CN114624438A - 一种用于肝素结合蛋白定量检测的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于肝素结合蛋白定量检测的试剂盒及其制备方法。本试剂盒优化量子点标记技术与试剂盒组成结构，实现了肝素结合蛋白检测的易操作、高灵敏度、宽检测范围、强稳定性。

Description

一种用于肝素结合蛋白定量检测的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，尤其涉及一种用于肝素结合蛋白定量检测的试剂盒及其制备方法。
背景技术
肝素结合蛋白又称为37kDa抗微生物阳离子蛋白，是由中性粒细胞合成的37kDa的糖蛋白。HBP属于丝氨酸蛋白酶大家族的成员，尽管它有45％的序列与人中性白细胞弹性蛋白酶相一致，但它没有蛋白酶活性。最初研究HBP是为了其抗微生物活性，但研究发现，HBP与很多炎症反应相关。活化的中性粒细胞接触内皮后，从分泌小泡中释放HBP，HBP一旦释放，诱导钙依赖的内皮细胞骨架的重排，从而使细胞收缩，并增加内皮细胞的渗透性。它也能使内皮细胞内化以防止细胞调亡。当细胞表面释放M蛋白，此时M蛋白与纤维蛋白原结合形成复合物，并与嗜中性粒细胞表面的i2整联蛋白接触，由分泌小泡分泌HBP。在感染灶处，发生吞噬作用时，嗜苯胺蓝颗粒分泌HBP，具有抗微生物生长活性，激活单核细胞和其他炎性介质；HBP也可以使单核细胞内化，维持生存和刺激生成更多的细胞因子。HBP有助于炎症反应的维持和发展，检测HBP有助于鉴别伴有循环系统衰竭的脓毒症的危险性。目前医护人员使用的肝素结合蛋白的检测试剂盒操作复杂，耗时较长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肝素结合蛋白定量检测的试剂盒及其制备方法，旨在解决现有技术中的医护人员的使用感不佳的技术问题。
为实现上述目的，本发明采用的一种用于肝素结合蛋白定量检测试剂盒，所述用于肝素结合蛋白定量检测试剂盒包括检测试剂卡、存贮与运输装置和操作台。
其中，所述检测试剂卡由检测试纸条和卡套组成，检测试纸条由PVC底板、吸水纸、硝酸纤维素膜、量子点释放垫、样品处理垫组成，且各组分层层叠压粘在PVC衬板上，硝酸纤维素膜上包被有检测线与质控线；量子点释放垫包被有连接荧光物质的抗体混合液。
其中，所述存贮与运输装置由干燥袋和包装盒组成，干燥袋由铝箔材质的袋子加上干燥剂组成；包装盒由与干燥袋尺寸相适宜的纸质较硬纸盒做成。
其中，所述操作台全部由较硬的纸板做成，表面附着若干试管放置孔，在未使用之前，该操作台处于待折叠状态可以不占用较多空间的放于包装盒内，当医护人员使用肝素结合蛋白检测试剂盒时可以将其取出迅速折叠盛放试管与采血管。
其中，检测试剂卡的制备步骤包括制备量子点标记的肝素结合蛋白单克隆抗体；检测线与质控线抗体溶液制备；标记抗体溶液制备；在硝酸纤维素膜上包被检测线、质控线抗体，在释放垫上包被量子点标记抗体；组装试纸条；组装试剂卡。
其中，采用QD-COOH-SA-HBP-Ab的连接方式，增强可测信号，提高试剂卡的灵敏度与稳定性；步骤包括：活化QD-COOH；偶联SA；封闭；连接HBP-Ab。
本发明还提供了试剂卡的制备方法：
根据肝素结合蛋白的分子量为37kDa，属于大分子蛋白。故采用双抗体夹心法来检测该物质。根据检测方法学选择了2株肝素结合蛋白的单克隆抗体，1株用于作为包被抗体，1株与量子点制成量子点标记的肝素结合蛋白单克隆抗体。通过实验探索得到了最佳制备方式，稀释比例以及稀释液配方。
本发明的有益效果体现在：通过该方法制备的检测试剂卡灵敏度更高，可检测范围更广，稳定性更好。使医护人员的操作更加简便可以轻易上手减少过多的培训与学习时间，检测时间更短，让医生可快速接受到检测结果完成诊断，产生废弃物更少，方便处理，提高医护人员的使用感。
附图说明
为了更清楚地说明本发明中的技术方案，下面将对发明描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明的试剂卡的结构示意图。
图2是本发明的试纸条的结构示意图。
