JP2012522222A - 感染因子の急速な生前検出 - Google Patents

Abstract

疑わしい生物試料におけるＰｒＰ^Scの存在又は欠失の検出のための方法であって、試料マトリックスからＰｒＰ^Scを実質的に分離することによって、試料中に存在してよいＰｒＰ^Scを濃縮する工程、少なくとも１つの分子標識で濃縮したＰｒＰ^Scを標識して、標識したＰｒＰ^Scを製造する工程、及びアトモル量の標識したＰｒＰ^Scを検出することができる装置上で、標識したＰｒＰ^Scを検出する工程を含み、その際前記ＰｒＰ^Scの濃縮及び標識したＰｒＰ^Scの検出の間の時間が、４８時間以下である方法。

Description

本明細書は、２００９年３月２５日に出願された米国仮特許出願６１／２１１，２６５の優先権の利益を請求しており、参照をもって本発明に組込まれたものとする。本明細書は、２００９年３月２５日に出願された米国仮特許出願６１／２１１，２６４の優先権の利益を請求しており、参照をもって本発明に組込まれたものとする。

本発明は、米国エネルギー省（Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ）によって承認されている契約ＤＥ− ＡＣ５２−０６ ＮＡ ２５３９６のもと政府援支援されている。政府は、本発明に明らかに権利を有する。本発明は、さらに、Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉｅｌ Ｃｏｍｍａｎｄによって承認されている承認番号ＤＡＭＤ１７−０３−１−０３６８、及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって承認されている承認番号ＨＬ０６３８３７のもと支援されている。

発明の分野
本発明は、急速な、生物学的及び化学的生成物の微量の生存検出の方法に関し、代表的なそれらの中には、生物学的試料中の細胞プリオンタンパク質の立体構造的に変更された形である。

発明の背景
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）又はプリオン疾患は、牛海綿状脳症（"狂牛"病）、シカ及びオオシカの慢性消耗性疾患、羊におけるスクレイピー、及び人における、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）を含む、哺乳動物の伝染性神経変性疾患である。ＴＳＥは、感染させた組織の摂取又は輸血によって宿主から宿主へ渡ってよい。ＴＳＥの臨床的症状は、運動協調性の損失及び人における痴呆を含む。それらは、数か月から数年の潜伏期間を有するが、しかし臨床的サインの出現後に、それらは急速に進行し、治療不能であり、そして一定に致死する。ＴＳＥリスクの低減の試みは、生産において著しい変化をもたらし、かつ農産物、医薬品、化粧品、血液及び組織提供、並びに生物学的生成物の取引をもたらす。

ＴＳＥは、細胞プリオンタンパク質エンコードした宿主の立体構造的に変更された形（ＰｒＰ^Sc）への変換と関連する。動物又はヒトからの脳組織の検死神経病理試験は、ＴＳＥ診断の‘ゴールドスタンダード’が残っており、かつ典型的に、時にＰｒＰ^Sc含有アミロイド付着の形成に伴う星状細胞増加及び海綿状変性を示す。これは非常に特異的であるが、しかし他の技術（Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｓｍｉｔｈ， １９９５； Ｇａｖｉｅｒ− Ｗｉｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５）よりもほとんど感受性がない。顕微鏡観察の感受性は、アミロイド付着におけるＰｒＰ^Scの蓄積を検出するために、ＰｒＰに特異的なアミロイドを使用する免疫組織化学的技術によって増加されうるが（ｖａｎ Ｋｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５； １９９６）、それらの方法は、急速な機械的な解析に不適当である。追加の懸念は、ＴＳＥの研究室での診断が、神経系組織において一貫して見出される最も高い濃度、及び容易に到達可能な体組織、例えば血液又は尿における非常に低い濃度を有する、体組織におけるＴＳＥ関連分子の不均等な分布によって複雑にされることである。

ＰｒＰ^Scは、明確な生理化学的及び生化学的特性、特に凝集、不溶性、プロテアーゼ消化耐性、及びβ−シートが豊富な二次構造を有する。かかるＰｒＰ^Scの変更された特性、すなわちプロテアーゼ消化に対する部分的な耐性は、大部分の診断の生化学的試験の基礎を形成する。ＰｒＰ^CとＰｒＰ^Scとの区別のために、試料は、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）で前処理される。ＰｒＰ^Scが部分的な消化耐性があり、かつＰｒＰ^Cが容易にＰＫによって消化されるために、前処理は、ＰｒＰ^Cからの干渉の除去又は減少を、及びＰｒＰ^Cと比較してＰｒＰ^Scが豊富な試料をもたらす。しかしながら、ＣＪＤで死亡した患者の脳における大部分のＰｒＰ^Scは、生存中のアッセイにおけるＰＫ処理の使用させるＰｒＰ^ScのＰＫ感受性のもの（ｓＰｒＰ^Sc）であり、その際ＰｒＰ^Sc濃度は非常に低く非実用的であることが他によって示唆されている。試料のタンパク質分解処理を要求しない検出アッセイの開発は、タンパク質消化に関連し、かつアッセイ感受性を低減させる組織を除去する。

現在のＰｒＰ^Sc検出方法は時間がかかり、かつ疑わしい動物がその病気の１つ以上の症状を示した後に検死を行う。現在の検出方法は、主に、現在までＴＳＥのための信頼できるマーカーのみである、ＰｒＰ^CとＰｒＰ^Scとの物理化学的差異の検出に基づく。例えば、最も広く使用されている検出試験は、ＰｒＰ^CとＰｒＰ^Scとを区別するための脳試料におけるＰｒＰ^Scの相対的なプロテアーゼ耐性を利用する。通常の方法、例えばポリメラーゼ鎖反応、血清学又は細胞培養アッセイを使用することによってプリオン病を検出することは、まだ不可能である。特異的な核酸の作用剤は、まだ確認されておらず、感染した宿主は、抗体反応を誘発しない。

本記載内容に開示されている３つの抗体（８Ｅ９、１１Ｆ１２及び５Ｄ６）に対するＰｒＰ^Scの抗体−抗原結合の事象は、２００８年１０月３１日に電子出版されたＣｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ＰｒＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｅｖｏｋｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ， ２０５ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．， ９４， ９４−１００による文献において特徴づけられ、参照をもって本明細書に開示されたものとする。これらの抗体は、ＰｒＰ^Sc上の異なるエピトープと相互に作用する。モノクローナル抗体（Ｍａｂ）８Ｅ９は、ＰｒＰ^Scのアミノ酸１５５〜２００の領域で結合する。Ｍａｂ１１Ｆ１２は、ＰｒＰ^Scのアミノ酸９３〜１１２の領域で結合する。Ｍａｂ５Ｄ６は、ＰｒＰ^Scの未定義の立体構造エピトープと結合する。立体構造エピトープは、アミノ酸の特定の連続配列と結合しない。むしろ、いくつかの、アミノ酸一次構造の切断された領域からのアミノ酸残基を含んでよいタンパク質の構造の領域に結合する。

酵素に連結する免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のキャプチャーは、前記３つの抗体を使用して実施した。キャプチャー剤としてのＭａｂ１１Ｆ１２の使用及び検出剤としてのビオチン化したモノクローナル抗体５Ｄ６の使用のみは、結合に、及びＰｒＰ^Scの識別に成功した。この命令における抗体のこの組合せのみは、２６３Ｋに感染したハムスター、スクレイピー羊又はＣＷＤに影響を及ぼすシカにおいて同様の結果を提供した。この増加させた検出は、ＰｒＰ^Scにおいてマスキングしていないエピトープを含む抗体のためである。本質的に、１つの抗体（Ｍａｂ１Ｆ１２）のＰｒＰ^Scとの結合は、第二の抗体（Ｍａｂ５Ｄ６）をよりよく結合させる同様の方法におけるエピトープをアンマスクする。これが、ＰｒＰ立体構造の変更を介して、ＰｒＰ^Sc中にＰｒＰ^Cのリフォールディングを生じ、かつ／又はＰＫ耐性において変更し、又はＰｒＰ^Scが、追加の抗体結合に対してそれらをより接近しやすくするために形成するかどうかは、公知ではない。

周囲光ファイバー免疫アッセイ（Ｓｕｒｒｏｕｎｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｉｂｅｒ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＳＯＦＩＡ）は、２００９年２月２５日に電子出版されたＣｈａｎｇ ｅｔ． ａｌ．， Ｓｕｒｒｏｕｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｂｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ （ＳＯＦＩＡ）： Ａｎ Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｐｒｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， １５９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５， １５−２２による文献においても開示されている。ＳＯＦＩＡは、抗原キャプチャーのためのＭａｂにおける特定の本質と、周囲光学検出技術の感受性とを組合せる。極めて低いシグナルレベルを検出するために、低ノイズの、光電池ダイオードを、このシステムのための検出器として使用した。ＳＯＦＩＡは、試料を保持するマイクロキャピラリーを照らすレーザーを使用する。そして、試料から集められた光は、光ファイバーから視覚的に移動するために検出される。次に、電流測定として実施され、かつロックイン増幅器を加工するデジタルシグナルによるノイズに対して増幅させた光を、検出のために光学的に濾過させる。この結果は、コンピュータ上に示され、かつデータ取得のために設計されたコンピュータソフトフェア上に蓄積される。

ローダミンレッドは、０．１アトグラム（ａｇ）の濃度までＳＯＦＩＡによって検出される。従って、ＳＯＦＩＡは、ＰＫ処理したハムスターの脳から約１０ａｇのＰｒＰ^Scの及び推定される羊及びシカの脳材料からの約１フェムトグラムのＰｒＰ^Scの検出限界を有することを示す。しかしながら、当量の抗体反応性としても、グラム当量での羊及びシカの脳材料よりも、少なくとも１０〜１００倍多いハムスターの脳におけるＰｒＰ^Scであることが示されたウェスタンブロットは、後者の２つの種におけるタンパク質の検出が１０〜１００ａｇ以上の範囲でできることの示唆に基づく。

異常折り畳みタンパク質反復増幅（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ｃｙｃｌｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＰＭＣＡ）の研究室技術は、微量のＰｒＰ^Scの増幅をもたらすＰｒＰ^CのＰｒＰ^Scへの特定の再現性のある変換を支持することを報告している。ＣＷＤ感染作用剤が唾液、血液、尿及び排泄物において検出されているが、この材料からのＰｒＰ^Scの直接免疫検出は、失敗している（（Ｈａｌｅｙ ｅｔ ａｌ， ２００９ａ， ｂ）。さらに、いくつかのこの材料のためのＣＷＤ感染作用剤の成功した検出は、連続ＰＭＣＡ（ｓＰＭＣＡ）のバイオアッセイを要求した（（Ｍａｔｈｉａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ２００９； Ｈａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９ａ， ｂ； Ｔａｍｇｕｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。周囲組織、特に血液におけるＴＳＥの前臨床検出を容易にするために、試料における標的ＰｒＰ^Scが、ＰＭＣＡによって増幅されてよい（Ｓａｂｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。ＰＭＣＡは、実験的にスクレイピーに感染させたげっ歯類（Ｓａｂｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｄｅｌｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｂｉｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、それぞれ、牛海綿状脳症及びスクレイピーに自然に感染した牛及び羊（Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２００５）の脳から、並びにより最近ではクロイツフェルト・ヤコブ病に感染した人（（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００７）から、及び慢性消耗性疾患に感染したシカ（Ｋｕｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００７）からの、ＰｒＰ^Scの検出の感受性を増加することを報告している。さらに、ＰＭＣＡは、この技術を有用な診断のツールにする、羊及びハムスターの、双方とも病気の末期段階での血液における、及び前駆症状の動物における（Ｃａｓｔｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００５ａ， ｂ； Ｓａａ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｍｕｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｔｈｏｒｎｅ ａｎｄ Ｔｅｒｒｙ， ２００８）、及び尿及び髄液における（Ａｔａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， ２００８； Ｍｕｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）ＰｒＰ^Scを検出することを報告している。しかしながら、現在までＰＭＣＡはイムノブロットによる最終生成物を視覚化するための循環の多くのラウンドのための要求によって妨げられる。実際、ＰＭＣＡの多くのラウンドを実施することは、誤った明確な結果を導きうる。１９２サイクルによって、ＰｒＰ^CのＰｒＰ^Scへの自発的な変換を示した血液試料を調整し、従ってこの技術を幾分不十分に認識目的のためにもたらす。ＰＭＣＡは大きな可能性を有するが、しかし最適の感受性（約３週間）を達成するために必要な時間の長さを含む種々の基本及び技術の困難さによって妨害される。

