纤维蛋白或E-钙黏着蛋白引物和探针从Applied Biosystems购买。

针对N-钙黏着蛋白和OB-钙黏着蛋白的小干扰性RNA从AppliedBiosystems购买。通过使用实时RT-PCR检验敲减效率并且证实所述效率在不同功能测定法中在刺激时是95％。

共聚焦光学显微术

将1:1000稀释的小鼠抗N-钙黏着蛋白(BD Biosciences)、兔抗OB-钙黏着蛋白(Santa Cruz)、小鼠抗SMA(Sigma)和兔抗β-联蛋白抗体(CellSignaling Technology)用于染色4％PFA固定的HLF细胞或来自先前描述的IPF石棉模型的石蜡包埋小鼠肺切片(De等人，2004；Tan等人，2006)。第二抗体与AlexaFluor488或AlexaFluor647(Molecular Probes)缀合。DAPI(Sigma)用来染色细胞核。通过使用Leica共聚焦显微镜获得共聚焦图像。

蛋白质印迹

在RIPA缓冲液中制备HLF、IPF供体细胞、A549细胞裂解物或肺组织裂解物。患者肺活组织检查研究利用生物标本和数据由国家心脏、肺和血液研究所(NHLBI)资助的肺组织研究联盟(LTRC)提供。对于蛋白质印迹，将1:1000稀释的小鼠抗N-钙黏着蛋白(BD Biosciences)、兔抗OB-钙黏着蛋白(Santa Cruz)、小鼠抗SMA(Sigma)、小鼠抗波形蛋白(DACO)、小鼠抗E-钙黏着蛋白(Abcam)、兔抗β-联蛋白(Cell SignalingTechnology)、抗兔-p-Ser562-β-联蛋白(Cell Signaling Technology)、兔抗β-肌动蛋白(Santa Cruz)和小鼠抗GAPDH(Santa Cruz)与HRP缀合的第二抗体(GE Healthcare)组合使用。使用ECL系统(GE Healthcare)显影蛋白质印迹物。使用NIH ImageJ软件进行条带强度的定量。

基于细胞的功能测定法

为评估功能性反应，将未转染的HLF或用siRNA转染的HLF铺种在完全生长培养基中并使其生长过夜，在无血清培养基中使其饥饿24小时并用不同的生长因子刺激另外24小时。对于FMT评估，将HLF细胞用5ng/ml TGFβ(R&D Systems)或10μg/ml人N-钙黏着蛋白-Fc(R&D Systems)刺激，对于胶原蛋白分泌，用1ng/mlTGFβ刺激；对于增殖–用FBS、10ng/mL PDGF-BB(R&D Systems)或10ng/mLFGF-2(R&D Systems)并且对于迁移，用10μg/ml人N-钙黏着蛋白-Fc(R&D Systems)或人OB-钙黏着蛋白-Fc(R&D Systems)刺激。在功能损失FMT实验中，使用50μg/mlN-钙黏着蛋白中和抗体(克隆GC-4，Sigma)。通过针对SMA的蛋白质印迹法评价FMT的水平。通过Sircol胶原蛋白测定法(Biocolor Life Science)测量胶原蛋白分泌。使用DELFIA系统(PerkinElmer)进行增殖测定法，并且用Oris系统(Platypus Technology)评估迁移。

对于EMT评估，A549细胞用5ng/mlTGFβ(R&D Systems)，5ng/mlTGFβ(R&D Systems)和2.5ng/mLIL-1β(R&D Systems)组合或N-钙黏着蛋白-Fc(R&D Systems)刺激。通过针对波形纤维蛋白和E-钙黏着蛋白的RT-PCR和蛋白质印迹法或通过针对E-钙黏着蛋白的免疫细胞化学评价EMT的水平。在功能损失EMT实验中，在18μg/ml N-钙黏着蛋白-Fc(R&D Systems)存在下使用N-钙黏着蛋白中和工具抗体或IgG同种型对照。