图3是本发明的可拆卸的便于检测的简易操作台示意图。
图4是本发明的可拆卸的便于检测的简易操作台结构示意图。
图5是本发明的用于存贮与运输肝素结合蛋白定量检测试剂盒的示意图。
1-检测试剂卡、2-加样孔、3-检测线、4-质控线、5-视野观察窗、6-手持区、7-PVC底板、8-吸水纸、9-硝酸纤维素膜、10-量子点释放垫、11-样品处理垫、12-操作台、13-试管、14-试管放置孔、15-存贮与运输装置。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1右图所示，本发明肝素结合蛋白检测试纸卡由卡套与试纸条的组成，试纸条包括PVC底板7、吸水纸8、硝酸纤维素膜9、量子点释放垫10、样品处理垫11。肝素结合蛋白检测试剂卡的制备步骤为：
步骤1：制备带有标记物的肝素结合蛋白单克隆抗体。如采用量子点作为标记物。需要的主要原材料为：表面富含羧基官能团的量子点纳米球(QD-COOH)，粒径40±10nm，激发波长365nm，发射波长610±10nm；链霉亲和素(SA)，大小为66KDa；肝素结合蛋白鼠或兔单克隆抗体。制备流程为：(1)活化表面富含羧基官能团的量子点纳米球(QD-COOH)，采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)作为活化剂，使用比例为浓度为1uM的QD-COOH每mL加入浓度为10mM的EDC10μl，活化时间为20min。(2)活化后的表面富含羧基官能团的量子点纳米球(QD-COOH)与链霉亲和素(SA)共价偶联，每mL活化的QD-COOH溶液中加入25μL浓度为4.6mg/mL的SA溶液，偶联时间为1-2h。(3)封闭，封闭剂采用牛血清白蛋白(BSA)，浓度为10％。(4)链接肝素结合蛋白鼠/兔单克隆抗体，每mLQD-COOH-SA溶液添加200μL的浓度为2mg/mL的肝素结合蛋白鼠/兔单克隆抗体，时间为1-3h。
步骤2：检测线3与质控线4抗体溶液制备。需要的主要原材料为：检测线原料肝素结合蛋白鼠/兔单克隆抗体，浓度＞1mg/mL；质控线原料羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔IgG抗体，浓度>1mg/mL；包被抗体稀释液。其中包被抗体稀释液配方为：100mMTris+2％甘露糖+0.2％Tween20+2％蔗糖，pH＝8.0，采用此种配方将抗体1:10稀释作为包被溶液。
步骤3：标记抗体溶液制备。需要的主要原材料为：量子点标记的肝素结合蛋白单克隆抗体，标记抗体稀释液。其中标记抗体稀释液配方为：100mMTris+1％酪蛋白+0.5％Tween20+150mM NaCl，pH＝8.0，采用此种配方将抗体1:10稀释作为标记溶液。
步骤4：在硝酸纤维素膜上包被检测线、质控线抗体，在量子点释放垫10上包被量子点标记抗体。将步骤2和步骤3制得的包被溶液与标记溶液使用划膜喷金仪均匀的喷制在硝酸纤维素膜9与量子点释放垫10上，量子点释放垫10材质要求为玻璃纤维垫，在35-65℃的温度下干燥2h-4h。
步骤5：将各组分按照图1右图的方式组装完成并保证各个组分之间相互层压2-3mm，其中样品处理垫11的选择材质为玻璃纤维垫与棉纤维垫，吸水纸厚度为0.5-1mm。
步骤6：试纸条制备完成后通过手持区6将其装入特制卡套中成为检测试剂卡，要求硝酸纤维素膜9上的检测线3与质控线4在视野观察窗5的1/3与2/3处；样品处理垫11下端1/4位置在加样孔2中心处。
本发明步骤1使用的标记物不仅局限于量子点，还包括本领域常见的其他标记物：胶体金，微球，纳米磁性颗粒，碳纳米管，有机类荧光材料，上转磷光材料，镧系元素荧光螯合物。常用胶体金标记物制备“胶体金标记的肝素结合蛋白单克隆抗体”的方法如下：
