CN111007270A - 和肽素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，属于试剂盒技术领域。该试剂盒包括：链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒R1；化学发光标记物标记的和肽素抗体R2；偶联和肽素衍生物R3。本发明还提供一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。本发明的试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，减少人为操作误差，并且实现无人值守，完成对和肽素的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时间。

Description

和肽素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，涉及一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
心力衰竭是各种心脏结构或功能性疾病所导致心脏充盈或射血能力受损引起的临床综合征，是各种心脏疾病的终末期表现，致死率仅次于肿瘤。和肽素 (Copeptin)于1972年由Holwerda首次发现，其由39个氨基端残基组成，分子量约为5KDa。和肽素、神经垂体素运载蛋白II(Neurophysin II)及精氨酸加压素(AVP)共同组成加压素原。和肽素位于加压素原的氨基末端，与AVP由神经垂体等摩尔释放于血液中。AVP水平在急性冠脉综合征和心衰患者血液中升高，可以反映疾病的严重程度及预后评估。但AVP在体外测定比较困难，因此和肽素就称为AVP的良好替代物。
和肽素作为一种内源应激标记物，参与机体的应激反应，在急性冠脉综合征发生的最初就有显著升高，因此有望成为急性心肌梗死的诊断与排除的标志物之一；同时，和肽素可作为心力衰竭的标志物，在体内表达水平与患者心衰的程度密切相关，对指导诊疗和评估预后有重要作用。
目前测定和肽素的方法有放射免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA) 法。两种方法在实际应用过程中都存在一定的弊端：RIA的放射性核素污染、标记物的货价期短、操作复杂、测试结果不稳定；ELISA法灵敏度不高，操作复杂，检测时间长，自动化程度低化学发光免疫分析法具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其检测时间短，并且可以对衍生物、抗体类目标物质进行检测。
和肽素化学发光免疫测试剂盒相比传统的检测方法，衍生物、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，反应更加迅速灵敏；另一方面，和肽素化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。
发明内容
本发明的目的是提供一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒的检测精度较高。
本发明首先提供一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：
链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒R1；化学发光标记物标记的和肽素抗体R2；偶联和肽素衍生物R3。
优选的是，所述的链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒的粒径是3～6μm。
优选的是，所述化学发光标记物标记的抗体中，和肽素抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～10，缓冲液为100～500mM BISTRIS丙烷， 0.05％～0.1％PC300及0.05％～0.1％吐温-20,抗体终浓度为0.1～2μg/mL。
优选的是，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。
优选的是，所述偶联标记的和肽素衍生物中，和肽素衍生物与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5～10，缓冲液为缓冲液为100～500mM BISTRIS丙烷， 0.05％～0.1％PC300及0.05％～0.1％吐温-20，抗体终浓度为0.2～3μg/mL。
优选的是，所述偶联标记物为生物素或生物素衍生物。
优选的是，所述的试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；
其中所述化学发光底物液A为硝酸和过氧化氢溶液，B为氢氧化钠溶液。
优选的是，所述的试剂盒还包括和肽素校准品；
优选的是，所述和肽素校准品的浓度分别为0pg/mL、10pg/mL、40pg/mL、 200pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL和5000pg/mL的和肽素蛋白溶液。
本发明还提供一种上述的和肽素的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂R1；
步骤二：将和肽素抗体放入离心管中离心，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，将封闭好的抗体经过纯化、收集，然后放入缓冲液中稀释，保存，得到R2试剂；
步骤三：取和肽素衍生物，将TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的偶联标记物，2～8℃反应2-3h，再转入室温继续反应30-60min，最后加入赖氨酸反应 30-60min，将纯化后的和肽素衍生物浓溶液用缓冲液稀释，得到R3试剂。
本发明的有益效果
本发明是提供一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒选择吖啶酯为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。同时采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的衍生物可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。这种化学发光免疫分析试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，减少人为操作误差，并且实现无人值守，完成对和肽素的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时间。
附图说明
图1为本发明和肽素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的制备流程设计图；
图2为实施例4得到的和肽素标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的优点、目的和方法更加详实易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了诸多细节以便于理解，但本发明可以以不同与描述的其他方式来实施。
本发明首先提供一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：
链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒R1；化学发光标记物标记的和肽素抗体R2；偶联和肽素衍生物R3。
按照本发明，所述的链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒的质量比优选 0.01％～1％，更优选为0.072％；所述的链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒的粒径优选3～6μm，更优选为6μm。
按照本发明，所述化学发光标记物标记的抗体中，和肽素抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～10，缓冲液为100～500mM BISTRIS丙烷， 0.05％～0.1％PC300及0.05％～0.1％吐温-20,抗体终浓度为0.1～2μg/mL。所述化学发光标记物优选为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌，更优选为吖啶酯结构为式1：
Figure BDA0002290818850000041