現在のドグマは、ＰｒＰ^Scが感染性と直接相互関係を示し、かつ脳におけるそれらの蓄積が、神経病理学的及び臨床的疾患を引き起こすことである。ＰｒＰ^Sc蓄積の割合及びパターン、並びに従って、神経病理の形成の割合は、疾患の培養期間を決定する（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。しかしながら、ＣＮＳにおいて及び予期と反対に、ＰｒＰ^Scの全ての蓄積及び高レベルまでの感染力は、無症候性マウスにおいて存在してよい（Ｂｕｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。事前に及び実験的に感染した羊における追加の研究（Ｍａｄｅｃ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｂｕｌｇｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６）は、ＰｒＰ^Sc、ＩＨＣ染色トポロジー、組織学的領域の範囲及び臨床的疾患のレベル間の矛盾も証明している。

食料の安全性を改良するために、生存中の臨床前試験、すなわち症状の提示前の試験を使用するプリオン疾患のための全ての動物をふるい分けることは大いに有利であってよい。しかしながら、ＰｒＰ^Scレベルは、症状が出る前の宿主において非常に低い。さらに、ＰｒＰ^Scは、神経系組織において一貫して見出される最も高い濃度及び容易に到達可能な体液、例えば血液又は尿における非常に低い濃度で、一般に体組織中で不均等に分布される。従って、あらゆるかかる試験は、極めて少量のＰｒＰを検出することを要求し、ＰｒＰ^CとＰｒＰ^Scとを区別する必要がある。

速い検出を保証する能力は、実際の値であるべき治療的介入のために必要である。ヒトの食物連鎖並びに血液及び組織ドナーのために予定された動物に関して、プリオン作用剤は、あらゆる臨床症状の出現前に良好に検出できる必要がある。従って、プリオン検出のためのより感受性のある方法のための長期の要求がある。

発明の要約
ＰｒＰ^Cの立体構造的に変更された形はＰｒＰ^Scである。いくつかの群は、ＰｒＰ^ScがＴＳＥにおいて感染作用剤（プリオン作用剤）であることが知られているが、一方で他の群は知られていない。ＰｒＰ^Scは、病気プロセスの神経病理的生成物、感染作用剤の成分、それ自体感染作用剤、又は全く他のものであってよい。病気状態におけるその実際の機能の状態にかかわらず、明らかなことは、ＰｒＰ^Scが、特に病気プロセスに関係し、かつその検知は、プリオン病を引き起こす作用剤での感染を示す。

本発明は、特に、生物学的試料におけるＰｒＰ^Scの検出によるプリオン病の診断のための方法を提供する。この生物学的試料は、脳組織、神経組織、血液、尿、リンパ液、髄液又はそれらの組合せであってよい。ＰｒＰ^Scの欠乏は、前記方法の検出限界までの感染作用剤で感染しないことを示す。ＰｒＰ^Scの存在の検出は、プリオン病に関連する感染作用剤での感染を示す。プリオン作用剤での感染は、病気進行の前駆症状及び症状段階の双方において検出されてよい。

これらの、及び他の改良は、ＳＯＦＩＡ、ＰｒＰ^Scの検出のために開発されているレーザーを基礎とする免疫アッセイ（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）で達成されている。ＳＯＦＩＡの感受性及び特異性（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）は、正常な及び異常なＰｒＰアイソフォームを区別するためのＰＫ消化のための要求を除く。さらに、血液プラズマにおけるＰｒＰ^Scの検出は、現在、ＳＯＦＩＡに従った制限されたＰＭＣＡによって処理されている。ＳＯＦＩＡの感受性のために、ＰＭＣＡサイクルは、従って、自発的なＰｒＰ^Sc形成の機会、及び誤って陽性の試料の検出を減少する。

本発明は、最近開発されたＭａｂ作用剤ＰｒＰとの組合せで、明らかに記載されている方法よりも少ない試料の調合を要求する、高い感受性装置を使用する解析の方法を提供することによって、ヒトを含む、前駆症状及び症状のあるＴＳＥ感染動物におけるプリオン病の検出における増加させた感受性の前記要求を満たす。本発明の方法は、脳組織においてＰｒＰ^Scを検出するのに十分な感受性レベルを提供する。制限されたｓＰＭＣＡと結合される場合に、本発明の方法は、生前に採取された血液プラズマ、組織及び他の液体中で、ＰｒＰ^Scを検出するのに十分な感受性レベルを提供する。試料の採取と解析との間の時間は、脳材料に関して２４時間未満であってよい。前記方法は、キャプチャーのためのＭａｂの感受性と、周囲光ファイバー検出技術の感受性での濃度とを組み合わせる。脳ホモジネートにおけるＰｒＰ^Scの検出のために明らかに記載されている方法とは対照に、これらの技術は、脳ホモジネートを研究するために使用される場合は、播種重合（ｓｅｅｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、増幅又は酵素消化（例えばプロテアーゼＫ又は"ＰＫ"によって）を使用しない。これは、以前の報告が、アッセイの信頼性を低下させる変動させたＰＫを有するＰｒＰ^Scアイソフォームが存在していることを示唆している。このアッセイの感受性は、生物学的液体における、急速なプリオン検出アッセイのための土台として適している。プリオン病に加えて、前記方法は、感染及び病気の広いスペクトルのための急速な高い処理量試験のための手段を提供してよい。

免疫沈降との組合せで、ｓＰＭＣＡの約４０サイクルが、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによるプラズマにおけるＰｒＰ^Sc検出に不適切であることを見出した一方で、ＰｒＰ^Scは、ＳＯＦＩＡ法によって急速に測定されることも見出した。本発明に従って、本発明のアッセイの土台に必要な制限されたサイクル数は、例えば以前に報告された（Ｔｈｏｒｎｅ ａｎｄ Ｔｅｒｒｙ， ２００８）のように、ＰＭＣＡに関連する誤った明確な結果を得る可能性を実質的に除く。

次に、本発明の制限されない実施態様を報告する。第一の実施態様に従って、ＰｒＰ^Scの存在又は欠乏の検出のための、それらを有することが疑わしい生物学的試料中での方法は、試料マトリックスからのＰｒＰ^Scの実質的な分離によって試料中に存在してよいような、ＰｒＰ^Scを濃縮する工程、標識されたＰｒＰ^Scを生産するために少なくとも１分子の標識で濃縮したＰｒＰ^Scを標識する工程、及び解析装置上で標識されたＰｒＰ^Scを検出する工程を含んで開示されている。

本発明の第二の実施態様に従って、ＰｒＰ^Scの存在又は欠乏の検出のための、それらを有することが疑わしい生物学的試料中での方法は、試料マトリックスからのＰｒＰ^Scの実質的な分離によって試料中に存在してよいような、ＰｒＰ^Scを濃縮する工程、標識されたＰｒＰ^Scを生産するために少なくとも１分子の標識で濃縮したＰｒＰ^Scを標識する工程、及び解析装置上で標識されたＰｒＰ^Scを検出する工程を含んで開示されている。この実施態様において、ＰｒＰ^Scは消化されない。

本発明の第三の実施態様に従って、ＰｒＰ^Scの存在又は欠乏の検出のための、それらを有することが疑わしい生物学的試料中での方法は、試料マトリックスからのＰｒＰ^Scの実質的な分離によって試料中に存在してよいような、ＰｒＰ^Scを濃縮する工程、標識されたＰｒＰ^Scを生産するために少なくとも１分子の標識で濃縮したＰｒＰ^Scを標識する工程、及び解析装置上で標識されたＰｒＰ^Scを検出する工程を含んで開示されている。ＰｒＰ^Scの濃縮と、標識したＰｒＰ^Scの解析との時間は、有利には、約４８時間未満である。

さらなる本発明の実施態様に従って、ＰｒＰ^Scの存在又は欠乏の検出のための、それらを有することが疑わしい生物学的試料中での方法は、ｓＰＭＣＡによって試料中でＰｒＰ^Scを増幅する工程、試料マトリックスからのＰｒＰ^Scの実質的な分離によって試料中に存在してよいような、ＰｒＰ^Scを濃縮する工程、標識されたＰｒＰ^Scを生産するために少なくとも１分子の標識で濃縮したＰｒＰ^Scを標識する工程、及び解析装置上で標識されたＰｒＰ^Scを検出する工程を含んで開示されている。

さらなる本発明の実施態様に従って、ＰｒＰ^Scの存在又は欠乏の検出のための、それらを有することが疑わしい生物学的試料中での方法は、ｓＰＭＣＡによって試料中でＰｒＰ^Scを増幅する工程、試料マトリックスからのＰｒＰ^Scの実質的な分離によって試料中に存在してよいような、ＰｒＰ^Scを濃縮する工程、標識されたＰｒＰ^Scを生産するために少なくとも１分子の標識で濃縮したＰｒＰ^Scを標識する工程、及び解析装置上で標識されたＰｒＰ^Scを検出する工程を含んで開示されている。この実施態様において、生物学的試料は、脳組織、神経組織、血液、尿、リンパ液、髄液又はそれらの組合せである。

図１は、本発明のいくつかの方法によるＰｒＰ^Scの解析に適した装置の一実施態様を示す略図である。 図２は、本発明のいくつかの方法によるＰｒＰ^Scの解析に適した装置のエンドポートアセンブリ（ｅｎｄ ｐｏｒｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ）の一実施態様の側面図を示す略図である。 図３は、本発明のいくつかの方法によるＰｒＰ^Scの解析に適した装置の試料容器の一実施態様の略図である。 図４は、一辺からの見る、図３の試料容器の略図である。 図５は、頂点から見る、図３の試料容器の略図である。 図６は、２６３Ｋに感染したハムスター（Ｈ）、スクレイピーに感染した羊（Ｓ）及びＣＷＤに感染したシカ（Ｄ）からの、Ｍａｂ０８−１／５Ｄ６（Ａ）、０８−１／１１Ｆ１２（Ｂ）、及び０８−１／８Ｅ９（Ｃ）を使用した、未処理の及びＰＫ処理した合計の脳可溶化液のウェスタンブロット解析を示す。 図７は、ＯＤ₄₀₅で比色測定で測定された抗体結合を示す。キャプチャーＥＬＩＳＡは、キャプチャー剤としてＭａｂ１１Ｆ１２、及び検出剤としてビオチン化５Ｄ６を使用してアッセイする。脳組織は、通常の及び感染したハムスター、羊及びシカからホモジネートする。前記アッセイを、非ＰＫ及びＰＫ処理した脳可溶化液で実施した。 図８は、キャプチャーＥＬＩＳＡに従う、非ＰＫで処理した脳ホモジネートのウェスタンブロット解析を示す。キャプチャーＥＬＩＳＡを、通常の羊（ＮＳ）、スクレイピーに感染した羊（ＳＳ）、通常のシカ（ＮＤ）、ＣＷＤに感染したシカ（ＣＷＤ）、通常のハムスター（ＮＨ）及び２６３−Ｋに感染したハムスター（２６３Ｋ）に対して、非ビオチン化検出剤を使用して図７において記載されたように実施した。免疫染色をＭｂ８Ｅ９を使用して実施した。 図９は、未感染の及び感染したハムスター、羊及びシカからの脳可溶化液を使用するキャプチャーＥＬＩＳＡにおける、キャプチャー及び検出剤の逆転の比較を図示する。キャプチャー剤として５Ｄ６を、及びビオチン化検出剤として１１Ｆ１２を（５Ｄ６／ビオチン１１Ｆ１２）使用する研究は、キャプチャー剤として１１Ｆ１２及びビオチン化検出剤として５Ｄ６を（１１Ｆ１２／ビオチン５Ｄ６）使用と比較される。 図１０は、図１の装置で得られたデータを示し、ローダミンレッド（四角）の希釈、並びにマウス（アスタリスク）、ハムスター（ダイア）、羊（逆三角形）及びシカ（丸）からのｒＰｒＰ（組み換えｒＰｒＰ）からの相対的なシグナル強度を示す。 図１１は、感染させたハムスター、羊及びシカからの、ＰＫ処理した及び未処理の通常の（オープンバー）及び感染させた（立体バー）脳ホモジネートにおける、図１の装置によるＰｒＰ検出を示す。ｘ軸の数は、通常の試料の１０倍希釈の程度を示す。例えば、ハムスターに関する−１０は、試料が１×１０^-10の係数によって希釈されていることを示す。 図１２は、Ｍａｂ ８Ｅ９免疫沈降に従うＰｒＰのウェスタンブロット解析を示す。 図１３は、ＰｒＰのＭａｂ ８Ｅ９の免疫沈降のキャプチャーＥＬＩＳＡ解析の結果を示す。 図１４は、ｓＰＭＣＡに従うＰｒＰ^Scのウェスタンブロットを示す。 図１５は、スクレイピー羊の第三の瞼リンパ組織の免疫組織化学を示す。 図１６は、ｓＰＭＣＡを有する及び有さないＳＯＦＩＡを使用する羊スクレイピー血液試料におけるＰｒＰ^Sc検出を示す。 図１７は、ｓＰＭＣＡを有する及び有さないＳＯＦＩＡを使用するＣＷＤ血液試料におけるＰｒＰ^Sc検出を示す。

