JP2007502966A - タンパク質立体配座を検出するためのエピトープ保護アッセイおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
タンパク質は、複雑かつ最密な構造にフォールディングする可能性がある。フォールディングは生物活性に重要であるだけでなく、タンパク質が正確にフォールディングすることの失敗、またはタンパク質がフォールディングされた状態であることによって疾患が生じる可能性がある(Dobson CM、Methods (2004) 34 : 4〜14)。幾つかの場合、ミスフォールディングがタンパク質凝集を引き起こす可能性があり、それがさらに細胞外(例えばプラーク)または細胞内(例えばサイトゾルまたは核中の封入)の不連続な堆積を生じさせる可能性がある。
プリオン病はBSEすなわち「狂牛病」の発生以来、重大な健康上の関心事となっている(前に総説された、40、41)。BSEは英国で最初に発見されたが、現在はヨーロッパ中の多くの他の国々および日本に広がっている。英国内だけで約180,000例のBSEが存在しており、これが蓄牛の全滅およびおそらく推定3〜5百万頭の感染をもたらした。英国に関して推定される全コストは25億ポンドを超えた。BSEは感染した蓄牛から与えられるプリオンを含む飼料を通じて、蓄牛間で伝播すると考えられており、感染した動物由来のビーフ製品または他の蓄牛製品を食べることによって、BSEはヒトに伝播すると考えられる。
プリオン病は、海綿状の変化、神経細胞の消失、グリオーシス、および異常なアミロイドポリペプチドの脳内蓄積によって神経病理学的に特徴付けられる、急速に進行する治療不能な神経変性症候群の一群である。ヒトプリオン病は古典的なクロイツフェルトヤコブ病(CJD)を含み、これには散発性、医原性、および家族性の形がある。1996年以来、CJDの「新たな変形」(vCJD)が英国、フランス、アイルランド共和国、香港、イタリア、米国、およびカナダにおいて同定されている(40、41)。変形CJDは、未知の潜伏期間で14才という若い個体を殺傷することができる。vCJDがウシ海綿状脳症(BSE)のヒト形である疑いはほとんどない(42)。汚染した蓄牛組織を消費することからの第一次伝染は、このファイリングの時点で130を超える個体に影響を与えている。
新たに新生したプリオン病、およびプリオンのポリペプチドのみの性質は、世界中で重大な医学的、獣医学的、および経済的課題を生み出している。今日まで、プリオン感染に関する唯一の商用の試験は死後の脳サンプルに基づくものである。実験的な伝播の研究による検出が存在するにもかかわらず、感染した動物の血液中のプリオンを検出するための生化学試験は存在しない。プリオン感染用の感度の良い特異的な診断試験の開発は、部分的にはプリオン感染物質の異常な性質のために骨の折れる作業である。プリオン病を伝播させる感染物質は、核酸要素が感染物質中で検出されていない点で他の病原体と異なる(41)。ノーベル賞受賞者のDr.Stanley Prusinerによって開発されたプリオン理論によれば、周辺に偏在する正常細胞プリオンポリペプチドPrPCのミスフォールディングした立体配座のイソ型である、PrPScに感染性が存在する。実際PrPScはプリオン感染性の調製における最も顕著な(またはおそらく唯一の)マクロ分子であり、ほとんどプリオン感染の確かな代用であるようには思われない。PrPScは、プロテアーゼ感受性、可溶性のモノマーイソ型であるPrPCとは対照的に、プロテアーゼによる消化に対して部分的に耐性があり、可溶性が低く、凝集した状態で存在する(29、31、43〜46)。
アルツハイマー病(AD)、ハンチングトン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびパーキンソン病/レビー小体型痴呆(PD、LBD)などの神経変性病も、我々の加齢群およびヘルスケアシステムに対する重大な課題を提起する(1に総説)。推定364,000人の65才を超えるカナダ人が現在、ADまたは関連痴呆に関する診断を受けている(http://www.alzheimer.ca/)。増大する寿命と共に、神経変性病の発生率は増大すると予想される。2025年までに、ADは百万人もの多くのカナダ人に影響を与え、2050年までにはこの数字は倍になるであろう。
ADは、いずれもAPPのタンパク質分解生成物である(4中に総説)Aβ(1〜40)、Aβ(1〜42)およびAβ(1〜43)ペプチドから主に構成され細胞外プラークの脳内蓄積と関係がある、一般的な痴呆性(記憶障害および認知障害)の神経変性病である。さらに、異常にリン酸化したtauタンパク質(神経の微小管結合タンパク質)から主に構成される神経原繊維濃縮体は、瀕死のニューロンでは細胞内に蓄積する(4)。家族形のADは、APP遺伝子、またはプレセニリン1または2遺伝子の突然変異によって引き起こされる可能性があり(www.websiteformutations.com)、そのタンパク質生成物はAPPからAβへのプロセシングと関係がある。アポリポタンパク質E対立遺伝子変異体も、散発性および家族形のADの発症時の年齢に影響を与える(5中に総説)。AβはAD患者の血液およびCSF中、ならびに正常な対照中で検出されてきている(6)。Aβは、トリソミー21(ダウン症候群)、アミロイドーシス(HCHWA)-オランダ型遺伝性小脳出血、および正常な脳の老化においても血管およびプラークアミロイドフィラメント中に存在する(Mori、Hら、JBC (1992) 267 : 17082〜86)。Tauおよびリン酸化tauは、AD患者および他の神経疾患を有する患者の脳脊髄液(CSF)において検出されてきている(7;8中に総説)。
ALSは致命的な神経筋疾患であり、1000人の成人中1人に発生し、進行性の衰弱、筋萎縮、および痙縮として現れ、これは脊髄および脳幹の500,000までの「下部運動ニューロン」、および大脳皮質中の無数の「上部運動ニューロン」の変性によるものである。ALSの病因に対する重要な手掛かりは、家族性ALS(fALS)の症例の約20%は、スーパーオキシドジスムターゼ-1(SOD1)(10,11)、フリーラジカル防御酵素の突然変異によるものであるという発見と共に出現した。100を超えるfALS SOD1のミスセンス、ナンセンス、およびイントロンスプライシング障害突然変異が今日まで分類されてきている(12;www.alsod.org)。突然変異ヒトSOD1(mtHuSOD1)を発現するトランスジェニックマウスは、ヒトALSと臨床的および病的類似性を有する運動ニューロン症状を発症し(13、14)、野生型ヒトSOD1(wtHuSOD1)を発現するマウスは疾患を発症しない(13)。SOD1含有細胞質封入体は、家族性および散発性ALS患者由来の多くの疾患状態運動ニューロンにおいて(15)、ならびに大部分のトランスジェニックマウス(16、17)およびこの疾患の組織培養(18)モデルにおいて検出することができる。
