CN108828214B - 用于区分hiv-1新近与慢性感染的免疫吸附检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于区分HIV‐1新近和慢性感染的血清学抗体免疫吸附法，融合表达包含HIV‐1 B、D、CRF01_AE和CRF07_BC、CRF08_BC五种亚型跨膜蛋白gp41部分肽段的融合蛋白MP4作为检测抗原，捕获待测样本中代表HIV慢性感染的特异性抗体，通过检测辣根过氧化物酶催化底物TMB产生的蓝色物质的光密度值来判断待测样品中代表HIV慢性感染的抗HIV抗体的存在与含量。融合表达的四价多肽作为检测抗原，可以同时检测多个HIV基因亚型，使得检测范围更广，灵敏度和特异度更高。采用经典的ELISA间接法进行检测，操作相对更简便。在HIV‐1人群中进行防治措施的评价和新发感染率的流行病学调查中更具有实用性。

Description

用于区分HIV-1新近与慢性感染的免疫吸附检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及区分人类免疫缺陷病毒I型(humanimmunodeficiency virus type 1,HIV-1)新近和慢性感染免疫吸附检测方法的建立，以及在高通量HIV-1感染流行病学调查与监控中的应用。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)又称为艾滋病病毒，其所致的艾滋病是肆虐全球的一种慢性致死性传染病。据世界卫生组织报道，截止2016年底，全球有3670万HIV感染者，自该病毒发现以来的30多年时间已造成3500多万人死亡，严重危害公众健康，是全球面临的重大公共卫生问题。
根据感染HIV后时间的长短以及病毒学标志物的特征，可以将HIV感染分为急性感染(acute infection)、新近感染(recent infection)和慢性感染(chronic infection)：(1)HIV急性感染通常指感染HIV后1个月内，特点是血清HIV RNA或HIV p24抗原阳性，用酶联免疫吸附试验(Enzyme‐linked immunosorbent assay，ELISA)检测HIV抗体阴性，蛋白印迹试验(Western Blot，WB)显示HIV抗体阴性或者不确定(p24、gp41和gp120/160不完全阳性)。(2)HIV新近感染是指感染HIV后10个月内，血液中HIV病毒载量下降并稳定到一定水平(setpoint)。除血清HIV RNA或HIV p24抗原阳性外，抗HIV抗体滴度较低，仅可被高灵敏度的检测方法检出，且抗体尚未完全成熟，抗体亲和力低。(3)HIV慢性感染指感染HIV后一年以上，HIV抗体成熟，抗体滴度及亲和力提高。
目前发展到第四代的检测HIV感染的免疫学方法，既能检测HIV‐1p24抗原，又能检测抗HIV IgM和IgG抗体，但其检测结果只能判断是否感染HIV，而无法知道大致的感染时间，即无法区分HIV新近或慢性感染，只能获得人群HIV累计感染率。而HIV感染的潜伏期较长，从感染HIV到发展为艾滋病通常需要8‐10年，甚至更长。随着时间推移、疫情发展以及筛查工作范围扩大和力度提高，HIV感染率往往呈现上升趋势，所以，现行的HIV抗体检测方法不能实时反映疾病的流行趋势和干预措施的效果。因此，极需建立区分HIV新近感染和慢性感染的检测方法，掌握HIV感染时间，以及某时间段内某人群HIV新发感染率，为我国艾滋病疫情监测、流行趋势预测和防控效果评估等提供重要依据。
队列研究是检测HIV新发感染的最好方法，但需要明确知道感染的时间和途径，并对检测对象反复多次采血，因此实际开展时困难很大，很难实施。另一方面，队列研究方法设计复杂，容易受到社会环境因素的干扰，而且随访时间长、研究成本昂贵。
当HIV抗体仍然阴性时，通过检测血液中HIV P24抗原和HIV RNA，可以反映HIV急性期感染，但通常这一时期持续时间较短，一般为14‐22天，而且多数HIV感染病例受检时往往已经错过急性感染阶段，不利于检测大量样本HIV新发感染。
目前比较实用的区分HIV新近与慢性感染的方法是检测抗HIV抗体的亲和力和抗体滴度变化的免疫学方法。
1998年，Janssen等依据血清阳转后抗体滴度逐渐升高的原理，首次提出HIV新近感染血清学检测流程(Serological Testing Algorithm for Recent HIVSeroconversion,STARHS)，该检测流程可以发现HIV新近感染者，使得新发感染的可检时间延长，有助于更加准确地获取HIV新发感染率。2002年，Parekh等根据血清阳转后抗HIV‐1特异性抗gp41抗体IgG占总IgG的比例随感染时间延长而逐渐升高的原理，建立了针对HIV‐1B、D、E三个亚型的BED HIV‐1捕获酶联免疫方法(BED capture enzyme immunoassay,BED‐CEIA)，用于区分HIV新近和慢性感染。2010年，Parekh等依据人体感染HIV后产生的HIV‐1特异性抗gp41抗体的亲和力逐渐增加，建立了HIV‐1限制性抗原亲和力酶联免疫方法(HIV‐1LAg‐Avidityenzyme immunoassay,LAg‐Avidity EIA)，通过检测HIV抗体亲和力的差异，区分HIV新近与慢性感染。BED‐CEIA和LAg‐Avidity EIA目前在全世界范围内应用最为广泛，我国《全国艾滋病检测技术规范》中亦推荐使用这两种方法。但BED‐CEIA因为抗原材料合成问题，目前已经停用。