制备胶体金标记的肝素结合蛋白单克隆抗体。需要主要原材料为：粒子大小为直径40nm的胶体金，颜色呈现樱桃红色；肝素结合蛋白鼠或兔单克隆抗体。制备流程：(1)调节标记溶液的PH，每mL胶体金溶液添加浓度为0.1mol的K2CO3溶液20μL-40μL，混合均匀。(2)加入待标记的肝素结合蛋白鼠或兔单克隆抗体，添加浓度在5ug/mL-20ug/mL，混合均匀。(3)封闭，封闭剂采用牛血清白蛋白(BSA)或者酪蛋白，浓度为10％，时间为30min-2h。(4)离心，设置离心机转速13000r，温度4℃，离心20min；去除上清液再添加等量洗液，再次离心10min。(5)收集，去除上清液留下樱桃红色的金溶液，收集的沉淀液小于离心前溶液的1/50，将收集的沉淀物添加稀释液到沉淀物的3-5倍，混匀后完成标记，得到胶体金标记的肝素结合蛋白单克隆抗体。
如图3所示可拆卸的便于检测的简易操作台12，取一硬纸板按图3所示的展开结构示意图进行切割，按照线条进行折叠可以完成如图3的简易操作台，用于医护人员盛放试管13与采血管，所述可拆卸的便于检测的简易操作台12全部由较硬的纸板做成，表面附着若干试管放置孔14。在未使用之前，该操作台12处于待折叠状态可以不占用较多空间的放于包装盒内，当医护人员使用肝素结合蛋白检测试剂盒时可以将其取出迅速折叠盛放试管与采血管。
如图4所示，包装后的检测试剂卡1与便于检测的简易操作台按照如图4所示的进行包装在存贮与运输装置15中，达到便于存储与运输的效果，其中，所述存贮与运输装置15由干燥袋和包装盒组成。干燥袋由铝箔材质的袋子加上干燥剂组成，在将试剂卡装入袋子后密闭可以达到最佳的保存与保护环境。包装盒由与干燥袋尺寸相适宜的纸质较硬纸盒做成，保证可以无较大缝隙的包装若干试剂卡，达到进一步保护试剂卡以及方便存贮与运输的效果。
本发明还提供了试剂卡的制备方法：
根据肝素结合蛋白的分子量为37kDa，属于大分子蛋白。故采用双抗体夹心法来检测该物质。根据检测方法学选择了2株肝素结合蛋白的单克隆抗体，1株用于作为包被抗体，1株与量子点制成量子点标记的肝素结合蛋白单克隆抗体。通过实验探索得到了最佳制备方式，稀释比例以及稀释液配方。

Claims (6)

1.一种用于肝素结合蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，
所述用于肝素结合蛋白定量检测试剂盒包括检测试剂卡、存贮与运输装置和操作台，所述检测试剂卡与所述操作台可拆卸连接，所述存贮与运输装置与所述操作台可拆卸连接。
2.如权利要求1所述的用于肝素结合蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，
所述检测试剂卡由检测试纸条和卡套组成，检测试纸条由PVC底板、吸水纸、硝酸纤维素膜、释放垫、样品处理垫组成，且各组分层层叠压粘在PVC衬板上，硝酸纤维素膜上包被有检测线与质控线；释放垫包被有连接标记物质的抗体混合液。
3.如权利要求1所述的用于肝素结合蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，
所述存贮与运输装置由干燥袋和包装盒组成，干燥袋由铝箔材质的袋子加上干燥剂组成；包装盒由与干燥袋尺寸相适宜的纸质较硬纸盒做成。
4.如权利要求1所述的用于肝素结合蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，
所述操作台全部由较硬的纸板做成，表面附着若干试管放置孔，在未使用之前，该操作台处于待折叠状态可以不占用较多空间的放于包装盒内，当医护人员使用肝素结合蛋白检测试剂盒时可以将其取出迅速折叠盛放试管与采血管。
5.如权利要求2所述的用于肝素结合蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，
所述检测试剂卡的制备步骤包括制备量子点标记的肝素结合蛋白单克隆抗体；检测线与质控线抗体溶液制备；标记抗体溶液制备；在硝酸纤维素膜上包被检测线、质控线抗体，在释放垫上包被量子点标记抗体；组装试纸条；组装试剂卡。
6.如权利要求5所述的制备量子点标记的肝素结合蛋白单克隆抗体，其特征在于，采用QD-COOH-SA-HBP-Ab的连接方式，增强可测信号，提高试剂卡的灵敏度与稳定性；步骤包括：活化QD-COOH；偶联SA；封闭；连接HBP-Ab。
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