统计分析

通过使用采用双尾分布和双样品不等方差的Student's t-检验，确定统计显著性。在全部检验中，比较仅一个参数改变的两个组。

实施例1

人肺成纤维细胞之间的细胞-细胞接触诱导FMT

为了研究HLF之间的细胞-细胞接触是否可以诱导FMT，我们以低细胞密度并以高细胞密度(LCD和HCD)铺种原代HLF并进行蛋白质印迹法以评估肌成纤维细胞标志物(SMA)的表达。重要地，在加载到凝胶上之前，将总蛋白量归一化。在TGFβ存在和不存在下进行实验。如预期，TGFβ诱导LCD和HCD二者中SMA表达的明显增加。先前已经报道未刺激的细胞中存在少量SMA并且这归因于培养物中的某种自发表达(Hinz等人，2004)。有趣地，在基态(未刺激)条件和TGFβ刺激条件，相对于以LCD铺种的细胞，SMA表达在以HCD铺种的细胞中增加。这些数据表明细胞-细胞接触可以诱导FMT。

为了进一步研究造成HLF中SMA上调的胞间接触的性质，我们研究了在HLF中两种主要间充质钙黏着蛋白在LCD和在HCD时的表达水平(图1A)。与LCD相比，N-钙黏着蛋白表达在HCD时大幅度上调。OB-钙黏着蛋白表达也在HCD时增加，尽管这种增加与N-钙黏着蛋白相比较不明显。TGFβ处理在两种铺种条件均上调N-钙黏着蛋白和OB-钙黏着蛋白的表达。为了进一步研究N-钙黏着蛋白和SMA表达之间的联系，将HLF针对SMA和N-钙黏着蛋白二者染色。形成胞间接触的细胞倾向于呈SMA阳性并表达N-钙黏着蛋白(图1B)。这些数据表明，以高细胞密度铺种时，HLF形成细胞-细胞连接，表达N-钙黏着蛋白和发生FMT，因此代表IPF中临床上有意义的高细胞密度成纤维细胞病灶。

实施例2

N-钙黏着蛋白在体外参与人肺成纤维细胞至肌成纤维细胞转变

为了进一步在成纤维细胞中研究N-钙黏着蛋白信号传导的功能性影响，我们分别使用N-钙黏着蛋白-Fc融合蛋白和siRNA进行功能获得实验和损失实验。将HLF用10μg/mlN-钙黏着蛋白-Fc或对照Fc片段在TGFβ存在和不存在下处理24小时，并且通过蛋白质印迹法测量SMA(图2A)。先前已经展示N-钙黏着蛋白-Fc模拟N-钙黏着蛋白的跨细胞嗜同性相互作用并激活N-钙黏着蛋白信号传导(Utton等人，2001)。N-钙黏着蛋白-Fc诱导SMA表达明显增加到与采用TGFβ时所见到的相似水平。对照Fc-蛋白不诱导SMA表达。这个结果表明N-钙黏着蛋白激活作用可以诱导FMT至类似于TGFβ的程度。有趣地，采用TGFβ和N-钙黏着蛋白-Fc的组合时，我们没有在这个时间观察到对SMA表达的加合或协同效应。

为了检验N-钙黏着蛋白是否为FMT的原因或效果，我们用针对N-钙黏着蛋白的siRNA转染HLF并检查SMA的表达。与对照siRNA转染的细胞相比，用针对N-钙黏着蛋白的siRNA转染的HLF具有较低的N-钙黏着蛋白表达(图2B)。此外，敲减N-钙黏着蛋白导致基础HLF培养物中SMA表达显著减少(图2B)，表明N-钙黏着蛋白是FMT的原因。

为了检验如下假设：干扰N-钙黏着蛋白功能而非对其蛋白质表达敲减影响FMT，我们还在TGFβ存在或不存在下将HLF与N-钙黏着蛋白阻断性抗体温育(图2C)并测量SMA表达。相对于高剂量和低剂量TGFβ，N-钙黏着蛋白阻断性抗体抑制FMT。这些结果证实表面N-钙黏着蛋白的功能阻断足以阻止TGFβ诱导的SMA表达。