此外，这两种方法在应用中存在以下不足：(1)Parekh等研究表明，HIV‐1B和E亚型的gp41部分肽段作为检测抗原时，和同种亚型血样的反应强度比其他亚型血样的高。现有方法针对的基因亚型包括A、B、C、F、G、H、I、K、AG、AB、AC、BG、AE、D和AD，而我国HIV分子流行病学调查表明，我国主要流行的基因亚型为CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型，现有的方法并未完全适用于我国HIV新发感染的检测，需要改进和完善。(2)现有方法依据B亚型血样获得的新近感染窗口期和校正系数，不完全适合于我国多亚型流行的实际情况，需要结合我国流行背景获取相应的窗口期，完善新发感染率校正系数，才能准确计算我国HIV新发感染率。(3)现有方法对质控样本检测结果有严格的限定范围，对技术人员操作要求高，需要进行初筛和确证两次实验操作，不利于大规模人群HIV‐1新发感染率流行病学调查。(4)现有方法对gp41蛋白作为新近感染检测的抗原表位并不清楚，需要进一步研究明确其可能的作用机制。
所以，有必要针对我国主要HIV流行亚型建立一种简便、快速的区分HIV‐1新近与慢性感染的血清学抗体免疫吸附检测方法。
发明内容
本发明的目的在于避免现有检测方法的不足，提供一种适用于我国、简便而高通量的区分HIV‐1新近和慢性感染的免疫吸附方法。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现：
提供HIV-1跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列，用于作为区分HIV新近和慢性感染的用途，以HIV-1病毒株HXB2为参考，氨基酸序列位置为560-616aa。
优选的，上述跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列为多肽01AE-P57，用于筛分HIV-1CRF01_AE基因亚型血样新近和慢性感染，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSSWSN。
另一优选的，HIV-1跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列为多肽07BC-P57，用于筛分HIV-1CRF07_BC和CRF08_BC基因亚型血样新近和慢性感染，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSN。
另一优选的，HIV-1跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列为多肽B-P57，用于筛分HIV-1B亚型血样新近和慢性感染，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSN。
另一优选的，HIV-1跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列为多肽D-P57，用于筛分HIV-1D亚型血样新近和慢性感染，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN。
本发明同时提供上述的跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列作为区分HIV新近和慢性感染的用途。
本发明同时提供一种融合蛋白，用于筛分HIV-1CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型血样新近和慢性感染，由蛋白连接肽GGGGSGGGGS连接，融合表达01AE-P57、07BC-P57、B-P57和D-P57四个肽段，融合表达蛋白的具体氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSTWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN。
本发明同时提供一种用于区分HIV-1新近和慢性感染的血清学抗体免疫吸附法，选取HIV-1CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型跨膜糖蛋白gp41其中57个氨基酸融合表达作为检测抗原，捕获待测样本中特异性抗HIV抗体，去除非特异性或低亲和力抗HIV抗体，通过检测辣根过氧化物酶催化底物所产生的蓝色物质的光密度值来判断待测样品中代表HIV慢性感染的HIV抗体的存在与含量，判断被测对象处于HIV新近或者慢性感染。
优选的，上述的区分HIV‐1新近和慢性感染的免疫吸附检测方法，具体包括以下步骤：
S1.分析目标HIV的基因亚型，各亚型最优的检测抗原之间由连接肽连接，再对应合成碱基序列并在5’端和3’端分别加上酶切位点，通过酶切连接的方式构建重组质粒；
S2.将重组质粒转化至大肠杆菌，在其中大量诱导融合表达目的蛋白，并进行纯化回收、定量测定、低温保存备用；
S3.将融合表达蛋白作为检测抗原固定至固体支持物上；
S4.通过封闭液进行封闭；
S5.将待测样本加入一起孵育，待测样本中的抗体与捕捉抗原形成抗原‐抗体复合物附着在固体支持物表面，洗去没有结合的样本；
S6.加入8M尿素孵育，去除低亲和力或非特异性结合，洗去没有结合的样本；
S7.加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体孵育，与待测样本中的抗HIV抗体结合，洗去没有结合的抗体；