発明の詳細な説明
"ＰｒＰ^Sc"は、ＰｒＰ^Cの立体構造的に変更された形を意味すると解する。ＰｒＰ^Scは、特に、病気プロセス及びプリオン病を引き起こす作用剤での感染の徴候の検出に関する。（ＴＳＥ）は、制限されることなく、ヒトの病気、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、及びクールー、並びに病気の動物系、牛海綿状脳症（ＢＳＥ、通常狂牛病として公知である）、慢性消耗性疾患（ＣＷＳ）（オオシカ及びシカにおいて）、及びスクレイピー（羊において）を含むと解する。"タンパク質性の"は、プリオンが、タンパク質及び他の生物学的存在物を含んでいてよいことを意味し、かつ従って、プリオンが、単独のタンパク質からなることを暗示することを意図していない。

ＰｒＰ^Scの濃縮の記載において使用されるような"実質的分離"は、試料中に残っているあらゆる試料マトリックス又は非ＰｒＰ^Sc材料が、本発明に記載されている方法によって検出されるために、又は検出を妨げるために十分であることを意味すると解される。

"標識されたＰｒＰ^Sc"は、蛍光標識が、共有結合又は非共有結合で付着されているＰｒＰ^Scを意味する。有利には、１つの蛍光標識は、単一のＰｒＰ^Sc分子に付着される。

"検出の可能性"は、装置が、標識したＰｒＰ^Scが全く解析されない場合に、装置のバックグラウンドノイズシグナルよりも著しく高いシグナルをもたらすことを意味する。特定の試料がアトモル量より多く含まれてよいが、試料を、解析に対して装置が再現性があり、かつ統計的に著しいシグナルをもたらす、標識したＰｒＰ^Scの試料の約０．１アトモル／ミリリットルまで希釈すべきと解される。

"アトモル量"は、０．１アトモル〜１フェムトモルを意味する。

"生存"は、試料が採取される生物の死前を意味すると解される。

"前臨床"又は"前駆症状"は、試料が、プリオン病の症状を呈さない生物から採取されることを意味すると解される。

"播種重合"は、ＰｒＰ^Cの、より高いベータ−プリーツシートの含有率を有し、かつプロテアーゼ耐性があるＰｒＰ^Scへの変換の誘発を意味すると解される。

"酵素消化"は、特定のアミノ酸の選択的な開裂を誘発する、故意に試料中に導入されたプロテアーゼによるタンパク質の破壊を意味すると解される。"酵素消化"は、試料中に天然に存在する酵素による自己消化又は消化を誘発しないと介する。本明細書において使用される"未消化"は、ＰｒＰ^Scが試料調合又は解析中に酵素に従わないことを意味すると解される。

本発明の方法は、感染が生じているかどうかを決定することが所望されている動物又はヒトからの、ＰｒＰの異常なアイソフォーム（ＰｒＰ^Sc）を含んで良い、又は含まなくてよい試料を得る工程を含む。試料が感染した生物からである場合に、該試料は、ＰｒＰ^Sc、及び非ＰｒＰ^Sc構成成分、例えば細胞、細胞構成成分、生分子、非ＰｒＰ^Scタンパク質等を含むと解される試料マトリックスを含む。該試料は、神経組織、血液、尿、リンパ液、髄液及びそれらの組合せから採取され、かつそれらを含んでいてよい。

一度採取すれば、ＰｒＰ^Scは、試料マトリックスから重要なＰｒＰ^Scを分離することによって、少なくとも半分精製され、又は濃縮される。前記濃縮は、当業者に公知である、制限されることなく、分子抗体、免疫沈降、磁気ビーズ、プラスチック表面上での抗体キャプチャー、マグネシウムホスホタングステン、メタノール、及びそれあの組合せを使用する方法を含む種々の方法によって生じてよい。一実施態様において、前記濃縮は、モノクローナル抗体を使用して生じる。ＳＯＦＩＡにおいて、キャプチャーＥＬＩＳＡ中で共に使用される場合に、相乗作用を有すると記載されている、いくつかのＰｒＰに特異的なＭａｂを使用した（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰｒＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ＥｖｏｋｅｓＩｍｍｕｎｏｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ， Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｖ．２０５， ｉｓｓｕｅ １−２， ｐｐ． ９４−１００ （２００８））。

前記濃度は、さらに、染料標識したアンチ−ＰｒＰ Ｍａｂと共に、第二のビオチン化アンチ−ＰｒＰ Ｍａｂ及びストレプトビアジン共役磁気ビーズを使用する免疫沈降を基礎とするキャプチャーアッセイである、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００５において記載された技術によって生じてよく、参照をもって本発明に開示されたものとする。この技術の変法は、直接磁気ビーズと共役させた第二のＰｒＰ Ｍａｂでの染料標識したアンチ−ＰｒＰ Ｍａｂを含む。

濃縮させた試料は、少なくとも０．１アトモルのＰｒＰ^Sc、選択的に２００アトモル、選択的に約０．１アトモル〜約１．０アトモル、選択的に約０．１アトモル〜約１．０フェトモル、及び選択的に約０．４アトモル〜約１．０アトモルのＰｒＰ^Scを含んでよい。

濃縮した試料中のＰｒＰ^Scは、標識したＰｒＰ^Scを製造するために１つ以上の蛍光分子で標識されてよい。標識は、制限されることなく、蛍光標識、リン光標識、放射性同位体標識、ビオチン化を含む当業者に公知の種々の方法、及び当業者によって理解されうる標識方法によって生じてよい。一実施態様において、標識は、蛍光標識であり、かつ蛍光標識は、ローダミンレッドである。

他の一実施態様において、ＰｒＰ^Scは、蛍光標識の他に、制限されることなく、リン光体、赤外線、可視光線及び紫外線の吸収によって、及び当業者によって理解されてよい他の分光法によって検出されてよい。

一実施態様において、濃縮した試料は、ＰｒＰ^Scを感受性があり、かつ急速に検出できる適した解析装置で解析される。一実施態様において、前記装置は、標識されたＰｒＰ^Scのアトモル量を検出できる。一実施態様において、ＰｒＰ^Scを濃縮する工程、ＰｒＰ^Scを標識する工程、及び検出する工程を含む時間は、４８時間未満、選択的に２４時間未満、及び選択的に１２時間未満であり、選択的には３時間未満である。

一実施態様において、装置、例えば米国特許明細書第１１／５３４，５４６号（参照をもって本明細書に開示されたものとする）において記載されている装置を、本発明の目的のために使用してよい。システム１００の代わりの実施態様を図１において図示する。この実施態様において、４つの線状配置は、新調された透過試料容器３０６を格納する試料フォルダ１０２からエンドポート１０３まで伸びる。エンドポート１０４の末端は、エンドポートアセンブリ２００中に挿入される。線状配置は、第一エンド及び第二エンドを有する多数の光ファイバ、場合により保護及び／又は絶縁シースによって覆われた多数の光ファイバを含む。前記光ファイバの数は変動し、一実施態様においては、約１０〜約１００であり、選択的には約２５〜約７５であり、選択的には約５０である。線状配置の数は変動し、少なくとも２つである。線状配置の最大数は、試料フォルダのサイズに依存し、その際該試料フォルダは、覆うための光ファイバの第一エンドに十分な空間を与えるためにかなり十分であるべきであり、かつ試料容器に近く（例えば約１ｍｍ〜約１ｃｍ）にあるべきである。一実施態様において、前記線状配置の数は、２〜１０であり、選択的には約４〜６であり、かつ選択的には４である。一実施態様において、前記線状配置の数は、平面配置に置かれ、その際調整された線状配置は、互いから及び試料フォルダを覆って等距離に配向される。線状配置の数が４である場合に、調整された線状配置は、たがいに関連して９０度の角度で配向される。線状配置の長さは、非常に広く、かつ光ファイバの数及び性質に依存する。前記長さは、光ファイバの規準を損なうことなしにそれぞれ線状配置から光ファイバのバンドリングを可能にするために十分であるべきである。主にそれらは、試料の解析に使用される診断装置から遠く位置されるべき試料を考慮に入れる。光ファイバの長さに対する上限ではない。

光ファイバの第一エンドは、試料は含む容器の長さ沿った、実質的に直線の方法で置かれてよい。光ファイバの第二エンドは、シグナルエンドポートを共に形成するために束ねられる。言いかえれば、それぞれの線状配置から前記ファイバーの第二エンドの得られた長さは、単一の束を形成するために混ぜられる。有利には、それぞれの線状配置からの前記ファイバの第二エンドは、束内で無作為に点在される。多数の光ファイバは、重要な解析から発せられたシグナルを受け取り、かつ該ファイバの第一エンドから、該ファイバの第二エンドを含むエンドポートまでシグナルを伝達する。前記ファイバは、サインθ／２に対応する開口数（ＮＡ）を有し、θは適用された入射光の角度（光取り込み角度）である。前記光取り込み角度は、実質的に全ての放出されるシグナルが、多数の前記ファイバによって妨げられてよいように選択される。これは、希釈解析、例えばＰｒＰ^Scからのシグナルの最適な採取効率を確実にする。

一実施態様において、光ファイバは、ヒューズドシリカを含む。該ファイバは、約５０マイクロメートル〜約４００マイクロメートルの直径を有する。それぞれの線状配置からの光ファイのバンドリングは、いくつかの利点を提供する。それぞれの線状配置のための別々の検出が要求されるが、単一検出器を使用してよい。４つの線状配置を含むシステムのために、これは、４つの個々の検出器のサイズの４分の１を有する検出範囲をもたらす。したがって、同様にノイズに対するシグナルの割合を高めて、したがって検出の限界を低下するバックグラウンドノイズは、劇的に減少する。一実施態様において、検出器のサイズは、約０．５ｍｍ×０．５ｍｍ〜約１ｍｍ×１ｍｍである。この実施態様のシステムの検出の限界は、分析物の少なくとも０．１アトモルであり、選択的に少なくとも２００アトモルであり、選択的に約０．１アトモル〜約１．０ミクロモルであり、選択的に約０．１アトモル〜約１ナノモルであり、選択的に分析物の約０．４〜約１．０アトモルである。代わりに、この実施態様において、前記システムの検出の限界は、分析物の少なくとも０．１アトグラムであり、かつ選択的に分析物の少なくとも１０アトグラムである。

図２は、この実施態様のエンドポートアセンブリの一実施態様を示す。束ねられた光ファイバを含むシグナルエンドポートの末端は、エンドポートアセンブリ２００の入口２０２中に挿入される。前記シグナルは、光ファイバによってエンドポートアセンブリ２００を介して出口２０７に伝達される。光ファイバ２０８の出力は、約３００ミクロン〜約５００ミクロンの直径を有してよく、及び有利には約４００ミクロンである。したがって、エンドポートアセンブリは、光学的にシグナルエンドポートを検出器に繋げる。エンドポートアセンブリは、入射シグナルを合わせるために供給する第一レンズ２０３を有してよい。エンドポートアセンブリは、さらに、光ファイバ２０８の出力に適しているＮＡに出力シグナルを集中ために供給する第二レンズ２０４を有してよい。エンドポートアセンブリは、さらに、少なくとも１つのノッチフィルター２０５及び少なくとも１つのバンドパスフィルター２０６を有してよい。

適した検出器の制限のない例は、フォトダイオード検出器、光電子増倍管、電荷結合装置、光学顕微鏡、及びそれらのあらゆる組合せを含む。

図３は、この実施態様の適した試料フォルダ１０２の一実施態様を示す。スペーサー３０３は、空間を、試料フォルダ３００を通過して伸長された透過容器３０６に提供するように配置される。一実施態様において、該試料ホルダはキャピラリーであり、かつガラス、石英、又はあらゆる他の好適な当業者に公知の材料から製造されてよい。実施例によってのみ、前記キャピラリーは、液体の１００マイクロリットルを保持してよい。スペーサー３０３は、さらに、スロット３０４、又はスペーサーを透過容器の周囲及び接近して光ファイバの第一エンドに提供するために配置される。スペーサー３０２は、頂部エンドプレート３０５及び底部エンドプレート３０２によって固定され、双方は、留め金具、例えばネジのための方法によってスペーサー３０３に取り付けられる。

