TWI419711B - Tyrosinase polypeptide inhibitor - Google Patents

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TWI419711B
TWI419711B TW99124767A TW99124767A TWI419711B TW I419711 B TWI419711 B TW I419711B TW 99124767 A TW99124767 A TW 99124767A TW 99124767 A TW99124767 A TW 99124767A TW I419711 B TWI419711 B TW I419711B
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Description

酪胺酸酶多肽抑制劑
本發明係關於一種酪胺酸酶抑制劑，特別係關於一種含有多肽之酪胺酸酶抑制劑。
 1.　黑色素的來源及功能
在胚胎發育時，由神經脊(neuralcrest)分化出的黑色素細胞(melanocytes)，會分布在皮膚(表皮基底層)、眼睛-視網膜色素上皮、葡萄膜(uveal tract)、毛囊基質、耳朵-血管紋(stria vascularis)、黏膜和中樞神經系統-軟腦膜(leptomeninges)。在黑色素細胞中有一膜結合(membrane-bound)胞器稱為黑色素體(melanosomes)會合成黑色素(melanin)，當黑色素合成出來後，會藉由黑色素細胞的樹枝狀突起移動至鄰近的角質細胞(keratinocytes)，進而呈現出皮膚的顏色，而皮膚顏色的不同主要是因為黑色素的產生和分布不同。黑色素的主要功能是吸收陽光中的紫外光(UV)，保護皮膚避免受到紫外光的傷害，並且能移除活性氧(reactive oxygen species,ROS)，以減少自由基對正常細胞的傷害。
2.　黑色素的生合成路徑
酪胺酸(tyrosine)是黑色素生合成中重要的受質。在反應中，酪胺酸先被羥基化(hydroxylation)：經由酪胺酸酶(tyrosinase)的催化，在羥基(hydroxyl group)的鄰位碳加上一個羥基，形成多巴(L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-dopa)，接著再將多巴轉換成多巴醌(dopaquinone)。之後，多巴醌會走兩個路徑，第一個途徑，會經由酪胺酸酶相關蛋白的催化形成帶棕、黑色的真黑色素(eumelanin)。在另一個路徑，多巴醌經由麩胱甘肽(glutathione)或半胱胺酸(cysteine)作用，生成帶黃、紅色的深黑色素(pheomelanin)。(圖一)。
3.　酪胺酸酶的催化機制
酪胺酸酶(EC 1.14.18.1)在黑色素的生合成中扮演很重要的角色。它是一種多功能、具醣基化的含銅穿膜蛋白，存在於黑色素細胞中，在哺乳類中分子量大小約為60-70 kD，且通常專一表現在黑色素細胞中，屬於第三型含銅蛋白質(Type 3 copper protein)，在進行催化反應時，銅離子是很重要的輔助因子。在催化過程中，活化位的結構有三個不同形式，各扮演不同的角色：分別為氧化態(Oxy-form)、去氧態(Deoxy-form)、靜止態(Met-form)。去氧態酪胺酸酶不具活性，其活化位的銅離子帶正一價且不含氧離子，在催化反應中，去氧態酪胺酸酶需經氧化作用，藉由失去兩個電子形成氧化態酪胺酸酶，此時活化位中具有帶正二價銅離子及帶負一價氧離子，氧化態酪胺酸酶可接受兩種受質，分別為酪胺酸和多巴，當和酪胺酸結合時，會生成靜止態酪胺酸酶-多巴複合體(Met-E-Dopa)，在釋放出多巴醌後，酪胺酸酶又變成去氧態繼續循環；另一方面當與多巴結合時，除了生成多巴醌外，同時酪胺酸酶也由氧化態變成靜止態，此形式的酪胺酸酶若和多巴作用會生成多巴醌，若和酪胺酸結合，會形成不具催化作用的複合體而不會繼續黑色素生成途徑。由此可知，在催化過程中，氧化態酪胺酸酶扮演著重要的角色(圖二)。
4.　酪胺酸酶的影響
酪胺酸酶是造成水果和蔬菜在貯存或加工時產生酵素性褐變的原因，褐變對某些產品的製造，可以賦予產品特殊的色澤及風味，例如紅茶、葡萄乾，但對大部分生鮮蔬果而言，酪胺酸酶是使得蔬菜水果的顏色和氣味改變、組織軟化、降低其消化性、抑制蛋白水解和糖分解的酵素，酪胺酸酶在催化過程中所產生的非營養及有毒化合物可能進一步使營養價值喪失，甚至影響食品的安全。在2003年Dr.Asanuma(參考文獻Neurotox Res 5,p165-76,2003)則指出酪胺酸酶可能和帕金森氏症(Parkinson’s disease)以及其他的神經退化性疾病有關。
