CN1370078A - 朊病毒蛋白肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

总的来讲本发明的特征在于PrPSc特异性抗体及其诊断、治疗和净化用途。本发明的特征还在于可用作制备PrPSc特异性抗体的免疫原以及用作治疗朊病毒病治疗药物的合成肽。

Description

朊病毒蛋白肽及其应用
                              发明背景
本发明涉及PrPSc-特异性抗体以及用来产生所述抗体的肽。这些抗体适用于检测样品中的PrPSc以及纯化PrPSc。另外，本发明涉及用于检测PrPSc的诊断辅助剂、含有或模拟PrPSc-特异性构象表位的药物以及净化朊病毒的方法。
朊病毒是与神经变性性综合征相关的传染因子，所述综合征的特征为海绵状变化(例如通常主要在灰质中出现的脑微泡)、神经元细胞丧失、与神经元丧失不成比例的星形胶质细胞增生、以及有时在脑中的离散性病斑内累积异常淀粉样蛋白。朊病毒病神经变性可能与其它更常见的神经变性性综合征(例如早老性痴呆(Alzheimer’sDisease)、肌萎缩性侧索硬化和帕金森病(Parkinson’s disease))的某些基本机制相同。
传播这些疾病的病原明显不同于病毒和类病毒，因为在感染材料中一直没有重复检测到核酸组分的化学或物理学证据(Prusiner，Science，216：136-144，1982)。研究朊病毒和由朊病毒引起的疾病的一个主要步骤是发现并纯化称为朊病毒蛋白(PrP)的蛋白质(Bolton等，Science，218：1309-11，1982；Prusiner等，Biochemistry，21：6942-50，1982；McKinley等，Cell，35：57-62)。当采用蛋白酶K消化进行纯化时，在罹患瘙痒病的仓鼠脑中发现了一种27-30 kD蛋白酶抗性蛋白，并将其称为PrP 27-30，后来发现是一种PrPSc片段(Bolton等，Science，218：1309-1311，1982)。
按照朊病毒假说，朊病毒感染性在于PrPSc。PrPSc至少与感染性密切相关，因此看来PrPSc是朊病毒感染的可靠替身。PrPSc是称为PrPC的宿主编码细胞蛋白的构象变异体(Oesch等，Cell，40：735-746，1985)，所述PrPC是连接糖基磷脂酰肌醇(GPI)的细胞表面蛋白，分子量为33-35 kD。
已从正常脑中分离出PrPC，并发现PrPC对蛋白酶敏感，与产生瘙痒病的活性无关(Bendheim等，Ciba Found.Symp.164-177，988)。按照朊病毒学说，PrPC自动催化转换成PrPSc(Prusiner，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 95：13363-83，1998)。最近，据报道PrPC可以在体外通过PrPSc转变成蛋白酶抗性形式(Kocisko等，Nature，370：471-473，1994)。PrPC是进化上保守的膜蛋白，但其真正生物学功能或生理机能尚不了解。不含PrPC的小鼠也可存活，并且没有神经和身体障碍的明显表现(Bueler等，Nature，356：577-582，1992)。另外，这些小鼠对朊病毒感染不敏感，着重说明了PrP在反复感染性方面的中心重要性(Bueler等，Cell，73：1339-1347，1993；Prusiner等，Proc.Natl.Acad. Sci，USA90：10608-10612，1993)。针对性研究PrP敲出(knockout)小鼠揭示突触功能障碍(Collinge等，Nature，370：295-297，1994)以及睡眠调节改变(Tobler等，J Neurosci.，17：1869-79)。此外，已经显示PrPC改变由伴刀豆凝集素A刺激诱导的T细胞活化(Cashman等，Cell 61：185-192，1990)，表明该蛋白质的功能作用。
朊病毒病是一组快速进行性、致死性、无药可治的神经变性性综合征。人类朊病毒病包括克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)，该病存在散发性、医源性和家族性发病形式；以及变异型CJD(“vCJD”)，其可能原因是食用了污染牛海绵状脑病病原的牛组织(参见综述Cashman，Can.Med.Assoc.J.157：1381-5，1997)。CJD偶尔也通过污染的尸体垂体激素、硬脑膜移植、神经外科仪器和角膜移植而在人类中传播(Brown等，Lancet 340：24-7，1992)。通过血及血制品传播CJD的潜在危险性已受到全球广泛关注。此外，与英国牛海绵状脑病(俗称疯牛病)(BSE)一样，羊瘙痒病在北美是一种常见的在经济上重要的朊病毒相关疾病。根据英国农业、渔业和食品部的统计，超过4,347,380头牛已经被销毁，因为认为这些牛可能携带疯牛病病原因子。据英国农业部估计，截止到2002年，疯牛病流行的总损失达到$713亿(billion)。已经证实英国全国已有超过173,000头牛受到感染，然而无数的牛可能已经进入了未检测到的食品供应点。
另外，美国和加拿大现在已经实行BSE流行年和高峰年间居住在英国的个人供血者推迟供血。这样一种限制作为防止传播vCJD危险性的预防措施已被正式通过，从1996年至今，已有60多名英国人受此限制。加拿大血液服务中心(Canadian Blood Services)估计，从1980年至今，该血液服务中心600,000有效供血者中120,000(或22％)曾经到过英国(Montreal Gazette，1999年5月6日)。补充许多新供血者来代替所失去的供血者，引起了各种关注。一种这样的关注是，新供血者的血液不安全，因为只对疾病例如肝炎和人免疫缺陷病毒进行过筛选。
因此，需要适用于大量筛选朊病毒感染的血液或组织的诊断方法。因此能够获得把PrPC和PrPSc区分开来的抗体将在开发用于朊病毒感染的试验中具有重大价值。此外，需要预防和/或治疗朊病毒病的治疗药物。
                        发明概述
如本文所述，获得的证据证实PrP的YYX连续表位可用于产生PrPSc特异性抗体。具体地说，我们已经证明，利用根据PrP序列连续合成的短肽的免疫方案可产生PrPSc特异性高亲和力多克隆抗体和单克隆抗体。此外，也发现这类抗体对PrPC缺乏可检测反应性。在一个实例中，根据从PrPC构象变为PrPSc构象的分子建模分析，建模分析预测所述蛋白质PrPSc同种型的分子表面的溶剂可及序列，从而选择了包括YYR序列的肽。
因此，本发明的特征在于以高结合亲和力结合哺乳动物PrPSc连续YYX表位的表位特异性抗PrP抗体或其片段。所述抗体最好与哺乳动物PrPSc的YYR表位、YYQ表位或YYD表位结合。在优选的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。这类抗体包括IgG抗体、IgM抗体、IgE抗体、IgD抗体或IgA抗体，以及多种片段，例如Fab片段或Fv片段。这样的抗PrP抗体最好是针对特定PrPSc表位。另外，可以用与PrPSc结合的抗体定量测定任何标准诊断测定中的PrPSc。
再一个相关方面，本发明的特征在于表位特异性抗PrP抗体在免疫学检测方法中的应用，以便诊断传染病特异性的朊病毒。如本文所述，可以用适当改造的PrP肽制备与PrPSc特异性反应的抗PrP抗体。本发明尤其涉及含有所述PrP肽和/或表位特异性抗PrP抗体的诊断辅助剂。另外，本发明涉及与疾病特异性的朊病毒蛋白选择性结合而不与正常朊病毒蛋白结合的抗体。
另一方面，本发明的特征在于具有序列酪氨酸-酪氨酸-精氨酸(YYR)的朊病毒蛋白肽。最好是，所述肽是与一种载体连接的三肽，使所述肽免疫原性更强，可制备高亲和力抗PrP抗体。本文介绍了这种三肽的合成。按照本发明，这类短肽(例如，YYR三肽、YYQ三肽或YYID三肽)为朊病毒蛋白PrPSc同种型存在、正常PrPC同种型不存在和/或以允许抗体检测的方式在PrPSc中成簇的决定簇。例如，在所述三种朊病毒蛋白表位中的两种内含有YYR三肽；然而，该三肽以前没有将其鉴定为PrPSc免疫反应性的特异性基础。此外，这类序列在许多物种之间是高度保守的，所述物种包括但不限于牛、人、绵羊、小鼠和仓鼠(图2)。
再一个方面，本发明还的特征在于具有下式的合成肽：
      A-Tyr-Tyr-B-(Tyr-Tyr-B)n(SEQ ID NO：1-11)其中A或者为任何氨基酸或者不存在；B或者为任何氨基酸或者不存在；n为0-10(包括0和10)。在优选的实施方案中，A和B至少一个不为Tyr。在其它优选的实施方案中，A或B选自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp。在其它优选的实施方案中，所述肽与免疫载体连接。这类肽包括但不限于A-Tyr-Tyr-Arg(SEQ ID NO：12)；A-Tyr-Tyr-Gln(SEQ ID NO：13)；A-Tyr-Tyr-Asp(SEQ ID NO：14)；或其任何药学上可接受的盐。
又一个方面，本发明的特征在于具有下式的合成肽：A-Tyr-Tyr-B-C-Tyr-Tyr-D-Tyr-Tyr-(Tyr-Tyr-B)n(SEQ ID NO：15-24)其中A或者为任何氨基酸或者不存在；B或者为任何氨基酸或者不存在；C或者为任何氨基酸或者不存在；D或者为任何氨基酸或者不存在；n为0-10(包括0和10)。在优选的实施方案中，A、B、C和D中的至少一个不为Tyr。在其它优选的实施方案中，A、B、C或D选自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp。在另外优选的实施方案中，A选自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp，而B、C和D选自Arg、Gln、Asp、Glu、Phe或Trp。一种典型的肽包括但不限于A-Tyr-Tyr-Arg-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Tyr(SEQ ID NO：25)或其药学上可接受的盐。在其它的实施方案中，所述肽与免疫载体连接。
另一方面，本发明涉及具有PrPSc抗原性的合成朊病毒短肽(例如，3-10个(包括3个和10个)氨基酸或4-12个(包括4个和12个)氨基酸)，所述朊病毒短肽包括一个或多个下列氨基酸残基：见于小鼠PrP的T189-193的苏氨酸四重复残基或人PrP、绵羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相应氨基酸残基；小鼠PrP的M128、M133或M153氨基酸残基或人PrP、绵羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相应氨基酸残基；小鼠PrP的H186氨基酸残基或人PrP、绵羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相应氨基酸残基；小鼠PrP的Q159、Q167、Q185或Q216氨基酸残基或人PrP、绵羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相应氨基酸残基；小鼠PrP的N158氨基酸残基或人PrP、绵羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相应氨基酸残基；小鼠PrP的M128、M133或M153氨基酸残基或人PrP、绵羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相应氨基酸残基；小鼠PrP的L124或L129氨基酸残基或人PrP、绵羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相应氨基酸残基；或者小鼠PrP的I181或I183氨基酸残基或人PrP、绵羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相应氨基酸残基。
按照本领域已知的方法，可以通过化学合成制备按照本发明的肽。
另外，按照本发明的PrP肽可以用来制备表位特异性抗PrPSc抗体。具体地说，本发明的肽具有高度纯物质的各种优点，并且适合于制备抗PrP抗体，所述抗PrP抗体可以例如在标准免疫测定(例如免疫沉淀法、ELISA和流式细胞术)中用于检测样品中的PrPSc。按照本发明的PrP肽(例如，YYR)既可以用来制备表位特异性抗PrPSc多克隆抗体(抗血清)，又可以用来制备表位特异性抗PrP单克隆抗体。按照本领域已知的标准方法制备这些抗体，并且所述抗体最好与载体材料结合，以便用于产生抗体。
此外，可以合理设计或者从组合文库获得发挥PrPSc特异性暴露的YYX的化合物，所述组合文库模拟YYX与抗YYX抗体的相互作用。这些化合物可用于诊断朊病毒或者用作朊病毒病的治疗药物。
另一方面，本发明的特征在于用于治疗和预防朊病毒病的药用制剂，所述药用制剂包含本发明的PrP肽或结构相关化合物、或多克隆抗体或单克隆抗体和药用载体。这类药物含有按照本发明的PrP肽或表位特异性抗PrP抗体。
如有需要，可以以药学上可接受的盐形式提供本发明的肽和抗体。优选盐的实例是与治疗学上可接受的下列酸的盐：有机酸，例如乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、甲苯磺酸或扑酸(pamoic acid)；以及聚合酸，例如单宁酸或羧甲基纤维素；以及与无机酸的盐，所述无机酸例如氢卤酸(例如盐酸、硫酸或磷酸)。另外，以一种传统模式(例如，口服、胃肠外、经皮或经粘膜给药)，可以采用生物降解的生物相容性聚合物的缓释制剂或通过使用胶粒、凝胶和脂质体将本发明的任何肽或抗体给予哺乳动物、尤其是人。
再一个方面，本发明的特征在于治疗或预防动物(例如人、牛、绵羊、猪、山羊、狗或猫)朊病毒病的方法。在一个优选的实施方案中，所述方法包括给予所述动物治疗有效量的一种表位特异性抗PrP抗体或PrP肽，所述表位特异性抗PrP抗体或PrP肽阻断PrPC转换为PrPSc、抑制PrPSc∶PrPSc集合物的形成、或者阻断PrPC补充PrPSc。也可以用所述PrP肽免疫所述宿主，以通过刺激宿主产生PrPSc特异性抗体而抵抗朊病毒病。
在相关方面，本发明的特征在于用于检测生物样品中的PrPSc的方法和试剂盒。
再一个方面，本发明的特征在于用于净化生物样品中的PrPSc的方法和试剂盒。在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)用所述多克隆抗体或单克隆抗体(或其片段或类似物)处理生物样品，所述处理可形成抗体：PrPSc复合物；和(b)从所述生物样品中回收抗体：PrPSc复合物。这种净化方法也可以包括应用抗体(或其片段或类似物)灌流生物样品，以去除或灭活PrPSc。
另一方面，本发明的特征在于用于治疗朊病毒病的化合物的鉴定方法。所述方法包括以下步骤：(a)在试验化合物存在下，测定抗YYX抗体与PrPSc的结合；和(b)在所述试验化合物不存在时，测定抗YYX抗体与PrPSc的结合；其中在所述试验化合物存在下所述抗YYX抗体与PrPSc的结合水平比在所述试验化合物不存在时所述抗YYX抗体与PrPSc的结合水平低，表明所述试验化合物是可用于治疗朊病毒病的潜在治疗化合物。最好是，所述抗YYX抗体为抗YYR抗体、抗YYD抗体或抗YYQ抗体。
另一方面，本发明的特征在于用于诊断朊病毒病的化合物的鉴定方法。所述方法包括以下步骤：(a)在试验化合物存在下，测定抗YYX抗体与PrPSc的结合；和(b)在所述试验化合物不存在时，测定抗YYX抗体与PrPSc的结合；其中在所述试验化合物存在下所述抗YYX抗体与PrPSc的结合水平比在所述试验化合物不存在时所述抗YYX抗体与PrPSc的结合水平低，表明所述试验化合物是可用于诊断朊病毒病的潜在化合物。
在相关方面，本发明的特征在于按照任一前述方法鉴定的治疗化合物和诊断化合物。
“高结合亲和力”是指亲和常数小于10μM、优选小于1μM、更优选小于100nM、最优选小于10nM的结合。