S8.将辣根过氧化物酶的底物加入固体支持物中，孵育一定时间后用2M硫酸终止，使用酶标仪测定各孔光密度强度，判断待测样本为新近或慢性感染；
其中，融合蛋白碱基序列的5’端和3’端分别加上的酶切位点为BamHI和XhoI；重组质粒所用表达载体为pET‐28a；大肠杆菌为BL21(DE3)；去除非特异性结合或低亲和力抗体所用试剂为8M尿素，方式为37℃孵育30min。
本发明同时提供一种试剂盒，以HIV-1CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型跨膜糖蛋白gp41其中57个氨基酸融合表达作为检测抗原，以HIV-1病毒株HXB2为参考，氨基酸序列位置为560-616aa；
用于筛分HIV-1CRF01_AE基因亚型血样新近和慢性感染的为多肽01AE-P57，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSSWSN；
用于筛分HIV-1CRF07_BC和CRF08_BC基因亚型血样新近和慢性感染的为多肽07BC-P57，，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSN；
用于筛分HIV-1B亚型血样新近和慢性感染的为多肽B-P57，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSN；
用于筛分HIV-1D亚型血样新近和慢性感染的为多肽D-P57，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN。
本发明的技术方案，(1)发现HIV gp41蛋白一段含57个氨基酸的多肽，能很好的区分HIV新近与慢性感染，并确定了核心抗原决定簇的位置和氨基酸序列。(2)发现针对我国HIV主要流行的基因亚型CRF01_AE、CRF07_BC/CRF08_BC和B亚型特定的多肽序列，证明这些多肽联合使用，可以提高区分HIV新近与慢性感染检测方法的敏感性和特异性。(3)针对我国HIV主要流行的基因亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型，以及基因变异性比较大D亚型，构建包含上述五种HIV基因亚型最佳检测肽段的融合表达质粒pET28a‐MP4，在大肠杆菌中融合表达获得MP4重组蛋白作为检测抗原，通过间接ELISA法检测辣根过氧化物酶催化底物TMB而产生的蓝色物质的光密度值，反映待测样本中针对HIV慢性感染的抗HIV抗体。
本发明中用于区分HIV‐1新近和慢性感染的血清学抗体免疫吸附法的原理是基于HIV‐1gp41抗原表位随感染时间延长而发生构象变化，相关抗原决定簇释放和暴露机率增加，刺激机体产生的特异性抗HIV抗体滴度和亲和力增加。首次针对我国HIV主要流行的基因亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型，以及D亚型，利用位于HIV跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸组成的多肽来构建重组融合蛋白，可以覆盖我国HIV主要流行的基因亚型，检测敏感性更高，操作简单，在人群筛检试验中更有优势。我们发明的方法既保留了ELISA方法操作快速、简便和易于实现高通量检测的优点，又避免了现有的商品化试剂盒操作复杂、判定方法苛刻的缺点，是一种更加简单、实用和快速的区分HIV‐1新近和慢性感染的检测方法。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1为本发明建立的区分HIV‐1新近和慢性感染的免疫吸附方法原理示意图。
图2为gp41‐p1～gp41‐p10系列多肽与HIV‐1不同感染时期血清样本的反应结果。
具体实施例
结合具体实施例对本发明作进一步说明，但实施例中的内容不构成对本发明技术方案的限制。
实施例1。
一种跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列，用于作为区分HIV新近和慢性感染的用途，以HIV-1病毒株HXB2(GenBank登录号为K03455)为参考，氨基酸序列位置为560-616aa。
其中一种跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列为多肽01AE-P57，用于筛分HIV-1CRF01_AE基因亚型血样新近和慢性感染，以HIV-1病毒株HXB2(GenBank登录号为K03455)为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSSWSN。
其中，跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列为多肽07BC-P57，用于筛分HIV-1CRF07_BC和CRF08_BC基因亚型血样新近和慢性感染，以HIV-1病毒株HXB2(GenBank登录号为K03455)为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSN。
其中一种跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列为多肽B-P57，用于筛分HIV-1B亚型血样新近和慢性感染，以HIV-1病毒株HXB2(GenBank登录号为K03455)为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSN。