5.　酪胺酸酶抑制劑的應用
在農業及食品工業上：
蔬菜水果發生褐變後，會影響其外觀、氣味以及食用上的味道，這是種植者和食品工業者所關心的問題。而酵素性褐變的發生速率是依據組織內活化酪胺酸酶和酚類化合物的濃度、可利用的氧氣、pH值和溫度等條件來決定。因此，利用不同方法來停止由酪胺酸酶引起的酵素性褐變是必要的。酪胺酸酶抑制劑應用在食品工業上也行之有年，傳統常用的褐變反應抑制劑有抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)及亞硫酸鹽等，雖然亞硫酸鹽的抑制效果極佳，但卻有嚴重的副作用，因此，尋找天然且無害的酪胺酸酶抑制劑有其必要性。
在化妝品工業：
酪胺酸酶抑制劑在化妝品工業上越來越重要是因為美白的功能。先前已發現的天然抑制劑包括熊果素(Arbutin)、麴酸(Kojic acid)、亞麻油酸(Linoleic acid)、對苯二酚(Hydroquinones)等，但僅有少數被使用做為皮膚美白劑，主要是因為這些天然的酪胺酸酶抑制劑可能會引發副作用。
目前衛生署核准使用於美白化粧品的八種成分，如維他命C磷酸鎂鹽(Magnesium Ascorbyl Phosphate)、維他命C磷酸鈉鹽(Sodium Ascorbyl Phosphate)、維他命C醣苷(Ascorbyl Glucoside)、麴酸(Kojioc Acid)、熊果素(Arbutin)、鞣花酸(Ellagic Acid)、止血環酸(Tranexamic acid)和洋甘菊萃取物(Chamomile ET)，其中麴酸和熊果素即為酪胺酸酶抑制劑，可經由抑制酪胺酸酶達到美白的功能，亦是美白保養品受歡迎的成分。
熊果素是由越橘科植物熊果葉抽取而得，一些水果中也可以發現熊果素的蹤跡，例如西洋梨、小山梨。熊果素的結構與衛生署公告列為藥品之對苯二酚相似，經皮膚吸收後會被水解成對苯二酚與葡萄糖，因此，其作用機轉與對苯二酚雷同，都是透過抑制酪胺酸酶的活性，淡化已形成的黑色素，然而對苯二酚可同時抑制黑色素形成和破壞黑色素細胞，使用初期美白及除斑的效果很好，但卻會對皮膚造成永久性傷害，如產生其他斑點或腐蝕皮膚，由於熊果素的結構比對苯二酚多帶了葡萄糖分子，因此刺激性較低，而得以在保養品中出現，但是因為它還是必須還原成對苯二酚才能作用，因而引起部份人士懷疑，認為仍有機會產生類似對苯二酚的副作用，但至目前為止衛生署仍將熊果素公告為核可之美白成分，且規定熊果素在保養品中的濃度必須在7%以下，避免高濃度的熊果素使皮膚免疫力下降。
麴酸是從麴菌萃取出的成分，在黑色素形成過程中，銅離子扮演催化角色，而麴酸可以抓住銅離子，抑制黑色素形成，使色素生成細胞代謝正常，抑制黑斑或雀斑，達到美白功效。Dr. Noh在2007年(參考文獻Biopolymers 88,p300-7,2007)並指出在麴酸-tripeptide的羧酸端加上氨基，將有助於提高其抗酸鹼能力、耐熱性、存放的穩定度以及酪胺酸酶之抑制效果。然而近期日本厚生省懷疑麴酸作為食品添加物有致癌危險，目前已停止使用於食品之中，化妝品類則要求進行臨床測試，以評估麴酸是否禁用。自日本政府公告禁用麴酸之食品添加物後，含麴酸的保養品是否安全，各家說法紛云，直至目前為止並無明確數據與研究證實其有危害，台灣衛生署目前仍將麴酸公告為核可之美白成分，並規定麴酸在保養品中的濃度必須在2%以下。
雖然目前衛生署公布核准使用於美白化粧品之成分有八種，但部分種類仍有安全性的疑慮，對美白我們必須抱持正確期待，不應有立即見效的想法，為擁有健康且白皙的肌膚，如何做好有效且安全的美白，是目前美白化妝品領域中重要的課題。
為解決目前美白化妝品領域所遇到之問題，美國專利申請案20090099093A1提供一種酪胺酸酶抑制劑，該抑制劑係由一多肽組成，該多肽序列包含6至8個胺基酸，相較於習知技術所使用化合物作為酪胺酸酶抑制劑，該案所使用之多肽更具安全性，效果溫和而易於人體吸收和代謝，然而多肽合成之費用是廠商進行酪胺酸酶抑制劑商品化之一大考量，多肽合成長度越長費用越高，此外多肽之運送方式亦為考量重點，2008年Dr. Agarwal S(參考文獻Int J Pharm 359,7-14,2008)提出以適當的醫藥組合物運送，可提高胜肽類前驅物(peptide prodrug)的水溶性、滲透力等，避免胜肽類前驅物在過程中受到蛋白酶的分解，進而維持藥物的濃度。因此，研發一種既有效、安全且多肽長度更短之酪胺酸酶抑制劑，將是目前急欲解決之問題。
