JP6592002B2

JP6592002B2 - 新規なｉｆｎベータタンパク質アナログ

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Publication number: JP6592002B2
Application number: JP2016560749A
Authority: JP
Inventors: パリンスキーウォルフ; ロッシマーラ; エッレ．ペッツォッティアンナ
Original assignee: アレストレーディングソシエテアノニム
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2019-10-16
Anticipated expiration: 2035-04-01
Also published as: JP2017512820A; ES2736503T3; EP3126379B1; EP3126379A2; AU2015239104B2; US11242372B2; CN106132983A; US20170145068A1; US20180362609A1; AU2015239104A1; WO2015150468A2; IL248152A0; CN106132983B; WO2015150468A3

Description

説明
発明の背景
天然のインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−ベータ）は、主にウイルス感染への応答で又は他の生物学的製剤への曝露後に、細胞によって産生される。ＩＦＮ−ベータは、抗ウイルス、抗増殖及び免疫調節活性に関与している。

インターフェロン−ベータ１ａ及びインターフェロン−ベータ１ｂといわれる、いくつかの組換えヒトインターフェロン−ベータ製剤は、再発性多発性硬化症の治療のために市販されている（ＭＲｅｖｅｌ、ＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ２００３Ｏｃｔ、１００（１）：４９−６２）。ＩＦＮ−ベータ１ａは、Ａｓｎ₈₀残基に単一のＮ−結合型糖鎖を有する１６６個のアミノ酸の糖タンパク質である。その配列は３つのシステインを含み、そのうち２つはジスルフィド結合を形成し（Ｃｙｓ₃₁及びＣｙｓ₁₄₁）、そして１つのＣｙｓ₁₇は遊離で表面の近位にあるが、埋もれている。インターフェロン−ベータ１ｂは非グリコシル化であり、Ｃｙｓ１７Ｓｅｒ変異を有する。

インターフェロン−ベータは様々な方法でその抗ウイルス機能を発揮し、１つは標的細胞から抗ウイルス活性を誘発すること（ウイルス複製の阻害）であり、そしてもう１つは感染細胞においてアポトーシスを誘導することである（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｆｅｂ２００２、１４（１）：１１１−１１６）。この直接的な作用に加えて、インターフェロン−ベータは免疫系の細胞に影響を与えるだけでなく、それは細胞表面のＭＨＣ−クラスＩ分子の発現を誘導する。次いでウイルス感染細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって排除することができる。この排除機構は、感染細胞の表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるウイルス抗原のＣＴＬ認識に基づく。

免疫腫瘍学は、患者の免疫系を変更して腫瘍を除去することに焦点を当てた、がん治療への進化的アプローチである。

宿主系によって腫瘍細胞を除去する免疫機構の１つは、ＣＴＬによる腫瘍細胞の殺傷である。この排除機構は、腫瘍細胞の表面上のＭＨＣクラスＩによって提示される腫瘍抗原のＣＴＬ認識に基づく。

ウイルス及び腫瘍は、ＭＨＣ−クラスＩ発現の下方調節（ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を含む、免疫回避機構を使用することができる。

直接的な抗ウイルス応答及び／又はＣＴＬによる感染細胞の排除機構を増大させることができる分子、並びに腫瘍細胞を殺すための直接的な抗増殖活性及び／又は宿主免疫系を変更する能力を有する分子は、新規かつより強力な抗ウイルス及びがん治療剤として作用する可能性を有する。

国際公開第２００６／０５３１３４号は、２５℃及び６０％の相対湿度で６か月間の保存によって最大４０％の脱アミド化を示す、ＩＦＮ−ベータ１ｂタンパク質を同定する。このタンパク質は増加した抗ウイルス及び抗増殖活性を有する。増加した免疫調節活性は報告されていない。

したがって、新規かつより強力な治療用ＩＦＮ−ベータアナログ、特にＩＦＮ−ベータ１ａアナログを提供する必要性が依然として存在する。

本発明の発明者らは驚くべきことに、アミノ酸位置２５にあるアスパラギンでのＩＦＮ−ベータ１ａの脱アミド化が、免疫調節の増加、例えばクラスＩＭＨＣのアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、及び増加した抗ウイルス活性をもたらすことを発見した。加えて、本発明者らは予想外に、脱アミド化によって誘導される免疫調節及び抗ウイルス活性の増加が、ＩＦＮ−ベータ１ａのシアリル化に依存するということを発見した。