PDは、罹患率がADに次いで第2位の(100,000の個体群当たり350まで;1)神経変性運動障害である。それは動きの硬さ、緩慢さ、および震えによって臨床上特徴付けられる(21中に総説)。パーキンソン病の大部分の症例は散発性であるが、散発形と家族形の両方の疾患が、PDにおいて選択的に殺傷される中脳ニューロン(60,000まで)の個体群である黒質の、瀕死のニューロン中の細胞内レビー小体によって特徴付けられる。レビー小体はα-シヌクレインから主に構成される(22)。α-シヌクレインをコードする遺伝子の突然変異は、家族性のパーキンソン病を有する患者において発見されてきている(23中に総説; www.parkinsonsmutation.com)。常染色体劣性PDと関係がある他の遺伝子は、α-シヌクレイン変性と関係があるパーキンである(22、23)。α-シヌクレインから構成されるびまん性皮質レビー小体は、パーキンソン状態の変化、幻覚、および迅速な症状の変動と関係がある痴呆症状であるレビー小体病(LBD)において観察される(24)。LBDは、60才を超える人間の間で20〜30パーセントの症例を占める、ADに次ぐ第二の最も一般的な形の神経変性痴呆である可能性がある(1、24)。
HDは、ハンチングチンタンパク質のN末端におけるポリグルタミンをコードするCAG反復単位の伸長によって特徴付けられる、進行性の神経変性障害である(48中に総説)。36以上のポリグルタミンの伸長部が疾患を引き起こし、さらに長い反復単位はさらに早い発症を引き起こす(49、50)。
タンパク質凝集は、II型糖尿病を有する患者においても観察される。脂肪細胞由来ペプチド、レジスチンの高い発現がII型糖尿病患者において観察されてきており(Youn BSら、J Clin Endocrinol Metab.(2004); 89 : 150〜6)、高いレジスチンレベルは肥満およびインシュリン耐性において役割を果たしている可能性があることを、研究は示唆している。さらに、膵島アミロイドポリペプチド(アミリンとしても知られる)の堆積は、II型糖尿病と病理学的に関係がある。これらの堆積物は膵島アミロイドポリペプチド、特有のアミロイド性ペプチドを含み、β細胞の死と関係がある。近年の研究は、膵島アミロイド誘導型のβ細胞死を担う種は膵島アミロイド形成の初期に形成され、そのとき膵島アミロイドポリペプチドの蓄積が始まることを示唆している(Hull RLら、J Clin Endocrinol Metab.(2004) 89 : 3629〜43)。病原性膵島アミロイドポリペプチドを同定することができる診断試験は、食事および治療介入が最も有効であるその初期段階で、II型糖尿病を検出するのに非常に有用であると思われる。
多くの形の癌も、タンパク質立体配座関連の疾患であると考えられる(Ishimaru D.ら、Biochemistry (2003) 42 : 9022〜7)。神経芽細胞腫、癌腫およびメラノーマの部分集合は、腫瘍抑制因子p53タンパク質凝集体の異常な蓄積を示す(Butler JSら、Biochemistry (2003) 42 : 2396〜403 ; Ishimaru D.ら、Biochemistry (2003) 42 : 9022〜7)。この蓄積が幾つかの癌性細胞ではp53の機能の消失に貢献していると思われる(Ishimaru D.ら、Biochemistry (2003) 42 : 9022〜7)。蓄積したp53を検出することができるアッセイは診断上有用な検出システムをもたらすと思われ、治療介入を個別化することによって治療介入を高めると思われる。
Dobson CM、Methods (2004) 34 : 4〜14 http://www.alzheimer.ca/ www.websiteformutations.com Mori、Hら、JBC (1992) 267 : 17082〜86 www.alsod.org www.parkinsonsmutation.com Youn BSら、J Clin Endocrinol Metab.(2004); 89 : 150〜6 Hull RLら、J Clin Endocrinol Metab.(2004) 89 : 3629〜43 Ishimaru D.ら、Biochemistry (2003) 42 : 9022〜7 Butler JSら、Biochemistry (2003) 42 : 2396〜403 KohlerおよびMilstein (Nature 256、495〜497 (1975) Kozborら、Immunol.Today 4、72 (1983) Coleら、Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss、Inc、77〜96ページ Huseら、Science 246、1275 (1989) Morrisonら、Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81、6851 (1985) Takedaら、Nature 314、452 (1985)
候補ポリペプチドと遮断剤を接触させるステップと、
標的エピトープが遮断剤による化学的修飾と接触不能または接触可能であるかどうかを決定するステップとを含む方法を含む。
ポリペプチドのサンプル(サンプルはPrPScおよび/またはPrPC、ならびに多くの場合は多量の1つまたは他方を典型的には含む)と、典型的にはペルオキシ亜硝酸などのタンパク質と化学的に反応する物質であって、接触可能なエピトープ(標的エピトープ)をそれらが検出剤と結合することができないように修飾する、化学的修飾物質を反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、ポリペプチドが(脱凝集および/または変性の前などに)接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップとを含む方法を提供する。
ポリペプチドのサンプル(サンプルは典型的には疾患状態のアミロイド前駆体ポリペプチドまたはAβまたはtauおよび/または対応する野生型ポリペプチドの全体または一部分、および多くの場合は多量の1つまたは他方を含む)と、典型的にはペルオキシ亜硝酸などのタンパク質と化学的に反応する物質であって、露出したエピトープをそれらが検出剤と結合することができないように修飾する化学的修飾物質を反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップとを含む。
ポリペプチドのサンプルを、典型的にはタンパク質と化学的に反応する物質であって、それらが検出剤と結合することができないように露出したエピトープを修飾すると定義される化学的修飾物質と反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが化学的修飾物質と接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップとを含む検出法に関する。
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座または野生型立体配座の1つでは、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、他の立体配座では、標的エピトープは接触不能であり遮断剤と反応せず、未反応遮断剤は、例えば遮断剤が消費または分解される時間を与えることによって、あるいは以下に記載する物理的または化学的方法によってそれを積極的に除去することによって、ポリペプチドとの接触から除くステップと;
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、転換前に候補ポリペプチドは標的エピトープが接触不能であった立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドは標的エピトープが接触可能であった立体配座であったことを示し、したがってポリペプチドが野生型立体配座または非野生型立体配座であったこと示すステップとを含む方法を含む。