总之，这些实验显示，N-钙黏着蛋白调节FMT并且抑制N-钙黏着蛋白功能将阻止这个过程。

实施例3

N-钙黏着蛋白敲减抑制人肺成纤维细胞中的促纤维变性的功能性影响

增加的迁移是肌成纤维细胞标志并且认为有助于IPF的病理学。因此，我们研究N-钙黏着蛋白功能获得和功能损失对HLF迁移潜力的影响。我们用细胞进行体外伤口闭合测定法，其中所述细胞用重组N-钙黏着蛋白-Fc嵌合体或用N-钙黏着蛋白siRNA处理。用N-钙黏着蛋白-Fc激活的N-钙黏着蛋白信号传导导致HLF迁移入伤口明显增加。用siRNA敲减N-钙黏着蛋白减少向伤口中迁移(图3A)。

由于N-钙黏着蛋白信号传导已经显示在一些细胞类型中诱导增殖(Mariotti等人，2007)，所以我们评估了N-钙黏着蛋白对HLF增殖的可能影响。将细胞用N-钙黏着蛋白siRNA转染并且检查它们响应于不同浓度血清时的增殖。N-钙黏着蛋白敲减导致显著减少的血清诱导增殖(图3B)。为了更详细地研究这种作用，我们研究了N-钙黏着蛋白siRNA转染的细胞响应于FGF-2和PDGF-BB的增殖性反应(图3B)。N-钙黏着蛋白敲减导致响应于两种因子的增殖的明显丧失。这些结果显示N-钙黏着蛋白信号传导影响响应于一系列生长因子的HLF增殖。

由于胶原蛋白沉积是IPF中的关键事件，所以我们评估了N-钙黏着蛋白在来自HLF的胶原蛋白分泌中的作用。与对照siRNA转染的细胞相比，N-钙黏着蛋白siRNA转染的细胞分泌显著较少的胶原蛋白(图3C)。

总之，N-钙黏着蛋白的激活导致获得肌成纤维细胞表型，细胞展示出增加的迁移性和增殖性反应。N-钙黏着蛋白功能损失导致全部这些作用明显下降和胶原蛋白沉积减少，因此表明，抑制N-钙黏着蛋白可能在治疗IPF中有益。

实施例4

人肺成纤维细胞中的N-钙黏着蛋白下游信号传导

N-钙黏着蛋白与β-联蛋白(Wnt途径中的一种下游效应子)直接相互作用，所述β-联蛋白或者与α-联蛋白结合，使黏着连接直接连接至细胞骨架结构，或者转位至胞核并充当启动多种生长与分化基因表达的转录因子。此外，已经展示N-钙黏着蛋白信号传导以细胞类型特异性方式与FGFR、c-Met、Wnt和PI3K-Akt交互作用(De等人，2004；Nelson和Nusse，2004；Takeichi，1991；Utton等人，2001；Wallerand等人，2010；Williams等人，1994)。

为了评估HLF中响应于纤维变性的刺激对β-联蛋白的调节，将细胞用TGFβ刺激并且通过蛋白质印迹法评估β-联蛋白的表达水平和磷酸化状态(图4A)。在TGFβ-刺激的细胞中不存在总β-联蛋白表达水平的差异。但是，当细胞裂解物用磷酸特异性β-联蛋白抗体探测时，我们发现当TGFβ处理时Ser552的磷酸化增加。这个磷酸化位点最近已经证实是AKT的底物，并且激活这条途径与增加的细胞存活率相关(Fang等人，2007；Horowitz等人，2004)。为了研究TGFβ-刺激的HLF中β-联蛋白Ser552磷酸化是否在N-钙黏着蛋白下游，将HLF用N-钙黏着蛋白siRNA转染并使用磷酰-Ser552特异性抗体探测(图4B)。敲减N-钙黏着蛋白导致在不影响细胞中总β-联蛋白水平的情况下几乎彻底抑制β-联蛋白上的Ser552磷酸化。这些结果表明通过与PI3K-AKT途径交互作用，N-钙黏着蛋白参与肌成纤维细胞中TGFβ诱导的促存活信号。由于Wnt途径和PI3K-AKT途径二者在IPF中均上调，这些结果突出显示N-钙黏着蛋白在IPF中的治疗潜力。