また、本発明の発明者らは、ＩＦＮ−ベータ１ａのほぼ完全な脱アミド化をもたらす特定の脱アミド化条件を発見した。

したがって、本発明の脱アミド化ＩＦＮ−ベータタンパク質は高い生物学的効率で、かつ費用効率的に製造され得る。さらに、本発明の修飾されたＩＦＮ−ベータタンパク質は、単独で又は他の治療剤もしくは手段との組み合わせのいずれかで、例えば、がん免疫療法及び抗ウイルス療法、例えばワクチンの臨床的有効性を高め得る。加えて、ＩＦＮ−ベータ治療は、ＩＦＮ−ベータのより低用量の使用、及びＩＦＮ−ベータ治療に関連する副作用の減少から利益を得ることができる。

発明の概要
本発明は、少なくとも８０％が、配列番号１に記載のインターフェロン−ベータ１ａタンパク質のアミノ酸位置２５に対応するアミノ酸位置に位置するアミノ酸アスパラギンで脱アミド化される、インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−ベータ）タンパク質、好ましくはＩＦＮ−ベータ１ａを含有する組成物を提供する。

本発明はさらに、配列番号１に記載のインターフェロン−ベータ１ａタンパク質のアミノ酸位置２５に対応するアミノ酸位置にあるアミノ酸アスパラギンが脱アミド化される、修飾されたインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−ベータ）１ａタンパク質を提供する。

本発明はさらに、治療における使用のための、免疫調節剤としての使用のための、ワクチンとしての又はがん免疫療法における使用のための、当該組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質を提供する。

本発明に係る修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質は、配列番号２によって定義された配列を有する。

本発明はさらに、ウイルス感染、がん、及び神経障害からなる群から選択される症状の治療における使用のための、組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質を提供する。

本発明はさらに、タンパク質、好ましくはＩＦＮ−ベータ、より好ましくはＩＦＮ−ベータ１ａを脱アミド化する方法であって、以下、
（ａ）アルカリ性条件下で約１６から約２４時間、好ましくは２０時間、脱アミド化されるタンパク質をインキュベートし；そして
（ｂ）当該脱アミド化タンパク質を精製すること、
を含む、方法を提供する。

図１Ａ及び１Ｂは、ヒトＩＦＮ−β−１ａの一次構造（配列番号１）及び３Ｄモデル構造を示す。ＩＦＮ−β−１ａは、Ａｓｎ₈₀残基に単一のＮ−結合型糖鎖を有する１６６個のアミノ酸の糖タンパク質である。その配列は３つのシステインを含み、そのうち２つはジスルフィド結合を形成し（Ｃｙｓ₃₁及びＣｙｓ₁₄₁）、そして１つのＣｙｓ₁₇は遊離で表面の近位にあるが、埋もれている。図１Ａ及び１Ｂは、ヒトＩＦＮ−β−１ａの一次構造（配列番号１）及び３Ｄモデル構造を示す。ＩＦＮ−β−１ａは、Ａｓｎ₈₀残基に単一のＮ−結合型糖鎖を有する１６６個のアミノ酸の糖タンパク質である。その配列は３つのシステインを含み、そのうち２つはジスルフィド結合を形成し（Ｃｙｓ₃₁及びＣｙｓ₁₄₁）、そして１つのＣｙｓ₁₇は遊離で表面の近位にあるが、埋もれている。ＲＰ−ＵＰＬＣプロファイル又は人工的に分解されたＩＦＮ−ベータ１ａ。ＲＰ−ＵＰＬＣプロファイル又は人工的に分解されたＩＦＮ−ベータ１ａ。ＲＰ−ＵＰＬＣプロファイル又は人工的に分解されたＩＦＮ−ベータ１ａ。ＲＰ−ＵＰＬＣプロファイル又は人工的に分解されたＩＦＮ−ベータ１ａ。図２Ｂは図２Ａの部分的な拡大である。図２Ｂは図２Ａの部分的な拡大である。図２Ｂは図２Ａの部分的な拡大である。図２Ｂは図２Ａの部分的な拡大である。未処理のＩＦＮ−ベータ１ａの脱アミド化レベル。図３Ｂは図３Ａの部分的な拡大である。人工的に脱アミド化されたＩＦＮ−ベータ１ａの脱アミド化レベル。図４Ｂは図４Ａの部分的な拡大である。オーバーレイにおける未処理のＩＦＮ−ベータ１ａ及び人工的に脱アミド化されたＩＦＮ−ベータ１ａの脱アミド化レベル。人工的に脱シアリル化されたＩＦＮ−ベータ１ａの脱アミド化レベル。図６Ｂは図６Ａの部分的な拡大である。人工的に脱アミド化され、かつ脱シアリル化されたＩＦＮ−ベータ１ａの脱アミド化レベル。図７Ｂは図７Ａの部分的な拡大である。オーバーレイにおける、人工的に脱シアリル化されたＩＦＮ−ベータ１ａ、及び人工的に脱アミド化されかつ脱シアリル化されたＩＦＮ−ベータ１ａの脱アミド化レベル。オーバーレイにおける、人工的に脱シアリル化されたＩＦＮ−ベータ１ａ、及び人工的に脱アミド化されかつ脱シアリル化されたＩＦＮ−ベータ１ａの脱アミド化レベル。ＭＨＣクラスＩ免疫調節バイオアッセイ：用量反応曲線。ＩＦＮ−ベータ１ａの免疫調節生物活性。Ａ５４９／ＥＭＣＶ系による抗ウイルス活性：用量反応曲線。ＩＦＮ−ベータ１ａの抗ウイルス活性。