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、野生型立体配座では、標的エピトープは接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、標的エピトープは接触不能であり遮断剤と反応せず、未反応遮断剤は、例えば遮断剤が消費または分解される時間を与えることによって、あるいは以下に記載する物理的または化学的方法によってそれを積極的に除去することによって、ポリペプチドとの接触から除くステップと;
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如はポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法も含む。
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座では、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、野生型立体配座では、標的エピトープは接触不能であり遮断剤と反応せず、未反応遮断剤は、例えば遮断剤が消費または分解される時間を与えることによって、あるいは以下に記載する物理的または化学的方法によってそれを積極的に除去することによって、ポリペプチドとの接触から除くステップと;
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は候補ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法も含む。
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法も含む。
候補ポリペプチド中の接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とサンプルを接触させるステップであって、野生型立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、候補ポリペプチドが凝集ポリペプチドと凝集し標的エピトープが遮断剤と反応することができないために、標的エピトープが接触不能であるステップと、
サンプルと転換剤を接触させて候補ポリペプチドを修飾してサンプル中の任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が候補ポリペプチドが非野生型立体配座であること、および動物が疾患を有することを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如がポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法によって、候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを判定することを含む。
候補ポリペプチド中の接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とサンプルを接触させるステップであって、野生型立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、標的エピトープが接触不能であり遮断剤と反応することができないステップと、
サンプルと転換剤を接触させて候補ポリペプチドを修飾してサンプル中の任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったこと、およびサンプルが非野生型立体配座の候補ポリペプチドを含むことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法によって、候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを判定することを含む。
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、野生型立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、(例えば、候補ポリペプチドが凝集するために)標的エピトープが接触不能であり、標的エピトープが遮断剤と反応することができないステップと、
候補ポリペプチドを修飾して接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法に関する。未反応遮断剤も、例えばそれを消費または分解させることによって、あるいはそれを物理的または化学的方法によりそれを反応から除去することによって、ポリペプチドとの接触から除く。
サンプルと化学的修飾物質を反応させるステップと、
処理したポリペプチドを脱凝集および変性させるステップと、
化学的修飾物質によって遮断された特定のエピトープに対する抗体などの検出剤でサンプルをプローブ処理するステップと、
物質と結合したポリペプチドを(例えばELISAによって)検出するステップとからなる。
サンプルと化学的修飾物質を反応させるステップであって、この場合このような物質はペルオキシ亜硝酸だけには限らないが、ペルオキシ亜硝酸であってよいと思われるステップと、
熱、界面活性剤、またはカオトロピック剤によって化学的に修飾されたサンプルを脱凝集および/または変性させるステップと、
プリオンポリペプチドのエピトープに特異的な抗体を用いてプローブ処理するステップとを含む方法を含む。
ポリペプチドのサンプル(サンプルは典型的には、疾患関連タンパク質またはポリペプチド、例えばアミロイド前駆体ポリペプチドまたはアミロイドβまたはtauおよび/または対応する野生型ポリペプチドなどの全体または一部分、および多くの場合は多量の1つまたは他方を含む)と、それらが検出剤と結合することができないように露出したエピトープを修飾する化学的修飾物質、典型的にはペルオキシ亜硝酸などの遮断剤を反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップを含む。
それらが検出剤と結合することができないように露出したエピトープを修飾すると定義される化学的修飾物質(典型的には遮断剤)とポリペプチドを反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが化学的修飾物質と接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップとを含む検出法に関する。
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法も含む。
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座または野生型立体配座の1つでは、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、他の立体配座では、標的エピトープは接触不能であり遮断剤と反応しないステップと、
固有に修飾されたポリペプチドの標的エピトープから固有の修飾を除去する物質とサンプルを反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、候補ポリペプチドが固有に修飾されたポリペプチドであるかどうかを決定するステップとを含む方法も含む。