实施例5

人肺成纤维细胞中N-钙黏着蛋白至OB-钙黏着蛋白转变

OB-钙黏着蛋白是成骨细胞中高度表达的非经典钙黏着蛋白(Boscher和Mege，2008)。OB-钙黏着蛋白形成强相互作用并且与稳定粘附和激活增殖性信号传导途径相关(Boscher和Mege，2008；Cavallaro等人，2002；Gumbiner，2005b；Nelson和Nusse，2004；Patel等人，2003)。由于OB-钙黏着蛋白在间质谱系的细胞中表达，所以我们在基态和刺激的HLF中研究这种蛋白质的表达。在培养下生长的HLF中以低水平检测到OB-钙黏着蛋白表达。有趣地，OB-钙黏着蛋白响应于TGFβ上调。OB-钙黏着蛋白的这种上调似乎与SMA和N-钙黏着蛋白的表达上调同时出现(图1A)。为了进一步剖析事件的顺序并且为了研究FMT中OB-钙黏着蛋白的作用，将HLF用对照或OB-钙黏着蛋白siRNA转染并且测量SMA的表达。与对照细胞相比，用OB-钙黏着蛋白siRNA转染的细胞表达降低水平的OB-钙黏着蛋白(图5A)。然而令人惊讶地，OB-钙黏着蛋白siRNA转染的细胞表达更多的SMA。由于这与我们采用N-钙黏着蛋白时的观察结果形成鲜明对比，我们还评估了OB-钙黏着蛋白敲减对N-钙黏着蛋白水平的影响。与对照细胞相比，OB-钙黏着蛋白siRNA转染的细胞表达显著增加水平的N-钙黏着蛋白(图5B)。这些结果显示N-钙黏着蛋白表达与TGFβ刺激的HLF中的SMA表达相关并且尽管OB-钙黏着蛋白表达与对照HLF中的SMA表达相关，在OB-钙黏着蛋白siRNA转染的细胞中，存在因N-钙黏着蛋白补偿性上调所致的SMA表达增加。总之，这些结果表明，用TGFβ刺激的成纤维细胞依次表达N-钙黏着蛋白并且随后表达OB-钙黏着蛋白，并且敲减OB-钙黏着蛋白诱使细胞处于N-钙黏着蛋白表达阶段。这随后导致SMA表达增加。由于N-钙黏着蛋白信号传导的功能性影响之一是增加细胞迁移，所以我们测试了OB-钙黏着蛋白siRNA对这种反应的影响。与上文结果一致，OB-钙黏着蛋白siRNA转染的细胞显示迁移增加(图5C)。

因此，在IPF中抑制N-钙黏着蛋白并且不抑制OB-钙黏着蛋白更可能提供治疗益处。

实施例6

EMT期间的N-钙黏着蛋白表达

存在日益增长的证据：IPF进展期间上皮细胞发生EMT(Horowitz和Thannickal，2006；Kim等人，2006；Nieman等人，1999；Selman等人，2008)。在EMT期间，上皮细胞丧失E-钙黏着蛋白表达并且出现钙黏着蛋白转换成从头表达的N-钙黏着蛋白。丧失由E-钙黏着蛋白介导的稳定细胞-细胞接触和获得更为动态的N-钙黏着蛋白连接为这些细胞提供了从上皮层脱离并迁移的信号。这种间充质表型的获得以损失上皮标志(包括E-钙黏着蛋白)和获得间充质标志(包括波形纤维蛋白)为特征(Cavallaro等人，2002；Shintani等人，2008；Thiery等人，2009)。

在体外，可以通过用TGFβ和IL-1β的组合处理上皮细胞模拟这个过程(Border和Noble，1994；Leivonen等人，2002；Massague，2008；Willis等人，2005)。

使用A549细胞(源自人II型肺泡上皮细胞的细胞系)或原代人支气管上皮细胞(HBEC)，我们研究了EMT期间N-钙黏着蛋白的表达和作用。

将A549细胞用与IL-1β组合的TGFβ处理48小时以诱导EMT。与先前报道(Kim等人，2006；Willis等人，2005)一致，这引起E-钙黏着蛋白的损失，波形纤维蛋白表达的获得和细胞伸长。在这种过程期间，使用实时PCR监测这些EMT标志和N-钙黏着蛋白的表达水平(图6)。用TGFβ和IL-1β处理A549细胞导致N-钙黏着蛋白mRNA表达增加5倍，因此证实N-钙黏着蛋白可以用作为EMT的标志(Kim等人，2006；Willis等人，2005)。

