CN102060915A

CN102060915A - 人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用

Info

Publication number: CN102060915A
Application number: CN2010105266380A
Authority: CN
Inventors: 周荣; 李潇; 李海涛; 高文娟; 田新贵; 钟南山
Original assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease
Current assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2011-05-18

Abstract

本发明提供了人3型腺病毒六邻体高变区中可修饰的氨基酸位点，该可修饰位点位于六邻体的高变区，具有SEQ ID NO：1-4所示序列中的至少一个氨基酸位点。这些氨基酸位点是分别位于人3型腺病毒六邻体的高变区1、2、5、7上。本发明还提供了该可修饰氨基酸位点在外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备、检测试剂制备中的应用。本发明为利用人3型腺病毒六邻体高变区修饰外源多肽的技术平台作为疫苗或抗原研究开发的病毒展示技术平台奠定了基础。

Description

人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体是关于人3型腺病毒的可修饰位点及其应用。

背景技术

人腺病毒(Adenovirus)是1953年从急性呼吸道疾病病人身上分离、鉴定出来的，是一类主要感染人呼吸道和消化道的病原体。截目前为止，人类已经发现了6个种属52种不同血清型的腺病毒，腺病毒流行范围广，传播速度快，近年来在多个国家和地区爆发和流行，给人们的公共卫生安全带来了极大的威胁。流行病学调查表明，在我国，引起严重呼吸道感染的腺病毒亚型主要是3型、4型、7型，较为少见的是11型。

腺病毒的DNA为双股线状，全长30-38kb。可以在编码早期蛋白的E1、E3区插入外源基因进行表达，以腺病毒为载体进行基因治疗的重组疫苗的研究已经广泛进行。以人5型腺病毒为载体的研究进行较为深入。

六邻体(Hexon)蛋白是形成腺病毒二十面体颗粒的几种蛋白质中最大也是结构最丰富的蛋白，其分子量约为12×10⁴Da。不同型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序列有很高的同源性(78-95％)，其变化主要集中在暴露于病毒衣壳表面的9个高变区(Hypervariable Regions，HVRs)。在不影响病毒的复制、感染性及稳定性的前提下，可以将外源短肽直接替换或插入到六邻体的某些高变区中，使外源短肽“展示”于腺病毒颗粒表面，产生具有新的抗原特异性的嵌合型病毒粒子。在腺病毒衣壳上，共有240个六邻体颗粒以每面12个的形式均匀分布于其上，同时，每个六邻体颗粒又由三个六邻体多肽链相互作用形成同源三聚体，这就意味着嵌合型腺病毒衣壳表面将具有720个外源短肽拷贝；同时，六邻体蛋白本身分子量大，具有极强的免疫原性，此特性能大大提高嵌合于其中的外源短肽的免疫原性。另一方面，对不同HVR区同时进行改造，能够形成一个HVRs区修饰的、表达外源多肽的高效、多价的重组腺病毒“展示”平台。此技术的建立将极大的促进基因工程疫苗的发展。

腺病毒作为疫苗和基因药物载体应用的研究较多，但针对腺病毒本身和将明确的外源抗原表位展示于腺病毒表面后的重组病毒作为疫苗的研究尚不多见。Janet C.等的研究结果表明，在LoopI(包含HVR1-6)和LoopII(包含HVR7-9)中替换8个氨基酸是可行的(Janet C.，et al.，Expression of a foreign epitope on thesurface of the adenovirus hexon.J Gen Vriol，1994.75：p.133-139.外源表位在腺病毒六邻体表面的表达，普通病毒学杂志。)。Hongju W.等利用His6对人5型腺病毒的HVR2，3，5，6和7进行了替换研究(Hongju W.，et al.，Identification of sitesin adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.J Virol，2005.79(6)：p.3382-3390.腺病毒六邻体上可整合外源多肽位点的鉴定，病毒学杂志。)，但此研究的主要目的是腺病毒的HVR区是否可以被修饰，而不是如何修饰，因而此研究未对HVR中某些氨基酸的可替换与否进行研究，并且，人5型腺病毒在基因分型中属于C组(HAdV-C)，而人3型腺病毒则属于B组(HAdV-B)，两者的HVR区序列及长度均差异较大。而且由于人群中普遍存在针对人5型腺病毒的中和抗体等原因，使以其为载体进行表达式重组疫苗和治疗药物等的应用受到很大的限制。