本発明の化学的修飾物質は、本発明の方法によってエピトープが目に見えない状態になる(すなわち検出剤によって検出されない、あるいは検出が低下する)ように標的エピトープ残基を修飾する、任意の化学物質(生物物質を含む)を含む。例えばペルオキシ亜硝酸は、チロシン、セリン、メチオニン、ヒスチジンおよびトリプトファン、ならびにシステインおよび他のアミノ酸を優先的に修飾する(25、26)。DEPCはヒスチジンを優先的に修飾し(37)、無水コハク酸はアミンを含む残基を優先的に修飾する。コンジュリトール-B-エポキシドおよび1,2-エポキシ-3-(p-ニトロフェノキシ)プロパンを含めたエポキシドは、アスパルチルプロテアーゼの触媒残基などの、カルボキシル基側鎖の「自殺的阻害」用に広く使用されている反応基である(19、20)。過酸化水素およびメチレンも有用である。これらの化学物質はエピトープを酸化、硝化、還元、あるいは他の場合は修飾することによって標的エピトープを修飾することができる。さらにエピトープは、標的エピトープを覆い隠すリン酸基(リン酸化によって)、またはグリコシル基(グリコシル化によって)、および/または他の化学基である化学的修飾物質によって修飾することができる。
本発明の方法は、サンプルを前処理してEPA検出を高めることも企図する。例えば、血液または尿中においてプリオンなどの凝集タンパク質の低い検出が観察される場合、事前に清澄化する戦略を容易に使用して、界面活性剤、沈殿剤、および吸着剤、例えば当業者に知られている市販のELISAアッセイにおいて典型的に使用されているものなどを用いて検出を高める。ポリペプチドサンプルは、界面活性剤またはクアニジンなどの物質あるいは熱を用いて前処理することもできる。最終的にはサンプルを、遠心分離などの方法によって濃縮または事前にことができる。したがって一実施形態では、本発明の方法を使用する前にサンプルを前処理する。
本発明者は、1つの立体配座が検出剤と接触可能であり他の立体配座は修飾剤による接触不能なエピトープの修飾により接触不能である標的エピトープを有する、ポリペプチドを検出する方法を発見している。本発明者は、本発明の方法において標的エピトープとして有用である、幾つかのエピトープを同定している。他の標的エピトープは、以下に記載したのと同様に同定する。
2つ以上の立体配座で存在するポリペプチドの標的エピトープを同定し、抗体、アプタマーまたはペプチドなどの検出剤によって検出することができるエピトープは、1つの立体配座では接触可能であり他の立体配座では接触不能である。ポリペプチドの1つの立体配座でエピトープが遮断剤による検出から遮断されることが分かっている場合、そのエピトープが標的エピトープである。標的エピトープを同定するために、抗体などの検出剤を選択する。検出剤が抗体である場合、それはモノクローナル抗体であることが好ましいが、ポリクローナル抗体も使用可能である。線状または非線状エピトープであってよく、抗体によって特異的に認識されるエピトープは、場合によっては知られているエピトープである。ペルオキシ亜硝酸などの候補化学的修飾物質を選択する。検出剤によって認識されるエピトープが知られている場合、候補化学的修飾物質は、標的エピトープ中のアミノ酸残基を修飾するその能力に基づいて選択することが好ましい。例えば、ペルオキシ亜硝酸はチロシンおよびヒスチジン残基を優先的に修飾し、システインおよび他のアミノ酸をある程度修飾する。チロシンおよび/またはヒスチジンが標的エピトープ中に存在する場合、化学的修飾物質としてペルオキシ亜硝酸を場合によっては選択する。野生型ポリペプチドを含むサンプルの等分試料、および非野生型ポリペプチドを含むサンプルの等分試料を、高濃度の選択した化学的修飾物質と反応させる。それぞれのサンプルは、組換えポリペプチド、細胞抽出物または野生型または非野生型立体配座のいずれかのポリペプチドを発現することが知られている組織サンプルの1つまたは複数を含む。ポリペプチドのサンプルは、同様のポリペプチド濃度を有することが好ましい。あるいは非野生型立体配座のポリペプチドサンプルは、非野生型立体配座への転換を誘導する酸などの物質で、野生型立体配座のポリペプチドを処理することによって得る。
野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルおよび非野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルと、典型的には1つまたは複数の濃度の化学的修飾物質を反応させるステップと、
それぞれのサンプルを変性および/または脱凝集させて、任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
サンプルを検出剤と接触させるステップと、
化学的修飾物質で処理した野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルに関して検出剤によって生成するシグナルと、化学的修飾物質で処理した非野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルに関して検出剤によって生成するシグナルを比較するステップであって、野生型ポリペプチドを含むサンプルと非野生型サンプルを含むサンプルの間の検出の違いが、1つの立体配座のエピトープが保護されることを示し、そのエピトープが標的エピトープであることをさらに示すステップとを含む。
ペルオキシ亜硝酸、過酸化水素およびメチレン(前駆体ジアジリンのUV光による光分解に基づく)または他の修飾物質を用いる滴定実験は、エピトープ保護に関する条件を改善するのに有用である。
1.疾患関連タンパク質の滴定で「汚染された」動物およびヒトの血漿および尿;
2.疾患関連タンパク質を発現するモデル疾患動物由来の血漿および尿。
本発明は、プリオン疾患関連タンパク質を認識するビオチン3F4および3F4および6H4を含めた、知られている抗体の結合剤としての使用を企図する。3F4はMKHVエピトープに対して反応し、6H4はDYEDRYYREエピトープに対して反応する。さらに、Aβを認識する6E110は、EFRHDSエピトープ(残基3〜8)に対して反応する。
アプタマーも、疾患関連タンパク質などのポリペプチドを検出するために本発明の方法において有用である。アプタマーは、高い特異性および感受性を有するタンパク質などの標的を認識することができるマクロ分子である。
本発明の方法では、例えば熱、界面活性剤および/またはカオトロピック剤を用いてポリペプチドを変性させることによって、ポリペプチドを場合によっては修飾する。同型の他のポリペプチドから、および他の分子からポリペプチドを脱凝集させるための脱凝集剤を用いた処理によって、ポリペプチドを場合によっては修飾し、脱凝集剤はカオトロピック剤、界面活性剤および熱からなる群の少なくとも1つから場合によっては選択される。カオトロピック剤はグアニジン塩、尿素、およびチオ尿素などだけには限られないがこれらを含むことができる。
前に述べたように、本発明の方法によってELISA技法を使用することができる。Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorolmmunassay(DELFIA)技術を使用する時間分解蛍光2地点ELISAは、従来のELISA技法より1000倍感度が良く、本発明の方法と共に使用してin vitro、神経変性のトランスジェニックマウスモデルの神経組織中、およびヒトAD、ALS、PDおよびLBD患者の脳サンプル中に凝集するポリペプチドを検出することができる。
