ES2608002T3 - Métodos y composiciones para tratar y detectar enfermedades mediadas por SOD1 mal plegada - Google Patents

Abstract

Una composición adecuada para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), comprendiendo dicha composición un vehículo farmacéuticamente aceptable y un agente seleccionado de: (1) un anticuerpo exógeno o un fragmento del mismo que se une selectivamente a un epítopo que consiste en: (a) IKGLTEGLHGF [DSE5]; (b) GLHGFHVH [DSE7]; o (c) un análogo que consiste en IKGLTEGLHGF [DSE5] o GLHGFHVH [DSE7], comprendiendo el análogo una modificación de un aminoácido por oxidación o nitración; y (2) un inmunógeno que comprende un péptido de menos de 20 restos de SOD1 que comprende: a) IKGLTEGLHGF [DSE5]; o b) GLHGFHVH [DSE7]; o c) un análogo de a) o b), comprendiendo el análogo una modificación de un aminoácido por oxidación o nitración.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones para tratar y detectar enfermedades mediadas por SOD1 mal plegada Campo de la invencion

La invencion se refiere a composiciones y su uso en el tratamiento de esclerosis lateral amiotrofica.

Antecedentes de la invencion

Mal plegamiento y agregacion de protefnas

Las protefnas pueden plegarse en estructuras complejas y muy compactadas. El plegamiento no es solamente crucial para la actividad biologica, sino que el fallo de las protefnas en plegarse apropiadamente o en permanecer plegadas puede dar lugar a enfermedades (revisado en 48). El mal plegamiento puede causar, en algunos casos, la agregacion de protefnas, que puede dar lugar adicionalmente a depositos concretos extracelularmente (por ejemplo, placas) o intracelularmente (por ejemplo, inclusiones en el citosol o en el nucleo).

Las enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Huntington (HD), esclerosis lateral amiotrofica (ALS) y enfermedades por priones se caracterizan por depositos neurales de protefna agregada mal plegada (revisado en 49).

Las enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrofica (ALS) y enfermedad de Parkinson/demencia con cuerpos de Lewy (PD, LBD) tambien plantean grandes desaffos para nuestra poblacion envejecida y para el sistema de asistencia sanitaria.

AD, ALS y PD/LBD esporadica estan asociadas con acumulacion neural de multfmeros patologicos de polipeptidos mal plegados (estos podrfan ser preferentemente fibrillas, protofilamentos y agregados amorfos), incluyendo el fragmento amiloide beta (Abeta) de la protefna precursora amiloide (APP) en AD; la superoxido dismutasa-1 (SOD1) en ALS, AD y PD, y la alfa-sinuclefna en PD y LBD. Adicionalmente la polineuropatfa amiloidotica familiar (FAP) resulta de la agregacion de transtiretina para formar depositos amiloides. Como con las enfermedades por priones, mutaciones en genes que codifican estos polipeptidos estan asociadas con formas familiares dominantes autosomicas de AD, ALS y PD.

ALS y mal plegamiento de protefnas

La esclerosis lateral amiotrofica (ALS) es una enfermedad neuromuscular mortal que afecta a aproximadamente 30.000 pacientes en Norte America, con 5.000 nuevos casos por ano. En ALS, tambien conocida como "enfermedad de Lou Gehrig", los musculos de las extremidades, para hablar y tragar, y la respiracion se debilitan y atrofian, debido a la degeneracion de las celulas nerviosas motoras que los alimentan desde la medula espinal y el cerebro. La mitad de los pacientes afectados mueren en 3 anos, siendo la supervivencia de mas de 5 anos de menos del 20 %.

ALS pertenece a una familia de trastornos neurodegenerativos mortales, que incluye enfermedades por priones, enfermedades de Alzheimer y Parkinson, y en que se cree que las protefnas mal plegadas agregadas causan eliminacion progresiva de las celulas cerebrales. Aproximadamente el 20 % de ALS familiar (hereditaria) esta asociada con mutaciones en el gen que codifica la superoxido dismutasa-1 (SOD1), una enzima de defensa de radicales libres intracelular (vease 73 y la Tabla 1 para la lista de mutaciones conocidas). Los depositos intracelulares de SOD1 mal plegada agregada se han observado en ALS familiar, y tambien en la ALS no familiar mas comun (esporadica), que sugiere que la agregacion de SOD1 puede subyacer a todas las ALS.

Los experimentos realizados en cultivo celular y ratones transgenicos para SOD1 mutante humana han establecido que SOD1 mal plegada extracelular es muy toxica para las neuronas motoras (1), en parte por activacion de las rutas de eliminacion por celulas inmunitarias locales (microglia). Recientemente, tambien ha quedado claro que SOD1 mal plegada se exporta de la celula por mecanismos tanto secretores como constitutivos (1, 2).

La agregacion de SOD1 puede progresar a traves de un mecanismo de mal plegamiento dirigido por molde basado en protefna (3) similar al propuesto para las enfermedades por priones (4). Por tanto, SOD1 mal plegada en el espacio extracelular no solamente es directamente toxica para las neuronas motoras, sino que tambien participa en la propagacion de una celula a otra de la enfermedad en todo el sistema nervioso por un proceso de mal plegamiento con un molde tipo prion.

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TABLA 1. Mutaciones detectadas en SOD1 en FALS.

Aminoacidos

Mutacion Aminoacidos Mutacion Aminoacidos Mutacion

4

A -> S (en FALS). 67 L -> R (en FALS). 112 I -> M (en FALS).

4

A -> T (en FALS). 72 G -> S (en FALS). 112 I -> T (en FALS).

4

A -> V (en FALS). 76 D -> Y (en FALS). 113 I -> T (en FALS).

6

C -> F (en FALS). 80 H -> A (en ALS). 114 G -> A (en FALS).

7

V -> E (en FALS). 84 L -> F (en FALS). 115 R -> G (en FALS).

8

L -> Q (en FALS). 84 L -> V (en FALS). 118 V -> VFLQ (en FALS).

8

L -> V (en FALS). 85 G -> R (en FALS). 124 D -> V (en FALS).

12

G -> R (en FALS). 86 N -> S (en FALS). 125 D -> H (en FALS).

14

V -> G (en FALS). 89 A -> V (en FALS). 126 L -> S (en FALS).

14

V -> M (en FALS). 90 D -> A (en FALS). 133 Ausente (en ALS).

16

G -> S (en ALS). 90 D -> V (en FALS). 134 S -> N (en FALS).

21

E -> G (en FALS). 93 G -> A (en FALS). 139 N -> K (en FALS).

21

E -> K (en FALS). 93 G -> C (en FALS). 144 L -> F (en FALS).

37

G -> R (en FALS. 93 G -> D (en FALS). 144 L -> S (en FALS).

38

L -> R (en FALS). 93 G -> R (en FALS). 145 A -> T (en FALS).

38

L -> V (en FALS). 93 G -> V (en FALS). 146 C -> R (en FALS).

41

G -> D (en FALS). 100 E -> G (en FALS). 148 V -> G (en FALS).

41

G -> S (en FALS). 100 E -> K (en FALS). 148 V -> I (en FALS).

43

H -> R (en FALS). 101 D -> G (en FALS). 149 I -> T (en FALS).

45

F -> C (en FALS). 101 D -> N (en FALS). 151 I -> T (en FALS).

46

H -> R (en FALS). 104 I -> F (en FALS).

48

H -> Q (en FALS). 105 S -> L (en FALS).

49

E -> K (en FALS). 106 L -> V (en FALS).

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N -> S (en FALS). 108 G -> V (en FALS).

Enfermedad de Alzheimer

AD es una enfermedad neurodegenerativa de demencia comun (memoria y cognicion alteradas) asociada con la acumulacion en el cerebro de placas extracelulares compuestas predominantemente de los peptidos Abeta (1-40), Abeta (1-42) y Abeta (1-43), todos los cuales son productos proteolfticos de APP (revisado en 50). Ademas, los haces neurofibrilares, compuestos principalmente de protefna tau fosforilada de forma anormal (una protefna asociada con microtubulos neuronales), se acumulan de forma intracelular en neuronas que mueren (revisado en 49). Las formas familiares de AD pueden estar causadas por mutaciones en el gen APP, o en los genes de presenilina 1 o 2 (revisado en 51), cuyos productos proteicos estan implicados en el procesamiento de APP en Abeta. Las variantes alelicas de Apolipoprotefna E tambien influyen en la edad de la aparicion de las formas tanto esporadica como familiar de AD (revisado en 52). Abeta, tau y tau fosforilada se han detectado en la sangre y CSF de pacientes con AD y en controles normales (53 - 55). La inmunizacion de pacientes con enfermedad de Alzheimer con Abeta ha demostrado algunos resultados de tratamiento preliminares prometedores, aunque limitados por meningoencefalitis autoinmunitaria en seres humanos (56 - 58).