发明内容

本发明的目的是通过对人3型腺病毒六邻体高变区氨基酸位点的研究，提供人3型腺病毒六邻体高变区中可修饰的氨基酸位点，以及该可修饰氨基酸位点在外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备、检测试剂制备中的应用。

本发明的具体方案如下：

本发明首先提供了人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，该可修饰位点位于六邻体的高变区，具有SEQ ID NO：1-4所示序列中的至少一个氨基酸位点。

这些氨基酸位点是分别位于人3型腺病毒六邻体的高变区1、2、5、7上，具体来说，SEQ ID NO：1所示序列位于高变区1上，SEQ ID NO：2所示序列位于高变区2上，SEQ ID NO：3所示序列位于高变区5上，SEQ ID NO：4所示序列位于高变区7上。SEQ ID NO：1-4所示序列中的任一个或多个氨基酸位点可以对其进行缺失或替换，而不影响腺病毒包装活性。

本发明还提供了上述人3型腺病毒六邻体的可修饰位点在外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备和检测试剂制备中的应用。

优选的，上述应用可以采用如下方式进行：六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体在外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备、检测试剂制备中的应用，上述六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体均含有至少一种经修饰过的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，即上述六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体中的六邻体高变区上如SEQ ID NO：1-4所示序列的中至少一个氨基酸位点被修饰，可以利用这样的六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体来进行外源蛋白展示、制备免疫原、制备药物和制备检测试剂。

其次，本发明还提供了一种腺病毒六邻体蛋白，该腺病毒六邻体蛋白含有至少一种经修饰过的上述人3型腺病毒六邻体的可修饰位点。即，在该腺病毒六邻体蛋白的高变区中，本发明所公开的SEQ ID NO：1-4所示序列中至少有一个氨基酸缺失，或被替换为其他片段或插入其他片段。

本发明还提供了一种不合遗传物质的腺病毒壳体，所述腺病毒壳体含有上述腺病毒六邻体蛋白。

本发明还提供了一种腺病毒载体，所述腺病毒载体含有上述腺病毒六邻体蛋白。

本发明还提供了一种重组腺病毒，所述重组腺病毒含有上述腺病毒六邻体蛋白。

本发明还提供了一种疫苗株，该疫苗株含有上述腺病毒载体。

本发明提供了人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，并提供了利用该位点可以用来进行外源蛋白展示、制备免疫原、药物、检测试剂等方面。为利用人3型腺病毒六邻体高变区修饰外源多肽的技术平台作为疫苗或抗原研究开发的病毒展示技术平台奠定了基础。

附图说明

图1为实施例1中构建的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图；

图2为实施例1中L-HVR-R(EcoR I/Sal I)与PBRADV3ΔE3EGFP-MH5(AvrII/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒的电泳图；

图3为实施例1中的细胞病变的照片；

图4为实施例2中构建的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图；

图5为实施例2中L-HVR-R(EcoR I/Sal I)与PBRADV3ΔE3EGFP-MH5(AvrII/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒的电泳图；

图6为转染重组腺病毒基因组后的照片；

图7为实施例3中构建的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图；

图8为实施例3中L-HVR-R(EcoRI/Sal I)与PBRADV3ΔE3EGFP-MH5(AvrII/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒的电泳图；

图9为实施例3中的细胞病变的照片。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

本发明的“修饰”是指可将其他外源片段与SEQ ID NO：1-4所示序列中的任一个或多个氨基酸位点进行替换，或在SEQ ID NO：1-4所示序列中的任一个或多个氨基酸位点处插入其他外源片段，或将SEQ ID NO：1-4所示序列中的任一个或多个氨基酸位点进行缺失。

本发明的“位点”泛指一个或多个氨基酸位点，即除了指代某一个氨基酸位点外，还可以指代某一段氨基酸序列。

本发明中实验用到的PBRADV3ΔE3EGFP的制备方法详见武汉大学博士学位论文《人3型腺病毒感染性全基因组克隆及表达载体的构建》，张其威，2007年3月，编号10486。