ヒトの神経変性病の生前診断用の、効率の良い、有効かつ安価の診断およびスクリーニング戦略が、加齢群およびヘルスケアシステムに関する連続的な財政圧力を考慮して早急に必要とされる。EPAは関連および接触可能な生物組織および体液中のポリペプチド凝集体を検出することによって臨床的有用性を得るものであり、そのための技術は現在存在しない。一実施形態では、本発明の方法を使用して、疾患関連タンパク質関連疾患を有する個体を診断する。一実施形態では本発明を使用して、神経変性疾患を有する個体を診断する。他の実施形態では本発明を使用して、プリオン関連疾患、AD、HD、ALSおよびPDを含む群から選択される神経変性疾患を有する個体を診断する。他の実施形態では、本発明の方法を死後に使用して、個体が疾患関連タンパク質関連疾患を有していたかどうかを決定する。
プリオンタンパク質転換体、アルツハイマー病関連ポリペプチドまたは他の疾患/障害関連ポリペプチドは、経時的に被験体において定期的に調べて(例えば第一回目、および第一回目の少なくとも一週間または少なくとも一ヶ月後に第二回目)、例えば被験体中の高または低レベルのPrPCあるいは高または低レベルのPrPScを同定することができる。本発明の方法は、被験体のPrPCまたはPrPScレベルを測定して薬剤療法に対する被験体の応答性を決定するのにも有用である。経時的な被験体中のプリオンタンパク質の低レベルは、薬剤療法に対する陽性応答を示す。同じ方法を、他の疾患または障害関連タンパク質に関して使用する。
本発明はポリペプチド間の違いを検出するのに有用であるので、本発明はさらに、候補化合物がプリオン転換または他の疾患または障害関連ポリペプチド、例えばアルツハイマー病におけるアミロイドβ、tauおよびAPP、筋萎縮性側索硬化症におけるSOD1、パーキンソン病およびレビー小体病におけるα-シヌクレイン、ハンチングトン病におけるハンチングチン、糖尿病における膵島アミロイドポリペプチドおよびレジスチン、ならびに癌におけるp53などの形成を阻害するかあるいは安定化させることができるかどうかを評価するためのアッセイを含む。本発明はさらに、本出願中に記載した方法によって同定されるプリオン転換(あるいは他の疾患または障害関連ポリペプチドの転換)を、阻害するかあるいは安定化させるための化合物を含む。中間体プリオンタンパク質基質またはPrPSc(あるいは他の疾患または障害関連ポリペプチド)への低いタンパク質転換は、候補化合物がプリオン病を治療するのに有用であることを示す。
ポリペプチドと候補物質を反応させるステップ、および
本発明の方法を使用して、タンパク質がPrPScに転換されたかどうか判定するステップを含む方法も提供する。
ポリペプチドと候補物質を反応させるステップ、および
本発明の方法を使用して、タンパク質がアルツハイマー病におけるアミロイドβまたはAPPタンパク質に転換されたかどうか判定するステップを含む方法も提供する。
ポリペプチドと候補物質を反応させるステップ、および
本発明の方法を使用して、PrPScが野生型タンパク質に転換されたかどうか判定するステップを含む方法を提供する。
ポリペプチドと候補物質を反応させるステップと、
本発明の方法を使用して、アルツハイマー病におけるアミロイドβまたはAPPタンパク質が野生型タンパク質に転換されたかどうか判定するステップとを含む方法を提供する。
本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドが非野生型立体配座のポリペプチドであるか、あるいは野生型立体配座のポリペプチドであるかを検出する方法であって、
候補ポリペプチドと遮断剤を接触させるステップと、
標的エピトープが遮断剤による化学的修飾と接触不能であるか、あるいは接触可能であるかを判定するステップとを含む方法を含む。
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座または野生型立体配座の1つにおいては、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、他の立体配座では、標的エピトープが接触不能であり遮断剤と反応することができないステップと、
未反応遮断剤をポリペプチドとの接触から除くステップと(例えば、候補ポリペプチドを含むサンプル中において遮断剤を消費または分解させることによって、あるいは物理的または化学的除去法によって)、
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、転換前に候補ポリペプチドは標的エピトープが接触不能であった立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドは標的エピトープが接触不能であった立体配座であったことを示し、したがってポリペプチドが野生型立体配座または非野生型立体配座であったこと示すステップとを含む方法を含む。
本発明は、立体配座の1つの標的エピトープが固有の機構によって修飾される、2つ以上の立体配座で存在するポリペプチドを検出する方法も提供する。固有の機構は、リン酸化および/またはグリコシル化などのポリペプチドの細胞内および/または翻訳後修飾、または方法中に使用される添加剤から生じる修飾を含むことができる。固有の修飾は、検出剤による検出から標的エピトープが隠れるのを妨げる。ポリペプチドのサンプルは、固有に修飾されないポリペプチド中の利用可能な標的エピトープと反応する遮断剤と反応させる。固有の修飾は次いで除去する。例えば固有の修飾がリン酸化である場合、リン酸化を除去し、以前に固有に修飾されたポリペプチド中の接触不能な標的エピトープを接触可能なエピトープに転換するホスファターゼによって、ポリペプチドを処理する。次いでポリペプチドは、抗体などの検出剤を用いて検出する。
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座または野生型立体配座の1つにおいては、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、他の立体配座では、標的エピトープが接触不能であり遮断剤と反応することができないステップと、
固有に修飾されたポリペプチドの標的エピトープから固有の修飾を除去する物質とサンプルを反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、候補ポリペプチドが固有に修飾されたポリペプチドであるかどうかを決定するステップとを含む方法を提供する。
本明細書に記載する方法は、必要な試薬を含む予めパッケージ化された診断キットを使用することによって場合によっては実施して、本発明の方法のいずれかを行う。例えばキットは、少なくとも1つの本明細書に記載する特異的な核酸、ペプチドまたは抗体を典型的には含み、これらは例えば患者をスクリーニングおよび診断するため、疾患関連立体配座のタンパク質を発現する個体をスクリーニングおよび同定するための臨床設定において好都合に使用される。キット抗体は完全抗体、抗体断片、単鎖抗体、モノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体を含むことができる。キットは場合によっては、抗体またはアプタマーによって認識されるエピトープを修飾するための少なくとも1つの化学物質も含む。キットは場合によっては、サンドウィッチELISAおよびDELFIAなどのELISA技術に基づき、ELISA技術において典型的に使用され当業者に知られている、界面活性剤、沈殿剤(リンタングステン酸など)、および吸着剤を使用することができる。キットは、本発明の方法を実施するための詳細な指示書も含む。組換えタンパク質はキットの標準用に有用である。
ペルオキシ亜硝酸は、正常および酸処理またはスクレーピー脳ホモジェネート中でPrPと異なる反応をする