“朊病毒病”是指一组朊病毒介导的、快速进行性、致死性、无药可治的脑变性性疾病，包括但不限于人类中的克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、变异型克-雅病、医源性克-雅病、家族性克-雅病、库鲁病(Kuru)、格施综合征(Gerstmann-Strussler syndrome)和致死性家族失眠症(Prusiner，Science 252：1515-1522，1991)、羊瘙痒病和牛海绵状脑病、以及最近描述的其它反刍动物和猫朊病毒病。
“朊病毒病的治疗”是指减轻、预防、稳定或延迟与朊病毒病相关的任何症状、尤其是导致海绵状变化、神经元细胞丧失、星形胶质细胞增生、PrPSc蛋白的累积、痴呆或死亡的朊病毒病改变的发生的能力。
“纯化抗体”是指不含所述蛋白质和与其天然结合的天然有机分子的至少60％(重量)的抗体。所述制剂中的抗体，例如YYX特异性抗体(例如YYR特异性抗体、YYQ特异性抗体或YYD特异性抗体)优选为至少75％(重量)、更优选至少90％(重量)、最优选至少99％(重量)。例如采用底物结合YYX的亲和层析和标准技术可以获得纯化抗体。
“YYX”是指具有序列酪氨酸-酪氨酸-X的肽，其中X为任何氨基酸。“YYR”是指具有序列酪氨酸-酪氨酸-精氨酸的肽。“YYQ”是指具有序列“酪氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺”的肽。“YYD”是指具有序列“酪氨酸-酪氨酸-天冬氨酸”的肽。
“治疗组合物”是指适合于给予动物的组合物，所述动物例如哺乳动物(例如人)、家畜(例如牛、山羊、猪或绵羊)或宠物。
“小分子”是指分子量小于或等于10,000道尔顿、优选小于或等于1000道尔顿、最优选小于或等于500道尔顿的化合物。
根据以下描述的优选实施方案和权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
                      附图简述
图1A为显示小鼠重组PrPC的pH相关性构象变化的圆二色性图。在pH为7.0和3.0时PrPC的远紫外线圆二色光谱学显示分子椭圆率改变与在生理pH下主要为α螺旋构象变为在低pH下主要为β折叠构象一致。
图1B为显示小鼠重组PrPC中的芳族环取向的pH相关性变化的荧光光谱曲线图。酪氨酸侧链和色氨酸侧链的特异性荧光变化与用于溶剂可及性的相反倾向一致，因为pH被降低。
图2显示以下PrP氨基酸序列的序列比对：牛(SEQ ID NO：26)、人(SEQ ID NO：27)、绵羊(SEQ ID NO：28)、小鼠(SEQ ID NO：29)和仓鼠(SEQ ID NO：30)。方框突出显示在氨基酸160-162和173-175上的两个高度保守的YYR序列以及在氨基酸235-237上的YYQ/D序列(按照牛的序列)。
图3显示小鼠PrPC的NMR溶液结构，突出显示了YYR序列和YYD序列的位置和取向。没有YYR基序显示芳族环对分子表面的所谓垂直串联取向。
图4为示意图，显示基于PrPC构象变为PrPSc构象的酪氨酸环取向改变的表位产生。如图3所示，PrPC中两个YYR基序的取向使得在所述分子内的一个酪氨酸环为溶剂可及的，而另一个酪氨酸环为溶剂不可及的。(第三个YY基序(在该图中未显示)的取向使得所述酪氨酸环不能相互作用)。在PrP构象转换后，一个或多个YYX基序中的酪氨酸环以垂直串联取向存在于分子表面，所述取向通过π-堆积(pi-stacking)作用稳定。末端平面精氨酸(或在第三个基序中的天冬氨酸/谷氨酰胺)可以加强稳定酪氨酸-酪氨酸的相互作用。
图5显示采用缀合对照蛋白的磁珠的小鼠PrPSc的免疫沉淀(IP)。将与磁珠(泳道9-12)或偶联BSA的磁珠(泳道5-8)的非区别性PrP单克隆抗体6H4与正常(N)或ME7瘙痒病感染(Sc)的小鼠脑匀浆进行反应。在进行免疫沉淀之前用蛋白酶K处理(+)或不用蛋白酶K处理(-)所述脑匀浆。泳道1-4(Load)显示与用于免疫沉淀中的相同脑匀浆量的直接蛋白质印迹。在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下分辨所述免疫沉淀物。印迹用6H4单克隆抗体进行探测后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。
图6显示采用与抗YYR多克隆抗体pAbC2缀合的磁珠的小鼠PrPSc的免疫沉淀(IP)。将偶联pAbC2的磁珠(泳道9-12)或与BSA偶联的磁珠(磁珠，泳道5-8)与正常(N)或ME7瘙痒病感染(Sc)的小鼠脑匀浆进行反应。所述脑匀浆用蛋白酶K进行处理(+)或不用蛋白酶K进行处理(-)，然后进行免疫沉淀。用于所述免疫沉淀中的相同脑匀浆量的直接蛋白质印迹在泳道1-4(Load)中显示。在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下分辨所述免疫沉淀物。印迹用6H4单克隆抗体进行探测后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。
图7显示采用与pAbC2兔多克隆抗体缀合的磁珠的牛PrPSc的免疫沉淀。用6H4(泳道1和2)或pAbC2偶联的磁珠(泳道3和4)免疫沉淀正常或BSE脑匀浆。在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下分辨所述免疫沉淀物。印迹用6H4单克隆抗体进行探测后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。
图8显示采用与抗YYR p165山羊多克隆抗体缀合的磁珠的小鼠PrPSc的免疫沉淀。将偶联抗体的磁珠与正常(N)或ME7瘙痒病感染(Sc)的小鼠脑匀浆进行反应。瘙痒病小鼠脑匀浆样品用蛋白酶K进行处理(+)或不用蛋白酶K进行处理(-)，然后进行免疫沉淀。泳道1-3(p165)亲和纯化的山羊pAb；泳道4-6(IgG)山羊总IgG；泳道7-9(BSA)缀合BSA的磁珠；泳道10-12(6H4)非区别性抗PrP单克隆抗体6H4。在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下分辨所述免疫沉淀物。印迹用6H4单克隆抗体进行探测后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。
图9显示采用与抗YYR小鼠单克隆抗体缀合的磁珠的小鼠PrPSc的免疫沉淀。将偶联单克隆抗体的磁珠与正常(N)或ME7瘙痒病感染(Sc)的小鼠脑匀浆进行反应。该瘙痒病样品用蛋白酶K进行处理(+)或不用蛋白酶K进行处理(-)，然后进行免疫沉淀。1A4(泳道1-3)、2C(泳道4-6)和6B1(泳道7-9)为瘙痒病反应性单克隆抗体。19E(泳道10-12)为不与PrP反应的单克隆抗体。6H4(泳道13-15)为不能将PrPC和PrPSc区分开的抗PrP单克隆抗体。在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下分辨所述免疫沉淀物。印迹用6H4单克隆抗体进行探测后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。在泳道10-12(相当于19E)中，抗体-磁珠缀合物的免疫球蛋白重链(45 kDa)和轻链(30 kDa)分别与PrP二聚体和一种PrP糖基化变异体共迁移。
图10显示抗体-磁珠缀合物的免疫球蛋白轻链和重链渗漏。将单克隆抗体1A4和6B1磁珠缀合物加工后，在脑匀浆不存在时用于SDSPAGE和蛋白质印迹分析。对于这两种抗体-磁珠缀合物均在非还原条件下进行SDS-PAGE凝胶电泳，而对于未缀合的6H4单克隆抗体在还原条件下进行SDS-PAGE凝胶电泳。印迹用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物显色。
图11显示采用与抗YYR 1A4单克隆抗体偶联的磁珠的多个小鼠PrPSc样品的免疫沉淀。将1A4-磁珠缀合物与正常(N，泳道19)、4个ME7(泳道1-8)或5个139A(泳道9-18)瘙痒病感染的小鼠脑匀浆进行反应。所述瘙痒病样品用蛋白酶K进行处理(+)或不用蛋白酶K进行处理(-)，然后进行免疫沉淀。作为对照，将6H4-磁珠缀合物与正常(N，泳道20)小鼠脑匀浆进行反应。在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下分辨所述免疫沉淀物。印迹用6H4单克隆抗体进行探测后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。
图12显示抗YYR单克隆抗体与PrPSc的反应性的构象依赖性。在SDS-PAGE凝胶中在非还原条件下分辨正常(N)、ME7或139A瘙痒病感染的小鼠脑匀浆。印迹用1A4(泳道1-3)或6B1(泳道4-6)进行探测后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。然后所述印迹不经剥离再用6H4(泳道7-9)和山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。
图13显示采用流式细胞术分析与荧光素化抗PrPSc单克隆抗体1A4、2B5、6B1、17B和18B反应的解离的正常小鼠脾细胞。将荧光素化山羊抗小鼠Ig(GAMIg)用作对照。截获时(on acquisition)通过特征性前向和侧向散射参数门控细胞，并且排除碘化丙锭。虚线代表背景荧光；实线代表染色抗体。根据96孔板读出器的荧光素发射测量，单克隆抗体被成功地荧光素标记，并且根据ELISA测定所述单克隆抗体保持对免疫抗原的反应性。
图14显示采用抗YYR小鼠单克隆抗体和山羊多克隆抗体的仓鼠PrPSc的免疫沉淀。将1A4单克隆抗体和p165多克隆抗体-磁珠缀合物与正常(N)或瘙痒病感染的仓鼠脑匀浆(Sc)进行反应。该瘙痒病样品用蛋白酶K进行处理(+)或不用蛋白酶K进行处理(-)，然后进行免疫沉淀。在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下分辨所述免疫沉淀物。印迹用6H4单克隆抗体进行探测后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物进行探测。
图15显示对正常牛脑中的蛋白酶敏感PrPC(泳道1和4)和BSE脑中的PrPC和蛋白酶抗性PrPSc(泳道2和3)的免疫印迹检测。将用蛋白酶K处理或不用蛋白酶K处理的脑匀浆(+或-)在SDS-PAGE电泳上分辨后，转移至PVDF膜上进行免疫印迹。按照标准方法，将膜用mAb 6H4探测，洗涤，然后用ECL显色，最后对X-光胶片曝光。
图16显示证明抗YYR兔多克隆抗体pAbC2特异性识别牛PrPSc的ELISA系统。与吸附的可溶性朊病毒受体胞外域(PC2)或对照蛋白(Mek)反应的BSE脑提取物按照ELISA显示，在受体孔与对照孔中pAbC2对结合PrPSc的检测结果具有统计学显著性(图A；p值＝0.008)。还显示了用pAbC2或mAb6H4通过直接ELISA识别牛重组PrPC(bPrP)(图B)。
                         发明详述
我们发现，在PrP中的一个或多个位点上的YYX表位(例如YYR)的酪氨酸选定芳族侧链的取向限定PrPSc分子表面特异性的连续免疫表位，而按照公开的PrPC NMR结构溶液，已知同样的酪氨酸侧链在PrPC构象中是隐蔽的(Riek等，Nature 382：180，1996；Donne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：13452-7，1997；Zahn等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA，97：145-50，2000)。这一发现有助于产生可用于诊断和治疗目的的PrPSc特异性抗体，以及开发筛选可用于检测或消灭朊病毒及其相关疾病和障碍的新型化合物。制备抗PrPSc的表位特异性抗体
抗体通过独特的氨基酸决定簇或表位特异性识别蛋白质。这些决定簇或表位可以为线性氨基酸序列或通过氨基酸以三维空间形成的特有构象。认为PrPC转换为PrPSc涉及蛋白质构象的主要变化，可能是转变后形成或暴露出独特表位。因此，如本文所讨论的，我们提出了关于朊病毒蛋白转换的所谓侧链假说。按照该方案，通常隐蔽在溶剂不可及PrPC内部的侧链在PrPSc中成为溶剂可及的。因此，预期新暴露侧链的优势在于是疏水性的，其证据是稳定的PrPSc样中间体中疏水性残基的溶剂暴露增加(Swietnicki等，J.Biol.Chem.272：27517-20，1997)。挤出的这些疏水性侧链单独或与通常存在于PrPC分子表面的侧链一起构成抗体识别PrPSc的独特表位基础。此外，预期这些表面可及的疏水性侧链改变PrPSc的溶解度和聚集特性，与该结构同种型的已知特性等同。新的可及侧链也可以参与PrPC补充PrPSc的过程。
检验该假说，始于在体外检查色氨酸环和酪氨酸环的两个疏水性氨基酸侧链的取向，其信息通过荧光光谱学研究获得。首先，通过低pH诱导小鼠重组PrPC的β折叠转换，以便模拟PrPC转换为PrPSc的特征性结构变化(Hornemann和Glockshuber，Proc.Natl.Acad.Sci.95：6010，1998)。图1A说明：根据pH7.0-3.0的圆二色性，分子椭圆率的改变与PrPC从主要为α螺旋改变成主要为β折叠相一致(光谱在适当的相应频率从双最小变成单最小)。
其次，采用标准荧光光谱法，检查重组PrPC中的酪氨酸侧链和色氨酸侧链随pH增加的溶剂可及性(图1B)。该研究基于以下原理：与基它氨基酸侧链相邻的芳族侧链(即在蛋白质内)将具有与暴露于水的芳族侧链不同的特定荧光(例如，Chin等，Biochemistry 31：1945-51，1992)。当重组小鼠PrPC在低pH时，色氨酸和酪氨酸芳族基团呈现与差别溶剂暴露一致的相反行为。
检查人PrPC、牛PrPC和小鼠PrPC的氨基酸序列揭示出13个酪氨酸残基(图2)。人PrP和牛PrP中的11个酪氨酸、小鼠PrP中的10个酪氨酸位于所述蛋白质C末端2/3中，所述蛋白质C末端2/3包含朊病毒感染性必需的足够蛋白酶抗性结构域。值得注意的是，该结构域中的6个酪氨酸以罕见的“YY”成对基序存在(图2)。3对中的2对与C末端精氨酸(R)连接，而第3个YY基序在小鼠和仓鼠中与C末端天冬氨酸(D)连接或在牛、绵羊和人中与C末端的谷氨酰胺(Q)连接。R含有一个末端胍基，而Q和D含有平面羧酰胺和羰基键。在YY基序中这样的一个末端平面氨基酸可以与暴露的酪氨酸环相互作用，以稳定或指导它们的免疫识别。
另外，检查小鼠PrPC、仓鼠PrPC和人PrPC的NMR解析结构揭示，没有鉴定的酪氨酸对的两个环取向为分子表面可及的垂直串联构型(Riek等，Nature，382：180，1996；Donne等，Proc Natl.Acad.Sci.94：13452，1997；Zahn等，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：145-50,2000)(图3)。推测是在酸处理的PrPC或PrPSc表面酪氨酸暴露增加可能与某些酪氨酸对有关。一种稳定的酪氨酸环构象称为π-堆积，其中两个酪氨酸环以略偏移的平行方式堆积(示意性说明见图4)。虽然稳定，但是对结构数据库进行π-堆积表面可及酪氨酸环的初步检索仅鉴定出4种其它具有类似取向的蛋白质，其中没有一个位于膜蛋白胞外域。因此，认为新型PrPSc特异性表位是以π-堆积取向的酪氨酸对，存在或没有精氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸侧链(属于平面氨基酸，也可能参与与其前面的酪氨酸的π-堆积作用)的作用。
除了PrPSc中酪氨酸侧链取向方面的改变外，也可能所述三种YYR基序因为其相互靠近的变化使成为PrPSc免疫学上更可及。典型IgG抗体的组成是：两个相同的抗原结合区通过柔性绞链区与一个恒定区连接。在PrPC构象改变成PrPSc构象期间，YYR基序可能彼此相对移动(Korth等，Nature，390：74-77，1997)，从相对分开移至相对靠近。另外，IgG识别PrPC中的YYR基序可能是不利的，因为两个关键基序位于该分子的不同侧面，使得识别为低亲和力单价性质，而不是其中两个IgG抗原结合区都参与识别的高亲和力相互作用。