其中一种跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列为多肽D-P57，用于筛分HIV-1D亚型血样新近和慢性感染，以HIV-1病毒株HXB2(GenBank登录号为K03455)为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN。
该跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸序列可以作为区分HIV新近和慢性感染的用途。
本发明首次针对我国HIV主要流行的基因亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型，以及D亚型，利用位于HIV跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸组成的多肽来构建重组融合蛋白，可以覆盖我国HIV主要流行的基因亚型，检测敏感性更高，操作简单，在人群筛检试验中更有优势。我们发明的方法既保留了ELISA方法操作快速、简便和易于实现高通量检测的优点，又避免了现有的商品化试剂盒操作复杂、判定方法苛刻的缺点，是一种更加简单、实用和快速的区分HIV‐1新近和慢性感染的检测方法。
实施例2。
一种融合蛋白，用于筛分HIV-1CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型血样新近和慢性感染，由蛋白连接肽GGGGSGGGGS连接，融合表达01AE-P57、07BC-P57、B-P57和D-P57四个肽段，融合表达蛋白的具体氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSTWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN。
实施例3。
一种用于区分HIV-1新近和慢性感染的血清学抗体免疫吸附法，如图1所示，选取HIV-1CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型跨膜糖蛋白gp41其中57个氨基酸融合表达作为检测抗原，捕获待测样本中特异性抗HIV抗体，去除非特异性或低亲和力抗HIV抗体，通过检测辣根过氧化物酶催化底物所产生的蓝色物质的光密度值来判断待测样品中代表HIV慢性感染的HIV抗体的存在与含量，判断被测对象处于HIV新近或者慢性感染。
其中，区分HIV‐1新近和慢性感染的免疫吸附检测方法，具体包括以下步骤：
S1.分析目标HIV的基因亚型，各亚型最优的检测抗原之间由连接肽连接，再对应合成碱基序列并在5’端和3’端分别加上酶切位点，通过酶切连接的方式构建重组质粒；
S2.将重组质粒转化至大肠杆菌，在其中大量诱导融合表达目的蛋白，并进行纯化回收、定量测定、低温保存备用；
S3.将融合表达蛋白作为检测抗原固定至固体支持物上；
S4.通过封闭液进行封闭；
S5.将待测样本加入一起孵育，待测样本中的抗体与捕捉抗原形成抗原‐抗体复合物附着在固体支持物表面，洗去没有结合的样本；
S6.加入8M尿素孵育，去除低亲和力或非特异性结合，洗去没有结合的样本；
S7.加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体孵育，与待测样本中的抗HIV抗体结合，洗去没有结合的抗体；
S8.将辣根过氧化物酶的底物加入固体支持物中，孵育一定时间后用2M硫酸终止，使用酶标仪测定各孔光密度强度，判断待测样本为新近或慢性感染；
其中，融合蛋白碱基序列的5’端和3’端分别加上的酶切位点为BamHI和XhoI；重组质粒所用表达载体为pET‐28a；大肠杆菌为BL21(DE3)；去除非特异性结合或低亲和力抗体所用试剂为8M尿素，方式为37℃孵育30min。
以下结合具体实例，对本发明的方法做进一步说明。以下实施例中用到的仪器、实验材料和试剂如下：
实验仪器：
酶标仪(Multistan FC，Thermo Scientific)，
洗板机(Tecan，Hydro FLEX，帝肯(上海)贸易有限公司)，
电热恒温培养箱(SGSP 02B 500，黄石市恒丰医疗器械有限公司)，
超声破碎仪(JY92IIDN，宁波新芝生物科技股份有限公司)，
蛋白质电泳仪(525BR，Bio‐RAD)，
半干式转膜仪(SEMI‐DRY，Bio‐RAD)。
实验材料与试剂：
ELISA反应板(康宁公司，美国)，
基因克隆所需的各类试剂(Takara公司，中国)，
质粒提取所需的试剂盒(天根，中国)，
常规生化试剂(鼎国，中国)，
辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体(Abcam，英国)，
TMB(碧云天生物技术，中国)，
Ni‐NTA Superflow Columns(Qiagen，德国)。
实施例4。
本发明前期建立的检测方法与LAg‐Avidity EIA商品化试剂盒在检测HIV‐1阳性样本的结果比较。值得说明的是，本发明前期建立的检测方法为人工合成HIV‐1CRF01_AE亚型gp41上57个氨基酸序列的特异性肽段gp41‐P1，在此仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制。
具体实施步骤如下：
S1.收集129份分别来自129名HIV‐1感染者的横断面血清样本。随访10名HIV‐1感染者，分四次共收集40份不同时间的随访血清样本，按照HIV‐1抗体阳转时间记录感染时间。
S2.LAg‐Avidity EIA试剂盒分别购自Maxim公司(美国)和北京金豪制药股份有限公司(中国)。根据两种试剂盒的说明书独立操作，分别判定样本的感染分期，剔除两试剂盒判断结果不一致的样本。