Enfermedad de Parkinson

PD es un trastorno neurodegenerativo del movimiento, el segundo solamente tras AD en predominancia (-350 por 100.000 habitantes, revisado en 59). Se caracteriza clfnicamente por rigidez, lentitud de movimientos y temblores. La mayorfa de los casos de enfermedad de Parkinson son esporadicos, pero las formas tanto esporadicas como familiares de la enfermedad se caracterizan por cuerpos de Lewy intracelulares en neuronas que mueren de la sustancia negra, una poblacion de neuronas del mesencefalo (-60.000) que se han diezmado selectivamente en PD. Los cuerpos de Lewy estan compuestos predominantemente de alfa-sinuclefna (60). Las mutaciones en, y la duplicacion de, el gen que codifica la alfa-sinuclefna se han encontrado en pacientes con enfermedad de Parkinson familiar (revisado en 61). Otro gen asociado con PD recesiva autosomica es parkina, que esta implicada en la degradacion de la alfa-sinuclefna (61). Los cuerpos de Lewy corticales difusos compuestos de alfa-sinuclefna se observan en enfermedad con cuerpos de Lewy (LBD), un sfndrome de demencia asociado con cambios parkinsonianos de tono, alucinaciones y fluctuacion rapida de los sfntomas (62). LBD puede ser la segunda forma mas comun de demencia neurodegenerativa despues de AD, representando del 20 al 30 por ciento de los casos entre las personas por encima de la edad de 60 anos. Similar al enfoque de vacuna para la enfermedad de Alzheimer (58 - 60) se han obtenido resultados prometedores en un modelo de raton de enfermedad de Parkinson/con cuerpos de Lewy por inmunizacion con alfa-sinuclefna (63). Otros sfndromes de demencia incluyen demencias frontotemporales, enfermedad de Pick y demencia corticobasal, y otros conocidos para la medicina neurologica.

SOD1 se ha detectado en agregados proteicos de AD y PD

El estres oxidativo se ha implicado en varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo ALS, PD y AD. Las

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especies reactivas de oxfgeno y nitrogeno (ROS y RNS respectivamente) generadas en estos entornos pueden participar en la lesion celular, incluyendo la oxidacion anormal de protefnas o lfpidos. Otras marcas distintivas patologicas de dicha enfermedad incluyen acumulaciones de desechos citoesqueleticos y muerte neuronal selectiva, frecuentemente atribuida a estres oxidativo y la protefna soluble acumulada (74-81). Varias enzimas, incluyendo SOD1, tienen papeles antioxidantes. Las alteraciones en la actividad de dichas enzimas pueden contribuir a un estado patologico neurodegenerativo.

Recientemente, Choi et al. (64) informo de que SOD1 es una diana principal del dano oxidativo en cerebros AD y PD. Apreciaron que el nivel total de SOD1 esta aumentado tanto en Ad como en PD y que SOD1 forma agregados proteicos que se asocian con placas seniles amiloides y haces neurofibrilares en cerebros AD. Choi et al. (64) han sugerido que AD, PD y ALS pueden compartir un mecanismo patogenico comun. Tambien se ha demostrado recientemente que SOD1 se secreta en el espacio extracelular, en una forma que es toxica para las neuronas, pero mas accesible por agentes terapeuticos extracelulares (1).

La implicacion de que SOD1 mal plegada extracelular desempena un papel en la patogenesis de ALS proporciona una oportunidad para el tratamiento con anticuerpos de enfermedades autodegenerativas, ya que este compartimento es accesible para la neutralizacion por anticuerpos. En seres humanos normales, las IgG pueden cruzar la barrera hematoencefalica hasta niveles entre 1/100 y 1/1000 de las concentraciones en circulacion; y una trasudacion de inmunoglobulinas a menudo esta aumentada en enfermedades que afectan a la barrera hematoencefalica. Sin embargo, el tratamiento de pacientes humanos con anticuerpos o vacunas dirigidas a epftopos extracelulares accesibles sobre protefnas ubicuas puede conducir a efectos autoinmunitarios nocivos tales como los observados con Abeta en enfermedad de Alzheimer. Por tanto, sigue existiendo una necesidad en la tecnica de composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de enfermedades relacionadas con SOD1 mal plegada, tales como ALS, AD y PD.

Goldberg (2005) "SESSION 7A Protein Folding and Degradation Defects", Amyotrophic Lateral Sclerosis Vol. 6, N.° 4, Supl. 1: paginas 33-35 describe una SOD1 monomerica/mal plegada C45detectada en modelos de raton de ALS usando un anticuerpo disenado.

El documento WO 2007/025385 describe un anticuerpo que se une especfficamente a una superoxido dismutasa 1 (SOD1) anormal, y que neutraliza su efecto patologico cuando se administra a un animal tal como a un ser humano. El anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por lfneas celulares de hibridoma depositadas en la International Depositary Authority of Canada el 29 de agosto de 2006 con los numeros de acceso ADI-290806-01, ADI-290806-02 y ADI-290806-03. Tambien se describe el uso del anticuerpo en el tratamiento, prevencion y diagnostico de enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis lateral amiotrofica, Parkinson y Alzheimer en un animal tal como en un ser humano.

El documento US 5.849.290 y la base de datos Geneseq (24 de febrero de 2009) "Human Cu/Zn SOD exon 2 protein fragment", recuperado del numero de acceso EBI GSP: AAW82448 describe la secuencia de aminoacidos del fragmento de la protefna SOD Cu/Zn humana codificado por el exon 2 del gen SOD1.

Sumario de la invencion

SOD1 mal plegada es toxica para las neuronas (1) y se cree que participa en la muerte celular neuronal y la disfuncion en esclerosis lateral amiotrofica y otras enfermedades neurodegenerativas. La presente invencion usa epftopos especfficos de enfermedad por SOD1 (DSE) como una diana para vacunas o inmunoterapia para esclerosis lateral amiotrofica. Tambien se describen DSE como una diana para vacunas o inmunoterapia para (ALS), enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson (PD) y enfermedades con cuerpos de Lewy (LBD). La invencion afsla y aborda epftopos que se presentan selectivamente por formas no nativas de SOD1 que estan asociadas con ALS. Estos epftopos no se presentan o estan accesibles en formas nativas de SOD1. Por ejemplo, los epftopos especfficos de enfermedad tales como especfficos de ALS, especfficos de AD y especfficos de PD, no se presentan por las formas dimericas nativas de SOD1. Sin embargo, los epftopos especfficos de enfermedad se presentan o estan accesibles cuando el monomero SOD1 no logra asociarse o se disocia de su estado homodimerico normal, y en otras formas no nativas de SOD1, incluyendo monomeros de SOD1 mal plegados, dfmeros de SOD1 mal plegados y agregados de SOD1. Estos epftopos se presentan selectivamente o estan accesibles en forman no nativas de SOD1, y son caracterfsticos de afecciones, enfermedades y trastornos relacionados con SOD1 no nativa.

En esta solicitud, epftopos "especfficos de ALS" se refiere a epftopos que se presentan en las formas asociadas a ALS de SOD1, epftopos "especfficos de AD" se refiere a epftopos que se presentan en las formas asociadas a AD de SOD1, y epftopos "especfficos de PD" se refiere a epftopos que se presentan en las formas asociadas a PD de SOD1 que surgen de procesos tales como mal plegamiento, agregacion o disociacion. SOD1 mal plegada presenta muchos de los mismos epftopos en cada uno de ALS, AD y PD, sin embargo, por conveniencia en este documento, los epftopos se describen como "especfficos" a esa enfermedad porque, dentro del organismo de un sujeto particular, los epftopos se presentan especfficamente solamente en la SOD1 toxica no nativa que causa, subyace o esta asociada con la enfermedad neurodegenerativa. Dichos epftopos especfficos de enfermedad, por tanto,

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incluyen los epftopos sobre el monomero de SOD1 que se revelan cuando el monomero de SOD1 se disocia de su estado homodimerico normal, los epftopos se presentan selectivamente o estan accesibles en formas de SOD1 no nativas incluyendo monomero de SOD1 mal plegado, dfmero de SOD1 mal plegado y los epftopos se presentan selectivamente o estan accesibles en agregados de SOD1.