鑒於上述之發明背景，研發一種既有效、安全且多肽長度更短之天然酪胺酸酶抑制劑，是當前急欲解決之問題。本發明依據酪胺酸酶的結構特性，設計一系列的酪胺酸酶抑制劑，經由體外酪胺酸酶活性實驗測試、安全性測試結果以及活體動物實驗之黑色素含量分析，證實本發明所提出之酪胺酸酶抑制劑具有顯著的抑制效果。並且該酪胺酸酶抑制劑較習知技術所提出的胜肽序列更為有效、安全且長度更短。
本發明所引用的胺基酸序列名稱定義對照表：
本發明內容所指的胺基酸的分類：
1.　脂肪性胺基酸類(Aliphatic)包括：丙胺酸(Alanine,A)、異白胺酸(Isoleucine,I)、白胺酸(Leucine,L)、纈胺酸(Valine,V)、脯胺酸(Proline,P)。
2.　芳香性胺基酸類(Aromatic)包括：苯丙胺酸(Phenylalanine,F)、色胺酸(Tryptophan,W),、酪胺酸(Tyrosine,Y)。
3.　酸性胺基酸類(Acidic)包括：天冬胺酸(Aspartic acid,D)、麩胺酸(Glutamic acid,E)。
4.　鹼性胺基酸類(Basic)包括：精胺酸(Arginine,R)、組胺酸(Histidine,H)、離胺酸(Lysine,K)。
5.　羥基胺基酸類(Hydroxylic)包括：絲胺酸(Serine,S),、蘇胺酸(Threonine,T)。
6.　含硫胺基酸類(Sulfur containing)包括：半胱胺酸(Cysteine,C)、甲硫胺酸(Methionine,M)。
7.　醯胺胺基酸類(Amidic)包括：天冬醯胺酸(Asparagine,N)、麩醯胺酸(Glutamine,Q)。
本發明係關於一種酪胺酸酶抑制劑，其多肽序列為
R1n1-Xaa-R2n2-Yaa-R3n3
其中Xaa或Yaa為酪胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、麩胺酸或精胺酸，取代基R1、R2或R3係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組，且其中n1、n2或n3為取代基的數目，該數目各別獨立等於0或1。
本發明係關於一種酪胺酸酶抑制劑，其多肽序列包含：
(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3
(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3
(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3
(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3
本發明係關於一種酪胺酸酶抑制劑，其多肽序列包含：
Tyr-Cys-Cys、Glu-Cys-Val、Cys-Arg、Cys-Asp-Tyr、Arg-Tyr-Cys-Arg、Asp-Cys-Gly、Arg-Cys-Tyr-Arg、Cys-Gly-Ser、Asn-Cys-Tyr、Phe-Tyr-Cys、Arg-Cys-Tyr-Val、Val-Cys-Gly、Cys-Gly-Tyr、Phe-Tyr-Cys、Tyr-Phe-Cys、Cys-Val、Arg-Phe-Tyr-Cys、Gly-Cys-Tyr、Phe-Tyr-Cys-Arg、Cys-Tyr-Gly、Arg-Cys-Tyr、Val-Ser-His-Tyr、Gly-Cys-Tyr、Tyr-Phe-Arg、Tyr-Asp。
本發明酪胺酸酶抑制劑多肽序列之詳細說明：
(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3
其中取代基R1、R2或R3係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組；及其中n1、n2或n3為取代基的數目，該數目各別獨立等於0或1。由下表可知，其多肽序列設計以各胺基酸官能基類型擇一為代表，交叉排列成不同序列之短多肽。
(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3
其中取代基R1、R2或R3係選自甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組；及其中n1、n2或n3為取代基的數目，該數目各別獨立等於0或1。由下表可知，其多肽序列設計以各胺基酸官能基類型擇一為代表，交叉排列成不同序列之短多肽。
(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3
其中取代基R1、R2或R3係選自甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組；及其中n1、n2或n3為取代基的數目，該數目各別獨立等於0或1。由下表可知，其多肽序列設計以各胺基酸官能基類型擇一為代表，交叉排列成不同序列之短多肽。