我们用牛PrPC和PrPSc获得的数据表明，根据免疫沉淀和ELISA测试，抗YYR抗体特异性识别PrPSc(参见下文)，与PrPSc中和/或YYR表位附近的酪氨酸侧链的可及性改变相一致。还认为氨基酸残基精氨酸在YYR抗体的产生和识别特异性方面是重要的。认为在极性酪氨酸侧链和精氨酸高碱性侧链之间的静电作用归因于YYR表位在通过YYR三肽免疫和衍生抗体识别PrPSc两个方面的性质。值得注意的是，在某些物种(包括人和牛)中，在末端PrP环中的第三个YY二聚体基序与谷氨酰胺结合，谷氨酰胺是对精氨酸的部分保守取代，在某些其它物种(包括小鼠和仓鼠)中，末端PrP环中的第三个YY二聚体基序与天冬氨酸结合，为非保守取代。具有平面侧链的典型氨基酸包括精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺。
PrPC构象转换为PrPSc构象伴随的氨基酸侧链暴露现象可能不只适用于酪氨酸对。可能具有大侧链的其它氨基酸可能存在PrPSc核心耐受性差的侧链，这些侧链单独或与基它局部部分一起构成PrPSc独特免疫反应性的基础。在PrPC和PrPSc之间不同的免疫表位构成用于PrPSc诊断试验的基础，并且也可用于治疗和免疫人和动物，以抵抗朊病毒病。认为疏水侧链暴露使得PrPSc比PrPC的疏水性增加和聚集增强。
在PrPC中溶剂不完全可及的大侧链的实例包括以下氨基酸(按照小鼠PrP序列对氨基酸残基进行编号)：
1.非YYX基序包含的酪氨酸，包括Y127、Y156、Y217。
2.部分不暴露于溶剂的一个苏氨酸四重复残基T189-193。
3.组氨酸H186。
4.谷氨酰胺Q159、Q167、Q185、Q216。
5.天冬酰胺N158。
6.甲硫氨酸M128、M133、M153。
7.亮氨酸L124、L129。
8.异亮氨酸I181、I183。
如下所述，合成含YYR表位的肽。将这些肽与载体缀合后，用于免疫兔子或小鼠，以产生多克隆抗体或单克隆抗体。然后测试多克隆和单克隆抗体对PrPSc的特异性。结果表明，这样的抗体以高结合亲和力特异性结合PrPSc。
提供下述实施例用来说明本发明，而不应认为是限制本发明。PrPSc-特异性抗体
在兔子中，针对与KLH连接的YYR肽产生多克隆抗血清pAbC2。在免疫方案后从每只兔子中收集血清，并用A蛋白柱纯化总IgG。然后在免疫沉淀反应中用得自正常或瘙痒病感染小鼠的脑匀浆测试这些样品的抗PrPSc活性。用于这些研究的脑匀浆的初步分析表明，正常脑提取物中的PrPC量(图5，泳道1)和感染样品中的PrP量(图5，泳道3)均为可检测量。同预期的一样，PrPC对蛋白酶K(PK)消化敏感(图5，泳道2)，而PK消化后显示PrPSc蛋白酶抗性核心(命名为PrP 27-30)的特征性迁移改变(图5，泳道4)。这些脑匀浆与偶联BSA的磁珠一起温育不能沉淀任何可检测的PrP(图5，泳道5-8)，而将所述样品与用6H4(PrP特异性单克隆抗体)偶联的磁珠一起温育免疫沉淀正常脑的PrPC(图5，泳道9)以及感染脑匀浆的PrPSc(图5，泳道11)和PrP27-30(图5，泳道12)。当将pAbC2 IgG与所述磁珠偶联后与正常脑匀浆一起温育时，没有免疫沉淀可检测的PrP(图6，泳道9和10)。引人注目的是，将偶联pAbC2 IgG的磁珠与受感染样品一起温育免疫沉淀PrPSc(图6，泳道11)和PrP 27-30(图6，泳道12)。再一次证实，包括可检测量的PrPC和PrPSc的这些组织(图6，泳道1-4)和偶联BSA的磁珠不能免疫沉淀任何PrP(图6，泳道5-8)。
另外，类似的实验显示，与6H4相比，pAbC2 IgG特异性免疫沉淀BSE感染的牛脑PrPSc(图7)。此外，在ELISA系统中，采用可溶性PC2(朊病毒受体)作为捕获试剂，pAbC2抗体可以识别牛PrPSc，但是在重组牛PrP直接吸附在板上的ELISA研究中不产生信号，尽管使用6H4单克隆抗体可检测(图16)。在蛋白质印迹法中，抗YYRIgG不识别变性的重组牛PrPC(数据未显示)，与以下详述的用小鼠抗YYR单克隆抗体进行的研究相似。
也针对与KLH连接的YYR产生山羊多克隆抗血清。收集血清，经硫酸铵沉淀分离纯化总IgG。也采用缀合YYR的柱子，通过亲和层析，从同一血清纯化YYR反应性IgG。如上详述，将这些抗血清进行一系列的类似筛选并验证免疫沉淀反应。3只免疫山羊中的其中一只产生PrPSc特异性抗血清(p165)(图8)，并进行进一步特征鉴定。如同以上实验，偶联6H4的磁珠不能区别性沉淀受感染小鼠脑的PrPC和PrPSc(图8，泳道10和11)。在该实验中没有观察到6H4免疫沉淀PrP 27-30(图8，泳道12)，偶尔观察到的原因未知。当将免疫山羊的总IgG与所述磁珠偶联时，从正常和受感染小鼠脑匀浆中沉淀的物质即使有也很少(图8，泳道4、5和6)。相反，当将YYR亲和纯化的IgG(p165)与所述磁珠偶联时，从受感染小鼠脑中仅沉淀PrPSc(图8，泳道2)。与得自兔子的pAbC2多克隆不同，山羊抗YYR多克隆不沉淀PrP 27-30(图8，泳道3)。PK消化后，这些提取物都含有可检测PrP 27-30，与此同时使用相同匀浆评价单克隆抗体(参见下文)，并且在PK消化后检测到PrP 27-30(图9，泳道3、6和9)。此外，通过蛋白质印迹分析脑匀浆揭示，受感染小鼠脑匀浆中可检测到PrPSc和PrP 27-30(数据未显示)。
除产生山羊多克隆抗体外，也产生针对同一PrPSc特异性表位的单克隆抗体，但是用原抗原的衍生物，在所述抗原衍生物中多个原YYR肽连接在一起成为一种连续序列。合成YYRRYYRYY(SEQ IDNO：31)，试图增加在所述肽序列中YYR表位的数目，以及增加酪氨酸堆积的机率和/或π-堆积的频率。此外，在5个目的物种中，在朊病毒蛋白中的一个YYR序列前接一个精氨酸(图2)。将YYRRYYRYY肽与KLH连接，随后用该抗原免疫小鼠。分离这些小鼠的脾细胞，并将其与FO小鼠B细胞系(ATCC CRL-1646)融合，以产生特异性杂交瘤克隆。从克隆产生腹水，在ELISA中，腹水与缀合替代载体8map的YYR反应。用A蛋白柱纯化得自这些腹水的IgG，然后用标准方法进行筛选和验证。在免疫沉淀反应中，用得自受感染小鼠的脑匀浆，鉴定出特异性识别PrPSc的5种单克隆抗体(1A4、6B1、2B5、2C和18B)。图9说明这些单克隆抗体中的3种1A4、2C和6B1特异性沉淀PrPSc。与阴性对照抗体19E(图9，泳道10和11)以及非区别性抗体6H4(图9，泳道14和15)相比，观察到p165、1A4、2C和6B1特异性沉淀PrPSc(图9，将泳道1、3和5分别与泳道2、4和6比较)。与p165相反，这些PrPSc特异性抗体中的所有3种均沉淀PrP 27-30(图9，泳道3、6和9)。采用正常小鼠脑匀浆，在1A4、2C和6B1沉淀(图9，泳道1、3和5)以及19E的沉淀中均存在模糊条带，可能代表混合存在的PrPC和从磁珠洗脱出的小鼠IgG轻链及重链的非特异性背景沉淀，所述小鼠IgG轻链和重链随后通过山羊抗小鼠Ig-HRP缀合物检测到(图10)。
继续评价PrPSc特异性单克隆抗体揭示，PrPSc特异性单克隆抗体能够通过构象依赖性表位识别不同鼠品系的PrPSc。如图11所示，将1A4用于对用感染鼠瘙痒病ME7或139A病毒株的不同小鼠制备的大量提取物的免疫沉淀。在这些实验中，发现1A4特异性沉淀PrPSc和PrP 27-30，与病毒株无关。对于其它PrPSc特异性单克隆抗体也观察到这种结果(数据未显示)。当在SDS-PAGE凝胶中在非还原条件下将脑匀浆(正常、ME7和139A感染)进行电泳，然后用一种PrPSc特异性单克隆抗体(1A4或6B1)或6H4探测PrP时，很明显仅6H4能够检测变性PrPC和PrPSc(图12，泳道7、8和9)。对于1A4和6B1，样品变性后丧失PrPSc特异性决定簇，确定了所述表位的构象敏感性。
另外，确定了在正常和PrP-/-敲出小鼠脾细胞表面或离体后立即解离的脑细胞表面，YYR反应性单克隆抗体不识别任何细胞表面蛋白。通过ficol梯度，将脾细胞和脑悬浮液离心，分离小鼠活脾细胞和脑细胞。如图13所示，用所列的缀合FITC的抗体(实线)或用同种型匹配的FITC标记的对照抗体(虚线)染色脾细胞。用碘化丙锭排除分析中的死细胞。脾细胞(图13)或脑细胞(未显示)上缺乏表面免疫反应性表明，YYR构象表位罕见，与上述结构检索结果一样。此外，缺乏明显信号为研究脾细胞和其它受试细胞细胞表面的PrPSc免疫反应性提供可接受的背景。细胞表面PrPSc的检测可用作人和动物朊病毒病感染的诊断试验。最后，细胞表面免疫反应性的缺乏独立证实了这样的事实：抗YYR抗体不识别PrPC，因为脾细胞和脑细胞具有通过6H4免疫组织化学可检测到的表面PrPC(数据未显示)。
还检测了YYR表位的种特异性。在采用瘙痒病感染仓鼠脑匀浆的研究中，发现上述PrPSc特异性单克隆抗体和多克隆抗体免疫沉淀仓鼠PrPSc(图14)。此外，也观测到在采用感染小鼠组织的研究中存在的PrPSc和PrP 27-30相似特异性。例如，单克隆抗体1A4特异性免疫沉淀PrPSc和PrP 27-30(图14，泳道3和4)，而多克隆山羊抗体p165仅特异性免疫沉淀感染仓鼠脑的PrPSc(图14，泳道7、8、9和10)。如果需要的话，可采用本文所述的任何技术特异性免疫沉淀除仓鼠以外的感染绵羊、牛和人组织的PrPSc。材料与方法
采用下列材料和方法获得并测试上述PrPSc特异性抗体。圆二色性
按照Hornemann和Glockshuber(Proc.Natl.Acad.Sci.95：6010，1998)介绍的方法进行圆二色谱检测。于25℃以0.1cm光径的石英杯在62DS型Aviv圆二色谱仪(Lakewood，NJ)上记录远紫外线圆二色谱。从195nm-260nm以1.0nm梯段、1.0nm带宽和收集时间4秒/段获取光谱。实验数据表示为平均残留椭圆率(residue ellipticity)(degθcm2 dmol-1)。荧光光谱学
按照Chin等介绍的方法(Biochemistry 31：1945-51，1992)进行荧光光谱检测。制备免疫性YYR肽
为了获得抗PrPSc抗体，合成具有氨基酸序列乙酰基-Cys-Tyr-Tyr-Arg-NH2(YYR)(SEQ ID NO：32)的肽，使其与KLH缀合，然后采用众所周知的技术将所述肽肌内注射到兔子体内。
在所述肽的氨基末端，加入半胱氨酸残基，使得所述肽可与蛋白载体缀合。经乙酰化封闭所述肽的氨基，经酰胺化封闭所述肽的羧基。肽合成
采用人工固相肽合成法或者自动固相肽合成法(MPS396肽合成仪，Advanced ChemTech)合成肽。用Fmoc肽合成化学完成氨基酸残基的偶联(Fields等，1990，IJPPR 35，161)。在Wang树脂或酰胺Rink树脂上，用侧链完全保护的氨基酸进行合成。由于用Fmoc基团保护氨基酸的α-氨基，因此对于三官能氨基酸侧基选择以下保护基：半胱氨酸：5-三苯基甲基(Trt)精氨酸：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)酪氨酸：叔丁基醚(tBu)
根据偶联反应的化学和难度，将BOP、PyBOP或TBTU用作活化剂。所有化学品购自Advanced ChemTech，Bachem和Calbiochem/NovaBiochem。通过用3-6倍过量的偶联剂和所说的双偶联确保序列残基之间的每个肽键的形成；意味着对于加入至生长肽链中的每个氨基酸都重复偶联反应。从树脂中切下fluo-肽
合成后，用试剂K作为切割混合物：水(2.5％)、TIS(2.5％)、EDT(2.5％)、TFA(92.5％)，从树脂中切下所述肽。然后用冷乙醚沉淀所述肽。将沉淀物离心，用乙醚洗涤三次，溶于20％-50％AcCN/水混合物中，然后冻干。用分析型RP-HPLC和电雾化MS进行粗制品的分析。HPLC纯化
使用RP-HPLC(反相高效液相层析)，在Vydac C18柱(2.5×25cm)上，使用10-50％线性梯度乙腈水溶液与0.06％TFA(1％/分钟梯度，10ml/分钟流速)，在215nm和254nm进行UV监测，从而纯化所述粗制肽。用分析型RP-HPLC评价流分的纯度。获得的终产物为冻干肽，通过分析型RP-HPLC(Vydac C18，0.46×25cm，线性梯度10-60％乙腈水溶液，0.1％TFA，1％/分钟，1ml/分钟流速，在215nm和254nm进行UV吸收检测)估计所述冻干肽的纯度为至少95％。使用SCIEXAPI III质谱仪，按照标准方法，通过分子量分析鉴定该纯肽。分析数据
所述肽在RP-HPLC上的保留时间为21.215分钟。所述肽的理论分子量计算值为644.74；分子量分析的实际分子量实测值为646.5(MW+H+)。肽与载体的偶联
将肽与载体偶联，在本情况下载体为匙孔血蓝蛋白(KLH)。可用于这种偶联的其它载体包括但不限于白蛋白、或卵清蛋白、8map、或溶菌酶。通过与半胱氨酸巯基的硫醚键实现偶联。这种类型的健合有利于肽以确定方式与载体蛋白进行偶联。
与KLH偶联如下进行。将10mg肽溶于2ml磷酸缓冲液(PBS 1x)中。将1ml KLH(Pierce产品目录号77100)加入肽溶液中并搅拌(1mole肽/50个氨基酸)。KLH浓度为10mg/ml。边搅拌边将20μl戊二醛(25％水溶液)加入肽/载体溶液中，温育1小时后，加入甘氨酸终止液。通过PBS透析，从所述肽中分离出肽/载体缀合物。
按照标准方法，例如本文介绍的方法，合成另外的YYR肽(例如，CYYRRYYRYY(SEQ ID NO：33)和CKYEDRYYRE(SEQ ID NO：34))。通过对上述合成方法进行适当改进，可以制备其它合成肽。也采用本领域已知的任何标准方法(例如本文介绍的方法)鉴定这类肽。免疫兔子
按照标准方法制备多克隆抗体，以3-8周的间隔，用重复强化注射增强免疫应答。以蛋白质印迹或ELISA或者两种方法，通过测定抗体浓度证实免疫成功。更具体地说，为了产生针对PrPSc的多克隆抗体，按照164天的免疫方案，将与KLH缀合的三肽YYR注射到兔子体内，然后从产生特异性抗体的动物取血。
为了取免疫前血清样品，每只兔子抽取10ml血作为免疫前对照。首先用弗氏完全佐剂进行初次免疫，随后用弗氏不完全佐剂(IFA)加强免疫(1ml/只兔，0.5ml/每侧股肌)。每次注射包含约200μg纯肽。在第21天、第42天和第70天，用IFA给予强化注射。在第31天、第42天和第80天，从耳中央动脉抽取10ml血液用于效价测定(6ml/kg/只兔)。在第80天，检查血清效价，再以4周间隔注射(IFA)三次，注射后10天取血样。最后一次加强免疫后10天，通过心脏穿刺对麻醉兔子进行取血，并收集抗血清。免疫山羊
按照标准方法产生山羊多克隆抗体。如下免疫3只山羊。在第1天，所有山羊的初次免疫为接受1mg YYR-KLH缀合物的弗氏完全佐剂。对于3只山羊中的2只通过注射1mg YYR-KLH缀合物的弗氏不完全佐剂进行加强免疫，而第3只山羊按受1mg YYR-8map缀合物的弗氏不完全佐剂。通过ELISA，测试3次取血样品的各血清样品对YYR-BSA缀合物的反应性。用第3组血样品，经硫酸铵沉淀纯化总IgG，然后使用YYR亲和柱纯化YYR反应性IgG。按照本文所述测试IgG流分对PrPSc的反应性。严格免疫程序如下：第1天，初次免疫；第21天，第1次加强免疫；第30天，第1次取血；第46天，第2次加强免疫；第53天，第2次加强免疫；第60天，第2次取血；第76天，第3次加强免疫；第83天，第3次加强免疫；第90天，第3次取血。
或者，可以采用本文所述的合成肽和标准杂交瘤技术(参见例如Kohler等，Nature 256，1975；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hydridomas，Elsevier，NY，1981；Ausubel等，1999，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，NewYork)，制备单克隆抗体。制备单克隆抗体后还通过免疫沉淀和蛋白质印迹分析(例如，通过采用Ausubel等介绍的方法，参见上文)测试单克隆抗体对PrP的特异性识别。免疫小鼠