キャプチャーされる放出されたシグナルは、光検出器によって電子シグナルに変換され、かつ解析器に伝達され（示されていない）、そして電子シグナルを受け、そして解析物の存在で試料を解析する。解析器の例は、当業者によく知られている。前記解析器は、電子シグナルの位相敏感検出を可能にするロックイン増幅器、又は本明細書に記載されている光検出器の種々のタイプによって発せられる電子シグナルを解析するために当業者に公知の方法を含んでよい。

前記アッセイのために開発された装置は、レポーター分子から光の採取に最適化されてよい。蛍光を基礎とするアッセイにおいて現在使用される染料は、９０％の近く又は９０％より高い量子効率を有する。一実施態様において、前記染料は、ローダミンレッドＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）である。さらに、トランスコンダクタンス前置増幅器及びロックイン検出器装置は、低シグナル／低ノイズ検出を良いにするために最適化される。最初に、ロックイン増幅器によるラインフィルタリングが使用されるべきである。一実施態様において、変調周波数は、７５３Ｈｚであり、かつロックイン増幅器は、６０Ｈｚ及び１２０Ｈｚでのフィルタに調整される。トランスコンダクタンス前置増幅器を、期待されるシグナルレベルに基づいて、及び前置増幅器の入力インピーダンスを最適化するために選択し、かつ一実施態様においては１ｎＡ／Ｖに調整される。一実施態様において、バンドパスフィルターを、例えば７５３Ｈｚであるチョッパ周波数に集中させる。

実施例
１．組織試料の採取
ハムスターに適用した２６３Ｋスクレイピー株の調達及び繁殖は、Ｃｈａｎｇ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， "ＰｒＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｅｖｏｋｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ，" Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ｖ．２０５， ｉｓｓｕｅ １−２， ｐｐ． ９４−１００ （２００８））に記載されている。スクレイピーに感染した羊及びＣＷＤに感染したオジロジカからの脳を、臨床的疾患の時点で摘出し、そして−８０℃で凍結した。未感染動物からの脳を同様に摘出し、そして凍結した。完全な長さのシカ、ハムスター、マウス及び羊ＰｒＰのコード領域を、ｐＥＴ−２３ベクター中にクローンして、Ｄ． Ｒ． Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， "Ｎｏｒｍａｌ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｓ ａｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｌｉｋｅ ｔｈａｔ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，" Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ｖｏｌ． ３４４ ｐｐ． １−５ （１９９９）において記載されているように、タフを有さないタンパク質（ｒＰｒＰ）を製造した。発現及び精製は、ＣＥ． Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， "Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｃｕ^２＋ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｉｓ⁹⁶ ａｎｄ Ｈｉｓ¹¹¹ ｉｎｄｕｃｅｓ β−ｓｈｅｅｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ" Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９， ｐｐ． ３２０１８−３２０２７ （２００４）の手順と実質的に同様であった。

実験的経口感染は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で製造された２０％スクレイピー羊の脳ホモジネート（臨床的及び免疫組織学的に要請の動物からのスクレイピー脳の合成物から由来する）を使用した。すべての未感染の動物を、別々のスクレイピーを有さない手段で格納した。羊スクレイピーの臨床的サインは、体の震え、摩擦からの羊毛の損失、最期でのニブリング、過敏症及び足取りの異常を含む。

羊の遺伝子タイピングを商業的に実施した（Ｇｅｎｅ Ｃｈｅｃｋ， Ｉｎｃ．， Ｇｒｅｅｌｅｙ，ＣＯ）。

ＩＨＣに関して、ホルマリンで固定した第三眼瞼組織を、水中で１５分間洗浄し、そして９９％ギ酸中で１時間浸漬した。３時間の水での洗浄後、その組織をＭｉｃｒｏｍ ＳＴＰ １２０中でパラフィン処理し、そしてマウンティングのために４ミクロンで切断した。そのスライドを、少なくとも２４時間乾燥させ、脱パラフィン処理し、そしてＶｅｎｔａｎａ （Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｏ Ｖａｌｌｅｙ， ＡＺ）所有の試薬（プリオンを高めた溶液及びアンチＰｒＰ抗体）、及びＢｅｎｃｈｍａｒｋ ＬＴ自動システムを使用して免疫染色した。血液採取のために、動物を固定し、そして針を頸静脈中に挿入した。直ちに血液採取し（抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを使用して）、血液の２分の１を冷却し、そして直ちに輸送した。採取した全体の血液試料の残りの半分を、４℃で１５分間、低速で遠心分離した。プラズマを取り除き、凍結し、そしてドライアイス上で輸送した。

オジロジカの処理及びサンプリグプロトコルを、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ’ｓ （ＣＤＯＷ） ＩＡＣＵＣによって実証した。いくつかの自由な範囲源から獲得した新生児のオジロジカの子ジカを、缶詰にした牛のエバミルクを使用して飼育し、そしてプロトコルを確立した（Ｗｉｌｄ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ １９９１； Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ． １９９４）。シカを、試料採取の時間を除いて、研究中にバイオセンサーパドックに閉じ込めた。食料、水、及びサプリメントを、全てのパドック中で自由に提供した。約６ヶ月の年齢で、オジロジカの子ジカを、同種の約０．５ｇで経口的に接種し、プールし、感染した脳材料を舌の基に置いた。以前の解析は、この接種物プールが感染性であり、かつ脳組織の約６μｇ ＰｒＰ ＣＷＤ／ｇを含むことを示した（Ｒａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ． ２０００； Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ． ２００７）。全てのシカを、ＣＷＤの臨床的サインの認識で経験した獣医によって評価し、そして行動変化、体の状態の低下、機能障害、及び唾液分泌及び多渇症に関して主観的に評価した。この研究のための５匹のシカは、天然のプリオンタンパク質遺伝子の子ドン９６でのグリシン及びセリンに関する異型接合体であり、感染後日数（ｄｐｉ）２５３又は３４３日によって扁桃腺の政権体においてＰｒＰ ＣＷＤ蓄積を有し（Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ． ２００７）、そして検死の試験８９１〜１７７４ｄｐｉでプリオンに感染したことを確かめた。

血液試料を、８９１ｄｐｉで、５匹の摂取したオジロジカから採取した。サンプリングの時点で、１匹の動物（ＢＣ０４）は、最終ステージで、臨床的に慢性消耗病であり、２匹（Ｎ２０４及びＷ１００４）は、いくつかの体の状態の低下を示し、そして他の２匹（Ｉ３０４、Ｋ３０４）は臨床的に通常であった。血液採取のために、シカをキシラジンで落ち着かせ、頸静脈の上の皮膚を無菌的に準備し、そして血液について、クエン酸ナトリウムで処理したプラスチックの溶液中に頸静脈パンチャーを介して採取した。

２．モノクローナル抗体の発生
アミノ酸（ａａ）９０〜２３１（ＰｒＰ_90-231）を含むコアタンパク質からなるＰＫ処理したＰｒＰ^Scを、Ｄｉｒｉｎｇｅｒ （１９８４） によって独自に報告された方法を使用して２６３Ｋに感染したハムスターの脳から単離し、そしてＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）によって改質した。この材料を、以前に記載した（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３）のように沈降させたグアジニンヒドロクロリド及びメタノールを使用して可溶化し、そして抗原として使用した。ＰｒＰ^-/-マウスを免疫化し、そしてそれらの免疫反応を、以前に記載した（Ｋａｓｃｓａｋ ｅｔ ａｌ．， １９８７）のようにＥＬＩＳＡによって監視した。免疫化したマウスの１つは、ハイブリドーマを製造するために使用した。そのマウスは、融合後４日に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に静脈内経路によって、抗原の最後の免疫化を受けた。脾臓細胞を、細胞表面ＰｒＰ^Scの低減したレベルを発現するＳＰ２／０骨髄腫の細胞系列に融合した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。そのハイブリドーマを以前に記載した（Ｋａｓｃｓａｋ ｅｔ ａｌ．， １９８７）のようにＥＬＩＳＡによって検査し、そして得られた細胞を制限希釈によって３時間クローンした。ラージスケールのＭａｂの生産を、処理可能な生物反応フラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して実施し、そして抗体をタンパク質Ｇ免疫アフィニティークロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を使用して、媒体から精製した。タンパク質をマイクロＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定し、そしてアイソタイピングを、マウスＭａｂアイソタイピングキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して実施した。それぞれのＭａｂを、ＥＺリンクビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してビオチン化した。

多数のＭａｂを、免疫原として可溶化ＰｒＰ^Sc、及びＳＰ２／０骨髄腫の細胞系列を発現する低いＰｒＰを使用して生じた。それらの３つのＭａｂ、０８−１／５Ｄ６ （５Ｄ６）、０８−１／１１Ｆ１２ （１１Ｆ１２）及び０８−１／８Ｅ９ （８Ｅ９） を、この研究のために選択し、それぞれＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｂとしてアイソタイプさせた。ここにすべての３つのＭａｂは、通常の、及び病気の関連ＰｒＰアイソフォームと反応した。

全体の脳溶解物のウェスタンブロット（図６）は、全ての３つのＭａｂが、２６３Ｋに感染したハムスター、スクレイピーに感染した羊及びＣＷＤに感染したシカからのプロテアーゼ処理していない脳狩猟及びＰＫ処理したＰｒＰ^ScからのＰｒＰに対して、反応性があることを証明した（図６）。同様の結果を、未処理の及びＰＫ処理した部分的に精製したＰｒＰ^Sc調合物を使用して観察した（データは示されていない）。それらのＭａｂを、通常及び異常なＰｒＰアイソフォーム、並びにＭＥ７、１３９Ａ及び２２Ｌマウスに適用されるスクレイピー株で感染させたマウスの脳から単離したＰＫ処理したＰｒＰ^Sc、並びにＣＪＤに感染したヒトの脳、並びに家畜を含む全ての試験された種からの未感染の脳材料から由来するＰｒＰ^Cに対しても、免疫反応がある（データは示されていない）。

間接のＥＬＩＳＡによって、３つのＭａｂは、２６３Ｋに感染したハムスター脳から精製したＰＫ処理したＰｒＰ^Scに免疫反応がある。反応性の程度は、変性処理の範囲に依存した。熱又はＳＤＳ処理は、単独で、免疫反応性を増加したが、２つの処理の組合せは、抗体結合の最も高いレベル、及び２つの処理の付加効果に近い免疫反応性（表１）をもたらし、エピトープの露出が、マルチな機械的プロセスであることを示した。興味深いことに、５Ｄ６は、形態的エピトープに結合するが、このＭａｂの反応性は損失せず、しかしむしろＰｒＰの変性を高めた。熱変性がＰｒＰ^Scのポリマー構造を崩壊するために十分ではないことは以前に報告されている（Ｔａｙｅｂｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。さらに、Ｍａｂは、ＥＬＩＳＡによる、未感染の脳及び変性していない脳ホモジネートにおける全ＰｒＰ（通常及び異常なＰｒＰアイソフォーム）に対して同等に免疫反応性があった。免疫反応性は、ＳＤＳ及び熱での変性に従って、約２倍高められた。ＰＬ処理及び変性に従って、ＰｒＰ^Scの免疫反応性は、タンパク質の分解消化の結果として結合する外因的な脳タンパク質がほとんど存在しないことによって、さらに３倍増加した（データは示されていない）。

ＰｒＰ検出の特異性及び感受性を高めるために、キャプチャーＥＬＩＳＡアッセイを、ビオチン化検出抗体の取り込みで使用した。予期されたように、それぞれのビオチン化したＭａｂのために、５〜６個のビオチンをそれぞれの抗体分子に結合した。さらに、Ｍａｂのビオチン化は、部分的に精製したＰＫ処理したＰｒＰ^Scを使用する、直接ＥＬＩＳＡによって評価されたそれらの免疫反応を干渉せず、又は低減しない（データは示されていない）。従って、検出抗体の結合及び反応性における差異は、物理学的なビオチン化方法の結果ではない。ＳＤＳ及び熱で変性させたＰＫ処理したＰｒＰ^Scを使用して、いくつかのＭａｂの組合せを試験し、そしてそれぞれの抗体を、キャプチャー剤として、及び検出剤として評価した（表２）。抗体の組合せ、キャプチャー剤としてＭａｂ １１Ｆ１２及び検出剤としてビオチン化５Ｄ６の１つのみは、ＰｒＰ^Scとの結合及びＰｒＰ^Scの同定において成功した。その結果は、ＰｒＰ^Scが、２６３Ｋに感染したハムスター、スクレイピー羊及びＣＷＤに感染したシカから由来したかどうかは気にかけなかった。精製したハムスター脳に対する直接ＥＬＩＳＡアッセイに関する銭の結果と同様に、キャプチャーＥＬＩＳＡアッセイにおけるＰｒＰの検出は、エピトープの利用可能性に依存し、そして脳溶解物の最初の処理によって決定された。感染した動物からの未処理の脳溶解物は、未感染の脳材料と比較してシグナル強度におけるわずかな（１．５倍）増加を示す一方で、洗浄剤又は熱変性が単独で４〜７倍の増加をもたらした。驚くことなく、ＰｒＰ^Scの検出の最も高いレベル（１０倍より大きい）を、ＳＤＳ及び熱処理の組合せを使用した場合に達成した。さらに、１％未満のＳＤＳの濃度の増加は、おそらく抗体−抗原結合の阻害及び／又は悪化によって検出できるＰｒＰ^Scを低下した。この以下で見られるような厳しい変性処理は、ＰｒＰ構造を完全に破壊するのに十分ではない。スクレイピー感染性、及びＰｒＰ^Sc構造の推定できる程度が、ＳＤＳ、熱及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにしたがって精製したＰｒＰ^Sc調合物中で維持されうることが以前に報告されている（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。