La presente invencion proporciona composiciones, anticuerpos aislados, inmunogenos y usos de dichas composiciones, anticuerpos aislados e inmunogenos en el tratamiento de ALS, asf como hibridomas, kits y metodos para obtener dichos anticuerpos como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Se describen epftopos que se presentan por o estan accesibles en formas no nativas de SOD1, incluyendo:

DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) (documento WO 2005/019828);

NPLSRKHGGPKDEE (DSE3) (documento WO 2005/019828);

IKGLTEGLHGF (DSE5) (8);

HCIIGRTLVVH (DSE 6) (8); y

GLHGFHVH (DSE7),

asf como los epftopos adicionales que se presentan por o estan accesibles solamente en formas monomericas de SOD1, que incluyen:

RLACGVIGI (DSE1); y

KAVCVLK (DSE4).

La presente solicitud describe estos epftopos y/o determinantes antigenicos contenidos dentro de estos epftopos, y asimismo cualquier epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, como dianas para intervencion inmunoterapeutica. Por ejemplo, los peptidos aislados correspondientes a estos epftopos son utiles para reducir o inhibir la participacion de SOD1 monomerica, dimerica o mal plegada en agregacion de SOD1, que es caracterfstica de trastornos relacionados con SOD1 mal plegada, tal como esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer y/o enfermedad de Parkinson. Por consiguiente, los peptidos aislados correspondientes a estos epftopos pueden usarse para tratar esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer y/o enfermedad de Parkinson y pueden usarse para provocar una respuesta inmunitaria selectiva en un animal contra las moleculas SOD1 monomericas, agregadas o mal plegadas, y para inhibir o neutralizar el efecto toxico de estas especies de SOD1 mal plegadas en neuronas. En el caso donde el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de enfermedad se usa en una vacuna, el peptido aislado puede ser cualquier analogo de los peptidos aislados indicados que produce anticuerpos endogenos contra ese epftopo. Ademas, el inventor proporciona protefnas de union tales como anticuerpos y fragmentos que se unen a los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, anticuerpos y fragmentos que se unen a epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer y anticuerpos y fragmentos que se unen a epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson. Estos anticuerpos pueden usarse para detectar o tratar la esclerosis lateral amiotrofica, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

Por consiguiente, se describe una composicion util para inhibir la agregacion de SOD1 mediada por SOD1 monomerica o mal plegada, y por tanto para tratar trastornos de SOD1 incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer y/o enfermedad de Parkinson. Por consiguiente, se describe una composicion para tratar una enfermedad neurodegenerativa tal como ALS, AD o PD en un sujeto, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 (opcionalmente mencionado como un epftopo especffico de enfermedad), o un inmunogeno que comprende dicho peptido, en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, tal como uno farmaceuticamente aceptable. Tambien se describe una composicion para tratar ALS en un sujeto, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, o un analogo del mismo que provoca anticuerpos endogenos que se unen a ese epftopo o un inmunogeno que comprende dicho peptido aislado, en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, tal como uno farmaceuticamente aceptable. Tambien se describe una composicion para tratar AD en un sujeto, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o asociado con formas no nativas de SOD1, o un analogo del mismo que provoca anticuerpos endogenos que se unen a ese epftopo o un inmunogeno que comprende dicho peptido aislado o analogo, en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, tal como uno farmaceuticamente aceptable. Tambien se describe una composicion para tratar PD en un sujeto, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, o un inmunogeno que comprende dicho peptido, en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, tal como uno farmaceuticamente aceptable.

Se describe un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, que se selecciona del grupo que consiste en los peptidos asilados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A (descritas a continuacion) o un analogo de los mismos.

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Tabla 2. Peptidos aislados correspondientes a epftopos selectivamente accesibles en formas no nativas de

SOD1

RLACGVIGI (SEQ ID NO: 1, DSE1):

DLGKGGNEESTKTGNAGS (SEQ ID NO: 2, DSE2);

NPLSRKHGGPKDEE; (SEQ ID NO: 3, DSE3):

IKGLTEGLHGF; SEQ ID NO: 5, DSE5);

HCIIGRTLVVH; SEQ ID NO: 6, DSE6);

RLA[acido cisteico]GVIGI (DSE1a); SEQ ID NO: 8, DSE1a);

KAVCVLK (DSE4); SEQ ID NO: 4, DSE4) y GLHGFHVH (DSE7) SEQ ID NO: 7, DSE7).

Estos peptidos aislados enumerados en la Tabla 2 se mencionan en este documento como los "peptidos aislados de la Tabla 2".

Se describe una composicion farmaceutica para tratar la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto, que comprende una cantidad eficaz de un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica aislado, o un inmunogeno que comprende dicho epftopo, en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, tal como uno farmaceuticamente aceptable. En una descripcion, el epftopo o una forma inmunogenica del mismo se presenta selectivamente o es accesible en la forma monomerica de SOD1. Dichos epftopos incluyen aquellos que reconocen un epftopo del monomero SOD1 que descansa normalmente en la superficie de contacto del dfmero SOD1. Otro de dichos epftopos son aquellos accesibles en la superficie de SOD1 cuando lo monomeros de SOD1 estan en su estado asociado normal, por ejemplo, cuando SOD1 esta en su forma dimerica o cuando esta en su forma agregada. En descripciones particulares, el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica se selecciona del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Tambien son utiles analogos de los peptidos aislados y peptidos aislados modificados. Los analogos y peptidos aislados modificados comprenden peptidos de origen in vivo y modificados por ingenierfa molecular correspondientes a los epftopos presentados o accesibles en formas no nativas de SOD1 que retienen la capacidad de provocar la produccion de anticuerpos que reconocen especfficamente los epftopos correspondientes en formas monomericas, mal plegadas o agregadas de SOD1. En una descripcion, el analogo peptfdico aislado comprende un acido cisteico. Se describe un peptido aislado analogo correspondiente a un epftopo que comprende RLAC*GVIGI (DSE1 a), donde * indica una cistefna oxidada, en forma de acido cisteico.

Se describe una composicion para tratar un trastorno, enfermedad o afeccion mediada por SOD1 que comprende una cantidad eficaz de un acido nucleico aislado que codifica un peptido o analogo correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. Se describe una composicion para tratar la esclerosis lateral amiotrofica, que comprende una cantidad eficaz de un acido nucleico aislado que codifica un peptido correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con diluyente o vehfculo adecuado.

En una descripcion, el acido nucleico codifica un peptido aislado correspondiente a un epftopo seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describe una composicion para tratar la esclerosis lateral amiotrofica, que comprende una cantidad eficaz de un acido nucleico que codifica un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, donde el peptido aislado correspondiente al epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica se selecciona del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Estas composiciones pueden usarse para tratar la esclerosis lateral amiotrofica, la enfermedad de Alzheimer y/o la enfermedad de Parkinson y en metodos para tratar la esclerosis lateral amiotrofica, la enfermedad de Alzheimer y/o la enfermedad de Parkinson.

Las composiciones son utiles particularmente para tratar una enfermedad neurodegenerativa usando inmunoterapia dirigida a un epftopo presentado en SOD1 mal plegada, donde el tratamiento comprende inmunoterapia activa, es decir, terapia basada en vacuna en que el peptido aislado correspondiente a un epftopo se usa en un inmunogeno para producir anticuerpos que reconocen SOD1 monomerica o mal plegada en el destinatario, o comprende inmunoterapia pasiva en que se administra un anticuerpo contra el peptido aislado correspondiente al epftopo al destinatario. La composicion tfpicamente es una composicion farmaceutica.

Por consiguiente, se describe una composicion para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. La afeccion, enfermedad o trastorno medico incluye, aunque sin limitacion, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson.

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Otra descripcion es una composicion para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, donde el peptido aislado correspondiente al epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica se selecciona del grupo que consiste en los peptidos asilados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

En una descripcion, la composicion es una composicion farmaceutica para tratar la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto por inmunizacion activa, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica, o un inmunogeno que comprende dicho peptido aislado correspondiente a dicho epftopo, en mezcla con un vehfculo adecuado, tal como un diluyente o vehfculo farmaceuticamente aceptable. En una descripcion, el peptido aislado o una forma inmunogenica del mismo corresponde a un epftopo presentado selectivamente o accesible en la forma monomerica de SOD1. Dichos epftopos incluyen aquellos epftopos en el monomero de SOD1 que normalmente descansa en la superficie de contacto del dfmero de SOD1. Otros de dichos epftopos son aquellos accesibles en la superficie de SOD1 cuando esta en forma dimerica, o cuando SOD1 esta en su forma agregada. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica que se selecciona del grupo que consiste en los peptidos asilados de la Tabla o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describe una composicion para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende una cantidad eficaz de un acido nucleico que codifica un peptido correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. La afeccion, enfermedad o trastorno medico es un trastorno de SOD1 tal como una enfermedad neurodegenerativa que incluye, aunque sin limitacion, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson.