如下制备单克隆抗体。用含小鼠PrP-AP融合蛋白的杆状病毒上清液的弗氏完全佐剂免疫小鼠，然后2周后用同样抗原的弗氏不完全佐剂进行加强免疫。免疫后2周，用PrP-AP上清液加上100μgKLH-CYYRRYYRYY和100μg KLH-CKYEDRYYRE缀合物的混合物加强免疫小鼠。将这些小鼠的脾细胞与FO小鼠B细胞系(ATCCCRL-1646)融合，产生特异性杂交瘤克隆。通过ELISA筛选杂交瘤上清液。没有对PrP-AP或CKYEDRYYRE序列反应的上清液，但是有对YYR-8map缀合物反应的克隆。抗体的纯化
采用Pharmacia A蛋白HiTrap柱，按照生产商的建议，从血清纯化兔总IgG。概括地讲，用3倍柱体积的起始缓冲液(0.2M磷酸钠缓冲液，pH7.0)平衡HiTrap柱。使用注射器通过luer接管将血清加样到柱子上。随后用5ml起始缓冲液洗涤柱子。用0.1M甘氨酸，pH3.0洗脱结合蛋白，并收集于装有1M Tris pH8.0(50μl/500μl样品)的eppendorf管中。在SDS-PAGE上分析流分。
如上所述从血清样品纯化山羊多克隆抗体。
产生的小鼠单克隆抗体为腹水，并用A蛋白柱试剂盒(Pierce)，按照生产商的说明，纯化小鼠单克隆抗体。概括地讲，用结合缓冲液以1∶1终比率稀释腹水样品。然后将样品加样到柱子顶部，该柱子先前已用结合缓冲液平衡，让样品流过基质。收集流出物质，用5倍体积的结合缓冲液洗涤柱子。将温性洗脱缓冲液加入柱子中，以从基质释放结合的IgG抗体。通过转换成IgG洗脱缓冲液收集其它抗体同种型。以1ml流分收集所有抗体，通过BCA以测定总蛋白含量以及经SDS-PAGE电泳以确定抗体纯度的程度来对该流分进行分析。通过使流分通过D-盐柱(Pierce)，使含有最大得率IgG的流分脱盐。分配抗体流分，用PBS将其贮藏于-80℃。
随后如下测试采用前述方法产生的抗体的高亲和力结合。牛脑匀浆的制备
使用两种方法制备牛脑匀浆。在第一种方法(A)中，采用Polytron(OMNI GLH)，将脑样品在组织匀浆缓冲液(10％蔗糖、20mM HEPESpH7.5、2％十二烷基肌氨酸钠和5mM EDTA)中匀浆。使用的匀浆终浓度为1％(w/v)。
在第二种方法(B)中，将脑匀浆制成10％(w/v)溶液。使用Dounce匀浆器(带一个Teflon研棒)以2倍体积的冷裂解缓冲液(100mMNaCl、10mM EDTA、0.5％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠的tris-HCl溶液，pH7.4)将牛脑捣碎。样品在冰上孵育20分钟后，再在匀浆器中匀浆15次。通过在4℃以3000rpm离心15分钟来去除细胞碎片。随后定量测定上清液的蛋白质含量。仓鼠和小鼠匀浆的制备
仓鼠或小鼠脑组织加入足够匀浆缓冲液(PBS 0.5％NP40、0.5％脱氧胆酸盐)，产生10％(重量/体积)匀浆。重复通过18号针和22号针使组织匀浆。连续2次以500g离心20分钟去除细胞碎片。用BCA试剂盒(Pierce)定量测定上清液中的总蛋白，用匀浆缓冲液将浓度调至终浓度为5mg/ml。制备成各200μl等份样品，贮藏于-80℃。磁珠缀合
采用生产商提供的方案，将60-150μl纯化抗体或BSA与大约6×108甲苯磺酰活化的磁珠(Dynal)缀合。概括地讲，将每种抗体的1ml匀质未缀合磁珠悬液洗涤两次，重悬于含抗体或BSA的PBS pH7.4中。混合物在转子上于37℃温育20-24小时。然后旋转下在PBS 0.1％BSA中将混合物洗涤两次，每次5分钟，然后旋转下在封闭缓冲液(0.2M Tris pH8.5 0.1％BSA)中于37℃温育4小时。用PBS 0.1％BSA再洗涤5分钟后，将抗体-磁珠缀合物在PBS 0.1％BSA 1％Tween-20中洗涤10分钟，再用PBS 0.1％BSA洗涤，然后贮藏于4℃。蛋白酶K消化
将牛脑匀浆与蛋白酶K溶液(100μg/ml)于50℃温育30分钟。用蛋白抑制剂PMSF(2 mM)终止消化。
用45μg/ml终浓度蛋白酶K于37℃消化小鼠和仓鼠脑匀浆30分钟。加入19mM PMSF终浓度终止反应。免疫沉淀法
将10μl脑提取物加入950μl免疫沉淀缓冲液(PBS 3％NP-40、3％Tween-20)，于37℃温育30分钟或60分钟。对于评价PrP 27-30与磁珠缀合物反应性的实验，进行温育之前加入50μl 1mg/ml蛋白酶K。将未用蛋白酶K处理的样品于37℃再温育适当时间。温育后，两组试管中都加入60μl 100mM PMSF溶液。然后将100μl重悬浮的磁珠缀合物加入至混合物中，边旋转边于室温下温育2小时。用洗涤缓冲液(PBS 2％NP-40 2％Tween-20)洗涤磁珠3次，每次洗涤后通过涡旋进行重悬。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于20μl 2X加样缓冲液(100mM Tris pH6 8、4％SDS、0.015％溴酚蓝、20％甘油)中，于95℃加热3分钟。蛋白质印迹
按照标准方法，通过蛋白质印迹测定脑匀浆的PrPSc含量。将蛋白质样品与2x样品缓冲液以1∶1比率进行混合，于100℃煮沸5分钟。按照标准方法进行SDS-PAGE分析。将样品与预染色分子量标准参照物(Biorad)一起加样到15％预制丙烯酰胺凝胶(Biorad)中。凝胶于100V进行电泳直至溴酚蓝染料前沿到达凝胶底部。然后在100V将分离的蛋白质转移至PVDF膜上达1小时。在封闭缓冲液中将膜封闭30分钟，封闭后用TBST洗涤膜3次。然后将膜与变性PrP特异性抗体一起于室温下温育2小时。如上所述洗涤膜后，将其与山羊抗小鼠IgG碱性磷酸酶缀合的第二抗体(1∶5000的TBST)一起于室温下温育1小时。洗涤后，用化学发光底物CDP-star产生信号，然后对X-光胶片曝光。流式细胞术
通过使组织通过金属网，从Balb/c小鼠制备脾细胞悬液。用不含Ca2+或Mg2+的冷Dulbecco PBS洗涤细胞1次，在细胞悬液上加入Lympholyte(Cedarlane)并且以1300g离心20分钟分离活细胞。用不含Ca2+或Mg2+2.5％胎牛血清的冷Dulbecco PBS洗涤细胞1次，将0.5×106细胞等份加至圆底96孔板的各孔中。将细胞离心后以1/10终浓度重悬于50μl抗体-FITC缀合物的不含Ca2+或Mg2+2.5％胎牛血清的冷Dulbecco PBS中，在冰上保持15分钟。细胞用不含Ca2+或Mg2+2.5％胎牛血清的冷Dulbecco PBS洗涤2次后，重悬于含1μg/ml碘化丙锭的相同培养基中。在Coulter Epics流式细胞仪上分析细胞并根据大小和粒度(前向和侧向散射)和活力(排除碘化丙锭荧光)门控细胞。FITC抗体缀合
通过使用Fluorotag试剂盒(Sigma)，按照生产商的说明，制备荧光素标记的mAb。概括地讲，用浓碳酸氢盐缓冲液使0.5mg每种抗体升高至pH9，加入FITC储备液，使FITC∶抗体的比率为20∶1。然后将实验瓶于室温下温育2小时。通过使混合物通过Sephadex G-25M柱，将标记抗体与游离FITC分开。采用LJL Biosystems Analyst，通过测量缀合抗体在535nm的FITC发射光，来测试缀合抗体的成功荧光素化，用ELISA针对YYR-8map缀合物测试抗体保留的结合活性。脑匀浆PrP含量的测定
使用mAb6H4通过蛋白质印迹法证实从脑样品制备的提取物中存在PrPC和PrPSc(图3)。在从正常和BSE感染的脑样品制备的提取物中观察到PrPC(33-35 kDa)的分散带型。用蛋白酶K处理提取物后，PrPC被完全消化，而PrPSc显示为27-30 kDa的条带。
所有脑的特征在于存在PrPSc，在合并提取物中占总PrP含量的15-20％(图15)。可溶性原钙粘着蛋白-2(sPC2)的表达
一种PrP结合蛋白PC2用作PrPC和PrPSc的捕获试剂，以证明pAbC2的PrPSc特异性。将含有编码所有6个钙粘着蛋白结构域、但在跨膜结构域的起点处截断的人原钙粘着蛋白-2序列的质粒(HU-PC43 3’trunc/PC1nel)，转染到COS细胞中。收集含可溶形式的原钙粘着蛋白-2的培养基，使用抗PC2单克隆抗体通过蛋白质印迹法，测定sPC2的存在。题目是“朊病毒蛋白结合蛋白及其应用”的WO97/45746描述了PC2作为朊病毒蛋白受体的应用，所述文献通过引用结合到本文中。用ELISA测试pAbC2
采用ELISA方法确定与使用重组PrP(rbPrP)的PrP相比，pAbC2是否有效特异性识别牛脑提取物中的PrPSc，。用含PrPSc的脑提取物合并物或rbPrP测试pAbC2对PrPSc的特异性。
在含50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1mM CaCl2的TBS缓冲液中，用含PC2的培养上清液将Immunolon ELISA板(Dynex)各孔于4℃包被过夜。对于BSE脑提取物实验，将对照各孔用含Mek-4的上清液包被；对于rbPrP实验，将牛奶用作对照，以测定各孔中抗体的非特异性结合。用抗PC2单克隆抗体证实可溶性PC2对ELISA板的包被。使用SLT“Columbus”微量培养板洗涤仪(Tecan)，用含0.05％Tween-20的TBS，洗涤各孔4次，然后通过用0.2％I-Block(Tropix)的TBST填充各孔并将该板于37℃温育1小时来进行封闭。洗涤板，将牛脑匀浆(在TBS中稀释至1％w/v)或rbPrP加入至设计的各孔中，于室温下温育1小时。用TBST洗涤各孔4次。将pAbC2加入至合适孔中，于室温下温育1小时，随后再与100μl抗兔或小鼠IgG/辣根过氧化物酶缀合物(1∶5000)的含1％脱脂牛奶的TBST一起温育45分钟。用TBST洗涤各孔4次。用TMB/H2O2作为过氧化物酶的底物产生信号。15分钟后通过加入100μl 2M磷酸终止反应。采用SLT微量培养板读出器，以620nm为参考波长监测450nm的信号。通过将与PC2结合的PrP和与阴性对照Mek-2或牛奶结合的PrP进行比较，测定特异性阳性信号。免疫前对照显示无结合。
在BSE感染的所有牛脑提取物的情况下，这些点记录的绝对值都比得自正常脑提取物的记录值高，无论所述板上是否存在sPC2。可能BSE样品中的聚集导致与ELISA板各孔的非特异性粘附，因此，记录到的信号较高。然而，BSE样品的值仍然比用Mek-4对照探测同一样品获得的值高。
pAbC2与结合PC2的物质的反应比与结合Mek-4的物质的反应更强，通过比与Mek-4对照的结合高1.5-2倍，表明与PrPSc的结合是特异性的(图16)。在大多数情况下，pAbC2抗体作为第二检测试剂仅与PrPSc阳性样品结合，表明这种试剂的组合可以在未经蛋白酶预处理就能够检测PrPSc。采用免疫沉淀法检测分析PrP
确定pAbC2识别ELISA测定中的PrPSc后，随后进行免疫沉淀法，以验证pAbC2是否可以免疫沉淀牛脑提取物中的PrP。将数个正常或BSE感染的脑提取物的合并物用于本实验中，除非另有说明。所有脑样品先前已鉴定存在PrPSc。概括地讲，将20μl 10％脑匀浆与各种已知与PrP结合的抗体(例如mAb6H4)以及含0.5M GuHCl的TBS中的pAbC2一起于室温下温育2小时。与25μl偶联A蛋白的磁珠或偶联G蛋白的磁珠(Dyna-beads)一起于室温下温育1小时后，用磁铁沉淀琼脂糖磁珠。洗涤沉淀3次后，在SDS样品缓冲液中煮沸，用于蛋白质印迹分析。用抗PrP多克隆抗体或单克隆抗体检测PrP。
使用pAbC2，在含正常脑提取物的反应中未检测到PrP，然而，在含BSE感染样品提取物的反应中检测到与PrP相似位置上的迁移条带(图7)。这些结果进一步证实了ELISA研究结果：即pAbC2对PrPSc是特异性的而对PrPC无特异性。未偶联的磁珠用作阴性对照，显示不能沉淀PrPSc。在免疫沉淀反应中mAb 6H4用作阳性对照。如所预期的一样，使用mAb 6H4有效沉淀正常脑的PrPC。用途
可以将本文描述的PrP肽和PrPSc特异性抗体用于例如以下诊断、治疗、疫苗和净化目的，以及用于筛选可以用于诊断或对抗朊病毒病的化合物或净化朊病毒样品的新型化合物。用于诊断朊病毒病的试验试剂盒
表位特异性抗PrP抗体主要具有在检测或监测朊病毒病方面的诊断用途。例如，采用标准检测方法，可以将抗PrP抗体用于监测生物样品(例如活检组织、细胞或液体)中是否存在PrPSc。免疫测定可以包括直接检测PrPSc，并且尤其适合于筛选存在PrPSc的大量样品。例如，针对连续YYX表位例如YYR产生的多克隆抗体或单克隆抗体(如上所述)可以用于任何标准免疫测定形式(例如ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、流式细胞术或RIA测定)，以测定复合物的形成。另外，因为本文所述抗体对PrPSc有特异性，因此，如有需要，免疫分析前可以不用蛋白酶预处理待测样品。在这些检测方法中可以使用直接或间接显现的任何合适的标记物，包括但不限于任何放射性标记、荧光标记、生色标记(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)、化学发光标标记、可以用标记的半抗原特异性抗体或其它结合配偶体(例如抗生物素蛋白)显现的半抗原(例如洋地黄毒苷或生物素)。例如，在Ausubel等，参见上文，Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryApproach，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)，以及Moynagh和Schimmel，Nature 400：105，1999中描述了典型的免疫测定。例如，使用本文描述的抗体，采用标准流式细胞术法，例如本文所述的那些方法，在细胞表面(例如白细胞)可以容易地检测到PrPSc。与合适对照样品相比，标记复合物水平增加的样品说明存在PrPSc，因此指示存在朊病毒相关疾病。
另外，使用本发明的抗体可以鉴定出可用于诊断朊病毒病的新型化合物。例如，按照标准方法(例如平衡透析、Biacore分析或竞争性抑制)，筛选组合化学文库或小分子文库，以鉴定能够抑制一种或多种抗YYX抗体与YYX表位的结合作用的化合物。这样的文库按照本领域已知方法可以从天然产物、合成(或半合成)提取物或化学文库获得。药物发现和开发领域的技术人员知道，化合物的准确来源对于本发明的筛选方法不是至关重要的。天然化合物来源的实例包括但不限于植物来源、真菌来源、原核生物来源或动物来源以及对现有化合物的修饰。许多方法也可用来随机产生或定向合成(例如半合成或全合成)任何数量的化学化合物，包括但不限于糖、脂质、肽和核酸型化合物。合成化合物文库可以商业性获得或可以按照本领域已知方法产生。此外，如有需要，采用标准化学方法、物理方法或生物化学方法，可以容易地改进任一文库或化合物。
在最低浓度下抑制抗YYX抗体与YYX表位结合的化合物被称为“高亲和力竞争剂”并可用于本发明的诊断方法。随后测试这类模拟抗YYX抗体(例如抗YYX抗体的互补决定区(“CDR”))活性的高亲和力竞争剂对PrPSc的有效识别和结合。鉴定出高亲和力竞争剂后，就可将其与固体支持物(例如ELISA孔或珠)偶联，用作朊病毒感染的任何实际诊断试验的捕获相。使抗PrPSc单克隆抗体转换成IgM
诊断方法也可以使用IgM抗体进行，所述IgM抗体增加对PrPSc的亲和力。为了增加对PrPSc的抗体亲和力，可以如下将特异性结合的IgG Fab区基因构建为五价IgM片段。
免疫球蛋白(Ig)分子由不同结构域和功能域组成。每种免疫球蛋白由2条重链(每条50-80kD)和2条轻链(每条25kD)构成。重链是4种免疫球蛋白基因VH、DH、JH和CH之一重排的产物。前3个基因统称为可变区，它们组合形成重链的结合部位。第4个基因CH也称为恒定区，不参与结合部位的形成，但起免疫系统其它组分识别重链的作用。同样，轻链产生于三种免疫球蛋白基因VL、JL和CL之一拷贝的重排。与重链一样，轻链的结合部位通过VL基因和JL基因组合产生，但不包括CL基因。因此任何特定抗体的结合部位通过两个可变区：VH-DH-JH多肽和VL-JL多肽的相互作用而产生。大多数抗体具有两个这样的结合部位。