発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも８０％が、配列番号１に記載のインターフェロン−ベータ１ａタンパク質のアミノ酸位置２５に対応するアミノ酸位置に位置するアミノ酸アスパラギンで脱アミド化される、インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−ベータ）、好ましくはＩＦＮ−ベータ１ａ、タンパク質を含有する組成物を提供する（図１参照）。

さらに、本発明は、配列番号１に記載のインターフェロン−ベータ１ａタンパク質のアミノ酸位置２５に対応するアミノ酸位置にあるアミノ酸アスパラギンが脱アミド化される、修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質を提供する。

好ましくは、組成物中のＩＦＮ−ベータタンパク質、例えばＩＦＮ−ベータ１ａの、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は少なくとも９６％が、最も好ましくは９６％が脱アミド化される。

脱アミド化はタンパク質の可能な修飾経路の１つである。このタイプの修飾は、主にアスパラギン及びグルタミン残基で生じる。脱アミド化を受けるそれぞれのアスパラギンについて、以下の３つの可能な修飾生成物が形成される。
・スクシンイミド中間体（アスパラギニルタンパク質がアンモニアの分子を失った）
・アスパルチルタンパク質（アスパラギンがアスパラギン酸に変換された）
・イソアスパルチルタンパク質（アスパラギンがイソアスパラギン酸に変換された；この場合、タンパク質骨格はアミノ酸のＣＯＯＨではなく、アスパラギン酸の側鎖のＣＯＯＨに続く）。
アスパラギンの中性アミド側鎖がより酸性のアスパラギン酸のカルボキシル基に変換されているので、最後の２つの修飾生成物はタンパク質の実効電荷の変化を生じる。

いかなる理論にも拘束されることなく、Ａｓｎ２５の空間位置に関して（図１Ｂ参照）、そのＡｓｐ２５への脱アミド化は、Ａｒｇ１４７とＴｈｒ１４４との追加の水素結合を形成する可能性を有する空間的に近いＡｒｇ１４７との静電相互作用を増大させることが期待される。アスパラギン酸とアルギニンとの間の静電相互作用は、図１Ｂに示すように、カルボキシレートの２つの酸素原子及び／又はアルギニンのグアニジニウム基の２つの窒素中心に広がり得る。

本明細書に記載される組成物は、脱アミド化されるアミノ酸アスパラギンのアスパラギン残基が、アスパラギン酸残基、イソアスパラギン酸残基、又は環状イミド（ｃｙｃｌｉｃｉｍｉｄｉｄ）残基、例えばスクシンイミドによって置換される、脱アミド化ＩＦＮ−ベータタンパク質、例えばＩＦＮ−ベータ１ａを含有する。好ましくは、アスパラギン残基の約６５％から約７０％、より好ましくは約６８％が、アスパラギン酸（ａｓｐａｒａｔｅ）によって置換され、約１５％から約２０％、より好ましくは約１８％がイソアスパラギン酸（ｉｓｏａｓｐａｒａｔｅ）によって置換され、そして約８％から約１３％、好ましくは約１１％がスクシンイミドによって置換される。