实施例7

N-钙黏着蛋白损失功能阻止EMT

在用TGFβ与IL-1β组合处理的细胞中的N-钙黏着蛋白表达增加经证实为N-钙黏着蛋白增加(图7A)。重要的是，我们在未处理的A549细胞中检测到基态N-钙黏着蛋白和波形纤维蛋白表达，这很可能归因于该细胞是转化细胞系的事实。为了证实在未处理时不表达N-钙黏着蛋白的原代上皮细胞中的观察结果，我们使用原代HBEC。我们用来自未处理的和TGFβ外加IL-1β处理的细胞的裂解物进行蛋白质印迹分析并且检测到N-钙黏着蛋白的从头表达(图7A)。为了研究N-钙黏着蛋白功能损失对EMT的影响，我们用N-钙黏着蛋白siRNA或对照siRNA转染A549细胞并评估EMT(图7B)。TGFβ和IL-1β处理对照siRNA转染的细胞诱导EMT特异性形态改变，即，细胞延伸和细胞团中丧失特征性牢固上皮粘附作用。通过使用蛋白质印迹，我们还可以检测到波形纤维蛋白表达增加。但是，在N-钙黏着蛋白敲减细胞中，细胞上皮形态部分地保留。另外，我们发现当TGFβ和IL-1β处理时，N-钙黏着蛋白敲减彻底地阻止波形纤维蛋白表达上调。这些结果显示N-钙黏着蛋白调节引导EMT的关键细胞过程。

为了证实N-钙黏着蛋白功能获得和功能损失调节EMT，而非siRNA介导的敲减调节EMT，我们在工具N-钙黏着蛋白中和抗体存在或不存在下用重组N-钙黏着蛋白-Fc处理A549细胞(图7C)。我们通过使用针对E-钙黏着蛋白的免疫细胞化学测量EMT。在实验的功能获得设定下，添加重组N-钙黏着蛋白-Fc造成明显的EMT，由减少的E-钙黏着蛋白信号度量。EMT的程度与用TGFβ和IL-1β处理的对照的那种程度相当。在功能损失设定下，用N-钙黏着蛋白-Fc处理之前，将细胞与中和抗体预温育。这导致彻底抑制EMT，因此证实，抑制N-钙黏着蛋白导致阻止IPF中的这种过程。

实施例8

肺纤维化动物模型中和IPF患者衍生的肺成纤维细胞中的N-钙黏着蛋白表达

为了评估N-钙黏着蛋白在IPF中的可能作用，我们分析N-钙黏着蛋白在肺纤维化临床前动物模型-石棉小鼠模型中的表达(Tan等人，2006)。石棉是天然存在的硅酸盐矿物，如果吸入，则它造成进行性肺纤维化。我们用石棉、对照矿物质–二氧化钛(TitO₂)或盐水溶液处理小鼠64天时间，在各个时间点处死动物，收获肺并处理独立的样品用于IHC分析。在来自3个组的肺组织的切片中，通常在血管周围血管平滑肌细胞中观察到对SMA的免疫染色。然而重要地，在石棉处理组中，纤维变性的组织内一致地存在SMA信号的增加。对N-钙黏着蛋白的免疫染色显示，发生重塑的区域是表达N-钙黏着蛋白的区域，并且N-钙黏着蛋白在对照动物中不表达(图8A)。这些数据显示N-钙黏着蛋白在IPF临床前小鼠模型中肺的纤维变性的区域内上调。

为了寻找疾病相关的细胞类型特异性N-钙黏着蛋白表达，我们通过蛋白质印迹法分析从IPF患者的肺中纯化的成纤维细胞中的N-钙黏着蛋白表达。使用来自不患IPF的供体的人肺成纤维细胞作为对照。在IPF细胞中存在N-钙黏着蛋白表达的高程度变异。但是，患者细胞比对照细胞表达显著更多的N-钙黏着蛋白(图8B)。