按照本发明，所述偶联标记的和肽素衍生物中，和肽素衍生物与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5～10，缓冲液为缓冲液为100～500mM BISTRIS丙烷， 0.05％～0.1％PC300及0.05％～0.1％吐温-20，终浓度为0.2～3μg/mL。所述偶联标记物优选为生物素或生物素衍生物。更优选的为生物素，结构为式2：
Figure 1
按照本发明，所述的试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；其中所述化学发光底物液A为硝酸和过氧化氢溶液，B为氢氧化钠溶液。
按照本发明，所述的试剂盒还包括和肽素校准品；其中所述和肽素校准品的浓度分别为0pg/mL、10pg/mL、40pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL 和5000pg/mL的和肽素蛋白溶液。
本发明还提供一种上述的和肽素的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，制备流程如图1所示，包括如下步骤：
步骤一：将链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，所述的混匀时间优选为10-15min，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂R1；所述的链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒溶液的浓度优选为100mg/ml；链霉亲和素带有Tosyl 官能团的磁颗粒溶液和TBST溶液的体积比优选为0.5：10；缓冲液为50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液；所述的固相试剂中链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒浓度优选为0.01-0.1％；
步骤二：将和肽素抗体放入离心管中离心，优选在室温下离心10s～50s，保证抗体位于离心管底部位置，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，所述的离心温度优选为室温，离心时间优选为0.5min～3min；将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中混匀，所述的混匀时间优选为2-5h，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，所述的封闭时间优选为1-3h，将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化、用 BISTRIS缓冲液洗脱，收集，然后用100～500mM BISTRIS丙烷， 0.05％～0.1％PC300及0.05％～0.1％吐温-20,的缓冲液稀释至终浓度为 20-40μg/mL，2℃～8℃保存，得到R2试剂；
所述的和肽素抗体的质量(μg)：化学发光标记物溶液的体积(μl)优选为 (250-1000)：(0.375-1.5)；所述的化学发光标记物溶液的浓度优选为2mg/mL；所述的封闭液优选为赖氨酸，质量分数优选为20％；
步骤三：取和肽素衍生物，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的偶联标记物，2～8℃反应2-3h，再转入室温继续反应30-60min，最后加入赖氨酸反应30-60min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％NaN3或0.1％ ProClin300；将纯化后的和肽素衍生物浓溶液用100～500mM BISTRIS丙烷， 0.05％～0.1％PC300及0.05％～0.1％吐温-20的缓冲液稀释至终浓度为 20-40μg/mL，2℃～8℃保存，得到R3试剂。
所述的和肽素衍生物、已活化的偶联标记物和赖氨酸的摩尔比为1：5-20： 100。
和肽素化学发光免疫检测试剂盒用于检测和肽素时，利用全自动化学发光免疫分析仪对和肽素校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的相对光单位(RLU)计算和肽素的浓度。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，实施例中涉及到的原料均为商购获得。
实施例1
(1)链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒悬浮液的制备：
取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒溶液0.5mL (其中链霉亲和素磁珠来自安捷伦科技有限公司，货号PL6727-1001)。加入 10mL的TBST溶液充分混匀10分钟，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.01％的固相试剂，2℃～8℃保存。
(2)化学发光标记物标记的和肽素抗体标记工艺：将500μg和肽素抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心30s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入0.75μL的2mg/mL吖啶酯DMF溶液，用离心机室温条件下离心0.5min；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀4小时；加入1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为2h；将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用BISTRIS丙烷缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存。使用时将纯化后的和肽素抗体浓溶液用100mM BISTRIS丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为 20μg/mL，2℃～8℃保存。
(3)偶联标记物标记的和肽素衍生物制备工艺：
取500μg和肽素衍生物，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入5倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)，5℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应1h，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％NaN3或0.1％ProClin300。使用时将纯化后的和肽素衍生物浓溶液用100mM BISTRIS丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为20μg/mL，2℃～8℃保存。
实施例2
(1)链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒悬浮液的制备：
取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒溶液0.5mL (其中链霉亲和素磁珠来自安捷伦科技有限公司，货号PL6727-1001)。加入 10mL的TBST溶液充分混匀13分钟，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗5次后在50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％ Proclin300，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05％的固相试剂，2℃～8℃保存。
(2)化学发光标记物标记的和肽素抗体标记工艺：将250μg和肽素抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心40s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入0.375μL的2mg/mL吖啶酯DMF溶液，用离心机室温条件下离心1min；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀5小时；加入1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为3h；将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用BISTRIS丙烷缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存；使用时将纯化后的和肽素抗体浓溶液用150mM BISTRIS丙烷、0.1％吐温、0.1％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为 25μg/mL，2℃～8℃保存。