同様に、本明細書に記載される修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質において、脱アミド化されるアミノ酸アスパラギンのアスパラギン残基は、アスパラギン酸残基、イソアスパラギン酸残基、又は環状イミド残基、例えばスクシンイミドによって置換される。

本明細書に記載される組成物はさらに、ＣＨＯ細胞で産生された、好ましくは配列番号１の、ＩＦＮ−ベータタンパク質と比較して、増加した免疫調節活性、好ましくは増加したクラスＩＭＨＣ複合体のアップレギュレーションを示す。特に、増加したクラスＩＭＨＣのアップレギュレーションに起因して、本明細書に記載される脱アミド化された又は修飾されたＩＮＦ−ベータタンパク質のいずれも、腫瘍又は感染細胞の細胞表面上の抗原提示を復元することによってがん免疫療法又は抗ウイルスワクチン接種に関与することができ、それは次にＣＴＬによる殺細胞活性に関して結果として増加した有効性とともに、ＣＴＬ活性のための細胞表面上の標的数の増加をもたらすであろう。この免疫調節活性は、ＩＦＮ−ベータ単独療法で、あるいは従来療法、例えば抗ウイルス又はがん（免疫）療法との組み合わせで活用されてもよい。

記載される組成物はさらに、増加した抗ウイルス活性を示す（実施例３．２参照）。

さらに、本明細書に記載される修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質又は組成物のいずれも、グリコシル化される、特にシアリル化されるＩＦＮ−ベータタンパク質を含有してもよい。グリコシル化は、アスパラギン又はアルギニン残基の窒素に結合した、Ｎ−結合型グリコシル化；セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリシンまたはヒドロキシプロリン残基のヒドロキシ酸素（ｈｙｄｒｏｘｙｏｘｇｅｎ）に結合した、Ｏ−結合型グリコシル化；セリン残基と結合したホスホセリン結合型グリコシル化、あるいは、トリプトファン残基上の炭素に結合したＣ−結合型グリコシル化であってもよい。好ましくは、グリコシル化はＮ−結合型グリコシル化である。最も好ましくは、グリコシル化は、配列番号１のアスパラギン８０に対応するアスパラギンに結合している。

さらに、本明細書に記載される修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質又は組成物のいずれも、任意の真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓細胞（２９３Ｔ）、ヒト肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２）、ヒトＴ細胞白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）、ヒトＴ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞（Ｍｏｌｔ４）、ヒトＥＢＶ不死化Ｂ細胞ライン（Ｄａｋｉｋｉ）、ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ）及びヒト線維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、好ましくはＣＨＯ細胞において産生されるＩＦＮ−ベータタンパク質のグリコシル化パターンを有するＩＦＮ−ベータタンパク質を含有してもよい。

修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のグリカン鎖は、好ましくはＣＨＯ細胞で行われる、３又は４分岐（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造であってもよい。

また、本明細書に記載される修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質又は組成物のいずれも、前記修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質に結合したグリカン鎖の末端で、好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸で、シアリル化されるＩＦＮ−ベータタンパク質を含有してもよい。シアル酸のアミノ基の修飾（例えばアセチル基又はグリコリル基による）及びグリカン分岐（ａｎｔｅｎｎａｅ）当たりのシアル酸の量（例えばトリ又はテトラシアリル化）は、組織特異的であるため、グリカン鎖のシアリル化は好ましくはＣＨＯによって行われるシアリル化である。特に好ましい実施形態では、全てのグリカン側鎖は、例えばＣＨＯ細胞によって行われるように、シアリル化される。

本発明の組成物は、活性剤として、ＩＦＮ−ベータタンパク質を単独で、あるいは、ＩＦＮ−ベータタンパク質を本明細書に記載される他の治療剤との組み合わせで、任意に本明細書に記載される薬学的に許容される担体、アジュバント又は添加剤とともに、例えば本明細書に記載されるさらなる担体、アジュバント又は添加剤を任意に含む水溶液として、含有してもよい。