Una descripcion adicional es una composicion para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende una cantidad eficaz de un acido nucleico que codifica un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, donde el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica se selecciona del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Estas composiciones son utiles para provocar una respuesta inmunitaria en un animal y son utiles en metodos para provocar una respuesta inmunitaria en un animal contra formas no nativas de SOD1, incluyendo una respuesta inmunitaria contra epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer y/o epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson.

Estas composiciones son utiles para generar protefnas de union, tales como anticuerpos contra formas no nativas de SOD1, incluyendo anticuerpos que se unen a epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer y/o epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson.

Por consiguiente, se describen anticuerpos exogenos especfficos para formas no nativas de SOD1, incluyendo epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer y/o epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson.

En una descripcion, los anticuerpos especfficos para formas no nativas de SOD1 se producen usando una composicion que comprende un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de enfermedad seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

En una descripcion, el anticuerpo se une al epftopo RLACGVIGI. En otra descripcion, el anticuerpo se une al epftopo DLGKGGNEESTKTGNAGS. En otra descripcion, el anticuerpo se une al epftopo NPLSRKHGGPKDEE. En un aspecto de la invencion, el anticuerpo se une al epftopo IKGLTEGLHGF. En otra descripcion, el anticuerpo se une al epftopo HCIIGRTLVVH. En otra descripcion, el anticuerpo se une al epftopo RLAC*GVIGI. En otra descripcion, el anticuerpo se une al epftopo KAVCVLK. En un aspecto de la invencion, el anticuerpo se une al epftopo GLHGFHVH.

Los anticuerpos de la invencion pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y/o fragmentos de union a epftopo y analogos de los mismos. La invencion comprende adicionalmente hibridomas que producen anticuerpos contra DSE5. Las realizaciones de la presente invencion incluyen los hibridomas per se, asf como la descendencia de los mismos, fusiones posteriores con los mismos y ADN y ARN endogeno que codifica el anticuerpo contra SOD1. En aspectos relacionados, la invencion, por tanto, proporciona adicionalmente un metodo para producir anticuerpos que se unen selectivamente a DSE5, que comprende la etapa de cultivar los hibridomas. Estos anticuerpos son utiles para tratar la esclerosis lateral amiotrofica por inmunizacion pasiva. Por ejemplo, inhiben o neutralizan el efecto toxico de estas especies mal plegadas de SOD1 en las neuronas, y/o evitan la progresion de la enfermedad por eliminacion inmunologica de agregados toxicos de SOD, inhibiendo la agregacion de SOD1 mediada por SOD1 mal plegada, y/o bloqueando el proceso de mal plegamiento dirigido por molde SOD1. Por tanto, la invencion incluye composiciones utiles para tratar la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo

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especffico para DSE5 o DS7 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado.

Ademas de los anticuerpos, tambien se describen otros agentes que se unen especfficamente a epftopos presentados o accesibles en formas no nativas de SOD1 y no presentados o accesibles en formas nativas de SOD1. Los agentes que se unen incluyen polipeptidos, moleculas pequenas, aptameros nucleicos o peptfdicos, aficuerpos y anticalinas.

Mas generalmente, se describe un metodo para tratar a un sujeto que tiene una afeccion, enfermedad o trastorno medico mediado por una forma no nativa de la superoxido dismutasa (SOD), comprendiendo el metodo la etapa de administrar al sujeto una composicion que comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable y un agente seleccionado de (1) una protefna en forma de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une selectivamente a la forma monomerica o mal plegada de SOD1, y/o (2) un inmunogeno que provoca la produccion de dicho anticuerpo por dicho sujeto, y/o (3) una secuencia de acido nucleico que codifica (1) o (2).

Los metodos descritos, por tanto, se refieren a aplicaciones inmunoterapeuticas de anticuerpos contra SOD1 que se unen selectivamente a epftopos accesibles en las formas monomericas o mal plagadas de SOD1 presentes en estados patologicos. El metodo puede realizarse como monoterapia, en que un anticuerpo cualquiera o un epftopo cualquiera se administra al sujeto. Como alternativa, el metodo puede realizarse como una terapia de combinacion, en que el sujeto se trata para recibir tanto un anticuerpo o peptido seleccionado correspondiente a un epftopo como otro agente util en el tratamiento o control de la enfermedad.

Estos anticuerpos son utiles para detectar formas no nativas de formas monomericas, dimericas o agregadas de SOD1, y de ese modo son utiles para diagnosticar la esclerosis lateral amiotrofica. Se describe un metodo de deteccion o diagnostico de la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo de dicho sujeto con un anticuerpo especffico para un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica, donde el anticuerpo se une a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica para producir un complejo de anticuerpo-antfgeno;

(b) medir la cantidad de complejo de anticuerpo-antfgeno en la muestra de ensayo; y

(c) comparar la cantidad de complejo de anticuerpo-antfgeno en la muestra de ensayo con un control donde una diferencia en la cantidad del complejo de anticuerpo-antfgeno en la muestra de ensayo en comparacion con el control es indicativa de esclerosis lateral amiotrofica. Opcionalmente, y en el caso donde el epftopo SOD1 mal plegado esta enmascarado dentro de una agregacion de SOD1, el metodo proporciona la etapa de tratar la muestra para promover la disgregacion del agregado de SOD1 para exponer el epftopo diana antes de la etapa (a).

Estos anticuerpos y/o fragmentos de union de los mismos se conjugan de forma util con marcadores para producir un agente de diagnostico.

Se describen kits que comprenden las composiciones y anticuerpos descritos para tratar enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, por ejemplo para inhibir la agregacion de SOD1; para provocar una respuesta inmunitaria en un animal; o para detectar SOD1 mal plegada, y de ese modo diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa tal como esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson.

Tambien se describen novedosos peptidos aislados. En una descripcion los peptidos aislados novedosos comprenden peptidos que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

RLACGVIGI (SEQ ID NO: 1, DSE1)

ACGVIGI (SEQ ID NO: 9, analogo de DSE1)

Ac-GG-RLACGVIG-GGKG (SEQ ID NO: 10, analogo de DSE1)

CDLGKGGNEESTKTGNAGS (SEQ ID NO: 11, analogo de DSE2)

CNPLSRKHGGPKDEE (SEQ ID NO: 12, analogo de DSE3)

CIKGLTEGLHGF (SEQ ID NO: 14, analogo de DSE5)

RLA[Acido cisteico]GVIGI (SEQ ID NO: 8, DSE1a)

A[Acido cisteico]GVIGI (sEq ID NO: 13, analogo de DSE1a)

C-GGG-RLA[Acido cisteico]GVIGI-GSG (SEQ ID NO: 15, analogo de DSE1a)

KAVCVLK (SEQ ID NO: 4, DSE4);

GSGKAVCLK (SEQ ID NO: 16, analogo de DSE 4); y GLHGFHVH (SEQ ID NO: 7, DSE7).

En otra descripcion, la invencion comprende novedosos peptidos aislados modificados que comprenden RLA[Acido cisteico]GVIGI (SEQ ID NO: 8, DSE1a), donde el resto de cistefna es acido cisteico.

En descripciones relacionadas, estos peptidos se proporcionan en forma marcada, o como conjugados o fusiones, por ejemplo, "inmunogenos" utiles para producir anticuerpos o detectar SOD1 y para otros usos de diagnostico y

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terapeuticos. Dichos inmunogenos comprenden los peptidos acoplados, por ejemplo, a KLH o a antfgeno MAP.

Ciertas descripciones se refieren a un metodo de i) provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto y/o ii( tratar una afeccion, enfermedad o trastorno medico mediado por una forma mal plegada de la superoxido dismutasa (SOD) en un sujeto que necesita tratamiento, que comprende administrar una composicion que comprende un acido nucleico que codifica un inmunogeno aislado especffico de esclerosis lateral amiotrofica (por ejemplo, peptido) de la invencion en mezcla con un diluyente o un vehfculo adecuado al sujeto. Por supuesto, dichos acidos nucleicos codificaran solamente aquellas formas de los epftopos y peptidos que consisten en aminoacidos codificados geneticamente, pero los acidos nucleicos tambien pueden producir, de forma endogena, analogos de los epftopos codificados que, despues de expresarse tal cual, quedan modificados in vivo tal como por nitracion, oxidacion, carbonilacion y similares por el entorno endogeno. Las secuencias de nucleotidos adecuadas de ARN y de ADN se exponen en esta solicitud (otras secuencias de ADN que tienen identidad de secuencia o equivalente sinonimos de codones tambien son utiles en los metodos). Ejemplos de afecciones, enfermedades o trastornos medicos incluyen ALS, enfermedad de Parkinson, enfermedad con cuerpos de Lewy o enfermedad de Alzheimer.