(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3
其中取代基R1、R2或R3係選自甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組；及其中n1、n2或n3為取代基的數目，該數目各別獨立等於0或1。由下表可知，其多肽序列設計以各胺基酸官能基類型擇一為代表，交叉排列成不同序列之短多肽。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑
(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，其中n1=0、n2=0且n3=1時，取代基R3係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，其中n1=0、n2=1且n3=0時，取代基R2係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，其中n1=1、n2=0且n3=0時，取代基R1係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，其中n1=1、n2=0且n3=1時，取代基R1或R3係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，其中n1=1、n2=1且n3=0時，取代基R1或R2係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，其中n1=0、n2=1且n3=1時，取代基R2或R3係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，其中n1=1、n2=1且n3=1時，取代基R1、R2或R3係選自由甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸所組成之群組。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑，其中該多肽序列包含：Tyr-Cys-Cys、Glu-Cys-Val、Cys-Arg、Cys-Asp-Tyr、Arg-Tyr-Cys-Arg、Asp-Cys-Gly、Arg-Cys-Tyr-Arg、Cys-Gly-Ser、Asn-Cys-Tyr、Phe-Tyr-Cys、Arg-Cys-Tyr-Val、Val-Cys-Gly、Cys-Gly-Tyr、Phe-Tyr-Cys、Tyr-Phe-Cys、Cys-Val、Arg-Phe-Tyr-Cys、Gly-Cys-Tyr、Phe-Tyr-Cys-Arg、Cys-Tyr-Gly、Arg-Cys-Tyr、Val-Ser-His-Tyr、Gly-Cys-Tyr、Tyr-Phe-Arg、Tyr-Asp。
在一較佳之實施例中，本發明的酪胺酸酶抑制劑，其中該多肽序列之一個或多個胺基酸可進一步經過乙醯化(Acetylated)、醯胺化(Amidated)、甲醯化(Formylated)、羥基化(Hydroxylated)、脂質修飾(Lipid Modified)、甲基化(Methylated)或磷酸化(Phosphorylated)之修飾，在2009年Anan Abu Ubeid同樣也是發現的多肽序列可作為酪胺酸酶的抑制劑，而在同時間發表的專利(WO2009003034(A1))也有提到經過修飾的多肽序列也算在專利範圍中，認為其經過修飾的多肽序列並不會因此而改變其作用的活性機制。
本發明另關於一種抑制酪胺酸酶活性之醫藥組合物，其係包含上述之酪胺酸酶抑制劑，更包含一種醫藥可接受載劑，其中該載劑可為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。本發明的醫藥組合物係藉由酪胺酸酶之活性抑制進而抑制黑色素之生成，降低細胞內黑色素含量，並可應用於化妝品或農產品，當其應用於化妝品時可作為美白劑。
本發明另關於一種減少皮膚中黑色素沈澱的方法，此機制主要是透過抑制酪胺酸酶的活性，該方法包括將上述之酪胺酸酶抑制劑經由口服、經皮吸收、注射或吸入之方式傳輸至一哺乳動物。其中哺乳動物包含人類等生物。
下列實施例為非限制性且僅作為本發明於各方面之代表例。
實施例1：In vitro酪胺酸酶活性測試
I.　藥品