S3.利用本发明前期建立的检测方法检测上述样本：
3A.将肽段gp41-P1及gp41重组蛋白用PBS(0.01M，pH7.4)稀释至1μg/mL和2.5μg/mL，分别加至ELISA板中。每孔加入50μL，4℃包被12h。
3B.用洗板机洗涤ELISA板五次，洗涤液为PBST(0.05％吐温)，最后一次尽量扣干。
3C.每孔加入封闭液(5％的脱脂奶粉)200μL，置于37℃恒温箱内孵育1h。
3D.用洗板机洗涤ELISA板五次，洗涤液为PBST(0.05％吐温)，最后一次尽量扣干。
3E.将待测HIV‐1血清样本用2％脱脂奶(0.05％PBST稀释)稀释100倍，每孔加入50μL，设置不加血清的孔作为阴性对照，置于37℃恒温箱内孵育1h。
3F.用洗板机洗涤ELISA板五次，洗涤液为PBST(0.05％吐温)，最后一次尽量扣干。
3G.每孔加入50μL的8mol/L尿素，37℃孵育10min。
3H.用洗板机洗涤ELISA板五次，洗涤液为PBST(0.05％吐温)，最后一次尽量扣干。
3I.将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体用2％脱脂奶(0.05％PBST稀释)稀释5000倍，每孔加入50μL，置于37℃恒温箱内孵育30min。
3J.用洗板机洗涤ELISA板五次，洗涤液为PBST(0.05％吐温)，最后一次尽量扣干。
3K.每孔加入辣根过氧化物酶的底物TMB 50μL，室温显色15min后再加入2M H2SO4终止显色，采用酶标仪读取光密度值。
3L.结果判定：光密度值小于阴性对照的平均值加上2倍标准差判定为抗体阴性，光密度值大于等于阴性对照的平均值加上2倍标准差判定为抗体阳性。当待测样本gp41重组蛋白抗体阳性而肽段gp41‐P1抗体阴性时，结果判定为新近感染；当待测样本gp41重组蛋白抗体阳性而肽段gp41‐P1抗体阳性时，结果判断为慢性感染；当gp41抗体阴性时，此样品为HIV‐1抗体阴性。结果如表1所示，本发明前期建立的检测方法和LAg‐Avidity EIA商品化试剂盒在检测横断面研究样本和队列研究样本上的一致性分别为0.887和0.885，说明本发明前期建立的检测方法检测结果是可靠的，gp41‐P1可以用于区分HIV‐1新近和慢性感染。
表1本发明前期建立的检测方法与LAg-Avidity EIA商品化试剂盒在检测HIV-1阳性样本的结果比较
Figure BDA0001692878500000151
Figure BDA0001692878500000161
实施实例5。
将实施实例1中所用的肽段gp41‐P1从氨基端以5个氨基酸递减、人工合成的5条系列多肽gp41‐p1～gp41‐p5，以及从羧基端以5个氨基酸递减、人工合成的5条系列多肽gp41‐p6～gp41‐p10，作为检测抗原，与HIV‐1新近和慢性感染血样反应。通过GraphPad Prism5.0绘制点图分析gp41‐p1～gp41‐p10共10条系列多肽与HIV‐1新近和慢性感染血样反应结果的差异，确定区分新近和慢性感染的检测抗原gp41‐P1的抗原表位。通过比较12条多肽与LAg‐Avidity EIA试剂盒检测结果的一致性及其作ROC曲线后的约登指数，选取最适合作为检测抗原的多肽序列。
具体实施步骤如下：
S1.用PBS将各合成多肽分别稀释成1μg/mL，50ul/孔，4℃包被12小时。0.05％PBST洗涤5次。
S2.5％脱脂奶粉封闭，200μL/孔。37℃，1h。0.05％PBST洗涤5次。
S3.将新近和慢性感染血清样品分别以1:100稀释，50μL/孔，37℃，1h。0.05％PBST洗涤5次。
S4.以1:5000稀释羊抗人酶标抗体，50μL/孔，37℃，30min。0.05％PBST洗涤五次。
S5.各孔加入50μL TMB，室温避光显色15min后用50μL 2M硫酸终止。使用酶标仪测定各孔光密度强度。
表2各肽与试剂盒筛分HIV-1新近/慢性感染结果的一致性比较
Figure BDA0001692878500000162
Figure BDA0001692878500000171
表3 gp41各肽作ROC曲线的结果比较
Figure BDA0001692878500000172
Figure BDA0001692878500000181
S6.结果：使用SPSS 20.0统计软件对实验结果进行分析，结果如图2、表2及表3所示。gp41‐p1～gp41‐p10共10条系列多肽与HIV‐1新近和慢性感染血样反应结果显示，仅gp41‐p10与近长期感染血样无反应，而gp41‐p8和gp41‐p9的反应强度明显弱于gp41‐p1～gp41‐p7，说明最主要抗原表位为GKIIC和QKFLG。跨膜蛋白gp41在HIV‐1病毒与宿主细胞膜融合前被包膜蛋白gp120包裹，氨基端与宿主细胞膜嵌合，羧基端与病毒包膜嵌合，一段时间后形成发卡结构，氨基端与羧基端之间形成半环。经蛋白结构分析主要抗原表位GKIIC和QKFLG恰好位于半环位置，因此跨膜蛋白gp41在与宿主细胞膜融合时的构象变化可能是HIV‐1新近与慢性感染时，抗体应答水平不同的原因。在新近感染时，非主要抗原表位区域的氨基酸可能封闭主要抗原表位暴露。另一方面，综合符合率及约登指数的分析结果表明gp41‐P1作为检测抗原的效果最佳。
实施实例6。