同様に、本明細書に記載される修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質は、単独で、あるいは本明細書に記載される他の治療剤又は薬学的に許容される担体の両方との組み合わせで、使用されてもよい。

本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント又は添加剤を含有してもよい。そのような担体、アジュバント又は添加剤は当該技術分野において知られており、体内での適用の指標及び局在に依存する。それらの選択はまた、治療剤の放出速度、例えば即時放出又は遅延を考慮してもよい。本明細書に記載される組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれも、好ましくは全身投与用である。当該組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質は、経口的、局所的、例えば皮膚に、又は非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）、好ましくは点滴の注射を介して、投与されてもよい。

非経口投与のための担体、アジュバント又は添加剤は、滅菌水（ａｑｕａｓｔｅｒｉｌｉｓａｔａ）、ｐＨに影響を与える試薬、例えば有機酸及び無機酸（ａｎｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓ）ならびにそれらの塩、ｐＨを調整するための緩衝剤、等張剤、例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース、フルクトース、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、及び乳化剤（ｅｍｕｌｇａｔｏｒｓ）、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、油、例えば落花生油、大豆油、ヒマシ油、合成脂肪酸エステル、高分子担体、錯化剤、保存剤、及び安定剤である。

本明細書に記載される組成物は、抗酸化剤、例えば亜硫酸（ｓｕｌｆｉｔ）ナトリウム又はメチオニン、好ましくはメチオニンをさらに含有してもよい。

同様に、本明細書に記載される修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質は、本明細書に記載される抗酸化剤との組み合わせであってもよい。

本発明のさらなる実施形態では、本明細書に記載される組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれも、免疫調節剤としての、ワクチンとしての、又はがん免疫療法における治療における使用のためである。

本明細書に記載される組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれも、単独、あるいは他の治療剤、例えば抗ウイルス剤、例えばリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ワクチン、免疫調節剤、例えば腫瘍免疫療法薬、サイトカイン、インターロイキン又はケモカイン（Ｌ−ＢＬＰ−２５又は他の腫瘍関連抗原）との組み合わせのいずれかであってもよい。

免疫調節療法は、免疫応答を誘発し又は増幅するように設計されてもよい。あるいは、免疫調節療法は、免疫応答を減少させ又は抑制してもよい。本発明の好ましい実施形態では、免疫調節療法は免疫応答を誘発し又は増幅する。免疫調節剤として本明細書に記載される発明の組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれも、単独で、あるいは本明細書に記載される他の免疫調節剤との組み合わせで使用されてもよい。

本明細書に記載されるワクチンは、予防、治療ワクチン又はがんワクチンであってもよい。当該ワクチンは、ワクチンの注射、ナノパッチ又は経口送達のための薬学的に許容される担体をさらに含有してもよい。そのような担体は当業者に知られており、アジュバント、例えばアルブミン、保存剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ホルムアルデヒド又はチメロサール、抗生物質及び／又は安定剤、例えばＭＳＧ又は２フェノキシエタノールを含有してもよい。

本明細書に記載される組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれも、対象におけるウイルス感染、がん、及び神経障害からなる群から選択される症状の治療に使用されてもよい。

本明細書に記載される組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれも、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザ、デング熱などによって引き起こされるウイルス感染の治療に使用されてもよい。特にＨＣＶは、Ｃ型肝炎又は慢性肝疾患、例えば肝硬変、肝不全、及び肝細胞癌を引き起こす可能性があり、それらも本明細書に記載される発明の組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質の両方によって治療される。

本明細書に記載される組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質の両方によって治療され得るがんは、乳癌、肺癌、例えば非小細胞肺癌、肝癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、胆道癌、膵臓癌などからなる群から選択されてもよい。

本明細書に記載される組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれもまた、神経障害、例えば神経外傷の治療ために使用されてもよい。例えば、それらは神経再生、例えば視神経の再生のために使用されてもよく、例えばここで、前記治療はシナプス可塑性の調節又は軸索の増強を含む。

本明細書に記載される組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれもまた、神経障害、例えば多発性硬化症の治療のために使用されてもよい。