实施例9

IPF患者肺组织活组织检查样品中的N-钙黏着蛋白表达。

另外，与健康对照相比，我们已经通过蛋白质印迹法分析IPF患者肺活组织检查样品中N-钙黏着蛋白的表达(图9)。我们发现与健康对照相比，N-钙黏着蛋白在大多数分析的IPF患者肺组织中显著上调，因此为N-钙黏着蛋白在IPF中的作用提供额外的临床支持。

讨论

生理性伤口愈合是生物中响应于损伤时天然发生的防御机制。伤口愈合过程的不同阶段受直接和间接细胞通讯紧密调节。广泛接受FMT是伤口愈合中的关键事件，是为恢复组织构造提供机械基础必需的。类似于其他纤维化适应症，如硬皮病、肾与肝纤维化，认为IPF代表因重复性微观损伤和消退失效所致的异常伤口愈合反应。

将TGFβ称作各种纤维化病状中的成纤维总开关，与其他细胞因子协同以激发对IPF形成和进展的各种影响(du Bois，2010)。日益增长的众多研究显示IPF进展的多个方面受细胞-胞外基质相互作用和直接细胞-细胞相互作用调节(Hinz和Gabbiani，2003a)。例如，对成纤维细胞施加机械应力导致SMA表达的诱导，而移除机械应力减少SMA表达(Follonier等人，2008；Hinz等人，2001；Hinz和Gabbiani，2003b；Hinz和Gabbiani，2003a)。基质的机械特征似乎调节TGFβ作用以促进迁移或收缩(Wipff等人，2007)。另外这可能形成正反馈回路，因为响应在非顺从性微观环境下的细胞收缩性，组织更刚性地增加潜在的TGFβ激活。

先前已经提出，一旦肺中损伤，分隔间质细胞与上皮的基底膜的完整性受损，因此允许成纤维细胞和上皮细胞之间的直接细胞-细胞接触。有趣地，显示这些直接接触诱导FMT并在成纤维细胞中促进存活，并且同时在上皮细胞中诱导凋亡(Horowitz和Thannickal，2006)，表明直接干扰细胞-细胞粘附可能是治疗IPF的有效治疗策略。与这种观点一致，本文呈献的数据说明细胞-细胞接触和N-钙黏着蛋白在驱动纤维变性的细胞反应中的重要作用。另外，N-钙黏着蛋白在IPF患者肺活组织检查样品中、IPF石棉临床前模型和来自IPF患者的肺成纤维细胞中上调。

IPF形成和进展的最新提出的方面是EMT从受损上皮供应额外的肌成纤维细胞源(Selman等人，2006；Selman等人，2008)。充分分化的上皮细胞发生转变成为间充质细胞。钙黏着蛋白从E-钙黏着蛋白转换成N-钙黏着蛋白为正在发生的EMT的细胞提供迁移潜能并可能调节进一步FMT、增殖和存活率。我们已经展示N-钙黏着蛋白抑制阻止II肺泡型上皮细胞系中的EMT。因此，在体内抑制N-钙黏着蛋白活性可能阻止或减少EMT，并且限制IPF肺中肌成纤维细胞积累的来源之一。

肌成纤维细胞代表全部纤维化疾病的核心。在本研究中，我们显示与正常成纤维细胞相反，N-钙黏着蛋白由肌成纤维细胞优势表达。这个观察结果与关于成纤维细胞培养物中连接形成的先前报道一致(Hinz等人，2004)。另外，我们为N-钙黏着蛋白在肌成纤维细胞中的功能提供证据。类似于正在发生EMT的上皮细胞，正在发生FMT的成纤维细胞从头表达N-钙黏着蛋白，并且这为它们提供促迁移、促增殖和促存活表型。这在本研究中得到证实，因为干扰N-钙黏着蛋白功能导致迁移、增殖和存活的下调。肌成纤维细胞的形成本身取决于N-钙黏着蛋白信号传导，因为N-钙黏着蛋白的激活诱导SMA表达和N-钙黏着蛋白的敲减抑制FMT。重要地，在我们的研究中通过使用功能阻断性抗体干扰N-钙黏着蛋白功能导致TGFβ诱导的FMT下调。这个观察结果表明，用于抑制N-钙黏着蛋白的阻断性抗体方案可能证明IPF疗法有治疗效果。