人工合成的1条HIV‐1CRF01_AE亚型和1条HIV‐1CRF07_BC/CRF08_BC亚型跨膜糖蛋白gp41上含57个氨基酸的特异性肽段01AE‐P57和07BC‐P57与HIV‐1CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC三种亚型新近和慢性感染血清反应。以LAg‐Avidity EIA试剂盒为金标准作比较，通过McNemar检验分析两条多肽检测结果与LAg‐Avidity EIA试剂盒的一致性，分析两多肽与不同亚型血样的反应是否有差别。
具体实施步骤如下：
S1.用PBS将各合成多肽分别稀释成2μg/mL，50μL/孔，4℃包被12小时。0.05％PBST洗涤5次。
S2.5％脱脂奶粉封闭，300μL/孔。37℃，1h。0.05％PBST洗涤5次。
S3.将HIV‐1各亚型新近和慢性感染血清样品分别以1:100稀释，50μL/孔，37℃，1h。0.05％PBST洗涤5次。
S4.每孔加入50μL的8mol/L尿素，37℃孵育30min。0.05％PBST洗涤5次。
S5.以1:5000稀释羊抗人酶标抗体，50μL/孔,37℃，30min。0.05％PBST洗涤五次。
S6.各孔加入50μL TMB，室温避光显色15min后用50μL 2M硫酸终止。使用酶标仪测定各孔光密度强度。
表4两肽单独检测与试剂盒筛分HIV-1三种基因亚型新近/慢性感染结果的一致性比较
Figure BDA0001692878500000191
Figure BDA0001692878500000201
S7.结果：使用SPSS 20.0统计软件进行McNemar检验，结果如表4。以LAg‐AvidityEIA试剂盒为金标准作比较，多肽01AE‐P57对CRF01_AE基因亚型血样的筛分结果与试剂盒无统计学差异，并且吻合系数更高。多肽07BC‐P57反应结果与多肽01AE‐P57的结果相同。说明多肽与血样反应时具有亚型特异性，即某亚型的多肽筛分相同亚型血样新近或慢性感染的效果更佳。
实施实例7。
人工合成的01AE‐P57和07BC‐P57两条多肽以1:1混合作为检测抗原，筛分HIV‐1CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC三种亚型血样。以LAg‐Avidity EIA试剂盒为金标准作比较，通过McNemar检验分析本实验室所建立方法与LAg‐Avidity EIA试剂盒的一致性，明确多种亚型肽段混合作为检测抗原能否提高方法灵敏度。
具体实施步骤如下：
S1.用PBS将两合成多肽以1:1稀释成总浓度为8μg/mL，50μL/孔，4℃包被12小时。0.05％PBST洗涤5次。
S2.5％脱脂奶粉封闭，300μL/孔。37℃，1h。0.05％PBST洗涤5次。
S3.将HIV‐1各亚型新近和慢性感染血清样品分别以1:100稀释，50μL/孔，37℃，1h。0.05％PBST洗涤5次。
S4.每孔加入50μL的8mol/L尿素，37℃孵育30min。0.05％PBST洗涤5次。
S5.以1:5000稀释羊抗人酶标抗体，50μL/孔,37℃，30min。0.05％PBST洗涤五次。
S6.各孔加入50μL TMB，室温避光显色15min后用50μL 2M硫酸终止。使用酶标仪测定各孔光密度强度。
S7.结果：使用SPSS 20.0统计软件进行McNemar检验，结果如表5。以LAg‐AvidityEIA试剂盒为金标准作比较，混合肽的筛分结果与试剂盒的无统计学差异，并且吻合系数更高。
表5两肽单独或混合与试剂盒筛分HIV-1两基因亚型新近/慢性感染结果的一致性比较
Figure BDA0001692878500000211
综合以上实施实例的结果，说明本发明使用HIV‐1不同基因亚型的跨膜糖蛋白gp41中57个氨基酸肽段重组融合表达所得到的蛋白MP4作为区分HIV‐1新近和慢性感染的检测抗原，包含更多的抗原表位，覆盖我国主要HIV‐1流行亚型，检测灵敏度和特异性更高，在人群筛检试验中具有更好的应用价值。
实施例8。
提供一种试剂盒，以HIV-1CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型跨膜糖蛋白gp41其中57个氨基酸融合表达作为检测抗原，以HIV-1病毒株HXB2为参考，氨基酸序列位置为560-616aa；
用于筛分HIV-1CRF01_AE基因亚型血样新近和慢性感染的为多肽01AE-P57，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSSWSN；
用于筛分HIV-1CRF07_BC和CRF08_BC基因亚型血样新近和慢性感染的为多肽07BC-P57，，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSN；
用于筛分HIV-1B亚型血样新近和慢性感染的为多肽B-P57，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSN；
用于筛分HIV-1D亚型血样新近和慢性感染的为多肽D-P57，以HIV-1病毒株HXB2为参考，其氨基酸序列位置为560-616aa，氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN。
最后应当说明的是，以上实施实例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照实施实例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 用于区分HIV-1新近与慢性感染的免疫吸附检测方法
<130> GZZRH0504-18-1-353