本明細書に記載される好ましい対象は、ＨＣＶ感染透析患者であってもよい。

本明細書に記載される治療は、免疫調節、好ましくは本明細書に記載されるクラスＩＭＨＣ複合体のアップレギュレーションを含んでもよい。

本明細書に記載される組成物及び修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれもさらに、本明細書に記載される、化学免疫療法、化学療法、放射線療法、ワクチン、及び／又は、さらなる治療剤、例えば抗ウイルス剤、例えばリバビリン、サイトカイン、例えばＩＬ−２又はＩＦＮ−アルファ、又は化学療法抗体、例えばリツキシマブとの組み合わせで、使用されてもよい。

例えば、本明細書に記載される発明の組成物又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれも、化学免疫療法との組み合わせで使用されてもよく、そのような免疫療法は腫瘍関連抗原に基づいており、例えばＬ−ＢＬＰ２５との組み合わせで使用されてもよい。

本明細書に記載される発明の又は修飾されたＩＦＮ−ベータ１ａタンパク質のいずれも、本明細書に記載される、化学療法及び／又は放射線療法との組み合わせで使用されてもよい。特に、当該修飾されたタンパク質又は組成物は、メトロノミック化学療法中にＴ細胞の細胞毒性を介して抗腫瘍免疫応答を増強するため、ならびに、組み合わされた化学（又は放射線）療法の有効性を高めるために使用されてもよい。

本発明はさらに、タンパク質を脱アミド化する方法であって、以下、
（ａ）アルカリ性条件下で約１６から約２４時間、好ましくは２０時間、脱アミド化されるタンパク質をインキュベートし；そして
（ｂ）当該脱アミド化タンパク質を精製すること、
を含む、方法を提供する。

好ましくは、当該脱アミド化されるタンパク質はＩＦＮ−ベータ、特にＩＦＮ−ベータ１ａである。

本明細書に記載されるインキュベーションは、約８．９から約９．５のｐＨで、好ましくは約ｐＨ９．２で行われてもよい。

また、本明細書に記載されるインキュベーションは、脱アミド化のための任意の好適な緩衝液中で行われてもよい。そのような緩衝液は当業者に知られている。好ましくは、当該インキュベーションは炭酸水素アンモニウム中で、より好ましくは０．２Ｍの最終濃度で行われる。

さらに、本明細書に記載されるインキュベーションはさらに、約２０℃から約２５℃、例えば約２１℃から約２４℃の温度で、好ましくは約２３℃である。

本明細書に記載される精製は、当該技術分野で知られている任意の精製方法を含んでもよい。好ましくは、当該精製は限外濾過、より好ましくは酢酸アンモニウムｐＨ３．８での限外濾過を含む。

１．脱アミド化ＩＦＮ−ベータの調製
異なるＩＦＮ−β−１ａの分解形態を、ＩＦＮ−β−１ａＤＳ（薬物（ｄｒｕｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ））材料の、化学的（脱アミド化のための塩基性ｐＨ）及び酵素的（脱シアリル化のためのシアリダーゼ）処理によって調製した。

実験計画は、ＩＦＮ−β−１ａの免疫調節及び抗ウイルス活性に対する脱アミド化の影響を評価することを目的として、未処理の及び人工的に脱アミド化されたＩＦＮ−β−１ａの物理化学的及び生物学的特性評価を予見した。また当該計画は、もしあれば、それらの特定の生物学的活性を調節することにおけるシアリル化の役割を評価するために、シアル酸の除去後の未処理の及び脱アミド化された試料の試験も含んだ。

人工的に分解された試料を以下に記載のとおり調製した。
−ＩＦＮ−ベータ−１ａＤＳを１．２Ｍの重炭酸アンモニウムｐＨ９．２中に２３℃で２０時間インキュベートすることによって、脱アミド化を行った。インキュベーションに先立って、最終重炭酸アンモニウム濃度は約０．２Ｍであり、そしてＩＦＮ−ベータ−１ａ濃度は約０．３ｍｇ／ｍＬである。アルカリ性条件はアスパラギンのアスパラギン酸への変換を誘導するために一般的に使用され、効率的かつ一貫してＩＦＮ−β−１ａを脱アミド化することがこれまでに証明されている。
−当該タンパク質を、グリコ（Ｇｌｙｋｏ）（番号ＧＫ８００４０）からのシアリダーゼを用いて、ｐＨ６．０、３７℃で１時間インキュベートすることによって、脱シアリル化を行った。この酵素は、グリカン構造に結合したシアル酸を特異的に遊離させることができる。この処理を天然の、ならびに人工的に脱アミド化されたＩＦＮ−β−１ａに適用した。