N-钙黏着蛋白还调节由活化的肌成纤维细胞所致的异常胶原蛋白分泌(IPF病变的关键特征)。总之，N-钙黏着蛋白参与促成IPF的许多肌成纤维细胞功能以及通过FMT和EMT形成肌成纤维细胞(Nieman等人，1999)。因此，阻断N-钙黏着蛋白功能的药物可能抑制受细胞-细胞连接形成驱动的成纤维细胞/肌成纤维细胞的促纤维变性的功能并导致延缓或停滞疾病进展(Hinz，2004)。N-钙黏着蛋白还与促存活信号传导途径偶联并且N-钙黏着蛋白阻断可以导致纤维变性的损伤清除和肺纤维化逆转。

N-钙黏着蛋白已经是其中它促进血管生成和肿瘤细胞迁移、增殖和存活的多种肿瘤学适应症的药物靶(Augustine等人，2008；Mariotti等人，2007)。环状肽N-钙黏着蛋白拮抗剂，Exherin或ADH-1，已经临床测试并且目前在癌症中正处于II期试验，并且一项最近研究建议N-钙黏着蛋白抗体用于诊断、评价和治疗N-钙黏着蛋白相关的癌症并且描述了这类抗体在治疗前列腺癌临床前模型中的用途(Tanaka等人，2010)。这些数据显示用抗体或低分子量分子干扰N-钙黏着蛋白功能是一种有效治疗方案。有趣地，已经显示N-钙黏着蛋白拮抗剂ADH-1，在不影响周围组织中正常血流量的情况下通过破坏恶性黑色素瘤周围的新血管系统影响肿瘤血流量。在更稳定VE-钙黏着蛋白介导的连接接任之前，这些血管的完整性由N-钙黏着蛋白介导的细胞连接维持。在IPF中，纤维变性的病灶周围的区域以与肿瘤微环境中那些畸形血管相似的畸形血管高度血管化，并且因此诱人的是猜测N-钙黏着蛋白阻断可能影响IPF肺的这些区域以及致密填充的纤维变性的病灶。

总之，我们已经探究N-钙黏着蛋白在疾病相关性成纤维细胞或来自正常人和IPF患者的组织中的表达和功能作用。我们发现N-钙黏着蛋白在纤维变性的区域内和负责IPF表型的主要细胞类型–肌成纤维细胞中上调。N-钙黏着蛋白功能损失导致抑制了与这种纤维变性的表型相关的全部过程–FMT、增殖、胶原蛋白分泌、迁移和EMT。因此，我们得出结论，在IPF患者中抑制N-钙黏着蛋白很可能提供治疗益处。

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Claims

1.一种抑制或中和N-钙黏着蛋白活性的N-钙黏着蛋白拮抗剂，用于治疗或预防纤维化。

2.根据权利要求1所述的N-钙黏着蛋白拮抗剂，其中拮抗剂是抗N-钙黏着蛋白抗体。

3.根据权利要求2所述的N-钙黏着蛋白抗体，其中纤维化是特发性肺纤维化。

4.抑制或中和N-钙黏着蛋白活性的N-钙黏着蛋白拮抗剂在制备用于治疗或预防纤维化的药物中的用途。

5.根据权利要求5所述的用途，其中拮抗剂是抗N-钙黏着蛋白抗体。

6.根据权利要求6所述的用途，其中纤维化是特发性肺纤维化。

7.一种治疗或预防纤维化的方法，包括向有需求的受试者施用抑制或中和N-钙黏着蛋白活性的N-钙黏着蛋白拮抗剂。

8.根据权利要求9所述的方法，其中拮抗剂是抗N-钙黏着蛋白抗体。

9.根据权利要求10所述的方法，其中纤维化是特发性肺纤维化

10.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体、用途或方法，其中抗体用可药用载体配制。

11.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体、用途或方法，其中将抗体与吡非尼酮或干扰素依次或同时共施用。