Se describe un metodo para i) aumentar la eliminacion inmunologica de agregados de SOD, ii) reducir la agregacion de SOD1 mediada por SOD1 mal plegada, y/o iii) reducir el mal plegamiento dirigido por molde de SOD1, que comprende administrar al sujeto una composicion que comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable y un agente seleccionado de (1) un anticuerpo exogeno aislado que se une selectivamente a la forma mal plegada de SOD, y/o (2) un inmunogeno que provoca la produccion de un anticuerpo endogeno que se une selectivamente al monomero o a la forma mal plegada de SOD, y/o (3) una secuencia de acido nucleico que codifica (1) o (2).

Se describe un metodo para tratar una afeccion, enfermedad o trastorno medico mediado por una forma mal plegada de la superoxido dismutasa (SOD) en un sujeto que necesita tratamiento, comprendiendo el metodo administrar al sujeto que necesita tratamiento un agente (tal como un anticuerpo exogeno o inmunogeno (por ejemplo, peptido)) descrito en este documento que i) causa eliminacion inmunologica de agregados de SOD, ii) reduce la agregacion de SOD1 mediada por SOD1 mal plegada y/o iii) reduce el mal plegamiento dirigido por molde de SOD1. Tambien se describen metodos de tratamiento de afecciones, enfermedades o trastornos medicos descritos en este documento administrando a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo especffico para epftopos descritos en este documento que se presentan selectivamente o estan accesibles en formas no nativas de SOD1.

Otras caracterfsticas y ventajas de la presente invencion llegaran a ser evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada.

Breve descripcion de las figuras

Las realizaciones de la invencion se describiran en relacion a los dibujos en que:

La Figura 1 es un grafico que demuestra que el anticuerpo anti-DSE1a reconoce preferentemente DSE1a sobre DSE1.

La Figura 2 es un grafico que ilustra los datos de ELISA que muestran que el anticuerpo anti-DSE2 reconoce la protefna SOD1 oxidada.

La Figura 3A es un diagrama de antigenicidad de SOD1 usando el metodo de Hopp y Woods.

La Figura 3B es un diagrama de antigenicidad de SOD1 usando el metodo de Kolaskar y Tongaonkar.

La Figura 4A es una inmunotransferencia que muestra que DSE2 reconoce SOD1 humana y de raton desnaturalizada.

La Figura 4B es una inmunotransferencia de SOD1 inmunoprecipitada de cerebro humano y murino normal que demuestra que el anticuerpo anti-DSE2 no inmunoprecipita SOD1 nativa.

La Figura 4C es una inmunotransferencia de SOD1 inmunoprecipitada de ratones transgenicos que sobreexpresan SOD1 humana de tipo silvestre y mutante.

La Figura 5A es una seccion de cerebro humano de hipocampo normal en una mujer de 52 anos de edad tenido con un anticuerpo contra DSE2.

La Figura 5B es una composicion de las secciones del hipocampo humano de una mujer de 78 anos de edad con enfermedad de Alzheimer en fase final sondeadas con anticuerpo monoclonal anti-DSE2.

La Figura 6 (A-F) es una composicion de secciones cerebrales de una mujer de 79 anos de edad con demencia sondeadas con anticuerpo monoclonal anti-DSE2.

Descripcion detallada de la invencion

Se describen composiciones inmunoterapeuticas y metodos que abordan especfficamente especies toxicas de SOD1, incluyendo a aquellos conformeros de SOD1 que puede asociarse con enfermedades neurodegenerativas, tales como ALS, AD y Pd, identificando y aprovechando la ventaja terapeutica de epftopos inmunologicos (sitios de union de anticuerpo) expuestos sobre la superficie molecular de SOD1 mal plegada y agregada. Estos epftopos no se presentan en SOD1 plegada normalmente nativa. Se describen epftopos previamente desconocidos que son utiles como dianas para disenar compuestos o para producir anticuerpos para terapia o para diagnostico. Tambien se describe el uso inmunoterapeutico de epftopos identificados previamente presentados en formas mal plegadas y

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agregadas de SOD1 pero no conservadas en formas nativas de SOD1 (vease 3 y el documento WO 2005/019828). Estos epftopos son dianas utiles para inmunoterapia pasiva o activa para prevenir la progresion de la enfermedad. Sin el deseo de limitarse a teorfa alguna, estos epftopos previenen la progresion de la enfermedad por eliminacion inmunologica o secuestro de agregados toxicos de SOD1, bloqueando el proceso de mal plegamiento dirigido por molde de SOD1, neutralizando el efecto toxico de estas especies mal plegadas de SOD1 en neuronas, y/o la inhibicion del estres oxidativo mediado por SOD1 mal plegada.

Composiciones y usos de los epftopos especfficos de enfermedad

Los inventores han determinado que hay epftopos presentados selectivamente por, o accesibles en, SOD1 monomerica o formas mal plegadas de SOD1 en formas monomericas, dimericas o agregadas, pero no en la forma nativa o homodimerica apropiadamente plegada de SOD1. Las formas mal plegadas de SOD1 se caracterizan por la adopcion de una conformacion, particularmente una conformacion secundaria o terciaria que es diferente de la conformacion adoptada por un dfmero de SOD1 de tipo silvestre, y/o participa en la formacion de agregados de SOD1 que son caracterfsticos de trastornos de SOD1 incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. Dicha SOD1 mal plegada puede tener una secuencia de tipo silvestre o una secuencia mutada. En ciertas realizaciones, los epftopos son aquellos presentados selectivamente por o accesibles en SOD1 mal plegada que tiene una secuencia de tipo silvestre o nativa. En otras realizaciones, los epftopos son estos presentados selectivamente por o accesibles en SOD1 mal plegada que tiene la secuencia mutada o no de tipo silvestre. En otras realizaciones, el epftopo se presenta por el monomero de SOD1 (en cualquier forma incluyendo de tipo silvestre, mutante, mal plegada y nativa), y se vuelve accesible en el monomero de SOD1 tras la disociacion del monomero del homodfmero de SOD1. El reconocimiento inmunologico de solamente SOD1 mal plegada reducira o eliminara las manifestaciones autoinmunitarias causadas por la union de anticuerpo a SOD1 nativa normal. El reconocimiento inmunologico de SOD1 mal plegada que es tipo silvestre, en particular, sera util particularmente en el tratamiento de ALS esporadica.

El termino "SOD1" como se usa en este documento significa la superoxido dismutasa 1 e incluye todas las formas analogas y mutantes de todas las especies, particularmente SOD1 humana (es decir, hSOD1) y menciona opcionalmente como SOD. La secuencia de aminoacidos de SOD1 humana (por ejemplo, numero de acceso UniProtKB/TrEMBL Q6NR85; numero de acceso a GenBank CAG46542; SEQ ID NO: 17) y la secuencia de nucleotidos de ARNm (por ejemplo, numero de acceso a GenBank NM_000454; SEQ ID NO: 18) de SOD1 humana se han caracterizado previamente.

"Tipo silvestre" se refiere a la secuencia primaria de aminoacidos de una protefna nativa o no mutante, y SOD1 de tipo silvestre se refiere a SOD1, y particularmente SOD1 humana, que puede mencionarse opcionalmente como hSOD1, que tiene una secuencia de aminoacidos nativa o de origen natural. La secuencia de aminoacidos de SOD1 humana se proporciona en la SEQ ID NO: 17 y la secuencia de acido nucleico se proporciona en la SEQ ID NO: 18. "Tipo silvestre" tambien puede hacer referencia a la estructura nativa normal de una protefna especffica (por ejemplo, las coordenadas a nivel atomico de la estructura cristalina de la protefna SOD1 dimerica nativa estan disponibles en el numero de acceso del Protein Data Bank 1PUO). SOD1 plegada de tipo silvestre se menciona opcionalmente como SOD1 "plegada de forma nativa", SOD1 "plegada normalmente" y/o SOD1 "plegada apropiadamente".

"SOD mutante" se refiere a formas de SOD, y particularmente formas endogenas de SOD, que aparecen como resultado de mutacion genetica que produce, por ejemplo, sustituciones de aminoacidos, tales como aquellas sustituciones caracterfsticas, por ejemplo, de ALS familiar. Dichas sustituciones incluyen las enumeradas en la Tabla 1.