各処理の後、未処理のＤＳに相当するマトリックスを有するように、それらの緩衝液を５０ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ３．８（ＩＦＮ−ベータ−１ａＤＳ緩衝液）と交換するために、試料を限外濾過した。その後、各ＩＦＮ−β−１ａ分解試料を、処理の成功、特異的分解の程度、及びその生物活性に対する影響を確認するために試験した。

２．物理化学的特性評価の結果
２．１ＲＰ−ＵＰＬＣによるアッセイの結果
図２において、全ての調製された試料についてのＵＶプロファイル及びタンパク質濃度に関して得られた結果を要約する。図２における全てのプロファイルはＩＦＮ−β−１ａの鋭いピークを示し、未処理のＩＦＮ−β−１ａについて、ならびに全ての人工的に分解された試料についての最適なクロマトグラフ性能を実証する。

上記の報告されたデータは、本試験の中で参照含量として用いられた。

未処理のＩＦＮ−ベータ１ａに対応する試料は、未処理のＩＦＮ−ベータ１ａに期待される値に調整されたタンパク質含量を示す（〜３００μｇ／ｍｌ）。人工的に脱アミド化されたＩＦＮ−ベータ１ａ、及び人工的に脱アミド化されかつ脱シアリル化されたＩＦＮ−ベータ１ａの両方で検出されたタンパク質含量は、アミコンウルトラ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ）での試料の限外濾過及び濃縮のため、未処理のＩＦＮ−ベータ１ａよりも高い。

全ての試料は、計画された全ての特性評価試験を実施するのに適したＩＦＮ−β−１ａ濃度及び量を示した。

２．２ペプチドマッピング／ＵＰＬＣによる脱アミド化レベルの結果
図３から８に示されるように、脱アミド化された種類に関連したピーク存在量の明らかな変化がある。この観察結果を以下の表で確認し、定量化した。

上記の表で報告されたように、適用された脱アミド化処理は９７％に近いレベルでほぼ完全なＩＦＮ−β−１ａの脱アミド化を確実にすることが明らかに実証された。加えて、脱シアリル化処理は、未処理の試料に対して脱アミド化レベルを変化させない。

３．生物学的特性評価の結果
ＭＨＣクラスＩ発現ならびに抗ウイルス活性と比較した結果を本節で報告する。

３．１免疫調節バイオアッセイによるＭＨＣクラスＩ発現
免疫調節アッセイは、用量関連的にＡ５４９細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現をアップレギュレートするＩＦＮ−β−１ａの能力に基づく。ＭＨＣクラスＩの発現を、特異的な蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーによって検出する。

簡潔には、Ａ５４９細胞（３２．０００細胞／ウェル）を０．０００３８１ｎｇ／ｍＬから１６００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の１２の異なる濃度のＩＦＮ−β−１ａと、３７℃、５％ＣＯ₂で４８時間インキュベートした。ＭＨＣクラスＩの基礎発現レベルを評価するために、未処理の細胞も同様に行った。その後、細胞を回収し、ＭＨＣクラスＩの発現を、ＦＩＴＣ結合抗ｈＭＨＣクラスＩ抗体を用いてＦＡＣＳ解析によって評価した。ＦＡＣＳ解析を内部手順に従って行った。

参照及び試料の用量反応曲線は４ＰＬアルゴリズムによってフィットされ、最大可能発現の５０％をもたらすことができる濃度（ＥＣ₅₀）が自動的に計算される。

結果を、ＥＣ₅₀値に基づいて参照材料に対する活性パーセントとして表す。各試料について、結果は異なる３週にわたって行われた３つの独立したアッセイの平均であり、その各々は２つの独立した実施によって構成される（合計で６つの分析実施）。