为了寻找人3型腺病毒六邻体高变区中可修饰的氨基酸位点，该发明针对PBRADV3ΔE3EGFP六邻体高变区进行了三次突变实验。

实施例1：PBRADV3ΔE3EGFP六邻体高变区第一次突变实验

将野生型HADV7的六邻体高变区HVR1、HVR2、HVR5、HVR7分别替换到病毒载体PBRADV3ΔE3EGFP上六邻体高变区的相应位置(氨基酸序列中下划线所示)，突变氨基酸序列如表1中下划线部分所示。

表1

	HADV7	HADV3
			HVR1	IVTTGEDNATTYT	IVTTNRDNAVTTTTNT
HVR2	KEGLEIGKDITADNKPIYADK	KEGLQIGKDITTTEGEEKPIYADK
			HVR5	DGREAADAFSPEIVLYTEN	DGRDAVAGALAPEIVLYTEN

HVR7

IKPRDTAWEKDT

IKVKTDDANGWEKDAN

所用引物序列如表2所示，其中HexU和HexD序列中的下划线分别表示Cla I和BamH I的酶切位点。

表2

用引物HexU和HVRD(包括HVR1D、HVR2D、HVR5D、HVR7D)扩增的产物HVRA，用引物HVRU(包括HVR1U、HVR2U、HVR5U、HVR7U)和引物HexD扩增的产物HVRB，上述PCR反应模板均为PBRADV3ΔE3EGFP。纯化回收产物HVRA和HVRB，各取1微升做模板，以引物HexU和HexD扩增2700bp的产物HVR。用ClaI和BamHI双酶切PCR产物HVR和穿梭载体PBR322L/R，琼脂糖凝胶电泳回收之后，T4 DNA连接酶连接回收产物HVR(Cla I/BamHI)和PBR322L/R(Cla I/BamHI)得到穿梭质粒PBR322L/R-HVR。该质粒的电泳图见图1。图1为构建成功的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图。标注M的泳道为DL15000marker，标注1的泳道为PBR322L/R-HVR1，标注2的泳道为PBR322L/R-HVR2，标注3的泳道为PBR322L/R-HVR5，标注4的泳道为PBR322L/R-HVR7。

利用穿梭质粒PBR322L/R-HVR上的EcoR I、SalI位点，将带有重组同源序列的HVR片段释放出来得到L-HVR-R(EcoR I、Sal I)，同时将PBRADV3ΔE3EGFP的六邻体利用Avr II和Pac I切除。然后将2个片段同时电转化到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，利用PCR和酶切的方法鉴定得到正确的阳性克隆质粒PBRADV3ΔE3EGFP-AD4HVR。图2为L-HVR-R(EcoR I/Sal I)与PBRADV3ΔE3EGFP-MH5(Avr II/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒的电泳图；其中，标注M的泳道为marker DL15000，标注1的泳道为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR1(AD4)，标注2的泳道为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR2(AD4)，标注3的泳道为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR5(AD4)，标注4的泳道为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR7(AD4)。用Asis I线性化释放出病毒载体基因组，转染HEK293细胞，进行细胞病变(CPE)观察，图3为细胞病变照片；图3a为荧光显微镜下细胞病变照片，其中空洞的部分为因病变而脱落的细胞；图3b为自然光下同一视野的细胞病变照片，从而证明得到含有HADV4六邻体HVR的感染性重组病毒。

实施例2：PBRADV3ΔE3EGFP六邻体高变区第二次突变实验

将野生型HADV4的六邻体高变区HVR1、HVR2、HVR5、HVR7分别替换到病毒载体PBRADV3ΔE3EGFP上六邻体高变区的相应位置(氨基酸序列中下划线所示)，突变氨基酸序列如表3中下划线部分所示。

表3

	HADV4	HADV3
			HVR1	KDSDSKM	IVTTNRDNAVTTTTNT
HVR2	EADGLPIRIDSTSGTDTVIYADK	KEGLOIGKDITTTEGEEKPIYADK
			HVR5	DSKTIVANYDPDIVMYTEN	DGRDAVAGALAPEIVLYTEN
HVR7	VKVKTDAGSEKWDKDDTTV	IKVKTDDANGWEKDAN