"Mal plegada" como se usa en este documento, se refiere a la estructura secundaria y terciaria de una protefna, e indica que la protefna ha adoptado una conformacion que no es normal para esa protefna en su estado de funcionamiento apropiado. Aunque el mal plegamiento puede estar causado por mutaciones en una protefna, tales como delecion, sustitucion o adicion de aminoacidos, la protefna de secuencia de tipo silvestre tambien puede estar mal plegada en enfermedad, y exponer epftopos especfficos de enfermedad, por ejemplo, como resultado de condiciones microambientales y/o modificacion de aminoacidos tales como nitracion, oxidacion, carbonilacion u otra modificacion.

En ciertas realizaciones, en el caso donde SOD1 no nativa es SOD1 mutante tal como una forma de SOD1 que comprende variaciones de secuencia caracterfsticas de ALS familiar, el mutante de SOD1 no nativo es diferente a un mutante donde uno o mas de los aminoacidos A4, G37, G85, o G93 esta mutado.

Un "epftopo", como se usa en este documento, significa una region de una protefna que se reconoce por un receptor de celulas B o de celulas T, o un anticuerpo o un fragmento de union del mismo. El epftopo esta representado opcionalmente en este documento por la secuencia lineal de aminoacidos o la region de la protefna reconocida por el anticuerpo. Los "peptidos aislados correspondientes a un epftopo" opcionalmente se mencionan en sf mismos como un "epftopo".

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Un epftopo es "accesible" en el contexto de la presente memoria descriptiva cuando esta accesible a la union por un anticuerpo o por un fragmento de union del mismo. Un epftopo especffico de enfermedad de la invencion puede estar parcial o completamente expuesto sobre la superficie molecular de una protefna mal plegada en una forma accesible para union del anticuerpo, y parcial o completamente oculto del reconocimiento por el anticuerpo en la isoforma plegada de forma nativa de la protefna. Dicho epftopo se presenta o esta accesible de forma selectiva en una conformacion mal plegada o no nativa de una protefna y no se presenta o esta accesible en la conformacion nativa de la protefna. "Presentada de forma selectiva o accesible" se usa contextualmente, para indicar que el epftopo mencionado esta disponible para la union a un anticuerpo u otra protefna de union en SOD1 mal plegada y no disponible para la union del anticuerpo en formas nativas de SOD1. El epftopo especffico de enfermedad es suficientemente diferente de una parte correspondiente de SOD1 nativa plegada apropiadamente (es decir, SOD1 que tiene actividad SOD1 no patogenica normal), habitualmente en terminos de su conformacion, de modo que un anticuerpo puede unirse selectivamente al epftopo.

Un epftopo comprende uno o mas determinantes antigenicos. Por ejemplo, un anticuerpo generado contra un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de enfermedad especffica reconoce parte de o toda dicha secuencia epitopica. Por consiguiente, en una realizacion, una parte de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado o accesible en SOD1 mal plegada que retiene un determinante antigenico se usa para crear anticuerpos contra dicho epftopo.

Cuando se hace referencia a epftopos de SOD1 presentados selectivamente en ALS, los epftopos se mencionan opcionalmente como epftopos especfficos de ALS; cuando se hace referencia a epftopos presentados selectivamente en enfermedad de Alzheimer, los epftopos se mencionan opcionalmente como epftopos especfficos de AD y asimismo cuando se hace referencia a epftopos presentados selectivamente en enfermedad de Parkinson, los epftopos se mencionan opcionalmente como epftopos especfficos de PD para facilitar la referencia de la enfermedad nombrada. Sin embargo, se entiende que los epftopos especfficos de ALS de SOD1 no estan limitados a ALS, sino que se presentan opcionalmente en otras enfermedades neurodegenerativas tales como AD y PD; los epftopos especfficos de AD de SOD1 no estan limitados a AD, sino que se presentan opcionalmente en otras enfermedades neurodegenerativas tales como ALS y PD; y los epftopos de SOD1 especfficos de PD no estan limitados a PD, sino que se presentan opcionalmente en otras enfermedades neurodegenerativas tales como AD y ALS. Los epftopos que estan accesibles selectivamente en formas de SOD1 que estan asociadas con afecciones, enfermedades y trastornos mediados con SOD1 se mencionan opcionalmente como epftopos especfficos de enfermedad.

Un epftopo puede reconocerse selectivamente por un anticuerpo en una conformacion de una protefna y no en una segunda conformacion de la protefna. "Selectivo" se usa contextualmente para caracterizar las propiedades de union de un anticuerpo. Un anticuerpo que se une selectivamente a un epftopo dado se unira a ese epftopo con mayor avidez o con mas especificidad, respecto a otros epftopos diferentes presentados por la misma molecula. Por ejemplo, un anticuerpo se une selectivamente a un epftopo especffico de enfermedad si se une a SOD1 mal plegada en que el epftopo especffico de enfermedad esta accesible, de forma dos veces mas eficaz de lo que se une a SOD1 nativa donde el epftopo especffico de enfermedad no esta accesible. En otras realizaciones, el anticuerpo se une de forma 3-5 veces, 5-7 veces, 7-10, 10-15, 5-15, o 5-30 veces mas eficaz.

Los epftopos que son "especfficos de enfermedad", en el contexto de la presente memoria descriptiva, son epftopos que se presentan o estan accesibles selectivamente por una o mas formas mal plegadas de SOD1 que son caracterfsticas de una enfermedad particular o de una categorfa de enfermedad.

A causa de la especificidad de enfermedad de SOD1 de estos epftopos, son dianas utiles para tratar trastornos, enfermedades y afecciones mediadas por SOD1 tales como esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson o para producir una respuesta inmunitaria en un animal. Por ejemplo, la vacunacion de sujetos diagnosticados con esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson con una composicion que comprende peptidos aislados correspondientes a los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer o epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson, respectivamente, inhibe la formacion de agregados de SOD1 en la enfermedad bloqueando la participacion de las especies moleculares de SOD1 mal plegadas en el proceso de agregacion y/o bloqueando el mal plegamiento dirigido por molde de SOD1, o induciendo la eliminacion basada en complejo inmunitario de formas unidas a anticuerpo de SOD1 neurotoxica mal plegada y/o agregados.

Los epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 se encuentran en SOD1 asociada con enfermedades neurodegenerativas y son utiles para tratar, diagnosticar o prevenir enfermedades relacionadas con SOD1 mal plegada, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y/o esclerosis lateral amiotrofica.

La expresion "epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1" como se usa en este documento, se refiere a un epftopo que se presenta selectivamente o esta accesible en SOD1 monomerica o SOD1 mal plegada en formas monomericas, dimericas o agregadas, pero no sobre la superficie molecular de la forma homodimerica nativa, plegada correctamente de SOD1. En otros terminos, los epftopos pueden caracterizarse como

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aquellos que dan lugar a anticuerpos que se unen selectivamente a formas de SOD1 asociadas con enfermedades relacionadas con SOD1 mal plegada, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y/o esclerosis lateral amiotrofica, respecto a la forma homodimerica nativa de SOD1.

Los siguientes 7 epftopos se han identificado como epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1:

RLACGVIGI (SEQ ID NO: 1, DSE1);

DLGKGGNEESTKTGNAGS (SEQ ID NO: 2, DSE2) (documento WO 2005/019828);

NPLSRKHGGPKDEE (SEQ ID NO: 3, DSE3) (documento WO 2005/019828);

IKGLTEGLHGF (SEQ ID NO: 5, DSE5) (8);

HCIIGRTLVVH (SEQ ID NO: 6, DSE6) (8)

KAVCVLK (SEO ID NO: 4, DSE4); y GLHGFHVH (SEQ ID NO: 7, DSE7).

Un experto en la materia apreciara que los epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 pueden ser la totalidad o parte de las secuencias anteriores. El termino "parte de" como se usa en este documento se refiere a la secuencia que retiene la actividad epitopica de union a un anticuerpo selectivo para formas no nativas de SOD1 y donde el anticuerpo se genera opcionalmente por inmunizacion con un peptido aislado correspondiente a dicho epftopo en un animal. Tambien se describen analogos de las secuencias anteriores, tales como RLA[Acido cisteico]GVIGI (DSE1a), que tiene una cistefna oxidada.

La expresion "epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer" como se usa en este documento, se refiere a un epftopo que esta selectivamente presente o accesible en SOD1 monomerica o SOD1 mal plegada en forma monomerica, dimerica o agregada, pero no en la forma homodimerica nativa de SOD1. En otros terminos, los epftopos pueden caracterizarse como aquellos donde la inmunizacion con un inmunogeno que comprende peptidos aislados correspondientes a dichos epftopos da lugar a anticuerpos que se unen selectivamente a formas asociadas a enfermedad de Alzheimer de SOD1, respecto a la forma homodimerica nativa de SOD1.