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg
1 5 10 15
Tyr Leu Lys Asp Gln Lys Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys
20 25 30
Ile Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn
35 40 45
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
1 5 10 15
Lys Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Ile Ile Cys Thr Thr
20 25 30
Ala Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn
35 40
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys Phe Leu Gly Leu
1 5 10 15
Trp Gly Cys Ser Gly Lys Ile Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn
20 25 30
Ser Ser Trp Ser Asn
35
<210> 4
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ile Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn
20 25 30
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Lys Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Ile Ile Cys Thr
1 5 10 15
Thr Ala Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn
20 25
<210> 6
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys
20 25 30
Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Ile Ile Cys Thr Thr Ala
35 40 45
Val Pro
50
<210> 7
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys
20 25 30
Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Ile Ile Cys
35 40 45
<210> 8
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys
20 25 30
Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser
35 40
<210> 9
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys
20 25 30
Phe Leu Gly
35
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp
20 25 30
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ile Ile Cys
20
<210> 12
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys
20 25 30
Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Ile Ile Cys Thr Thr Ala
35 40 45
Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn
50 55
<210> 13
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Thr Arg Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
20 25 30
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala
35 40 45
Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn
50 55
<210> 14
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
20 25 30
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala
35 40 45
Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn
50 55
<210> 15
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
20 25 30
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys His Ile Cys Thr Thr Asn