ＰｒＰ^Cを、全ての３つのスクレイピーからのキャプチャーＥＬＩＳＡによるＰＫで処理していない通常の脳ホモジネートにおいて検出した。全ての場合において、シグナル強度（〜０．２５〜０．３）は、バックグラウンド（〜０．１２〜０．１５）の２倍より高くなかった。この材料を、ウェルから溶出し、そしてウェスタンブロットによって試験した。ＰＫ処理していない脳ホモジネートから直接検出したＰｒＰ^Cの前記の結果と対照的に、溶出した試料のウェスタンブロットは、ＩｇＧ軽鎖及び重鎖の検出のみをもたらした。ＰｒＰ^Cは、結合材料の低いレベルによって検出できた。ＰＫ消化に続いて、ＥＬＩＳＡ値を、ＰｒＰ^Cの除去を示すバックグラウンドレベルまで低下させた。ＰｒＰ^Scは、２６３Ｋに感染したハムスター、羊スクレイピー及びＣＷＤからのＰＫ処理した脳ホモジネートにおけるキャプチャーＥＬＩＳＡアッセイによって急速に検出することができた。興味深いことに、ＰｒＰ^C及びＰｒＰ^Scを含有するＰＫ処理していない脳ホモジネートで実施したキャプチャーＥＬＩＳＡアッセイはＰｒＰ^C（ＰＫ処理していない通常組織から決定された）及びＰｒＰ^Sc（ＰＫ処理した感染した組織から決定した）凝集物と考えられているものよりも高いシグナル強度を示した（図７）。代わりの説明は、タンパク質、推定できる完全な長さのＰｒＰ^Scと、キャプチャーＭａｂとの結合が、より影響されやすくなる第二Ｍａｂのためのエピトープをもたらす抗原における空間変化を誘発することである。このプロセスは、正の免疫反応性に関する。

この研究において、使用されるＭａｂの得られたセットに関して、図７において示されるような正の免疫反応性の程度は、主に依存した。ＣＷＤ感染したシカからのＰｒＰ^Scは、ＰｒＰ^C及びＰｒＰ^Scの組合せから単に算出された、５Ｄ６の結合を越えて５８％の増加を有する最大レベルを示したが、一方で羊スクレイピーのＰｒＰ^Scは、４６％の増加を示した。２６３Ｋに感染したハムスターからのＰｒＰ^Scは、最も少なく呈されるが、しかしまだ４０％で著しかった。図７における値は、それぞれの種に関する６つの個々の試料に関する３通りに基づき、かつ平均±標準誤差として表される。

ＰｒＰ^Scにおける抗体で誘発される空間再配列及び／又は立体構造変化は、１１Ｆ１２〜５Ｄ６でキャプチャーされた材料が、他のＰｒＰに特異的なＭａｂのためのエピトープを変更することを示すことによって証明されうる。キャプチャーアッセイを、ＰＫ処理していないＰｒＰ^Sc、ＳＤＳ及び熱変性したＰｒＰ^Scで実施した。これは、ビオチン化Ｍａｂ ８Ｅ９、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ及び基材でのインキュベートに従う。シグナルを越えるバックグランドの損失は、Ｍａｂ ８Ｅ９のためのエピトープが、もはや入手でき又は利用できたことを示した。しかしながら、ウェスタンブロット及びＭａｂ ８Ｅ９での免疫染色によるマイクロリットルのウェルからの１１Ｆ１２〜５Ｄ９の溶出は、Ｍａｂ ８Ｅ９エピトープが再度利用できたことを示す強力なＰｒＰ^Sc染色を証明した。おそらく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液での処理に加えて、ＳＤＳの存在での電気泳動が、１１Ｆ１２〜５Ｄ６とＰｒＰ^Scとの結合を変更し、かつ抗体で誘発されるＰｒＰ^Sc変化を再度可能な８Ｅ９結合に置き換える。

Ｍａｂ ８Ｅ９は、ウェスタンブロット及び間接ＥＬＩＳＡアッセイに対して直接ＰｒＰ^C及びＰｒＰ^Scに結合することができたが、キャプチャーＥＬＩＳＡアッセイにおける５Ｄ６及び８Ｅ９の置き換えは、抗原に結合するビオチン化８Ｅ９の不在を示す検出できないＰｒＰをもたらす。さらに、１１Ｆ１２〜５Ｄ６抗体ペアのＰｒＰ^Sc特異性は、これらの特異的Ｍａｂの存在によってだけでなく、結合事象の連続によってであった。キャプチャー剤として５Ｄ６及び検出剤としてビオチン化１１Ｆ１２（５Ｄ６／ビオチン１１Ｆ１２）を使用することによる抗体の置き換えは、１１Ｆ１２−ビオチン化５Ｄ６（１１Ｆ１２／ビオチン５Ｄ６）の組合せと比較した場合に、ＰＫで処理されていない脳溶解物を結合する最少ＰｒＰ^Scをもたらす（図９）。シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）の比を、ハムスター、羊及びシカの脳組織からの、未感染の脳溶解物を使用したキャプチャーアッセイで得られたＰｒＰシグナルと、未感染の材料から得られたバックグラウンドシグナルにおける相違とを比較することによって得られた（Ｓ／Ｎ＝（Ｓ−Ｓ０）／（３σＳ０）、その際Ｓはシグナルであり、Ｓ０は平均バックグラウンドシグナルであり、σＳ０はバックグラウンドシグナルの標準偏差である）。１未満のＳ／Ｎ比は、Ｍａｂの結合が、測定されたシグナルが十分な量のノイズ有し、十分に弱いことを示す。それとは反対に、１以上のＳ／Ｎは、測定における力のほとんどが、特異的なＭａｂ結合からもたらされることを示す、測定におけるノイズが著しくないことを示す。信頼レベルは、Ｓ／Ｎ比の増加として指数関数的に増加する。５Ｄ６／ビオチン１１Ｆ１２ペアに関して、Ｓ／Ｎ比は、それぞれ、ハムスター、羊及びシカに関して約０．６、０．１及び０．３であり、Ｍａｂ結合が非特異的であることを示す。しかしながら、１１Ｆ１２／ビオチン５Ｄ６に関して、Ｓ／Ｎ比の組合せは、約１９（ハムスター）、２８（羊）及び４２（シカ）であった。これらの比は、特異的なＭａｂ結合のより高い重要な性質を暗示する。図９における値は、それぞれの種からの６個の個々の試料に関する３通りに基づき、かつＥＬＩＳＡの結果は、平均±標準偏差として算出された。感染した試料からの増加した抗体結合（ＯＤ₄₀₅に基づく）を、未感染の対照と比較する。対数スケールでのプロットは、感染した試料のシグナル力を対照試料（ノイズ）における力に対して算出する、シグナルとノイズの比（Ｓ／Ｎ）である。

３．免疫アッセイ
１０％脳ホモジネートの精製のために、脳組織を、１ｍＭフェニルメチルスルホニル液（ＰＭＳＦ）の存在で、氷冷した溶解緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１% Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、０．５%デオキシコール酸塩、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）の１０体積中で均一化した（ホモジネートがプロテイナーゼＫ（ＰＫ）で処理されるべきである場合に、ＰＭＳＦを溶解緩衝液から省いた）。１０分間の１０００×ｇでの遠心分離後に、その上澄みをアリコートし、−８０℃で貯蔵した。

キャプチャーアッセイのためのプロトコル及び試薬は、Ｃｈａｎｇ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， "ＰｒＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｅｖｏｋｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ，" Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ｖ．２０５， ｉｓｓｕｅ １−２， ｐｐ． ９４−１００ （２００８）において記載されており、参照をもって本明細書に組込まれたものとする。本発明において使用されるマウスのモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞系列は、下記に示されたように置いた。キャプチャーＥＬＩＳＡアッセイに関して、９６ウェルプレートを、アフィニティー精製した１１Ｆ１２キャプチャーのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）（５μｇ／ｍｌ）で、２〜３時間室温で被覆した。被覆したウェルを、３％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）で、ＰＢＳ中で、一昼夜４℃で阻害した。そのウェルをＰＢＳＴで３時間洗浄した。その抗原を、ＰＫで処理していない、又はＰＫで処理した（５０℃で３０分間１００μｇ／ｍｌ）脳溶解物であり、１％ＰＭＳＦの最終濃度で添加した。全ての試料を、１％ＳＤＳ（最終濃度）で処理し、１０分間１００℃で加熱し、そして５分間１６０００×ｇで遠心分離した。その上澄みを、連続的に１０倍希釈し、そしてそれぞれのウェルに添加した。そのプレートを、１時間３７℃でインキュベートした。そのウェルを、ＰＢＳＴで３時間洗浄し、そしてビオチン化５Ｄ６検出器Ｍａｂ（５μｇ／ｍｌ）の１００μｌを添加した。６０分後に、そのウェルをＰＢＳＴで洗浄し、そして１００μｌストレプトアビジンとアルカリホスファターゼとを（１：５０００）、６０分間３７℃で添加した。ＰＮＰＰ（４−ニトロフェニルホスフェートジナトリウム塩ヘキサヒドレート）（Ｓｉｇｍａ）基材溶液を、それぞれのウェルに添加し（１００μｌ）、そして６０分後に、生成物を、ＯＤ₄₀₅でＥＬＩＳＡ読み取り機（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ， Ｖｅｒｍｏｎｔ， ＮＹ）で測定した。

レーザー解析のために、ビオチン化Ｍａｂ ５Ｄ６でのインキュベートを、ストレプトアビジンとローダミンレッド（１：１０００）の添加に従った。６０分３７℃でのインキュベートに続いて、そのウェルを、ＰＢＳＴで洗浄し、そして１００μｌの１Ｎ ＮａＯＨで、１０分間１００℃で処理し、そして室温で２０分間振とうした。その材料を、１００μｌのＭｉｃｒｏｃａｐ（登録商標）（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｂｒｏｏｍａｌｌ， ＰＡ）マイクロキャピラリー管中に置き、そしてレーザー励起及び放出物検出のために特に設計された試料フォルダ中に挿入した。希釈を、本来の出発脳組織と比較して算出する。それぞれの値（データポイント）は、図の凡例において記載されている多重アッセイからの平均±標準偏差（ＳＥ）を示す。

４．ウェスタンブロット
パーセント脳ホモジネートを、前記の溶解緩衝液中で製造した。その資料を、低速（２０００×ｇで１０分間）で遠心分離した。上澄みのマイクロリットルを、最終の１×試料緩衝液と混合し、４分間１００℃で加熱し、そして１２％アクリルアミドゲルを使用するＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＥ−ＰＡＧＥ）を受け、ニトロセルロース膜に転写し、そして、ストレプトアビジンに共役した、基材としてＮＢＴ及びＢＣＩＰでのアルカリホスファターゼ（Ｋａｓｃｓａｋ ｅｔ ａｌ， １９８６）、又はセイヨウワサビペルオキシダーゼと共役した、前記のような（ＬａＦａｕｃｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６） ｓｕｐｅｒ ｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）でのヤギアンチマウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ登録商標）を使用して免疫染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前にＰＫ消化した使用に関して、低速遠心分離からの上澄みの４０μｌを、１００μｇ／ｍｌのＰＫ（最終濃度）で３０分間５０℃でインキュベートし、続いて１% ＰＭＳＦ、１Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加し、そして１００℃で５分間加熱した。

５．免疫沈降
ＭａｇｎａＢｉｎｄタンパク質Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ５０μｌに再懸濁し、そして１０％脳ホモジネート２００μｌを、Ｍａｂ ８Ｅ９（１０ｍｇ／ｍｌ）５０μｇで、合計体積ＰＢＳの１．２ｍｌで添加した。室温で１時間の混合後に、そのビーズを時期的に分離し、３回、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄し、そして６００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。１００℃で１０分間の加熱後、及び１６０００×ｇでの３分間のマイクロ遠心分離後に、その上澄みをキャプチャーＥＬＩＳＡのために使用した。