Un experto en la materia apreciara que el epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer puede ser la totalidad o parte de las secuencias anteriores. El termino "parte de", como se usa en este documento, se refiere a la secuencia que retiene la actividad epitopica de union de un anticuerpo selectivo para formas no nativas de SOD1 donde el anticuerpo se genera opcionalmente por inmunizacion con un peptido aislado correspondiente a la totalidad o parte de dicho epftopo en un animal. Tambien se describen analogos de las secuencias anteriores.

La expresion "epftopo especffico de enfermedad de Parkinson", como se usa en este documento, se refiere a un epftopo que esta selectivamente presente o accesible en SOD1 monomerica o SOD1 mal plegada en forma monomerica, dimerica o agregada, pero no en la forma homodimerica nativa de SOD1. En otros terminos, los epftopos pueden caracterizarse como aquellos donde la inmunizacion con un inmunogeno que comprende peptidos aislados correspondientes a dichos epftopos da lugar a anticuerpos que se unen selectivamente a formas asociadas a enfermedad de Parkinson de SOD1, respecto a la forma homodimerica nativa de SOD1.

Un experto en la materia apreciara que el epftopo especffico de enfermedad de Parkinson puede ser la totalidad o parte de las secuencias anteriores. El termino "parte de", como se usa en este documento, se refiere a la secuencia que retiene la actividad epitopica de union de un anticuerpo selectivo para formas no nativas de SOD1, donde el anticuerpo se genera opcionalmente por inmunizacion con un peptido aislado correspondiente a la totalidad o parte de dicho epftopo en un animal. Tambien se describen analogos de las secuencias anteriores.

La expresion "epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica", como se usa en este documento, se refiere a un epftopo que esta selectivamente presente o accesible en SOD1 monomerica o SOD1 mal plegada en forma monomerica, dimerica o agregada, pero no en la forma homodimerica nativa de SOD1. En otros terminos, los epftopos pueden caracterizarse como aquellos que dan lugar a anticuerpos que se unen selectivamente a formas asociadas a ALS de SOD1, respecto a la forma homodimerica nativa de SOD1.

Un experto en la materia apreciara que el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica puede ser la totalidad o parte de las secuencias anteriores. El termino "parte de", como se usa en este documento, se refiere a la secuencia que retiene la actividad epitopica de union de un anticuerpo selectivo para formas no nativas de SOD1, donde el anticuerpo se genera opcionalmente por inmunizacion con un peptido aislado correspondiente a la totalidad o parte de dicho epftopo en un animal. Tambien se describen analogos de las secuencias anteriores.

El termino "analogo", como se usa en este documento, incluye partes, extensiones, sustituciones, variantes, modificaciones o equivalentes qufmicos y derivados de los mismos de las secuencias de aminoacidos y nucleotidos descritas en este documento que realizan sustancialmente la misma funcion que el peptido, protefna o moleculas de acido nucleico descritas en este documento sustancialmente del mismo modo. Por ejemplo, los analogos de peptidos y protefnas incluyen, sin limitacion, sustituciones conservativas de aminoacidos. Los analogos de peptidos tambien incluyen la modificacion de acido cisteico de un aminoacido, como en RLAC*GVIGI (DSE1 a). Por ejemplo,

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un aminoacido se acetila opcionalmente (Ac-). Los analogos de los peptidos y protefnas tambien incluyen adiciones y deleciones a los peptidos y protefnas descritos en este documento. Los analogos de acidos nucleicos incluyen sustituciones de nucleotidos degenerados que codifican un peptido aislado como se describe en este documento. Ademas, los peptidos analogos y secuencias nucleotfdicas analogas incluyen derivados de los mismos.

Una "sustitucion conservativa de aminoacido", como se usa en este documento, es una en que un resto de aminoacido se remplaza con otro resto de aminoacido sin anular las propiedades deseadas del peptido.

La expresion "derivado de un peptido" se refiere a un peptido que tiene uno o mas restos derivatizados qufmicamente por reaccion de un grupo lateral funcional. Dichas moleculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, aquellas moleculas en que los grupos amino libres se han derivatizado para formar clorhidratos de amina, grupos p- tolueno sulfonilo, carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, esteres metflicos y etflicos u otros tipos de esteres o hidracidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrogeno de imidazol de histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina. Tambien se incluyen como derivados aquellos peptidos que contienen uno o mas derivados de aminoacido de origen natural de los veinte aminoacidos convencionales. Por ejemplo: puede sustituirse 4-hidroxiprolina en el lugar de la prolina; puede sustituirse 5- hidroxilisina en el lugar de lisina; puede sustituirse 3-metilhistidina en el lugar de histidina; puede sustituirse homoserina en el lugar de serina; y puede sustituirse ornitina en el lugar de lisina. Un derivado de un peptido tambien incluye opcionalmente peptidos que comprenden formas de aminoacidos que estan oxidadas.

El estres oxidativo puede conducir a danos en las protefnas, ADN y lfpidos celulares. Se ha informado de estres oxidativo en AD y PD (64). Los inventores han demostrado que anticuerpos selectivos para DSE1a que comprenden una cistefna oxidada en forma de acido cisteico, tienen alta afinidad por SOD1 mal plegada. Otros aminoacidos tambien pueden oxidarse o nitrarse como resultado del estres oxidativo. Por ejemplo, la histidina, arginina y lisina pueden formar grupos carbonilo, la metionina puede oxidarse en sulfoxido de metiona y la fenilalanina puede nitrarse en nitrotriptofano. Adicionalmente la cistefna puede oxidarse en acido cistefna sulffnico.

Por consiguiente, los epftopos en una realizacion comprenden uno o mas aminoacidos oxidados o nitrados. En realizaciones especfficas de la invencion, el epftopo de SOD1 puede comprender un aminoacido oxidado o nitrado, particularmente cistefna oxidada, es decir, acido cisteico.

Los peptidos aislados correspondientes a epftopos presentados selectivamente en SOD1 no nativa, en una realizacion comprenden uno o mas aminoacidos oxidados o nitrados. En realizaciones especfficas de la invencion el epftopo de SOD1 puede comprender un aminoacido oxidado o nitrado, particularmente cistefna oxidada, es decir, acido cisteico.

Los peptidos asilados correspondientes a epftopos que son utiles en la presente invencion, por tanto, son opcionalmente peptidos que incorporan secuencias correspondientes a tramos de aminoacidos contiguos dentro de la secuencia de SOD1 humana para formar epftopos selectivamente accesible solamente en formas monomericas de SOD1, o en cualquier forma de SOD1 que este mal plegada o sea no nativa. Los epftopos que se han identificado como selectivamente accesibles en SOD1 no nativa comprenden los siguientes tramos de aminoacidos de hSOD1:

RLACGVIGI (SEQ ID NO: 1 en SOD1 SEQ ID NO: 17 restos 143-151) DLGKGGNEESTKTGNAGS (SEQ ID NO:

2 en SOD1 SEQ ID NO: 17 restos 125-142);

NPLSRKHGGPKDEE; (SEQ ID NO: 3 en SOD1 SEQ ID NO: 17 restos 65-78);

IKGLTEGLHGF (SEQ ID NO: 5 en SOD1 SEQ ID NO: 17 restos 35-42);

HCIIGRTLVVH (SEQ ID NO: 6 en SOD1 SEQ ID NO: 17 restos 110-120);

KAVCVLK (SEQ ID NO: 4 en SOD1 SEQ ID NO: 17 restos 3-9); y

GLHGFHVH (SEQ ID NO: 7 en SOD1 SEQ ID NO: 17 restos 41-48)

Para servir como inmunogeno util para inmunoterapia activa o para crear anticuerpos para su uso, por ejemplo, en inmunoterapia pasiva, el peptido incorpora de forma deseable un mfnimo de aproximadamente 3, 4, 5, 6 o 7 restos del epftopos especffico de enfermedad de SOD1. En una realizacion, el peptido aislado correspondiente a un epftopo comprende de forma deseable al menos 8 restos de SOD1. El peptido se acomodara dentro de un tramo de SOD1 que es de menos de 20 restos. Se describe el uso de peptidos que comprenden una parte aun mas grande de SOD1, posiblemente produciendo multiples anticuerpos, que requiere la seleccion de aquellos que se unen selectivamente a un epftopo caracterfstico de SOD1 mal plegada.