脳ホモジェネートをグアニジンの存在下においてpH3.5でインキュベートすると、PrPは界面活性剤不溶になり、PrPScの存在下においてPK耐性イソ型とのミスフォールディングに対してさらに影響を受けやすくなる(29)。この酸処理PrPは、PrPScの特性と類似して部分的にミスフォールディングおよび/または凝集した「モデルプリオン」である。擬似(□)および酸処理(●)脳ホモジェネートを高濃度のペルオキシ亜硝酸と共にインキュベートし、次いでイムノブロッティングに施すと、酸処理脳ホモジェネート中よりも擬似処理脳ホモジェネート中に、3F4(図1AおよびC)と6H4(図1BおよびD)の両方によって認識されるPrPが少量となる。酸処理脳ホモジェネート中のPrPは、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護される。
スクレーピー感染したハムスター脳内のPrPは、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護される
実施例1で観察したのと同様の「モデルプリオン」に関するエピトープ保護現象を、スクレーピー感染したハムスター(Ha)脳中の真正疾患関連-ミスフォールディングプリオンタンパク質に関しても観察した(図2AおよびB)。モデルプリオンと同様に、HaSc脳ホモジェネート中のPrPの3F4および6H4エピトープは、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護される。「モデルプリオン」とHaPrPScが、差別的なミスフォールディングまたは凝集などの、ペルオキシ亜硝酸による化学的修飾からの保護をもたらす特性を共有していることは明らかである。
凝集はミスフォールディングPrPのペルオキシ亜硝酸誘導型のエピトープ修飾の低下の原因である
酸処理およびスクレーピー脳のエピトープ保護が凝集によるものであったことを示すために、サンプルはペルオキシ亜硝酸で処理し、次いで免疫沈降前にグアニジン有りまたは無しでインキュベートした。グアニジンを用いたサンプルの処理は、ペルオキシ亜硝酸による修飾からポリペプチドを保護するPrP(43〜45)の凝集体を解離させる。ペルオキシ亜硝酸処理後に2.5Mのグアニジンと共に擬似治療脳をインキュベーションすることによって、免疫沈降によって明らかであったように、3F4および6H4エピトープの増大が示されることはなかった(図3Aレーン1〜4)。しかしながら、ペルオキシ亜硝酸処理した酸性の脳ホモジェネートをグアニジンと共にインキュベートすると、3F4および6H4イムノビーズを用いた免疫沈降によって検出することができると思われる、PrPの増大があった(図3A、レーン5〜8)。これは、グアニジンは酸処理した脳ホモジェネートの凝集体を解離させることができ、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護されるPrPを放出させることができることを示す。PrP凝集体を溶かす他の手段を使用し、SDSローディングバッファー中でサンプルを煮沸することによって、今日まで最も観察されている可溶化をもたらした。
EPAパラメータの最適化
ペルオキシ亜硝酸、過酸化水素およびメチレン(前駆体ジアジリンのUV光による光分解に基づく)または他の修飾物質を用いた滴定実験によって、以下のエピトープ保護に関する最適条件を同定する:
1.正常ハムスターおよびヒト脳「モデルプリオン」、イムノブロッティングおよび従来の蛍光ELISAを使用する。
2.ハムスターおよびヒト脳由来の感染プリオン、イムノブロッティング分析および時間分解蛍光を使用する。
蛍光ELISA系に適合させたEPA
凝集PrPに関するエピトープ保護アッセイを、捕捉抗体として6H4および検出抗体として3F4を使用する蛍光サンドウィッチELISA系に適合させた(図3B)。サンドウィッチELISAアッセイ系は、ペルオキシ亜硝酸処理後にサンプルをSDSローディングバッファー中で煮沸する場合のみ、酸処理した脳ホモジェネート中の凝集PrPを同定することができる。8mMを超えるペルオキシ亜硝酸濃度では、擬似処理サンプルと比較して、酸処理サンプル中に2.5〜3倍のPrPが検出される。
一種の脳プリオンの検出
一種の脳プリオンは、PrPScの105〜106個の分子を含むと推定されてきている。従来の蛍光ELISAを使用する、組換えPrPの108〜109個の分子の検出が実施されてきている。使用するこのアッセイは一種のプリオンの検出に関して約1000倍感度が良く、必要な感度はDissociation enhanced lanthanide fiuoroimmunoassay(DELFIA)によって与えられる。DELFIAは、ユーロピウム(Eu)および時間分解蛍光体(TRF)などのキレート化ランタニド標識トレーサーを使用して、出力シグナルを測定する。ランタニドキレートの利点は、それらの蛍光時間は従来の蛍光体より200,000倍まで長く続き、非特異的な干渉蛍光が衰えた後にシグナル捕捉を可能にすることである(非常に非特異的な蛍光を有する可能性がある生物サンプルには特に重要である)。DELFIA系システムは、わずか100fmol/Euウエルを測定することができ、これは従来のELISAアッセイの1000倍感度が良く、EPAによる一種のプリオンを検出する。DELFIA系用の最適なTRF96ウエルプレートリーダーはWallac-Victor(Perkin-Elmer)によって製造され、これを使用してサンプル分析を自動化する。
1.TRFによる組換えプリオンタンパク質の検出を特徴付け、最適化、および定量化する。
2.ハムスターおよびヒト脳プリオンに関するDELFIA-TRFの感度を測定する。
生物体液中のプリオンタンパク質の検出
EPAは、生物組織および体液中のPrPScを検出することによって商業的有用性を達成し、そのための技術は現在存在しない。血中プリオンは非常に少量であり(バイオアッセイにより10〜100プリオン/mL)、尿中のプロテアーゼ耐性PrPは多量の体液を沈殿させることによって断続的/散発的にのみ検出可能である。さらに、有望な血液試験はいずれも、高濃度のPrPC(PrPScの106倍を超える)、および異種血漿タンパク質による「遮断」に対処しなければならない。最適化した化学修飾法およびDELFIA-TRF系を使用して、血液および尿中におけるEPAに関する感度の閾値は、以下のものを使用して測定する。
1.263Kハムスタープリオンの滴定によって「汚染された」ハムスターおよびヒトの血漿および尿;
2.263Kプリオン病に「内因」感染したシリアンハムスター由来の血漿および尿。
EPAを使用する凝集したアミロイドβ(Aβ)の検出
アミロイドβペプチド(Aβ)は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解プロセシングの通常の切断産物である。Aβはアルツハイマー病の脳の感染領域中で不連続なプラークに蓄積し、この疾患で観察される神経死およびグリオーシスを誘発する。正常細胞によって発現されるAPPのAβ領域とは対照的に、プラークAβは凝集しβシート構造中で豊富である。エピトープ保護技術を使用して、APPのAβ領域中の6E10エピトープは、正常な脳と比較してアルツハイマー病の脳内ではペルオキシ亜硝酸による修飾に対して接触が少ないことを実証した(図4、パネルA)。同様に6E10エピトープは、タンパク質凝集を誘導するために低いpHで処理した脳ホモジェネート中で部分的に保護される(図4、パネルB)。水中における1mg/mlでの一晩のインキュベーションによって凝集したAβ1〜42ペプチドは、可溶性非凝集Aβ1〜42と比較して、ペルオキシ亜硝酸修飾に対する6E10エピトープの顕著なエピトープ保護を示す(図4、パネルC)。この現象の他の例は、6E10抗体を用いたイムノブロッティングを施し高濃度のペルオキシ亜硝酸で処理した、正常(○)および凝集(●)Aβ1〜42を示す図4パネルDに表す。