1.　洋菇酪胺酸酶(Mushroom tyrosinase,100 U/ml)、熊果素(Arbutin)、酪胺酸(L-tyrosine,0.5 mM)、麴酸(Kojic acid)和2至5個不同序列之短多肽(0.5 mM)。短多肽序列為R1n1-Xaa-R2n2-Yaa-R3n3，Xaa或Yaa為酪胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、麩胺酸及精胺酸五種胺基酸中各擇一，取代基R1、R2或R3之胺基酸依官能基分以下八種類型：甘胺酸、脂肪性胺基酸、芳香性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸和醯胺胺基酸，各類型擇一，n1、n2或n3為取代基的數目，該數目個別獨立等於0或1，以上胺基酸交叉排列成為2至5個不同序列之短多肽。
II.　實驗步驟
以分光光度計(Varian cary-50 Bio UV-Visible spectrophotometer)在475 nm下測dopachrome之OD值。再以下列公式計算tyrosinase的剩餘活性百分比：
Tyrosinase activity(%)=(D－C)/(B－A)×100%
A：控制組反應前的475 nm吸光值；
B：控制組反應後的475 nm吸光值；
C：對照組反應前的475 nm吸光值；
D：對照組反應後的475 nm吸光值。
III.實驗結果
以熊果素和麴酸(先前實驗結果顯示，麴酸在濃度0.4 mM下，可以100%抑制酪胺酸酶的活性，測試時間為30分鐘)做為正控制組來比較。
表五所列為在5分鐘時，不同核心之短多肽抑制酪胺酸酶活性之效果。將本發明所設計之短多肽和市售之美白成分熊果素與麴酸比較，熊果素抑制酪胺酸酶活性為32.2，本發明所設計之短多肽效果遠優於熊果素，而麴酸抑制酪胺酸酶活性為0.10，與本發明之短多肽具有同樣優越的效果，然而考量用於人體之安全性問題，本發明之短多肽比麴酸更為安全。
表五、5分鐘時，不同序列之短多肽抑制酪胺酸酶活性之效果
(一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3：
(二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3：
(三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3：
(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3：
(五)Val-Ser-His-Tyr
進一步試驗5及30分鐘時，不同序列之短多肽抑制酪胺酸酶活性之效果(僅列出核心為R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3的部分)。下表六所列結果顯示5和30分鐘分別有不同的抑制效果，本發明之短多肽在5分鐘已有抑制效果，至30分鐘仍持續有效，而以時間經濟考量，本發明在5分鐘已有足夠的抑制效果。
將本發明所設計之短多肽和熊果素與麴酸比較，熊果素抑制酪胺酸酶活性在5分鐘為32.24，至30分鐘時回復至49.14，可推知熊果素在30分鐘已被代謝，抑制效果已慢慢回復，而麴酸抑制酪胺酸酶活性在5分鐘為0.1，至30分鐘為0.24，效果十分顯著，然而以效果考量，本發明所設計之短多肽效果遠優於熊果素，以安全性考量，本發明之短多肽比麴酸更為安全，因此整體而言，本發明較市售之美白成分熊果素與麴酸更為優越。
實施例2：不同序列之短多肽進行安全性測試結果
I.　藥品來源
1.多肽序列為YD、YFR、GCY及YC
II.　實驗步驟
利用MTT assay來測定抑制劑是否含有細胞毒性，活細胞內粒線體中的琥珀酸去氫脢(succinate dehydrogenase)能將黃色的MTT還原成紫色的formazan，之後再加入DMSO將formazan溶解，並以分光光度計測量此溶液在OD 595nm之下的吸光值，並藉此估算測試物質對細胞生長之影響。
(1)　先配製含MTT之培養液，每500 μl培養液加入80 μl MTT(原始濃度為5 mg/ml)。
(2)　將細胞培養液全部吸起，每個96孔盤加入100 μl含MTT之培養液(24-孔盤中則加入500 μl含MTT之培養液)，於37℃之5% CO2 培養箱靜置一小時。
(3)　去除細胞培養盤的培養基，加入適當體積的DMSO(96-孔盤中加入200 μl)，靜置10分鐘。以連續波長微孔盤分析系統(Molecular Devices，SPECTRAMAX M2)測定波長550 nm之吸光值，之後以未處理對照組之平均吸光值為100%，計算實驗組的吸光值百分比。
III.實驗結果