生物活性を計算する前に、図９に示すように全ての試料の生物学的挙動を調べた。

全ての試料の用量反応曲線は、さらなる評価に必要な曲線の相似性を示すような、同程度の上下の平坦部及び傾きを有した。効力値を、違いをより良く理解するためのグラフ表示とともに図１０に報告する。

上記の図１０に報告されたデータは、未処理のＩＦＮ−β−１ａ及び脱シアリル化されたＩＦＮ−β−１ａと比較して、ＩＦＮ−β−１ａの脱アミド化された試料によってもたらされた、ＭＨＣクラスＩ発現のアップレギュレーションを示す。得られたデータから結論付けると、脱アミド化プロセスは、明らかにされたその生物学的エンドポイントの発現をアップレギュレートするように獲得された、２倍の能力を有するＩＦＮ−β−１ａをもたらす。この結果は、脱アミド化されたＩＦＮ−β−１ａ対未処理のＩＦＮ−β−１ａ、ならびに、脱アミド化され／脱シアリル化されたＩＦＮ−β−１ａ対脱シアリル化されたＩＦＮ−β−１ａを比較すると明らかである。生物活性の脱アミド化依存性の増加はＩＦＮ−ベータ１ａのシアリル化に依存することがわかる。

３．２Ａ５４９／ＥＭＣＶ系による抗ウイルス活性
ＩＦＮ−ベータ−１ａの抗ウイルス活性を、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の細胞変性作用に対する、Ａ５４９細胞の、ＩＦＮ−ベータ−１ａによって発揮される保護を測定することで評価した。この方法の簡単な説明を以下に示す。

ＩＦＮ−ベータ−１ａを０．０１６ｎｇ／ｍＬから２ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲で含む９６ウェルのマイクロタイタープレートに、Ａ５４９細胞を播種し（４０．０００細胞／ウェル）、その後、３７℃、５％ＣＯ₂で２０時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、ＥＭＣＶ懸濁液を各ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ₂でのインキュベーションの約２４時間後に、ＡＴＰＬｉｔｅ１Ｓｔｅｐを添加し、そのｃｐｓをルミノメーターマイクロプレートリーダーによって各ウェルで測定して、細胞の増殖及び活性を評価した。

結果を、ＥＣ₅₀値に基づいて参照材料に対する活性パーセントとして表す。各試料について、結果は異なる３日にわたって行われた３つの独立したアッセイの平均である。

生物活性を計算する前に、図１１に示すように全ての試料の生物学的挙動を調べた。

試験されたそれぞれのＩＦＮ−β−１ａ試料の生物活性を測定する効力値を、ＥＣ₅₀ ＲＨＳＩＦＮ−β−１ａと各試験試料のＥＣ₅₀とのパーセントの比率（％推定相対効力）として、集められたＥＣ₅₀に基づいて評価した。当該実験を複数のｎ＝２回で独立して行い、ＣＶ％（変動係数）を計算した。結果を図１２に示す。

図１２に記載されたデータは、未処理のＩＦＮ−β−１ａと比較して、ＩＦＮ−β−１ａの脱アミド化された試料によってもたらされたＡ５４９細胞におけるより高い抗ウイルス活性を示す。

得られたデータから出発して、脱アミド化プロセスは、明らかにされた生物学的応答を増加させるように獲得されたより高い能力を有するＩＦＮ−β−１ａをもたらす。これに反して、この脱アミド化された特徴は、脱シアリル化されたＩＦＮ−β−１ａと比較した場合、ＩＦＮ−β−１ａの脱アミド化され／脱シアリル化された試料には見られず、この場合における脱アミド化プロセスは、生物活性に対する脱シアリル化プロセスの影響を救うことができない。

Claims

タンパク質を脱アミド化する方法であって、以下、
（ａ）アルカリ性条件下で１６から２４時間、脱アミド化されるタンパク質をインキュベートし；そして
（ｂ）当該脱アミド化タンパク質を精製すること、
を含み、
ここで、前記タンパク質がＩＦＮ−ベータであり、かつ
前記インキュベーションが、２０℃から２５℃の温度で行われる、方法。
前記ＩＦＮ−ベータが、ＩＦＮ−ベータ１ａである、請求項１に記載の方法。
前記インキュベーションが、８．９から９．５のｐＨで行われる、請求項１又は２に記載の方法。
前記精製が限外濾過を含む、請求項３に記載の方法。