瀕死のニューロンは、tauなどの細胞内タンパク質をCSF中(39)およびおそらく最終的には血液中に放出する。Tau試験は、アルツハイマー患者サンプルおよび対照脳を含めた脳試料に直接行う。
EPAによる凝集スーパーオキシドジスムターゼ-1(SOD1)の検出
SOD1含有細胞質封入体は、家族性および散発性ALS患者由来の多くの疾患状態運動ニューロンにおいて(15)、ならびに大部分のトランスジェニックマウス(16、17)およびこの疾患の組織培養(18)モデルにおいて検出される。ヒトSOD1はin vitroで凝集することができる。他のSOD1は、無水コハク酸およびDEPCによって修飾可能である。EPA技術によってこの性質を利用して、凝集SOD1タンパク質と非凝集SOD1タンパク質を区別することができる。
1)本来の可溶状態で化学的修飾物質と接触可能な本来の二量体の分子表面上のエピトープを選択すること、
2)線状エピトープを同定して、イムノブロットおよびELISAでの変性状態における検出を最適化すること、
3)免疫原性、
4)SOD1に対する特異性、および
5)エポキシドによって容易に修飾される酸性アミノ酸(GluおよびAsp)の存在。
ヒトSOD1の静電性ループ:Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser
ヒトSOD1の亜鉛結合ループ:Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu
EPAによる凝集α-シヌクレインの検出
パーキンソン病の大部分の症例は散発性であるが、散発形と家族形の両方の疾患が、PDにおいて選択的に殺傷される中脳ニューロン(60,000まで)の個体群である黒質の、瀕死のニューロン中の細胞内レビー小体によって特徴付けられる。レビー小体はα-シヌクレインから主に構成される(22)。α-シヌクレインをコードする遺伝子の突然変異は、家族性のパーキンソン病を有する患者において発見されてきている(23中に総説)。常染色体劣性PDと関係がある他の遺伝子は、α-シヌクレイン変性と関係があるパーキンである(22、23)。α-シヌクレインから構成されるびまん性皮質レビー小体は、パーキンソン状態の変化、幻覚、および迅速な症状の変動と関係がある痴呆症状であるレビー小体病(LBD)において観察される(24)。
CSF中の凝集タンパク質の検出
ADを有する患者のCSFおよび血液ならびに正常対照において、細胞外に堆積したAβを定量化した(6〜8)。α-シヌクレインなどの細胞内ニューロンタンパク質は、CSFおよび血液中で検出されている(37、38)。瀕死のニューロンは、細胞内タンパク質14-3-3、ニューロン特異的エノラーゼ、tau、およびα-シヌクレインをCSF中(39)およびおそらく最終的には血液中に放出する。疾患中に放出されるタンパク質の一部分は凝集形である。EPA技術を適用して、AD、ALS、PD、およびLBDを有する患者由来のCSFサンプル中のポリペプチド凝集体の比率を決定する。それぞれ「完全」および「保護」エピトープを表す、化学処理の前後の脱凝集ポリペプチドに関するシグナルを測定して、脱凝集状態のポリペプチドの比率を決定する。最適化mAbおよび化学的修飾法、ならびにDELFIA-TRF系を使用して、EPA感度を以下のものにおいて決定する:
1.in vitroで凝集したポリペプチドによって「汚染された」正常CSF。
2.AD、ALS、PD、およびLBDを有する患者由来のCSF。
物質
組換えハムスターPrP(rhaPrP)および6H4はPrionicsからのものであった。組換えヒトPrP(rhuPrP)はRoboscreenからのものであった。ビオチン-3F4および3F4はSignetからのものであった。3F4はMKHVに対して反応し、6H4はDYEDRYYREに対して反応する。(Signetからの)6E10抗Aβは、EFRHDS(残基3〜8)に対して反応する。
酸処理したミスフォールディング状態のPrPを、この試験において「モデルプリオン」として使用し、(29)中と同様に調製した。簡潔には、100μlの10%脳ホモジェネートを等体積の3.0MのGdnHCl(最終濃度1.5M)と、1NのHClで調節したpH7.4またはpH3.5のPBS中で混合させ、次に室温で攪拌した。5時間のインキュベーション後、サンプルは5倍体積の氷冷メタノールを用いてメタノール沈殿させ、ペレットは100μlの溶解バッファーに再懸濁した。pH7.4で処理したサンプルを、擬似処理サンプルとして表した。
正常またはミスフォールディング状態/疾患状態脳ホモジェネートの等分試料(18μl)は、2μlのペルオキシ亜硝酸を100mMのNaOH/60mMH2O2に溶かしたものを加えながら攪拌して、0〜15mMの最終ペルオキシ亜硝酸濃度を与えた。さらに15秒間攪拌した後、サンプルをウエスタンブロッティング、免疫沈降またはサンドウィッチELISAした。
ヒト赤血球から精製したSOD1(Sigma)は、10mMのトリス-酢酸バッファー(pH7)中の40_MのSOD1、4mMのアスコルビン酸、および0.2mMのCuCl237℃3日間からなる金属触媒酸化反応において凝集する。(可溶性SOD1を含む)超遠心分離の上清および(不溶性SOD1を含む)ペレット再懸濁液を、さまざまな濃度のDEPC(100pM〜0.1M)で処理し、熱で変性させ、抗SOD1抗体を用いてイムノブロッティングする。
サンプルはSDSローディングバッファー(62mMのトリス(pH6.8)、10%グリセロール、2%のSDS、5%のβ-メルカプトエタノールおよび0.01%のブロモフェノールブルー)中で5分間煮沸し、12%トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル上に分離し、次にHybond-Pに移した。3F4(1:50000)6H4(1:10000)または6E10(1:1000)を一次抗体として、およびHRP結合ヤギ抗マウス(1:10000)を二次抗体として使用し、次にECL-Plusへの露光、およびKodak X-OMATフィルムへの露光により目に見える状態にすることによって、PrPを検出した。バンド強度はUnScan-ITソフトウェアを使用することによって定量化した。
サンプルは50μlの抗体結合(100μg/ml)Dynal M-280磁気ビーズと共に、1ml結合バッファー(3%のNP-40;3%のTween-20)の最終体積で3時間室温において攪拌しながらインキュベートした。ビーズは洗浄バッファー(2%のNP-40;2%のTween-20)で3回洗浄し、β-メルカプトエタノールを含まない30μlのSDSローディングバッファー中で5分間煮沸した。前に記載したのと同様にウエスタンブロッティングによって上清を分析した。