圖三為不同序列的短多肽抑制劑的安全性測試結果。不同短多肽在5分鐘時抑制酪胺酸酶活性之效果。從MTT assay實驗結果中，當加入5mM的熊果素或是1mM的麴酸時，細胞活性就已經降至95%的最低門檻。在MTT assay實驗結果中，加入了GCY 100 μM仍然不影響細胞活性。而其他抑制劑YC，YD，YFR也有相同情形，所以由以上實驗證實：這四個短多肽不具有毒性且不會影響細胞活性。
實施例3：In vivo黑色素含量分析
在本篇專利中有部分的順反向化合物，其抑制效果並不會受到順反向而有所差異，但是也有些順向與反向化合物的抑制效果可以差距50%左右，另一方面，部分化合物溶於溶液之後有呈色的情形，因此為了排除呈色的情形可能會影響吸光值過高，並證實本研究所設計的抑制劑在人體也能有同樣良好的美白功效，所以我們挑選部分化合物YD、YFR、GCY、YC進行黑色素含量分析。
I. 　藥品來源
1.多肽序列為YD、YFR、GCY及YC
II.　實驗步驟
將黑色素細胞培養在24孔盤中，並將不同的抑制劑，以1,5,10,25,50及100 μM的濃度分別培養七天。七天後，加入trypsin/EDTA(0.25%/0.1%in phosphate buffered saline)短暫培養，使得細胞分離。之後將細胞培養液全部吸起，加入HBSS清洗兩次，利用超音波將細胞振碎，再加入0.3 ml 1NNaOH(70℃)，並置入50℃的烘箱靜置10分鐘。最後將溶出的melanin混勻後，取0.2 ml至96孔盤，藉由分光光度計測定OD 405 nm melanin的吸光值。
III.實驗結果
從實驗結果中，可以發現當熊果素加入5mM時，可以使melanin的含量降至74.52%，而加入麴酸1 mM時，就可以使melanin的含量降至67.63%，所以麴酸的抑制效果在人類酪胺酸酶中也是表現的比熊果素良好。
從YD的實驗結果中，我們可以看到當加入YD 100 μM時，只需熊果素的0.02倍劑量即可達到相同的抑制效果，使得melanin的含量降至75%左右；而當加入YD1 μM時，即可達到與加入麴酸0.5 mM相同的抑制效果，使得melanin的含量降至八成。當加入YFR 100 μM時，只需麴酸的0.2倍劑量，即可達到與加入麴酸0.5 mM相同的抑制效果，使得melanin 的含量降至八成。
所以由以上的數據結果得知：YD,YFR在人類酪胺酸酶中，的確是有抑制效果的，而且其抑制能力甚至優於麴酸以及熊果素。所以反推回in vitro mushroom tyrosinase的酵素活性測試實驗結果，YD,YFR化合物之所以會被誤判為抑制效果不佳，主要是受到化合物在溶液當中有呈色情形的影響，進而產生過高的吸光值，另一方面，以上數據也證實了順反向化合物對於tyrosinase的抑制效果是差異不大的。
根據GCY的實驗結果，從數據中可以得知：當加入GCY 100 μM時，只需少許的劑量，即可達到與加入麴酸0.5 mM相同的抑制效果，使得melanin的含量降至80%左右。另一方面，YC的實驗結果與GCY的實驗數據相較之下，我們可以發現：在人類酪胺酸酶中，GCY的抑制效果也是優於YC，這個情形與在in vitro mushroom tyrosinase酵素活性測試結果中是相符合的。所以根據以上實驗結果，我們推論：對於洋菇酪胺酸酶有抑制效果的化合物，在人類酪胺酸酶中有可能也具有相同良好的抑制情形。
從MTT assay的結果，得知1mM的麴酸或是5mM的熊果素，就已經使得細胞活性降至最低門檻95%，而比對in vitro mushroom tyrosinase的酵素活性測試實驗結果，得知加入YD 100 μM可以達到與麴酸1mM或是熊果素5mM相近的七成抑制效果，但是加入YD 100 μM時並不會影響其細胞活性，所以從以上兩個實驗證實：這些化合物相較於化妝品工業上常用的麴酸及熊果素，不僅有良好的抑制效果，且不具有細胞毒性。
圖一係　黑色素的生合成途徑。
圖二係　酪胺酸酶的催化過程。
圖三係　不同序列之短多肽抑制劑之安全性測試結果。

Claims (16)

  1. 一種酪胺酸酶抑制劑，其多肽序列包含：R1n1-Xaa-R2n2-Yaa-R3n3；其中Xaa或Yaa為酪胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、麩胺酸或精胺酸，n1、n2或n3為取代基的數目，該數目各別獨立等於0或1；當n1、n2及n3的數目分別為1、0及0時，取代基R1為甘胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脂肪性胺基酸類、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸或醯胺胺基酸；當n1、n2及n3的數目分別為0、