血液試料に関して、ｍａｇｎａＢｉｎｄタンパク質Ｇビーズを、１００μｌのＰＢＳで再懸濁し、続いて１００μｇのＭａｂ ８Ｅ９を最終体積５ｍｌのＰＢＳ中で添加し、そして室温で１時間混合した。そのビーズを、ＰＢＳＴで洗浄し、５００μｌのプラズマを含む５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そしてさらに１時間インキュベートした。脳に関する前記のように、ビーズを単離し、ＰＢＳＴで洗浄し、キャプチャーＥＬＩＳＡによって解析したマイクロ遠心分離の上澄みを加熱した。

６．タンパク質のミスフォールディング環状増幅（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ｃｙｃｌｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＰＭＣＡ））
脳及び血液のｓＰＭＣＡのためのＰｒＰ^Cの源として、通常のハムスター、羊及びシカからの１０％（質量／体積）［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０% Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、４ ｍＭ ＥＤＴＡ、及び完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳ中で（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製造した］を、遠心分離（１５００×ｇ、３０秒）し、そして上澄みを急速に凍結した。２６３Ｋに感染したハムスター、羊スクレイピー及びＶＷＤシカからの脳ホモジネートの連続１０倍希釈（１０−８〜１０−１１）の５００μｌアリコートを、対応する種からの１０％の通常の脳上澄み１００μｌと混合し、そして浸透しながらインキュベート（１時間３７℃で）した。これを増幅の１サイクルとして定義した。５サイクル後に、ＰＭＣＡを、元の反応管から新しい管にＰＭＣＡ反応混合物５００μｌを移送し、そして１０％の通常の脳ホモジネートの１００μｌを添加することによって続けた。未希釈のスクレイピー羊又はＣＷＤシカのプラズマの５００μｌアリコートに対するＰＭＣＡを、脳に関する記載と同様に実施した。ＰＭＣＡに続いて、試料を２０００×ｇで１０分間遠心分離した。脳試料に関して、上澄みの２００μｌを、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）で消化し（１００μｇ／ｍｌ、５００Ｃ、３０分間）、続いて、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル及び１％ＳＤＳを添加した。試料を、１００℃で１０分間加熱し、そして１０μｌアリコートを、ウェスタンブロットによって解析した（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００９）。血液に関して、続いて増幅した血液試料のＰＭＣＡ５００μｌを、ウェスタンブロット又はＳＯＦＩＡによる解析前のＭａｂ ８Ｅ９免疫沈降に従って処理しない、又はＰＫ処理した。全てのＰＭＣＡに関して、希釈を、元の希釈していない脳又は血液試料と比較して表した。ＰＭＣＡに従わない血液試料を免疫沈降し、そして超音波破砕及び３７℃のインキュベートサイクルなしに上記と同様に製造した。

７．ＳＯＦＩＡ
Ｎｉｎｅｔｙ６ウェルＨｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇプレート（Ｃｏｓｔａｒ， ＮＹ）を、キャプチャーＭａｂ １１Ｆ１２（１００μｌ中５μｇ／ウェル）で、室温で３時間被覆し、そしてＴＢＳ中で一昼夜４℃でカゼインで阻害した。Ｍａｇｎｅｔｉｃタンパク質Ｇビーズ及びＭａｂ ８Ｅ９を６０分間混合し、３回ＰＢＳＴで洗浄し、そしてそのペレットを８００μｌ ＰＢＳ中で再懸濁した。血液試料を、遠心分離（８００×ｇ、５分）し、その上澄み８００μｌを、ＳＤＳと組み合わせ（１％最終濃度）、１００℃で１０分間加熱し、６０分間ＧビーズＭａｂ ８Ｅ９と混合し、そして１０分間加熱した。１６０００×ｇで５分間の遠心分離後に、上澄み１００μｌを１０分間加熱した。室温で（１時間）インキュベート及びＰＢＳＴでの洗浄後に、ビオチン化Ｍａｂ ５Ｄ６（２μｇ／ウェル）の１００μｌを、１時間添加し、続いて洗浄し、そして１００μｌのストレプトアビジン−ローダミンレッド−Ｘ共役物（インビトロゲン）で１時間インキュベートした。４回のＰＢＳＴでの洗浄後に、１Ｎ ＮａＯＨの１００μｌを添加し、そしてそのプレートを加熱し（１００℃で１０分間）、３０分間室温で混合し、そしてＨＣｌの等モル量で中和した。解析を９０μｌアリコートで実施した。

８．計測
装置を、一般に使用されている使い捨ての１００マイクロリットルのマイクロキャピラリー（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．， Ｂｒｏｏｍａｌｌ， ＰＡ）の周囲に、試料フォルダとして設置した。その試料を、ローダミンの吸収ピークと良好に適合する、波長５３２ｎｍで３０ｍＷの連続の典型的な力を有するキャピラリーの軸に沿った、固体状態の周波数二倍器Ｎｄ：：ＹＡＧレーザー（Ｂｅａｍ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈ．（登録商標）， Ｃｌａｃｋａｍａｓ， ＯＲ ）からの時間的に変化させた光の集光によって励起する。ファイバー光学アセンブリを、キャピラリーの長さの約３倍におよび、かつ互いにキャピラリーの周囲に関して９０度で配置されている４つの線状配置からなるように設計した。前記ファイバーの多数の開口部（０．２２、又は〜２３度の容認角度）の結果、このファイバーの方向づけは、試料の分野の完全な適用範囲をもたらす。４つの線状配置によって集められた光は、集まり（すなわち束ねられる又は合される）、かつホログラフィックノッチフィルター（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ． Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）及びバンドパスフィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ， Ｉｎｃ． Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， ＶＴ）がマウントされている伝達光学中に集光される。それらを、それぞれ、励起源からの散乱光を除去し、かつレポーター染料の蛍光の検出を制限するために使用する。その光を、単一のマルチモードの４００ミクロン光ファイバー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ（登録商標）， Ｉｎｃ． Ｎｅｗｔｏｎ， ＮＪ）中に集中させ、そして直接検出電子装置のプリアンプ上でＢＮＣコネクタ上にマウントされる単一の低ノイズの光電池ダイオード検出器（Ｕｎｉｔｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ， ＣＡ）に連結する。シグナルの検出は、相感受性、又は"ロックイン"、検出案を使用する。励起源を、検出システムのための参考波長を派するために提供される光学チョッパー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．）で変調する。ダイオード検出器は、トランスコンダクタンスプリアンプ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）の入力でマウントされて、合計ラインのインピーダンスを低減し、そしてそれらの低レベルでのシグナルのインピーダンス適合における困難さを取り除く。そして、そのシグナルを、ロックイン増幅器（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出し、そしてデータ取得を、Ｌａｂ Ｖｉｅｗ（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）を介して実施する。そのプログラムは、電圧におけるその読取りのためのロックイン増幅器を支え、周期的にオペレーターに測定値の時刻歴を表示し、かつＡＳＣＩＩファイルにおけるタイムスタンプでの値を記憶する電子ストリップチャートからなる。ロックイン増幅器の時定数は、Ｈｅｒｔｚの数十番目の帯域幅を提供するために選択されるべきである。これらの測定のために、３秒の時定数を選択した。ロックインは、安定な読取りを得るための継続時間（この場合３〜３０秒）におけるいくつかの時定数を要求する。測定のための値を、新たな試料を読み込んだ後にシグナルが安定化された（２０〜３０秒）後に取った。励起源、及びロックイン検出器のための基準周波数の変調は、最小環境ノイズに選択される７５３Ｈｚであった。さらに線周波数及び２回の線周波数でのシグナルのフィルタリングをロックイン増幅器で行い、そしてプリアンプシグナルは、変調周波数でフィルターしたバンドパスであった。試料のために、１ｎＡ／Ｖのプリアンプ感受性を選択し、１Ｍ Ｏｈｍの入力インピーダンスを得た。測定値の測定において、始動手順の設定を維持し、その際、全ての電子装置のための１５分の暖機（レーザー、ロックイン増幅器、プリアンプ）、システムが適切に電気的に基づくことを保証するためのダークシグナルレベルの目視検査、安定のために検査するためのレーザー出力の測定、レーザーアライメントの目視試験を含む。ベースラインシグナルの対照測定を、蒸留し、脱イオンした水でキャピラリーを使用して検査した。

装置の感受性制限を、ローダミンレッドの蛍光シグナル放出を減少濃度で測定することによって試験した。ローダミンレッドは、０．０１アトグラム（ａｇ）の濃度［２０アトモル（ａｍ）］まで検出可能である（図１０）。特異性及び感受性の測定を、シカ、ハムスター、マウス及び羊からの完全な長さの組換えＰｒＰ（ｒＰｒＰ）を使用するアッセイを実施することによって実施した。試験したスクレイピーに関わらず、検出可能性の限界は≧１０ａｇ ｒＰｒＰであった。図１０に変向して、データを、図２の装置で得た。その際水中でのローダミンレッド（四角）の希釈を１００μｌマイクロキャピラリー管に添加し、そして周囲光ファイバーの蛍光シグナル放出を記録した。相対的なシグナル強度を、水のみの蛍光シグナル放出に基づいて算出した。マウス（アスタリスク）、ハムスター（ダイヤ）、羊（三角）及びシカ（丸）からのｒＰｒＰの場合において、ｒＰｒＰを、１％ＰｒＰ^-/-脳ホモジネート中で希釈し、そしてＳＯＦＩＡを受けた。相対蛍光シグナル強度を、ｒＰｒＰ希釈（１％ ＰｒＰ^-/-脳ホモジネート）のみで実施した同様のアッセイに基づいて算出した。１ｎＡ／Ｖのプリアンプ設定での三重アッセイを、それぞれのｒＰｒＰ濃度に関して実施し、そしてその濃度を、シグナル強度（対照と比較した％増加）±ＳＤの平均でプロットした。

通常及び感染したハムスター、シカ及び羊からの脳ホモジネートを、本発明の方法におけるそれあの使用のために試験した。１０％脳ホモジネートのウェスタンブロットは、出発材料におけるＰｒＰ^Scの存在を証明した。典型的なＰｒＰバンドリングパターンは、完全なタンパク質消化の確認として、通常のハムスター能座医療からのＰｒＰ^Cの除去に加えてＰＫ消化に従うＰｒＰ^Scの低分子サイズに移る特徴的な束でＰＫ処理する前に、１０％脳ホモジネート中で明白であった。臨床動物からの、洗浄剤で抽出した脳ホモジネートの連続希釈は、ウェスタンブロットによるＰｒＰ^Sc検出の限界が、約１０^-3〜１０^-4である一方で、キャプチャーＥＬＩＳＡによるＰｒＰ^Scの検出が、さらに１０¹〜１０²倍希釈によって感受性があったことを証明している（データは示されていない）。同様のＭａｂ及び脳ホモジネートを使用した比較において、この原稿において報告されたアッセイの感受性は、ウェスタンブロット及びキャプチャーＥＬＩＳＡに関して大きさの少なくとも５オーダーだけ超えた。本発明の方法を使用して、シグナルとベースラインとの割合（Ｓ／Ｂ）を、脳ホモジネートにおけるＰｒＰ検出可能性を評価刷るために使用した。１．１より大きいＳ／Ｂの割合がＰｒＰの存在を示すことを決定した。ハムスター、羊及びシカの通常の及び感染した脳組織からのＰＫ処理した及び未処理の脳ホモジネートの希釈連続を、本発明の方法によってアッセイした（図１１）。値は、試料のローダミンレッド蛍光放出（Ｓ）に対する希釈液（１％ ＰｒＰ^-/-脳ホモジネート又は均一化緩衝液）のみの蛍光放出に由来するバックグラウンドベースラインシグナル（Ｂ）の割合として表した。そのデータは、それぞれ脳ホモジネート希釈のためにそれぞれ１ｎＡ／Ｖのプリアンプ設定で三重に実施した、３つの独立した実験からの平均±ＳＤを示す。予期したように、ＰＫ処理によって、通常の脳組織からの全ての試料は、ＰｒＰ^Cの不在を示す試験した濃度にかかわらず、１．１未満のＳ／Ｂ比を有した。合計シグナル出力又は１．１より高いＳ／Ｂ比によって証明されたように、ＰＫ処理した感染したハムスターの脳ホモジネートの連続１０倍希釈からの、プロテアーゼ耐性ＰｒＰ^Scは、１０^-11の希釈まで、及び羊及びシカから１０^-10まで検出可能であった。さらに、ＰＫ処理した脳ホモジネートからの最大ＰｒＰ^Sc検出は、ハムスター並びに羊及びシカに関して１０^-7〜１０^-8の希釈の範囲であった。