捕捉抗体(6H4;1:5000、50mM重炭酸結合バッファー、pH9.6中)を、4℃での一晩のインキュベーションによって不透明な96ウエルプレート(Nuns Maxisorp)と結合させた。2時間0.05%TBST中での1%BSAを用いた遮断後、プレートをTBST中で3回洗浄し、標準濃度のrhuPrPまたはrHaPrPならびに未知の脳ホモジェネートと共に4℃で一晩インキュベートした。プレートを3回洗浄し、検出抗体ビオチン-3F4(1:5000)と共に室温で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、アビジン-HRP(1:5000)を加え、30分間室温でインキュベートした。最終洗浄ステップ(3回)の後、室温で10〜90分間Quantablu蛍光基質を用いてプレートを現像し、325nmの励起および420nmの発光で蛍光強度を測定した。
(参考文献)
Claims (40)
- 標的エピトープを含む候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、野生型立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、候補ポリペプチドが凝集し標的エピトープが遮断剤と反応することができないために、標的エピトープが接触不能であるステップと、
未反応遮断剤をポリペプチドとの接触から除くステップと、
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如はポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップ
を含む方法。 - 候補ポリペプチドがプリオンタンパク質を含み、野生型立体配座が野生型プリオンタンパク質の立体配座を含み、非野生型立体配座がPrPScの立体配座を含む、請求項1に記載の方法。
- 候補ポリペプチドがβ-アミロイドポリペプチド、tauタンパク質またはAPPタンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
- 候補ポリペプチドがSOD1を含む、請求項1に記載の方法。
- 候補ポリペプチドがα-シヌクレインを含む、請求項1に記載の方法。
- 候補ポリペプチドがハンチングチンタンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
- 候補ポリペプチドがp53を含む、請求項1に記載の方法。
- 候補ポリペプチドが膵島アミロイドポリペプチドまたはレジスチンを含む、請求項1に記載の方法。
- 遮断剤がペルオキシ亜硝酸、過酸化水素、メチレン化合物、無水コハク酸、エポキシド、二炭酸ジエチル、4-ヒドロキシノネナール(4HNE)およびジアジリンからなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- ポリペプチドを変性させることによってポリペプチドを修飾する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 熱および/または界面活性剤および/またはカオトロピック剤によってポリペプチドを変性させる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 凝集ポリペプチドからポリペプチドを脱凝集させるための脱凝集剤を用いた処理によってポリペプチドを修飾する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 脱凝集剤がカオトロピック剤、界面活性剤および熱からなる群の少なくとも1つから選択される、請求項12に記載の方法。
- 界面活性剤がSDSを含む、請求項13に記載の方法。
- 検出剤がアプタマーまたは抗体を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- アプタマーまたは抗体がプリオンポリペプチドのエピトープを対象とする、請求項15に記載の方法。
- 抗体が6H4または3F4を含む、請求項16に記載の方法。
- アプタマーまたは抗体がアミロイドβのエピトープを対象とする、請求項15に記載の方法。
- 抗体が6E10または4G8を含む、請求項16に記載の方法。
- 非野生型立体配座がタンパク質凝集によって引き起こされる疾患を示す、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 疾患がプリオン病を含む、請求項20に記載の方法。
- 疾患がBSEまたはCJDを含む、請求項20に記載の方法。
- 疾患がアルツハイマー病を含む、請求項20に記載の方法。
- 疾患がパーキンソン病またはレビー小体病を含む、請求項20に記載の方法。
- 疾患がハンチングトン病を含む、請求項20に記載の方法。
- 疾患が筋萎縮性側索硬化症を含む、請求項20に記載の方法。
- 疾患が癌を含む、請求項20に記載の方法。
- 疾患が糖尿病を含む、請求項20に記載の方法。
- 遮断剤と候補ポリペプチドを接触させる前に、以下の方法:吸着、沈殿、または遠心分離の1つまたは複数によって前処理したサンプル中に候補ポリペプチドが存在する、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 遮断剤と候補ポリペプチドを接触させる前に、標的エピトープをマッピングする、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- CSF、血清、血液、尿、バイオプシーサンプルまたは脳組織の群から選択される死後または生前サンプル中にポリペプチドが存在する、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 標的エピトープを含む候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを検出するためのキットであって、標的エピトープを認識する検出剤、ならびにi)標的エピトープをマッピングすること、ii)候補ポリペプチドと遮断剤を接触させること、およびiii)候補ポリペプチドと検出剤を接触させることの少なくとも1つに関する指示書を含むキット。
- 検出剤がアプタマーまたは抗体を含む、請求項32に記載のキット。
- 抗体が6H4、3F4、6E10または4G8を含み、場合によっては固相担体に固定されている、請求項33に記載のキット。
- サンドウィッチELISA、蛍光ELISAを含めたELISA用のバッファーおよび試薬をさらに含む、請求項32から34のいずれか一項に記載のキット。
- 遮断剤をさらに含む、請求項32から35のいずれか一項に記載のキット。
- 界面活性剤およびカオトロピック剤の群の少なくとも1つから選択される変性剤をさらに含む、請求項32から36のいずれか一項に記載のキット。
- ポリペプチドスタンダードをさらに含む、請求項32から37のいずれか一項に記載のキット。
- ポリペプチドスタンダードが組換え疾患関連タンパク質、または疾患関連タンパク質を模倣した組換えタンパク質を含む、請求項35に記載のキット。
- 遮断剤と接触している候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、候補ポリペプチドが少なくとも1つ標的エピトープを含み、遮断剤との接触および遮断剤の除去の後、候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換し、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如はポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップ
を含む方法。
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