1及0時，取代基R2為甘胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脂肪性胺基酸類、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸或醯胺胺基酸；當n1、n2及n3的數目分別為0、0及1時，取代基R3為甘胺酸、苯丙胺酸、脂肪性胺基酸類、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸或醯胺胺基酸；當n1、n2及n3的數目分別為1、1及0時，取代基R1為甘胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脂肪性胺基酸類、酸性胺基酸、鹼性胺基酸或醯胺胺基酸，取代基R2為甘胺酸、苯丙胺酸或含硫胺基酸；當n1、n2及n3的數目分別為1、0及1時，取代基R1為甘胺酸、苯丙胺酸、脂肪性胺基酸類、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸或醯胺胺基酸，取代基R3為甘胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脂肪性胺基酸類、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸或醯胺胺基酸；當n1、n2及n3的數目分別為0、1及1時，取代基R2為苯丙胺酸、 脂肪性胺基酸類或含硫胺基酸，取代基R3為甘胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脂肪性胺基酸類、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、羥基胺基酸、含硫胺基酸或醯胺胺基酸。
  2. 根據申請專利範圍第1項的酪胺酸酶抑制劑，其中Xaa為酪胺酸、Yaa為半胱胺酸，或Xaa為半胱胺酸、Yaa為酪胺酸。
  3. 根據申請專利範圍第1項的酪胺酸酶抑制劑，其中Xaa為甘胺酸、Yaa為半胱胺酸，或Xaa為半胱胺酸、Yaa為甘胺酸。
  4. 根據申請專利範圍第1項的酪胺酸酶抑制劑，其中Xaa為麩胺酸、Yaa為半胱胺酸，或Xaa為半胱胺酸、Yaa為麩胺酸。
  5. 根據申請專利範圍第1項的酪胺酸酶抑制劑，其中Xaa為酪胺酸、Yaa為精胺酸，或Xaa為精胺酸、Yaa為酪胺酸。
  6. 一種酪胺酸酶抑制劑，其多肽序列係選自由Tyr-Cys-Cys、Glu-Cys-Val、Cys-Asp-Tyr、Arg-Tyr-Cys-Arg、Asp-Cys-Gly、Arg-Cys-Tyr-Arg、Cys-Gly-Ser、Asn-Cys-Tyr、Arg-Cys-Tyr-Val、Val-Cys-Gly、Cys-Gly-Tyr、Phe-Tyr-Cys、Tyr-Phe-Cys、Arg-Phe-Tyr-Cys、Phe-Tyr-Cys-Arg、Cys-Tyr-Gly、Arg-Cys-Tyr、Val-Ser-His-Tyr、Gly-Cys-Tyr、Tyr-Phe-Arg和Tyr-Asp所組成之群組。
  7. 一種酪胺酸酶抑制劑，其多肽序列係選自由Arg-Cys-Tyr、Val-Ser-His-Tyr、Gly-Cys-Tyr、Tyr-Phe-Arg和Tyr-Asp所組成之群組。
  8. 根據申請專利範圍第1、2、3、4、5、6或7項的酪胺酸酶抑制劑，其中該多肽序列之一個或多個胺基酸係經過乙醯化、醯胺化、甲醯化、羥基化、脂質修飾、甲基化或磷酸化之修飾。
  9. 一種抑制酪胺酸酶活性之醫藥組合物，其係包含申請專利範圍第1、2、3、4、5、6或7項之酪胺酸酶抑制劑。
  10. 根據申請專利範圍第9項的醫藥組合物，其更包含一種醫藥可接受載劑。
  11. 根據申請專利範圍第9項的醫藥組合物，其中該載劑為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。
  12. 根據申請專利範圍第9項的醫藥組合物，係應用於化妝品、農產品或美白劑。
  13. 一種減少哺乳動物皮膚中黑色素含量的方法，包括將申請專利範圍第1、2、3、4、5、6或7項之酪胺酸酶抑制劑傳輸至一哺乳動物。
  14. 根據申請專利範圍第13項的方法，其中該酪胺酸酶抑制劑為透過口服、經皮吸收、注射或吸入之方式進行傳輸。
  15. 根據申請專利範圍第13項的方法，其中該酪胺酸酶抑制劑更包含一種醫藥可接受載劑。
  16. 根據申請專利範圍第13項的方法，其中該哺乳動物為人類。
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