１０倍連続希釈したＰＫ処理していない通常の脳ホモジネートの場合において、ＰｒＰ^Cは、ＳＯＦＩＡによって、Ｓ／Ｂ比が全て１．１未満で減少した後、ハムスターに関して１０^-11の希釈、及びシカ及び羊に関して１０^-10まで（１０^-6〜１０^-7希釈でのピーク検出で）検出可能であった。２６３Ｋに感染したハムスター、スクレイピーに感染した羊及びＣＷＤに感染したシカのＰＫ処理していない脳組織からのＳ／Ｂ比は、ＰｒＰの存在を示すまで続けた。感染した組織からの連続希釈した脳ホモジネートは、全て、羊及びしかに関して１０^-11（１０^-7でのピーク検出で）、及びハムスターに関して１０^-13（１０^-8でのピーク検出）の希釈まで、１．１より高いＳ／Ｂ比を示した。それらの結果は、プロテアーゼ処理していない未感染の脳組織からのＰｒＰをＰｒＰ^C検出可能性のレベルを超えて希釈することができる一方で合計ＰｒＰ^Scを検出する能力を未だ維持していることを示す。それらの結果は、さらに、それらが臨床的疾患で感染した脳におけるＰｒＰ^Cよりも少なくとも１ｌｏｇ高い合計ＰｒＰ^Scであることを示唆する。この支持において、ＰｒＰ^Scが脳中でスクレイピー感染の間蓄積し、そしてＰｒＰ^Cの濃度よりも１０倍高い濃度に達することは、以前に報告されている。２６３Ｋに感染したハムスター関する以前に報告されたデータ（Ｒ． Ａｔａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． "Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｃｒａｐｉｅ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ｓｅｅｄｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，" Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈ． ｖｏｌ． ４ （２００７） ｐｐ． ６４５−６５０）を使用して、ＳＯＦＩＡは、ＰＫ処理していないハムスターの脳からのＰｒＰ^Scの約１０ａｇの検出限界を有する。ハムスターのデータから直接の外挿は、ＰｒＰ^Scの１フェトグラムを、羊及びシカの脳材料から検出出来ることを示す。しかしながら、当量の抗体反応性であると想定して、希釈した試料のウェスタンブロットは、それらがハムスター脳において、羊及びシカの２つの種におけるプリオンの検出が１０〜１００ａｇ以上の範囲で会って良いことを示唆するグラム当量を基礎とする羊及びシカの脳材料よりも、少なくとも１０〜１００倍高いＰｒＰ^Scであることを示した。

９．血液中でのＰｒＰ^Scの検出
Ｍａｂ ８Ｅ９での免疫沈降を架橋ＰＭＣＡ及びＳＯＦＩＡとして供給し、このＭａｂのＰｒＰ免疫沈降に関する有用性を試験した。未感染の及び２６３Ｋに感染したハムスター１０％脳ホモジネートの種々の比の混合物（未感染：感染（％）−１００：０、９０：１０、７０：３０、５０：５０）を、免疫沈降し、そしてウェスタンブロットによって解析した（図１２）。通常脳ホモジネート（ＮＢＨ）及び２６３Ｋに感染したハムスターの脳ホモジネート（２６３Ｋ ＢＨ）のパーセントを、種々の割合（レーン１、５−ＮＢＨのみ；レーン２、６−９０μＬ ＮＢＨ及び１０μＬ ２６３Ｋ ＢＨ；レーン３、７−７０μＬ ＮＢＨ＋３０μＬ２６３ ＢＨ；レーン４、８−５０μＬＮＢＨ＋５０μＬ ２６３Ｋ ＢＨ）で合し、そしてＭａｂ ８Ｅ９で免疫沈降した。その免疫沈降した試料を、ウェスタンブロット及びＭａｂ １１Ｆ１２での免疫染色前に、処理しなかった（レーン１〜４）又はＰＫ処理した（レーン５〜８）。ＰＫ消化の欠如において、脳ホモジネート比に関わらず、全ての試料は、同様の免疫染色強度を示した（レーン１〜４）。ＰＫ処理した免疫沈降（レーン５〜８）のウェスタンブロットは、ＰＫ処理した２６３Ｋに感染した脳ホモジネートのみを含有する試料と直接比較した場合に同様の免疫染色を証明した（データは示されていない）。これらの結果は、ＰｒＰ^C及びＰｒＰ^Scの双方を、並びにＰｒＰ^Cの存在で免疫沈降させたＭａｂ ８Ｅ９が、最大ＰｒＰ^C免疫沈降を阻害又は低減しなかったことを示す。単離したＰｒＰを質的に及び量的に評価するために、キャプチャーＥＬＩＳＡを、ＰＫ処理していない通常の及び２６３Ｋに感染したハムスターの脳ホモジネートからのＭａｂ ８Ｅ９免疫沈降で実施した（図１３）。キャプチャーＥＬＩＳＡは、同様のＭａｂペア（キャプチャーＭａｂとして１１Ｆ１２及び検出Ｍａｂとして５Ｄ６）を、ＳＯＦＩＡのために使用したように利用した。通常の脳：キャプチャーＥＬＩＳＡによる感染した脳の組合せのＭａｂ ８Ｅ９免疫沈降は、出発混合物において増加した感染した能座医療のレベルとしてＥＬＩＳＡシグナル強度の増加をもたらした。能座医療がタンパク質を消化しなかったために、それぞれの混合物は、ウェスタンブロットによって確認されたように、ＰｒＰ^Cのみ、又はＰｒＰ^C及びＰｒＰ^Scの混合物を含んだ（図１２）。しかしながら、キャプチャーＥＬＩＳＡによる免疫沈降の解析は、シグナル強度の増加がＰｒＰ^Scの存在に及びＰｒＰ^Cの欠失に依存することを示す。これは、それあの特異的なＭａｂの実用性及びＰｒＰ^Scの検出のための方法論を示唆する。免疫沈降−キャプチャーＥＬＩＳＡフォーマットが２６３Ｋに感染したハムスター、スクレイピー羊及びＣＷＤシカからのＰｒＰ^Sc由来の脳を容易に検出することができたが、ＰｒＰ^Scは、臨床動物からの血液中で検出することができなかった。

連続的なＰＭＣＡ（ｓＰＭＣＡ）に従う２６３Ｋに感染したハムスター及び羊スクレイピー試料からの血液中のＰｒＰ^Scの検出の能力は、以前に報告されている。しかしながら、ＰｒＰ^Sc検出に必要である多数のＰＭＣＡサイクルは、診断アッセイとしての使用のための実用的ではない技術をもたらす。血液中でのＰｒＰ^Sc検出の問題点は、ｓＰＭＣＡの取り込み、続いて増幅した標的の免疫沈降、そして感受性ＳＯＦＩＡアッセイでの検出によって取り組まれている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。ｓＰＭＣＡを評価し、そしてハムスターの脳を使用して検証した（図１４）。ハムスターの脳ホモジネートの希釈を、ＰＭＣＡの７、１４及び４０サイクル（レーン７〜１０）で実施し、一方で同一の試料を、超音波破砕梨で同様に実施した（レーン３〜６）。それぞれの試料の１０μＬアリコートを、Ｍａｂ １１Ｆ１２でのウェスタンブロットによって解析した。対照試料は、１０％の２６３Ｋに感染したハムスターの脳ホモジネートの希釈（基の脳組織に関する）をＰｒＰ^C源として通常のハムスターの脳ホモジネートを使用してｓＰＭＣＡを実施する前の、ＰＫ消化なし（レーン１）及びＰＫ消化あり（レーン２）の２６３Ｋに感染したハムスターの脳ホモジネートの１０^-2希釈であった。ＰｒＰ^Scは、ｓＰＭＣＡの７サイクルによる全ての希釈で検出することができなかったが、しかし１４サイクルの完了による１０^-8希釈した使用において検出することができた（図１４、レーン１０）。ｓＰＭＣＡの４０サイクル（ｓＰＭＣＡ₄₀）後に、ＰＫ耐性のＰｒＰ^Scは、試験した２６３Ｋに感染したハムスターの脳ホモジネートの全ての希釈で検出できた。省略したＰＭＣＡ超音波破砕工程と同時に実施される同様のハムスターの脳ホモジネートの希釈は、ＰＫ耐性のＰｒＰ^Scの免疫染色（図３、レーン３〜６）によって証明されたようなあらゆるＰｒＰ^Sc増幅を示さなかった。ｓＰＭＣＡ₄₀後の検出でのＰＭＣＡの欠失（基の脳組織に関して１０^-6）におけるＰｒＰ^Scの検出限界を比較して、及び解析した試料サイズを考慮に入れて、その結果は、ＰＭＣＡの結果として１０⁴倍の増幅を評価する。

希釈した羊脳又は臨床動物からのＣＷＤ脳ホモジネート（ＰｒＰ^Cの源として対応する種の未感染の脳ホモジネートに加えて）での同様のＰＭＣＡ試験は、感染した脳の１０^-8希釈でのＰＭＣＡの２８サイクルでのウェスタンブロットによる増幅したＰｒＰ^Scの最初の検出を証明した。ハムスターの脳と比較した羊及びシカの脳からのＰｒＰ^Scの最初の検出に必要とされるサイクルの増加数は、元の脳組織において見出される出発ＰｒＰ^Scのより小さい量による。期待されたように、ｓＰＭＣＡ₄₀の終わりで、スクレイピー羊及びＣＷＤシカの脳ホモジネートからの増幅したＰｒＰ^Scを、ＰＫ耐性のＰｒＰ^Scの増加した免疫染色強度及び検出限界によって証明した。羊及びシカの脳組織は、感染したハムスターの脳と比較してほとんどＰｒＰ^Scを有さないが、増幅のレベルは、最初のＰｒＰ^Scレベルに関して未だに約４ｌｏｇであった（データは示されていない）。