在免疫应答过程中，最早产生的免疫球蛋白类型称为IgM。一般而言，IgM含有具有相对低亲和力的结合部位，但是通过每个抗体分子表达五个结合部位而补偿所述特性。随着免疫应答的进展，产生其它抗体例如Ig G，Ig G比之前产生的IgM的亲和力高得多，但每个分子仅有两个结合部位。
如上所述，三肽YYR或相关基序在PrP序列中出现三次。在牛PrP、啮齿类动物PrP和人PrP中，所述基序以二次YYR和一次YYX出现。因此，可能的情况是，特定试剂检测到的所述各基序越多，所述试剂就越敏感。在IgG分子中含有最高亲和力结合部位。然而，因为它们仅有两个结合部位，因此这些抗体不是检测PrPSc的最佳试剂。IgM分子含有足够的结合部位，但它们的亲和力较低，因此它们也不是检测PrPSc的最佳试剂。因此模块式构建Ig分子可解决该问题而且提供了一种构建用于检测PrPSc的最佳Ig的方法。
用于产生抗PrPSc多克隆抗体的YYR-KLH抗原用来免疫小鼠。用本领域已建立的已知产生高亲和力Ig G抗体的方法，免疫小鼠。通过标准方法产生B细胞杂交瘤，然后通过ELISA，测试这些细胞产生的含有分泌单克隆抗体的组织培养上清液对该抗原YYR部分的免疫反应性。采用Heinrichs等(J.Immunol.Methods，178：241-51，1995)介绍的单侧PCR方法，克隆产生所述抗体的重排免疫球蛋白基因。仅需要克隆重链和轻链的可变区。然后，采用标准方法，将这些克隆基因插入到含有合适恒定区的表达载体质粒中，但是在这种情况下，分泌型IgM恒定区可以为任何其它Ig同种型。恒定区可以为小鼠来源或者人来源，人来源的IgM恒定区使所述抗体人源化，从而将其给予人后产生的副作用最小(关于综述参见Winter和Harris，Immunol Today，14(6)：243-6，1993；Vaughan等，Nature Biotech，16(6)：535-9，1998)。然后用现已含有与恒定区(例如衍生自IgM分子)偶联的产生自IgG分子的可变区的载体在细菌表达系统或真核表达系统中驱动产生重组抗PrPSc抗体。关于这种策略的实例参见Poul等，Immunotechnology，1：189-96，1995。
另一方面，按照文献(Marks等，J.Mol.Biol，222：581-597，1991；Vaughan等，Nature Biotech，14：309-14，1996)介绍从噬菌体展示文库选择对YYR-KLH抗原的YYR部分产生最佳反应性的可变区的组合，然后进行分离并亚克隆为上述全长抗体。使抗PrPSc单克隆抗体转换成IgE
检测样品(例如血样)中的PrPSc的一种替代方法包括使抗PrPSc单克隆抗体转换成IgE。PrPSc形成各种大小的聚集物，而通常PrPC不形成这样的聚集物。这些PrPSc多聚物可能存在于受感染个体的血液中。可以利用这种特征以生物测定检测PrPSc。具体地说，通过亚克隆，使PrPSc特异性或与PrPC和PrPSc交叉反应性的单克隆抗体转换成IgE同种型。这将包括与上述相同的方法，使用IgE恒定区代替IgM恒定区。
IgE恒定区特异性细胞表面受体结合IgE抗体。这些受体广泛分布于身体内，并在变态反应中起重要作用。这时所研究的受体，即对IgE(Fc RI)的高亲和力受体存在于肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cells)上。它是由3个多肽链组成的细胞表面受体，并对IgE具有非常强的亲和力(Ka＝10-10M)。每个Fc RI结合一个IgE分子(Kulczycki和Metzger，J.Exp.Med.，140：1676，1974；Barclay等，The Leukocyte Antigen Factsbook，SanDiego：Academic Press，1997)。然而，为了起动信号应答，多个Fc RI受体与多价抗原交联(Metzger，J.Immunol，149：1477，1992)。细胞内信号强度与交联程度成正比。交联后表达Fc RI的细胞脱颗粒，引起快速释放组胺和其它贮藏的介质。
在目前生物测定法中，将血样与PrPSc反应性或PrPC和PrPSc交叉反应性的单克隆抗体一起温育。结合单体PrP和多聚体PrP(例如PrPSc集合物)后，将该混合物与表达Fc RI的细胞系例如RBL-2H3(已知表达2-3×105Fc RI/细胞)一起温育(Barsumian等，Eur.J.Immunol，11：317，1981)。这样的细胞系可得自ATCC。由于Fc RJ的聚集是发生脱颗粒所需要的，所以无论是否与抗体结合的单体PrP都不引起细胞脱颗粒，然而，多聚体PrP可引起细胞脱颗粒。用标准免疫测定例如ELISA直接检测所释放的介质。PrPSc疫苗
本发明的肽及其混合物和组合也可用作疫苗的有效成分，所述疫苗能够在对感染敏感的宿主和/或感染宿主中诱发预防性或治疗性免疫应答以抵抗朊病毒病。给予途径、抗原剂量、注射次数和频率将随物种而变化并且可以与目前临床和/或实验用以产生针对其它传染病或癌症的免疫或治疗疗法同时使用。例如，疫苗是含有本发明肽、其类似物或混合物或其组合的药学上可接受的组合物，用有效量的该组合物治疗哺乳动物(包括人)，产生的免疫力足以保护所治疗的哺乳动物在一定时间内免患朊病毒病。用YYX(YYR、或YYD、或YYQ)或相关化合物免疫激发产生的PrPSc特异性免疫也可有效促进降解PrPSc或缓解所述疾病的临床表现，而不影响PrPC在脑和其它组织中的表达或功能，改善朊病毒病临床症状性患者的临床状态。
按照本领域已知的标准方法可以开发出不同类型的疫苗。例如，疫苗可以是肽型、核酸型、细菌型或病毒型疫苗。更具体地说，关于肽疫苗，相当于PrPSc特异性表位的肽或其功能衍生物可用作多种形式的预防性疫苗或治疗性疫苗，包括：1)PrPSc序列的单体或多聚体，2)与可促进所述表位聚集、促进其提呈或加工的额外序列(例如I/II类靶向序列)和/或增强PrPSc特异性表位的免疫原性或作为增强所述疫苗效能的一种方法的额外抗体、T辅助细胞或CTL表位连续或非连续组合，3)进行化学修饰或与可增强所述疫苗的免疫原性或传递的因子(例如脂肪酸或酰基链、KLH、破伤风类毒素、霍乱毒素等)缀合，4)上述组分的任何组合，5)上述组分与佐剂(包括但不限于铝盐、皂甙或三萜、MPL和霍乱毒素)和/或传递媒介(包括但不限于脂质体、VPL或病毒样粒子、微乳状液、减毒或灭毒细菌和病毒载体以及可降解微球体)的组合，6)通过任一途径给予或一种方法是用抗原离体加载细胞。
核酸型疫苗用作预防或治疗剂的实例包括：1)任何编码表达(转录和/或翻译)PrPSc特异性表位的核酸，2)促进加工和提呈、聚集、分泌、靶向(针对特定细胞类型)PrPSc特异性表位的额外核酸序列，为翻译融合物或独立转录单位，3)用作佐剂/免疫调制剂的额外核酸序列，为翻译融合物或独立转录单位，4)增加PrPSc特异性表位的免疫原性或疫苗效能的额外抗体、T辅助细胞或CTL表位，为翻译融合物或者独立转录单位，5)上述组分的任何组合，6)采用任何途径或离体加载，以盐水(“裸”DNA)或与佐剂(例如铝盐、QS-21、MPL)、免疫调制剂(例如rIL-2、rGM-CSF、rIL-12)和/或核酸传递因子(例如基于聚合物、脂质、肽的可降解粒子、微乳状液、VPL、减毒细菌或病毒载体)的组合给予上述组分。
减毒或灭活细菌或病毒载体可以用来传递抗原或编码表达所述抗原的DNA/RNA。使用这些组分的一种方法也可以是用抗原离体加载细胞。朊病毒净化
本文所述的方法和组合物可用于净化已知或怀疑污染朊病毒的生物样品，例如用于移植的生物样品。具体地说，可以将生物样品与抗PrPSc抗体一起温育，然后采用标准方法去除复合物。或者，可以将抗PrPSc抗体与生物样品一起温育，以与其形式复合物，由此抑制朊病毒的感染性。朊病毒病治疗药物
本发明的方法和组合物也提供治疗或预防哺乳动物朊病毒病的方法，所述哺乳动物包括但不限于人、绵羊、猪、牛、山羊、狗、猫和宠物。如上所述，PrP转换成PrPSc时，酪氨酸二聚体中酪氨酸侧链取向变化或YYX表位(例如YYR/D/Q)的成簇可能导致PrP的物理化学特性改变，例如疏水性和趋向聚集。这些残基也可能在PrPC至PrPSc的转换反应中是重要的。如果这一点能得到证实，则治疗朊病毒病可以基于破坏、抑制、减弱或中和与PrPC转换成PrPSc相关的生物学事件的拮抗剂。YYX(例如YYR)肽免疫主动产生的抗体或被动转移的抗YYX多克隆抗体或单克隆抗体可用于治疗这些疾病。此外，本发明不仅包括完整单克隆抗体，而且包括免疫活性抗体片段。这种片段的实例包括Fab片段或(Fab)2片段、基因工程改造的单链FV分子和嵌合抗体(例如“人源化”抗体)。本文所用的术语“人源化抗体”是指这样的抗体分子：改变非抗原结合区的氨基酸序列，使得所述抗体更类似于人类抗体，而仍保留其原结合能力。按照本领域已知的标准方法，例如描述于以下文献的方法：Kutemeier等(Biotechniques  17：242-246，1994)；Major 等(Hum.AntibodiesHybridomas 5：9-17，1994)；Jolliffe(Int.Rev.Immunol.10：241-250，1993)；Carter等(Biotechnology 10：163-167，1992)；Miyachi等(J.Clin.Lab.Anal.6：343-50)和Leung等(Mol.Immunol.32：1413-1427，1995)，构建和特征鉴定人源化型非人类(例如小鼠)抗体。人源化抗体可能具有较低免疫原性并可用于被动免疫疗法。此外，本发明的嵌合抗体可以包括(如果需要)非人类抗体的可变区(例如小鼠可变区)和人类抗体的恒定区。在本发明的某些实施方案中，将抗体或抗体片段与可检测标记连接。可检测标记的实例包括放射性标记、非放射性同位素标记、荧光标记、酶标记和比色标记。
此外，YYR表位结构衍生的小分子(包括但不限于酪氨酸侧链衍生物)可以阻断所述转换反应。最后，直接化学修饰关键残基，例如酶解酪氨酸环，或用大量取代共价衍生酪氨酸环也可以破坏PrPC至PrPSC的转换反应，如果证实YYR表位中的氨基酸在转换过程中是关键的话。
例如，这样的化合物可以采用本发明的抗体进行鉴定。因此，按照标准方法(例如平衡透析、Biacore分析或竞争性抑制)，筛选组合文库或小分子文库或两者(参见下文)，鉴定具有抑制一种或多种抗YYX抗体与YYX表位结合作用的能力的化合物。抑制这种抗体结合的化合物可用于本发明的疗法中。鉴定后测试这类化合物抵抗任何合适模型系统朊病毒病的能力。
评价试验拮抗剂是否对朊病毒病的体内发生产生保护作用一般涉及采用已知罹患这种疾病的动物(例如，Chandler，Lancet 6：1378-1379，1961；Eklund等，J.Infectious Disease 117：15-22，1967；Field，Brit.J.Exp.Path.8：129-239，1969)。按照标准方法，用试验化合物处理一种合适的动物(例如小鼠或仓鼠)，与未处理对照动物相比，朊病毒相关疾病的发病率降低或发病或病程延迟，则说明产生了保护作用。将试验化合物给予先前已注射朊病毒因子的动物，或者，使朊病毒和所述化合物预温育，然后将朊病毒/化合物混合物注射到试验动物，从而测试试验化合物中和朊病毒因子的能力。用于治疗或预防朊病毒病的分子(例如，如上所述的拮抗剂)被称为“抗朊病毒治疗药物”。
另一方面，PrPSc反应性循环抗体可能通过稳定PrPSc的构象而起恶化所述疾病的作用。因此，阻断这些内源性抗体的作用可以减慢所述疾病的进程或具有其它有益效应。YYR特异性单克隆抗体可以用作产生对YYR特异性抗体结合部位反应的另一组单克隆抗体的底物。第二组这些抗体被称为抗独特型抗体。抗独特型抗体可用于中和循环PrPSc反应性抗体。
按照本发明的抗朊病毒治疗药物可以与药学上可接受的稀释剂、载体、或赋形剂一起以单位剂型给予。例如，可以使用常规药学操作提供合适的制剂或组合物，将这样的抗朊病毒治疗药物给予罹患朊病毒病或朊病毒病前症状或朊病毒病风险的动物。可以使用任何合适给药途径，例如，胃肠外、静脉内、皮下、肌内、颅内、眼眶内、眼、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂或经口给药。
用于制备制剂的本领域熟知的方法可在例如“Remington’sPharmaceutical Sciences”中找到。用于胃肠外给药的制剂可以含有例如赋形剂、无菌水、或盐水、聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)、植物油或氢化萘。生物相容的、生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制所述化合物的释放。用于抗朊病毒治疗化合物的其它潜在有效的胃肠外传递系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物粒子、渗透泵、植入输注系统和脂质体。吸入制剂可以含有赋形剂(例如乳糖)，或可以为含有例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可以为滴鼻剂形式或凝胶的油性溶液。
本发明的方法可以用于缓解或预防任何动物的本文所述疾病，所述动物例如人、家养宠物或家畜。当治疗非人类动物时，所使用的抗朊病毒治疗药物最好是该物种专有的治疗药物。
本说明书中所提及的所有出版物和专利申请通过引用结合到本文中，其引用程度与每个单独出版物或专利申请通过引用具体而单独地结合到本文中的程度一样。
其它实施方案在以下权利要求书的范围内。
                               序  列  表<110>卡普利昂药品公司(Caprion Pharmaceuticals，Inc.)<120>朊病毒蛋白肽及其应用<130>50111/002WO2<150>60/140,634<151>1999-06-23<160>34<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(4)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>1Xaa Tyr Tyr Xaa1<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(7)<223>Xaa＝任何氨基酸  <400>2Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1               5<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(10)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>3Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1               5                  10<210>4<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(13)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>4Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1               5                  10<210>5<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(16)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>5Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1               5                  10                  15<210>6<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(19)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>6Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1               5                  10                  15Tyr Tyr Xaa<210>7<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(22)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>7Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1               5                  10                  15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa
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    35<210>24<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(40)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>24Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1               5                  10                  15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr
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    35              40<210>25<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>变异体<222>(1)...(10)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>25Xaa Tyr Tyr Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr Tyr1               5                  10<210>26<211>264<212>PRT<2 13>牛(Bos taurus)<400>26Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala1               5                  10                  15Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
        20                  25                  30Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly
    35                  40                  45Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
50                  55                  60Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65                  70                  75                  80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
            85                  90                  95Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys
        100                 105                 110Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala
    115                 120                 125Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala
130                 135                 140Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr145                 150                 155                 160Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro
            165                 170                 175Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn
        180                 185                 190Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn
    195                 200                 205Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met
210                 215                 220Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly225                 230                 235                 240Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser
            245                 250                 255Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
        260<210>27<211>253<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp1               5                  10                  15Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn
        20                  25                  30Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
    35                  40                  45Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly
50                  55                  60Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly65                  70                  75                  80Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His
            85                  90                  95Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
        100                 105                 110Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr
    115                 120                 125Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp
130                 135                 140Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln145                 150                 155                 160Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val
            165                 170                 175His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr
        180                 185                 190Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg
    195                 200                 205Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala
210                 215                 220Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val225                 230                 235                 240Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
            245                 250<210>28<211>256<212>PRT<213>绵羊(Ovis aries)<400>28Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala1               5                  10                  15Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
        20                  25                  30Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly
    35                  40                  45Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
50                  55                  60Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65                  70                  75                  80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly
            85                  90                  95Gly Ser His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
        100                 105                 110Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
    115                 120                 125Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe
130                 135                 140Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr145                 150                 155                 160Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Arg Tyr Ser Asn Gln Asn
            165                 170                 175Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val
        180                 185                 190Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile
    195                 200                 205Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu
210                 215                 220Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser225                 230                 235                 240Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
            245                 250                 255<210>29<211>254<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>29Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp1               5                  10                  15Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn
        20                  25                  30Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
     35                  40                  45Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp
 50                  55                  60Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp65                  70                  75                  80Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn
             85                  90                  95Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala
         100                 105                 110Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met
     115                 120                 125Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp
 130                 135                 140Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val145                 150                 155                 160Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His
             165                 170                 175Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr
         180                 185                 190Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val
     195                 200                 205Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr
 210                 215                 220Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro225                 230                 235                 240Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
             245                 250<210>30<211>254<212>PRT<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)<400>30Met Ala Asn Leu Ser Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Ala Met Trp1               5                  10                  15Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn
         20                  25                  30Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
     35                  40                  45Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly
 50                  55                  60Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly65                  70                  75                  80Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His
             85                  90                  95Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
         100                 105                 110Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr
    115                 120                 125Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Met His Phe Gly Asn Asp
130                 135                 140Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Asn Arg Tyr Pro Asn Gln145                 150                 155                 160Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn Asn Phe Val
            165                 170                 175His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr
        180                 185                 190Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile Met Glu Arg
    195                 200                 205Val Val Glu Gln Met Cys Thr Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala
210                 215                 220Tyr Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ala Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro225                 230                 235                 240Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Met Val Gly
            245                 250<210>31<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>31Tyr Tyr Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr Tyr1               5<210>32<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>32Cys Tyr Tyr Arg1<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>33Cys Tyr Tyr Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr Tyr1               5                  10<210>34<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>34Cys Lys Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu1               5                  10

Claims (80)

1.一种抗体或其片段，该抗体或其片段以高结合亲和力与哺乳动物PrPSc的YYX表位结合。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体基本上不结合PrPC。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体与哺乳动物PrPSc的YYR表位结合。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是针对PrPSc的YYR表位产生的多克隆抗体。
5.权利要求4的抗体，其中所述YYX表位是CYYR(SEQ ID NO：32)的组成部分。
6权利要求1的抗体，其中所述抗体是针对PrPSc的YYR表位产生的单克隆抗体。
7.权利要求6的抗体，其中所述YYR表位是CYYRRYYRYY(SEQ ID NO：33)的组成部分。
8.权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgG、IgM、IgE、IgD或IgA。
9.权利要求1的抗体，其中所述抗体片段是Fab片段或Fv片段。
10.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体以高结合亲和力与哺乳动物PrPSc的YYX表位结合。
11.权利要求10的杂交瘤，其中所述抗体基本上不结合PrPC。
12权利要求10的杂交瘤细胞系，其中所述抗体与哺乳动物PrPSc的YYR表位结合。
13.权利要求12的杂交瘤细胞系，其中所述YYR表位是CYYRRYYRYY(SEQ ID NO：33)的组成部分。
14.一种组合物，该组合物包含权利要求1-9中任一项的抗体。
15.权利要求14的组合物，其中所述组合物还包含一种载体。
16.权利要求14的组合物，其中所述组合物为治疗组合物。
17.一种免疫试验试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-9中任一项的抗体以及检测所述抗体的方法。
18.一种用于检测生物样品中的PrPSc的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在允许权利要求1-9的抗体和PrPSc形成复合物的条件下，使所述生物样品与所述抗体接触；和
(b)检测所述复合物，存在所述复合物说明所述生物样品中存在PrPSc。
19.权利要求18的方法，其中所述抗体基本上不结合PrPC。
20.权利要求18的方法，其中所述抗体是多克隆抗体或其片段。
21.权利要求18的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
22.权利要求18的方法，其中所述生物样品包括组织或细胞、组织或细胞提取物、体液或活检组织。
23权利要求18的方法，其中所述PrPSc来自人、家畜或宠物。
24.权利要求18的方法，其中采用ELISA、RIA、蛋白质印迹法、免疫沉淀法或流式细胞术检测所述复合物。
25.一种用于治疗或预防哺乳动物PrPSc病的方法，该方法包括给予所述哺乳动物用药学上可接受的载体配制的有效量的权利要求1-9的抗体。
26.一种包含YYX、YYR、YYD或YYQ氨基酸序列的肽，所述肽具有PrPSc抗原性。
27.权利要求26的肽，其中所述肽由18个或少于18个氨基酸组成。
28.权利要求26的肽，其中所述肽由12个或少于12个氨基酸组成。
29.权利要求26的肽，其中所述肽由8个或少于8个氨基酸组成。
30.权利要求26的肽，其中所述肽由5个或少于5个氨基酸组成。
31.权利要求26的肽，其中所述肽与一种免疫原性载体融合。
32.权利要求26的肽，其中所述免疫原性载体是血清清蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白、8map或溶菌酶。
33.权利要求26的肽，其中所述肽是具有氨基酸序列YYR的三肽。
34.一种具有下式的合成肽：
               A-Tyr-Tyr-B-(Tyr-Tyr-B)n其中A为任何氨基酸或者不存在；其中B为任何氨基酸或者不存在；和其中n为0-10，包括0和10。
35.权利要求34的肽，其中A和B中的至少一个不为Tyr。
36.权利要求34的肽，其中A或B选自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp。
37.权利要求34的肽，其中所述肽为A-Tyr-Tyr-Arg(SEQ ID NO：12)或其药学上可接受的盐。
38权利要求34的肽，其中所述肽为A-Tyr-Tyr-Gln(SEQ ID NO：13)或其药学上可接受的盐。
39.权利要求34的肽，其中所述肽为A-Tyr-Tyr-Asp(SEQ ID NO：14)或其药学上可接受的盐。
40.权利要求34的肽，其中所述肽与一种免疫载体连接。
41.一种具有下式的合成肽：
              A-Tyr-Tyr-B-C-Tyr-Tyr-D-Tyr-Tyr-(Tyr-Tyr-B)n其中A为任何氨基酸或者不存在；其中B为任何氨基酸或者不存在；其中C为任何氨基酸或者不存在；其中D为任何氨基酸或者不存在；和其中n为0-10，包括0和10。
42.权利要求41的肽，其中A、B、C和D中的至少一个不为Tyr。
43.权利要求41的肽，其中A、B、C或D选自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp。
44.权利要求41的肽，其中A为Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp，而B、C和D选自Arg、Gln、Asp、Glu、Phe或Trp。
45.权利要求41的肽，其中所述肽为A-Tyr-Tyr-Arg-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Tyr(SEQ ID NO：25)或其药学上可接受的盐。
46.权利要求41的肽，其中所述肽与一种免疫载体连接。
47.一种用于产生以高结合亲和力与哺乳动物PrPSc结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供一种朊病毒蛋白肽，该蛋白肽包含具有两个或两个以上氨基酸侧链的可及表位；
(b)用步骤(a)的所述朊病毒蛋白肽免疫哺乳动物；和
(c)从所述哺乳动物组织或从用所述组织制备的杂交瘤中纯化所述抗体。
48权利要求47的方法，其中所述抗体基本上不结合PrPC。
49.权利要求47的方法，其中所述抗体是多克隆抗体或其片段。
50.权利要求47的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
51.权利要求47的方法，其中所述朊病毒蛋白肽包含YYX氨基酸序列。
52权利要求51的方法，其中所述朊病毒蛋白肽包含YYR或YYQ或YYD氨基酸序列。
53.权利要求47的方法，其中所述朊病毒蛋白肽由18个或少于18个氨基酸组成。
54.权利要求47的方法，其中所述朊病毒蛋白肽由12个或少于12个氨基酸组成。
55.权利要求47的方法，其中所述肽由8个或少于8个氨基酸组成。
56.权利要求47的方法，其中所述肽由5个或少于5个氨基酸组成。
57.权利要求47的方法，其中所述朊病毒蛋白肽包括权利要求34或权利要求41的肽。