(3)偶联标记物标记的和肽素衍生物制备工艺：
取250μg和肽素衍生物，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入5倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)，6℃反应3h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应50min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％NaN3。使用时将纯化后的和肽素衍生物浓溶液用 150mM BISTRIS丙烷、0.1％吐温、0.1％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为25μg/mL，2℃～8℃保存。
实施例3
(1)链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒悬浮液的制备：
取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒溶液0.5mL (其中链霉亲和素磁珠来自安捷伦科技有限公司，货号PL6727-1001)。加入 10mL的TBST溶液充分混匀15分钟，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗4次后在50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％ Proclin300，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.1％的固相试剂，2℃～8℃保存。
(2)化学发光标记物标记的和肽素抗体标记工艺：
将1mg和肽素抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心50s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入1.5μL的2mg/mL 吖啶酯DMF溶液，用离心机室温条件下离心0.5min；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀3小时；加入 1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为 2.5h；将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用BISTRIS丙烷缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存；使用时将纯化后的和肽素抗体浓溶液用150mM BISTRIS丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为40μg/mL，2℃～8℃保存。
(3)偶联标记物标记的和肽素衍生物制备工艺：
取1mg和肽素衍生物，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入5倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)，4℃反应2.5h，再转入室温继续反应1h，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应40min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％ProClin300。使用时将纯化后的和肽素衍生物浓溶液用 150mM BISTRIS丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为40μg/mL，2℃～8℃保存。
实施例4：和肽素化学发光免疫检测试剂盒性能评价
1、线性的检测：
将校准品浓度为其中所述和肽素校准品的浓度分别为0pg/mL、10pg/mL、 40pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL和5000pg/mL的和肽素蛋白溶液作标准曲线，如表1和图2所示，得到线性相关系数r＝0.999，线性范围为 50-5000pg/mL。
表1
Figure BDA0002290818850000091
2、灵敏度：
为对零值校准品进行20次测定相对光单位(RLU)，取其平均值减两倍的标准差，带入0值及相近的标准曲线所得即为灵敏度；计算和肽素化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为20.21pg/mL。如表2所示。
表2
Figure BDA0002290818850000092
3、批间差：
对实施例1、实施例2及实施例3三个批号的试剂盒分别检测高值和低值两个浓度的样本，各重复10次，计算30次测量结果的平均值M和标准差SD。如表3所示。
表3
Figure BDA0002290818850000101
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒R1；化学发光标记物标记的和肽素抗体R2；偶联和肽素衍生物R3。
2.根据权利要求1所述的一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒的粒径是3～6μm。
3.根据权利要求1所述的一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的抗体中，和肽素抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～10，缓冲液为100～500mM BISTRIS丙烷，0.05％～0.1％PC300及0.05％～0.1％吐温-20,抗体终浓度为0.1～2μg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。
5.根据权利要求1所述的一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记的和肽素衍生物中，和肽素衍生物与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5～10，缓冲液为缓冲液为100～500mM BISTRIS丙烷，0.05％～0.1％PC300及0.05％～0.1％吐温-20，终浓度为0.2～3μg/mL。
6.根据权利要求5所述的一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记物为生物素或生物素衍生物。
7.根据权利要求1所述的一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；
其中所述化学发光底物液A为硝酸和过氧化氢溶液，B为氢氧化钠溶液。
8.根据权利要求1所述的一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括和肽素校准品。
9.根据权利要求8所述的一种和肽素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述和肽素校准品的浓度分别为0pg/mL、10pg/mL、40pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL和5000pg/mL的和肽素蛋白溶液。
10.根据权利要求1所述的一种上述的和肽素的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂R1；
步骤二：将和肽素抗体放入离心管中离心，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，将封闭好的抗体经过纯化、收集，然后放入缓冲液中稀释，保存，得到R2试剂；
步骤三：取和肽素衍生物，将TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的偶联标记物，2～8℃反应2-3h，再转入室温继续反应30-60min，最后加入赖氨酸反应30-60min，将纯化后的和肽素衍生物浓溶液用缓冲液稀释，得到R3试剂。
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