スクレイピー羊及びＣＷＤシカからのプラズマを、ｓＰＭＣＡ₄₀を受けさせた。羊試料は、血液採取の時点で、臨床的サイン及び第三眼瞼リンパ小節のＰｒＰ^Sc免疫組織学的（ＩＨＣ）染色の存在又は欠失に基づいて区別した（図１５）。血液採取の時点で臨床症状を示さなかったグループ３の全ての動物は、最終的に臨床症状に進行した。ＣＷＤ未感染の羊のグループ（表３、グループ４）を収容し、そして単離したスクレイピーを有さない領域中に維持した。ＣＷＤ試料は、いくつかの実験的に感染した（経口的に）前臨床の及び臨床のオジロジカからなった（表４）。羊及びＣＷＤ試料の全てを、個々にｓＰＭＣＡ₄₀を受けさせ、そしてＰＫ消化に続いて、ウェスタンブロットによって解析した。プラズマのｓＰＭＣＡ₄₀に続いて、Ｍａｂ ８Ｅ９免疫沈降によるＰｒＰ^Sc濃縮前又は後のＰＫ処理したＰＭＣＡ生成物のウェスタンブロットは、あらゆるＰｒＰ^Scを示さなかった。羊の血液からのＰｒＰ^Scの低レベルの急速な検出を容易にするために報告された（Ｔｈｏｒｎｅ ａｎｄ Ｔｅｒｒｙ， ２００８）、ポリアデニル酸［ポリ（Ａ）］の添加は、ｓＰＭＣＡ₄₀による羊スクレイピー又はＣＷＤシカのプラズマからのＰｒＰ^Scの検出の点まで増幅効率を改良しなかった。羊の血液からのｓＰＭＣＡ₄₀によるＰｒＰ^Sc検出の欠失は、使用した羊の遺伝子型に依存した（データは示されていない）。すなわち、ＰｒＰ^Scの源及び通常の羊の脳ＰｒＰ^Cの羊の遺伝子型の対合は、イムノブロットによる検出のための増幅した生成物を十分に増加しなかった。ウェスタンブロットが有益ではなかったために、ＰｒＰ^ScがＣＷＤ及び羊スクレイピーの３つのグループを含むあらゆる動物からの血液中で最初から存在するかどうか、又はＰＭＣＡが成功したかどうかは明確ではないが、しかしウェスタンブロットが４０サイクル後のみ増幅したＰｒＰ^Scを検出するために十分な感受性がなかった。羊の血液のＰＭＣＡが、ＰｒＰ^Scの明らかな自発的な発生による偽陽性結果を導きうることが報告されている（Ｔｈｏｒｎｅ ａｎｄ Ｔｅｒｒｙ， ２００８）。従って、むしろＰＭＣＡサイクル、周囲光ファイバー免疫アッセイ（ＳＯＦＩＡ）の数の連続増加を、ｓＰＭＣＡ₄₀生成物を免疫沈降させた未処理の及びＰＫ処理したＭａｂ ８Ｅ９のＰｒＰ^Scの検出のために使用した（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。我々の研究は、ｓＰＭＣＡ₄₀の欠失において、スクレイピー羊及び未感染の羊プラズマ試料からのＳＯＦＩＡによって得られた読取りが同様であり、かつベースラインレベルに達したことを証明した（図１６）。ｓＰＭＣＡ₄₀の前に、個々の試料に関するＳＯＦＩＡシグナル強度（試料／バックグラウンド）は、０．５〜０．９（グループ１）０．７〜１．２（グループ２）、０．８〜１．３（グループ３）及び０．６〜１．１（グループ４）の範囲であった。ＳＯＦＩＡの動的範囲に対する以前の研究（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）が、ＰＫで処理していない臨床羊の脳ＰｒＰ^Scがフェトモル範囲で検出することができる（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）ことを証明したために、おそらくスクレイピー羊のプラズマ試料におけるＰｒＰ^Scレベルが検出可能範囲未満である。ＳＯＦＩＡの動的範囲内までＰｒＰ^Scのレベルを増幅する試みにおいて、ｓＰＭＣＡ₄₀を、ＭａＢ ８Ｅ９免疫沈降によって実施した。ＰＫで処理していないＰｒＰ^Scを、免疫沈降したｓＰＭＣＡ₄₀生成物に対してＳＯＦＩＡによって検出することができた（図１６）。ｓＰＭＣＡ₄₀に続いて、対照グループ（グループ４）の個々の試料に関するシグナル強度（０．７〜１．２）の範囲は、ＰＭＣＡ前の試料と著しい差はなかった。しかしながら、スクレイピー羊の３つのグループに関するＳＯＦＩＡシグナル強度の範囲は、それぞれ他と同様（グループ１：４．３〜４．８、グループ２：４．４〜５．１、グループ３：４．８〜５．３）であり、それらの臨床発現に関わらず、前ＰＭＣＡ値及び未感染試料（グループ４）よりも著しく高かった。このアプローチの値は、病気の証明が感染したスクレイピーである羊に依存するが、しかし臨床サインの存在、及びＰｒＰ^Scの存在のために正に試験した羊の全ての３つのグループとしての神経病理学に依存する、１つの考察の場合に実現される（図１６）。ＰｒＰ^Sc増幅は、遺伝子型の相容性にも依存した。それというのも、ＡＲＱ／ＡＱＲ又はＡＲＱ／ＶＲＱ羊からの通常の脳ホモジネートを、あらゆる感染した羊のプラズマ試料で使用した場合に、増幅における差異がないからである。さらに、ＰｒＰ^ScからＰｒＰ^Cを認識するためのＰＫ消化のための要求は必要でない。それというのも、ＳＯＦＩＡの結果が、免疫沈降及び免疫アッセイ解析のために、ｓＰＭＣＡ₄₀生成物を処理していない（図１６）又はＰＫ処理した（示されていない）かどうかに関わらず同様であるからである。図１６におけるデータは、羊スクレイピーに関連する臨床サインの出現及び免疫組織学（ＩＨＣ）による３グループ中へのプラズマ試料の分割によって生じた。それぞれのプラズマ試料を、ＰＭＣＡ₄₀を受けさせ（黒塗りの四角）、又はＰＭＣＡなしにインキュベートした（白抜きの四角）。それぞれの試料は、未処理、又はＭａｂ ８Ｅ９免疫沈降によってＰＫ消化、そしてＳＯＦＩＡによるＰｒＰ^Scを解析した。それぞれ３つのグループからのプラズマ試料を、三重にアッセイし、そしてそれぞれの３グループにおける使用の全てのデータを組合せ、そして平均±標準偏差として表した。

同様の研究を、シカＣＷＤの、いくつかの前臨床及び臨床的な場合から得たプラズマで実施した（図１７）。前記の羊プラズマ試料と同様に、ｓＰＭＣＡ₄₀の欠失におけるＣＷＤ試料に対するＳＯＦＩＡによって得られたシグナルは、それ自体バックグラウンドに達した未感染の対照とは異ならなかった。さらに、ＰＫ耐性のＰｒＰ^Scを、キャプチャーＥＬＩＳＡ又はｓＰＭＣＡ₄₀によるウェスタンブロットによって検出することができなかった。しかしながら、ｓＰＭＣＡ₄₀生成物の免疫沈降に従って、ＰｒＰ^Scは、全ての前臨床の及び臨床的なＣＷＤ血液からＳＯＦＩＡによって検出することができた（図１７）。さらに、スクレイピー羊試料と同様に、ＳＯＦＩＡ値は、感染した動物から生じる試料に依存したが、しかしＳＯＦＩＡによる病気の認識は、病気にかかった動物の臨床状態に依存しなかった。図１７におけるデータを、ｓＰＭＣＡ₄₀に対する５つのＣＷＤの場合からのそれぞれのプラズマ試料（黒塗りの四角）によって得て、そしてＰＭＣＡ（白抜きの四角）の欠失で維持した。全ての試料を、未消化、又はＭａｂ ８Ｅ９免疫沈降及びＳＯＦＩＡによってＰＫ処理した。結果を、ＰＫ未処理の試料に関して示し、そしてその値は、三重アッセイの平均±ＳＤを表す。４つの未感染のシカプラズマ試料の場合において、それぞれの４試料を三重にアッセイし、そして４つの試料の混合結果を、平均±ＳＤとして表す。本発明の全ての実施態様において、全てのパーセンテージは、特に記載されていない限り、合計組成物の質量％である。

特に記載されていない限り、全ての比は質量比である。全ての範囲は、包含的であり、かつ組合せ可能である。有効数字の数は、示された量に対する制限又は測定の確度を意味する。全ての数適量は、特に記載されていない限り"約"の言葉によって変更されるべきと考えられる。

発明の詳細な説明において挙げられた全ての文献は、関連して、参照をもって本明細書に組み込まれたものとし、あらゆる文献の引用は、本発明に関する先行技術であると認めると解釈するべきではない。この文献における用語のあらゆる意味又は定義が、参照をもって組み込まれた文献における同様の用語のあらゆる意味又は定義と矛盾する範囲に対して、その意味又は定義は、この文献において管理される用語に割り当てられる。

本発明の特定の実施態様は説明及び記載されているのに対し、種々の他の変更及び改編は、本発明の趣旨及び範囲を逸脱するものではないことが当業者には明らかである。従って、付随の特許請求の範囲における、本発明の範囲内である全ての変更及び改編は保護されることを意図する。

Claims (32)

1. 疑わしい生物試料におけるＰｒＰ^Scの存在又は欠失の検出のための方法であって、
   ａ．試料マトリックスからＰｒＰ^Scを実質的に分離することによって、該試料中に存在してよいＰｒＰ^Scを濃縮する工程、
   ｂ．濃縮したＰｒＰ^Scを少なくとも１つの分子標識で標識して、標識したＰｒＰ^Scを製造する工程、及び
   ｃ．アトモル量の標識したＰｒＰ^Scを検出することができる装置上で、標識したＰｒＰ^Scを検出する工程
   を含む、方法。
2. 前記ＰｒＰ^Scを消化しない、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＰｒＰ^Scの濃縮及び標識したＰｒＰ^Scの検出の間の時間が、４８時間以下である、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＰｒＰ^Scの濃縮及び標識したＰｒＰ^Scの検出の間の時間が、２４時間以下である、請求項１に記載の方法。
5. 前記試料が、脳組織、神経組織、血液、尿、リンパ液、髄液、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記試料が、標識したＰｒＰ^Scの約０．１アトモル〜約２００アトモルを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記試料が、シード重合を受けない、請求項１に記載の方法。
8. 前記分子標識が、蛍光標識、リン光標識、放射性同位体標識、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
9. 前記分子標識が、蛍光標識した、アンチＰｒＰ抗体である、請求項８に記載の方法。
10. 前記分子標識が、さらに、ビオチン化アンチＰｒＰ抗体を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＰｒＰ^Scの濃縮工程が、抗体、免疫沈降、磁気ビーズ、又はそれらの組合せを使用する、請求項１に記載の方法。
12. 疑わしい生物試料におけるＰｒＰ^Scの存在又は欠失の検出のための方法であって、
    ａ．ｓＰＭＣＡによる前記試料中に存在するＰｒＰ^Scを増幅する工程、
    ｂ．試料マトリックスからＰｒＰ^Scを実質的に分離することによって、該試料中に存在してよいＰｒＰ^Scを濃縮する工程、
    ｃ．濃縮したＰｒＰ^Scを少なくとも１つの分子標識で標識して、標識したＰｒＰ^Scを製造する工程、及び
    ｄ．アトモル量の標識したＰｒＰ^Scを検出することができる装置上で、標識したＰｒＰ^Scを検出する工程
    を含む、方法。
13. 前記ＰｒＰ^Scの濃縮工程が、分子抗体、免疫沈降、磁気ビーズ、又はそれらの組合せを使用する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＰｒＰ^Scを消化しない、請求項１２に記載の方法。
15. 前記ＰｒＰ^Scの増幅及び標識したＰｒＰ^Scの検出の間の時間が、４８時間以下である、請求項１２に記載の方法。
16. 前記ＰｒＰ^Scの増幅及び標識したＰｒＰ^Scの検出の間の時間が、２４時間以下である、請求項１２に記載の方法。
17. 前記試料が、脳組織、神経組織、血液、尿、リンパ液、髄液、又はそれらの組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
18. 前記試料が、標識したＰｒＰ^Scの約０．１アトモル〜約２００アトモルを含む、請求項１２に記載の方法。
19. 前記分子標識が、蛍光標識、リン光標識、放射性同位体標識、又はそれらの組合せである、請求項１２に記載の方法。
20. 前記ＰｒＰ^Scを濃縮する工程が、モノクローナル抗体又はそれらの抗原−結合プリオンによって生じ、その際該抗体が、ハイブリドーマ０８−１／８Ｅ９によって製造された抗体と実質的に同一である、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。
21. 前記ＰｒＰ^Scを標識する工程が、
    ａ．モノクローナル抗体又はそれらの抗原−結合プリオン、その際該抗体が、ハイブリドーマ０８−１／１１Ｆ１２によって製造された抗体と実質的に同一である、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有し、
    ｂ．ビオチン化モノクローナル抗体又はそれらの抗原−結合プリオンでキャプチャーされたＰｒＰ^scを標識すること、その際該抗体が、ハイブリドーマ０８−１／５Ｄ６によって製造された抗体と実質的に同一である、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有し、
    によって生じる、請求項１２に記載の方法。
22. 解析装置が、米国特許明細書６１／２１１，２６４において開示されている、請求項１に記載の方法。
23. 解析装置が、米国特許明細書１１／６３４，５４６において開示されている、請求項１に記載の方法。
24. 解析装置が、米国特許明細書６１／２１１，２６４において開示されている、請求項１２に記載の方法。
25. 解析装置が、米国特許明細書１１／６３４，５４６において開示されている、請求項１２に記載の方法。
26. ＰｒＰ^Scに結合し、かつ第二モノクローナル抗体のＰｒＰ^Scへの結合を高める、モノクローナル抗体又はそれらの抗原−結合プリオン。
27. 第二モノクローナル抗体のＰｒＰ^Scへの結合後に高められた方法で通常ＰｒＰ^Scに結合する、モノクローナル抗体又はそれらの抗原−結合プリオン。
28. 第二モノクローナル抗体のＰｒＰ^Scへの結合後に結合することができない、通常ＰｒＰ^Scに結合する、モノクローナル抗体又はそれらの抗原−結合プリオン。
29. ＰｒＰ^Scの検出のためのキットであって、
    ａ．ＰｒＰ^Scに結合し、かつ第二モノクローナル抗体のＰｒＰ^Scへの結合を高める、第一モノクローナル抗体又はそれらの抗原−結合プリオン
    ｂ．第一モノクローナル抗体のＰｒＰ^Scへの結合後に高められた方法で通常ＰｒＰ^Scに結合する、第二モノクローナル抗体又はそれらの抗原−結合プリオン
    を含む、キット。
30. 前記第一抗体が、イブリドーマ０８−１／１１Ｆ１２によって製造された抗体と実質的に同一である、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有し、かつ前記第二抗体が、ハイブリドーマ０８−１／５Ｄ６によって製造された抗体と実質的に同一である、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載のキット。
31. さらに、ＰｒＰ^Scを免疫沈降することができる第三モノクローナル抗体を含む、ＰｒＰ^Scの検出のための請求項２９に記載のキット。
32. さらに、標識したＰｒＰ^Scのアトモル量を検出することができる装置での協同のたえの、少なくとも１つのバイアル、キュベット又はキャピラリーを含む、ＰｒＰ^Scの検出のための請求項２９に記載のキット。

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