所用引物序列如表4所示，其中HexU和HexD序列中的下划线分别表示Cla I和BamH I的酶切位点。

表4

实验方法同第一次突变实验，区别在于所用引物的序列是不同的。构建成功的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图见图4，在图4中，泳道M为markerDL15000，泳道1为PBR322L/R-HVR1，泳道2为PBR322L/R-HVR2，泳道3为PBR322L/R-HVR5，泳道4为PBR322L/R-HVR7。图5为L-HVR-R(EcoR I/SalI)与PBRADV3ΔE3EGFP-MH5(Avr II/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒的电泳图。泳道M为marker DL 15000，泳道1为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR1(AD4)，泳道2为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR2(AD4)，泳道3为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR5(AD4)，泳道4为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR7(AD4)。用Asis I线性化释放出病毒载体基因组，转染HEK293细胞持续进行细胞培养，结果见图6，图6为转染重组腺病毒基因组后的照片；图6a为荧光显微镜下转染重组腺病毒基因组后照片，可见多为单个细胞荧光，无病毒增殖的聚集荧光和病变；图6b为同一视野下的细胞图片，可见细胞并无病变。

实施例3：PBRADV3ΔE3EGFP六邻体高变区第三次突变实验

将野生型HADV4的六邻体高变区HVR1、HVR2、HVR5、HVR7分别替换到病毒载体PBRADV3ΔE3EGFP上六邻体高变区的相应位置(氨基酸序列中下划线所示)，突变氨基酸序列如表5中下划线部分所示。

表5

	HADV4	HADV3
			HVR1	KDSDSKM	IVTTNRDNAVTTTTNT
HVR2	EADGLPIRIDSTSGTDTVIYADK	KEGLQIGKDITTTEGEEKPIYADK
			HVR5	DSKTIVANYDPDIVMYTEN	DGRDAVAGALAPEIVLYTEN
HVR7	VKVKTDAGSEKWDKDDTTV	IKVKTDDANGWEKDAN

所用引物序列如表6所示，其中HexU和HexD序列中的下划线分别表示Cla I和BamH I的酶切位点。

表6

实验方法同第一次突变实验，区别在于所用引物的序列是不同的。构建的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图见图7，其中泳道M为marker DL15000，泳道1为PBR322L/R-HVR1，泳道2为PBR322L/R-HVR2，泳道3为PBR322L/R-HVR5，泳道4为PBR322L/R-HVR7。图8为L-HVR-R(EcoR I/Sal I)与PBRADV3ΔE3EGFP-MH5(Avr II/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒。泳道M为marker DL15000，泳道1为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR1(AD4)，泳道2为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR2(AD4)，泳道3为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR5(AD4)，泳道4为PBRADV3ΔE3EGFP-MH5-HVR7(AD4)。用Asis I线性化释放出病毒载体基因组，转染HEK293细胞，然后进行细胞病变观察，图9为细胞病变检测照片；图9a为荧光显微镜下细胞病变照片，其中空洞的部分为因病变而脱落的细胞；9b为自然光下同一视野的细胞病变照片。

由三次六邻体修饰的氨基酸序列相互比对，以及腺病毒包装的成功与否，可以得出HADV3的六邻体高变区HVR1、HVR2、HVR5、HVR7上有一些氨基酸是可修饰的。可替换的氨基酸序列如表7中下划线部分所示：

表7

	HADV3
		HVR1	IVTTNRDNAVTTTTNT
HVR2	KEGLQIGKDITTTEGEEKPIYADK
		HVR5	DGRDAVAGALAPEIVLYTEN
HVR7	IKVKTDDANGWEKDAN

实施例4：利用实施例1中得到的突变重组体的血清中和试验

具体实验步骤如下：

(1)、细胞准备：Hep-2细胞长满之后，用胰酶消化，加含10％新生牛血清DMEM培养基稀释至96孔细胞培养板，细胞密度为每孔2×10⁴个，于37℃5％CO₂培养箱培养。