58.一种抗PrPSc病的疫苗，该疫苗包含权利要求26、34或41中任一项的肽和一种药学上可接受的载体。
59.一种针对PrPSc病免疫哺乳动物的方法，该方法包括给予有效量的权利要求58的疫苗。
60.一种组合物，该组合物包含权利要求26-46中任一项的肽。
61.权利要求60的组合物，其中所述组合物为治疗组合物。
62.一种用于净化生物样品中的PrPSc的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用权利要求1-9中任一项的抗体处理生物样品，其处理时间足以允许形成抗PrPSc抗体：PrPSc复合物；和
(b)从所述生物样品中回收所述抗PrPSc抗体：PrPSc复合物。
63.权利要求62的方法，其中所述生物样品为组织、体液或器官。
64.权利要求62的方法，其中用所述抗体灌注所述生物样品。
65.一种抑制生物样品中的PrPSc的方法，该方法包括：
用权利要求1-9中任一项的抗体处理生物样品，其处理时间足以允许形成抗PrPSc抗体：PrPSc复合物。
66.权利要求65的方法，其中所述生物样品为体液、组织或器官。
67.权利要求65的方法，其中用所述抗体灌注所述生物样品。
68.一种鉴定治疗朊病毒病的候选化合物的方法，该方法包括：
(a)测定在试验化合物存在下抗YYX抗体与PrPSc的结合；和
(b)测定在所述试验化合物不存在时所述抗YYX抗体与PrPSc的结合；
其中在所述试验化合物存在下所述抗YYX抗体与PrPSc的结合水平比在所述试验化合物不存在时所述抗YYX抗体与PrPSc的结合水平低，表明所述试验化合物是用于治疗朊病毒病的潜在治疗化合物。
69.权利要求68的方法，其中所述抗YYX抗体是抗YYR抗体、抗YYD抗体或抗YYQ抗体。
70.权利要求68的方法，其中所述朊病毒病影响人类、家畜或宠物。
71.权利要求68的方法，其中所述朊病毒病影响人类、牛、绵羊或山羊。
72.权利要求68的方法，其中所述试验化合物是一种小分子。
73.一种化合物，该化合物为按照权利要求68的方法鉴定的化合物。
74.一种鉴定用于诊断朊病毒病的化合物的方法，该方法包括：
(a)测定在试验化合物存在下抗YYX抗体与PrPSc的结合；和
(b)测定在所述试验化合物不存在时所述抗YYX抗体与PrPSc的结合；
其中在所述试验化合物存在下所述抗YYX抗体与PrPSc的结合水平比在所述试验化合物不存在时所述抗YYX抗体与PrPSc的结合水平低，表明所述试验化合物是用于诊断朊病毒病的潜在化合物。
75.权利要求74的方法，其中所述抗YYX抗体是抗YYR抗体、抗YYD抗体或抗YYQ抗体。
76.权利要求74的方法，其中所述朊病毒病影响人类、家畜或宠物。
77.权利要求74的方法，其中所述朊病毒病影响人类、牛、绵羊或山羊。
78.权利要求74的方法，其中所述试验化合物是一种小分子。
79.一种化合物，该化合物是按照权利要求74的方法鉴定的化合物。
80.一种抗体，该抗体为按照权利要求47的方法产生的抗体。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297663C (zh) * 2003-05-07 2007-01-31 中国科学院微生物研究所 一类重组基因产生的朊蛋白（PrPC）融合变构体及其用途
CN102241741A (zh) * 2002-12-03 2011-11-16 病原体切除与诊断科技公司 朊病毒蛋白配基和使用方法
WO2012013136A1 (zh) * 2010-07-27 2012-02-02 国立彰化师范大学 酪氨酸酶多肽抑制剂
CN102365096A (zh) * 2009-03-25 2012-02-29 洛斯阿拉莫斯国家安全有限责任公司 传染剂的快速死前检测
TWI419711B (zh) * 2010-07-27 2013-12-21 Univ Nat Changhua Education Tyrosinase polypeptide inhibitor
CN108409865A (zh) * 2018-01-19 2018-08-17 鄞州出入境检验检疫局综合技术服务中心 特异性双酚a羊多克隆抗体及其应用

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7041807B1 (en) 1999-06-23 2006-05-09 Caprion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to a YYX epitope of a mammalian prion protein
EP1294759A1 (en) * 2000-06-26 2003-03-26 Universität Zürich Prion-binding activity in serum and plasma determined as plasminogen and fibrinogen
US7303907B2 (en) 2001-01-08 2007-12-04 Health Protection Agency Degradation and detection of TSE infectivity
GB2376071A (en) * 2001-05-31 2002-12-04 Mini Agriculture & Fisheries Method for typing a TSE strain
GB2379737A (en) * 2001-09-05 2003-03-19 Univ Geneve Diagnostic method for spongiform encephalopathy disease
EP1442300A2 (en) * 2001-11-09 2004-08-04 King's College London Diagnosis demyelinating or spongiform disease
AU2003205623A1 (en) * 2002-01-18 2003-07-30 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates
EP1572937B1 (en) * 2002-04-09 2012-02-08 The Scripps Research Institute Motif-grafted hybrid polypeptides and uses thereof
EP1382971A1 (en) * 2002-07-17 2004-01-21 Pepscan Systems B.V. Detection of prion disease
US20040072236A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-15 Neil Cashman PrPSc -interacting molecules and uses thereof
CA2502198A1 (en) * 2002-10-30 2004-05-13 Proteome Sciences Plc Diagnostic method for transmissible spongiform encephalopathies (prion diseases)
GB0227886D0 (en) * 2002-11-29 2003-01-08 Medical Res Council Prion inhibition
JP4709149B2 (ja) 2003-08-13 2011-06-22 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド プリオン特異的ペプチド試薬
JP4668191B2 (ja) 2003-08-20 2011-04-13 アモールフィックス・ライフ・サイエンシィズ・リミテッド タンパク質立体配座を検出するためのエピトープ保護アッセイおよび方法
RU2251699C1 (ru) * 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
US7482172B2 (en) 2005-09-19 2009-01-27 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Peptides for discrimination of prions
AU2005209592B2 (en) 2004-09-30 2012-07-12 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Peptides for discrimination of prions
WO2007030804A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Novartis Ag Prion-specific peptoid reagents
US7794692B2 (en) 2005-12-02 2010-09-14 Amorfix Life Sciences Ltd. Methods and compositions for detecting amyotrophic lateral sclerosis
US7887803B2 (en) 2005-12-02 2011-02-15 Amorfix Life Sciences Methods and compositions to treat misfolded-SOD1 mediated diseases
JP5823663B2 (ja) 2006-03-03 2015-11-25 プロミス ニューロサイエンシズ インコーポレイテッド ミスフォールドｓｏｄ１媒介疾患を処置および検出するための方法および組成物
US7601506B2 (en) * 2006-07-28 2009-10-13 Idexx Laboratories, Inc. Identification of leucocytes bearing diagnostic markers for transmissible spongiform encephalopathies
AU2009239651B2 (en) 2008-04-25 2013-12-12 University Of Saskatchewan Prion epitopes and methods of use thereof
EP2128618A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-02 Prion Diagnostica S.r.l. A process for monitoring the presence of pathogenic agents in biological fluids by nanostructured materials
JP5898495B2 (ja) * 2008-10-06 2016-04-06 ザ ユニヴァーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア ミスフォールドタンパク質エピトープを予測するための方法およびシステム
WO2010111508A1 (en) 2009-03-25 2010-09-30 Los Alamos National Security, Llc Fiber optical assembly for fluorescence spectrometry
EP2666020A1 (en) * 2011-01-18 2013-11-27 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods for amplification and detection of prions
CA2877505C (en) * 2012-06-12 2020-09-22 Helix Biopharma Corp. Antibodies and conjugates that target misfolded prion protein
US9809620B2 (en) 2013-04-30 2017-11-07 University Of Saskatchewan Prion disease-specific epitopes and methods of use thereof
EP3966227A1 (en) 2019-05-07 2022-03-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU675053B2 (en) * 1991-12-03 1997-01-23 Proteus Molecular Design Limited Fragments of prion proteins
AU4376093A (en) * 1992-05-15 1993-12-13 Instituto Nazionale Neurologico C. Besta Soluble prion polypeptides, and methods for detecting and purifying thereof
EP0852011B1 (en) * 1995-09-14 2004-03-31 The Regents of the University of California ANTIBODIES SPECIFIC FOR NATIVE PrP?Sc
US5750361A (en) * 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
US5891641A (en) * 1997-02-21 1999-04-06 The Regents Of The University Of California Assay for disease related conformation of a protein
EP0861900A1 (en) * 1997-02-21 1998-09-02 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Immunological detection of prions
US6165784A (en) * 1997-10-14 2000-12-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Antibodies for the detection of prion protein as an indication of transmissible spongiform encephalopathies

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102241741A (zh) * 2002-12-03 2011-11-16 病原体切除与诊断科技公司 朊病毒蛋白配基和使用方法
CN1297663C (zh) * 2003-05-07 2007-01-31 中国科学院微生物研究所 一类重组基因产生的朊蛋白（PrPC）融合变构体及其用途
CN102365096A (zh) * 2009-03-25 2012-02-29 洛斯阿拉莫斯国家安全有限责任公司 传染剂的快速死前检测
WO2012013136A1 (zh) * 2010-07-27 2012-02-02 国立彰化师范大学 酪氨酸酶多肽抑制剂
TWI419711B (zh) * 2010-07-27 2013-12-21 Univ Nat Changhua Education Tyrosinase polypeptide inhibitor
CN108409865A (zh) * 2018-01-19 2018-08-17 鄞州出入境检验检疫局综合技术服务中心 特异性双酚a羊多克隆抗体及其应用

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