35 40 45
Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn
50 55
<210> 16
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
1 5 10 15
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
20 25 30
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala
35 40 45
Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly
65 70 75 80
Ile Lys Gln Leu Gln Thr Arg Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys
100 105 110
Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr
130 135 140
Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg
145 150 155 160
Tyr Leu Lys Asp Gln Lys Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys
165 170 175
Ile Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ser Thr Trp Ser Asn Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Gln Gln His Leu Leu
195 200 205
Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala
210 215 220
Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
225 230 235 240
Ser Gly Lys His Ile Cys Thr Thr Asn Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp
245 250 255
Ser Asn

Claims (4)

1.一种融合表达蛋白，其特征在于：用于筛分HIV-1 CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型血样新近和慢性感染，由蛋白连接肽GGGGSGGGGS连接，融合表达B-P57、07BC-P57、01AE-P57和D-P57四个肽段，所述融合表达蛋白的氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSTWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN。
2.一种试剂盒，其特征在于：以权利要求1所述的融合表达蛋白作为检测抗原，用于筛分HIV-1 CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型血样新近和慢性感染。
3.权利要求1所述的融合表达蛋白在制备用于筛分HIV-1 CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型血样新近和慢性感染的试剂盒中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述试剂盒通过免疫吸附检测方法来区分HIV-1新近和慢性感染，所述免疫吸附检测方法包括以下步骤：
S1.分析目标HIV的基因亚型，各亚型最优的检测抗原之间由蛋白连接肽GGGGSGGGGS连接，再对应合成碱基序列并在5’端和3’端分别加上酶切位点，通过酶切连接的方式构建重组质粒；
S2.将重组质粒转化至大肠杆菌，在其中大量诱导融合表达目的蛋白，并进行纯化回收、定量测定、低温保存备用；
S3.将融合表达蛋白作为检测抗原固定至固体支持物上，所述融合表达蛋白的氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSTWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN；
S4.通过封闭液进行封闭；
S5.将待测样本加入一起孵育，待测样本中的特异性抗HIV抗体与检测抗原形成抗原-抗体复合物附着在固体支持物表面，洗去没有结合的样本；
S6.加入8M尿素37℃孵育30min，去除非特异性结合或低亲和力抗体，洗涤；
S7.加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体孵育，与待测样本中的特异性抗HIV抗体结合，洗去没有结合的抗体；
S8.将辣根过氧化物酶的底物加入固体支持物中，孵育一定时间后用2M 硫酸终止，使用酶标仪测定各孔光密度强度，判断待测样本为新近或慢性感染；
其中，融合表达蛋白碱基序列的5’端和3’端分别加上的酶切位点为BamHI和XhoI；重组质粒所用表达载体为pET-28a；大肠杆菌为BL21(DE3)。
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