(2)、病毒准备：先将各种病毒进行TCID₅₀滴定，所有病毒MH1、MH2、MH5、MH7、ADV7、ADV3E全部稀释至浓度100TCID₅₀。

(3)、血清准备：用含2％新生牛血清的无酚红DMEM将抗MH1、MH2、MH5、MH7、ADV7、ADV3E以及正常小鼠血清梯度稀释成2⁵、2⁷、2⁹、2¹¹、2¹³、2¹⁵、2¹⁷。其中正常小鼠血清用作阴性对照。

(4)、不同病毒与不同血清相互做中和试验：将稀释好的病毒与每个血清梯度各加50μl，混合均匀，放至37℃温箱孵育1小时，待细胞在细胞板中生长24小时，大约均匀铺满60％时，吸尽细胞板中的培养基，用PBS洗两遍，加入孵育好的血清病毒。每个血清梯度做3个平行孔，同时每块细胞板预留5孔正常细胞及5孔病毒感染细胞做对照。加好后，放37℃5％CO₂培养箱培养。

(5)、结果读取：培养72小时后，①由于病毒MH1、MH2、MH5、MH7、ADV3E表达荧光蛋白，先用荧光显微镜观察并拍照保存结果。小心将细胞板里的培养基吸出，用胰酶消化每孔细胞，再用PBS重悬细胞，转入专用测荧光值96孔板中，485nm/518nm波长处读数，将测完荧光值的细胞反复冻融3次之后，每孔取50μl抽提核酸做定量PCR。②ADV7病毒的中和试验平行做2份，一份用于中性红染色，一份用于荧光定量PCR。ADV7病毒由于不带荧光标记，用中性红染色结果显示。先去除培养板中的培养基，加入50μl 0.5％中性红(溶解于PBS中)，37℃培养箱中孵育1小时，150μlPBS洗2次，加染色液染色，于550nm波长读数。

第一组的中和反应的实验结果见表8，表8为抗ADV3E血清、抗ADV7血清、正常对照小鼠血清和抗重组病毒血清对MH1、MH2、MH5和MH7病毒的中和实验结果。

表8

表8中数据显示将ADV3的HVR7改造为ADV7的HVR7后，抗ADV3E血清对MH7的抑制作用出现下降，证明ADV7的HVR7已于ADV3腺病毒六邻体表面成功表达。抗ADV7病毒血清对MH2和MH5病毒感染具有抑制能力，同样证明ADV7的HVR2和HVR5也已于ADV3腺病毒六邻体表面成功表达，因而血清学呈现明显改变。

第二组的中和反应的实验结果见表9，表9为抗MH1病毒血清，抗MH2病毒血清，抗MH5病毒血清，抗MH7病毒血清，抗ADV3E病毒血清，抗ADV7病毒血清，正常对照小鼠血清对ADV3E病毒中和能力实验：

表9

由表9的结果可以看到，用MH7免疫小鼠得到的抗MH7血清由于ADV3的HVR7已经被改造为ADV7的HVR7，因此免疫产生的血清对ADV3病毒的中和能力减弱，同样说明ADV7的HVR7已于ADV3腺病毒六邻体表面成功表达，进而改变了ADV3六邻体的免疫原特性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，其特征在于，所述可修饰位点位于六邻体的高变区，具有SEQ ID NO：1-4所示序列中的至少一个氨基酸位点。

2.根据权利要求1所述的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，其特征在于，所述高变区为人3型腺病毒六邻体的高变区1、2、5、7中的至少一种。

3.权利要求1或2所述的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点在外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备和检测试剂制备中的应用。

4.六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体在外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备、检测试剂制备中的应用，其特征在于，所述六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体均含有至少一种经修饰过的权利要求1或2所述的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点。

5.一种腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，含有至少一种经修饰过的权利要求1或2所述的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点。

6.一种不含遗传物质的腺病毒壳体，其特征在于，所述腺病毒壳体含有如权利要求5所述的六邻体蛋白。

7.一种腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体含有如权利要求5所述的六邻体蛋白。

8.一种疫苗株，包含权利要求7所述的腺病毒载体。

9.一种重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒含有如权利要求5所述的六邻体蛋白。