Las secuencias de SOD1 utiles para abordarse de acuerdo con la presente descripcion incluyen las regiones de hSOD1 que incorporan los restos 3-9, los restos 35-45, los restos 41-48, los restos 65-78, los restos 125-142, los restos 143-151 y los restos 145-151. Como se aprecia, dicha secuencia peptfdica correspondiente a epftopos de SOD1 mal plegada puede truncarse para incorporar un mfnimo de cualquiera de 5, 6 o 7 restos de las regiones indicadas. Por ejemplo, DSE1 que tiene la secuencia RLACGVIGI, puede truncarse retirando los primeros dos aminoacidos "RL". Ademas, estas regiones pueden ampliarse, como se indica, para incorporar restos de SOD1 flanqueantes adicionales hasta una cantidad maxima de restos que impacte de alguna manera en el equilibrio

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deseado entre el coste de la produccion de peptido o vacuna y la especificidad deseada y otras propiedades del anticuerpo resultante.

En una descripcion, el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de enfermedad comprende todo o parte de la secuencia de un peptido aislado seleccionado del grupo que cosiste en los peptidos de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Los peptidos correspondientes a estos epftopos pueden comprender adicionalmente restos de aminoacido adicionales no de SOD1 particularmente en los extremos N y C-terminales de los mismos, que puede ser utiles en la conjugacion del peptido con un agente util, por ejemplo, para provocar una respuesta inmunitaria, o un agente que sirve como marca util en la produccion del peptido o para controlar su presencia. Por ejemplo, el peptido puede comprender adicionalmente un resto Cys N-terminal para ayudar con el acoplamiento a kLh o similares. El peptido puede comprender adicionalmente uno, dos, tres o mas restos de glicina flanqueantes, o una combinacion de glicina/serina o de glicina/lisina tal como GSG o GGKG, para mejorar la respuesta inmunitaria aumentando la longitud del peptido sin cambiar la especificidad de los anticuerpos que se forman. El peptido correspondiente al epftopo puede comprender adicionalmente un enlazador eficaz para acoplar el peptido en tandem con otra copia del mismo peptido o uno diferente correspondiente al mismo epftopo o uno diferente. Como alternativa, el peptido correspondiente a un epftopo puede comprender adicionalmente una marcad de polihistidina o Flag. En otra realizacion, los peptidos pueden comprender aminoacidos adicionales que potencian la inmunogenicidad o solubilidad del peptido. En una realizacion, el numero de aminoacidos adicionales es de 1 a aproximadamente 10, preferiblemente de 1 a 8, mas preferiblemente de 1 a 5. De forma importante, los restos adicionales no afectan de forma material a la conformacion del peptido. En una descripcion, el peptido aislado correspondiente al epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica comprende 6 aminoacidos adicionales y comprende la secuencia GGRLACGVIGIGGKG. En otra descripcion, el peptido aislado correspondiente al epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica comprende 4 aminoacidos adicionales y comprende la secuencia GGRLACGVIGIAQ.

En una descripcion, las secuencias de aminoacidos analogas del peptido aislado correspondiente a epftopos especfficos de enfermedad presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 tfpicamente tienen al menos: el 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de identidad de secuencia con las secuencias anteriores. En otra descripcion, las secuencias de aminoacidos analogas del peptido aislado correspondiente a epftopos especfficos de ALS, epftopos especfficos de PD o epftopos especfficos de AD tiene al menos: el 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de identidad de secuencia con las secuencias anteriores. La expresion "identidad de secuencia" como se usa en este documento se refiere al porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias polipeptfdicas. Para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptfdicas, se alinean las secuencias de aminoacidos de esas dos secuencias, preferiblemente usando el algoritmo Clustal W (9), junto con la matriz de valores BLOSUM 62 (10) y una penalizacion por abertura de hueco de 10 y una penalizacion por extension de hueco de 0,1, de modo que se obtenga la coincidencia de mayor orden entre dos secuencias donde al menos el 50 % de la longitud total de una de las secuencias esta implicada en la alineacion. Otros metodos que pueden usarse para alinear secuencias son el metodo de alineacion de Needleman y Wunsch (11), revisado por Smith y Waterman (12) de modo que se obtenga la coincidencia de mayor orden entre las dos secuencias y se determine la cantidad de aminoacidos identicos entre las dos secuencias. Otros metodos para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos estan generalmente reconocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, aquellos descritos por Carillo y Lipton (13) y aquellos descritos en Computational Molecular Biology (14). En lfneas generales, se emplearan programas informaticos para dichos calculos. Los programas informaticos que pueden usarse a este respecto incluyen, aunque sin limitacion, GCG (15) BLASTP, BLASTN y FASTA (16).

Por tanto, aunque las dianas epitopicas preferidas comprenden la secuencia que se encuentra en hSOD1, se describen analogos de estas secuencias epitopicas que, como se ha indicado anteriormente, incluyen derivados, extensiones, truncamientos, aminoacidos modificados y similares. Dichas formas de los peptidos aislados correspondientes a epftopos especfficos de enfermedad estan abarcadas por el termino "analogos". Dichos analogos tambien son utiles para crear anticuerpos que se uniran a los epftopos presentes en SOD mal plegada o monomerica, por ejemplo, a uno de los siete epftopos identificados anteriormente en este documento.

Por tanto, respecto a los epftopos preferidos identificados anteriormente, los peptidos aislados utiles correspondientes a analogos epitopicos, incluyen peptidos aislados que comprenden, aunque sin limitacion:

Para RLACGVIGI:

truncamiento N-terminal de R o RL; extension N-terminal con G o GG o acetil-GG y/o extension C-terminal

con G, GG, GGK o GGKG, por ejemplo, para llegar a acetil-RLACGVIVIVGGKG; con o sin oxidacion de C

para producir acido cisteico, para llegar a AC*GVIVIVG, incluyendo CGGGRLAC*GVIGIGSG;

RLAC*GVIGIGSG y CRLAC*GVIGIGSG; (donde C* indica acido cisteico)

Para DLGKGGNEESTKTGNAGS;

truncamiento N-terminal de D, DL, DLG, DLGK y/o truncamiento C-terminal de S, GS, AGS, NAGS; extension

N-terminal con C o con G, GG o GGG; extension C-terminal con G, GG, GS o GSG; por ejemplo para llegar a

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CDLGKGGNEESTKTGNAGS, con o sin modificacion interna por carbonilacion de uno o dos restos de K, por ejemplo; e incluyendo peptidos tales como LGKGGNEESTKTGNAGS, DLGKGGNEESTKTGNAG, GKGGNEESTKTGNAGS, DLGKGGNEESTKTGNA, KGGNEESTKTGNAGS, DLGKGGNEESTKTGN, GGNEESTKTGNAGS, DLGKGGNEESTKTG, LGKGGNEESTKTGNAG, GKGGNEESTKTGNA, o KGGNEESTKTGN.

Para NPLSRKHGGPKDEE;

truncamiento N-terminal de N, NP, NPL y/o truncamiento C-terminal de E, EE, DEE; extension N-terminal con C o con G, GG o GGG; extension C-terminal con G, GG, GS o GSG; por ejemplo para llegar a CNPLSRKHGGPKDEE, con o sin modificacion interna por carbonilacion de uno o dos restos de H, por ejemplo;

Para IKGLTEGLHGF;

adicion N-terminal de C, para llegar a CIKGLTEGLHGF Y para HCIIGRTLVVH;

truncamiento N-terminal de H o HC y/o truncamiento C-terminal de H, o VH, extension N-terminal para incluir la secuencia de SOD en los restos 109 o 108/109 y/o para incluir G, GG, o GGG y/o extension C-terminal por uno o dos restos de SOD tales como los restos 121 o 121/122, por ejemplo para llegar a GGGHCIIGRTLVVHGSG.

Los ejemplos de los peptidos descritos anteriormente se resumen en la Tabla 2A Tabla 2A. Peptidos aislados de DSE y analogos

ACGVIGI (SEQ ID NO: 9, analogo de DSE1);

Ac-GG-RLACGVIG-GGKG (SEQ ID NO: 10, analogo de DSE1);

CDLGKGGNEESTKTGNAGS (SEQ ID NO: 11, analogo de DSE2);

CNPLSRKHGGPKDEE (SEQ ID NO: 12; analogo de DSE3);

CIKGLTEGLHGF (SEQ ID NO: 14, analogo de DSE5);

RLA[Acido cisteico]GVIGI (SEQ ID NO: 8, DSE1a);

A[Acido cisteico]GVIGI (SEQ ID NO: 13, analogo de DSE1a);

C-GGG-RLA[Acido cisteico]GVIGI-GSG (SEQ ID NO: 15, analogo de DSE1a); y GSGKAVCLK (SEQ ID NO: 16,

analogo de DSE4).

Como se ha indicado anteriormente, se describe un epftopo de DSE1, un peptido aislado correspondiente al epftopo y un anticuerpo dirigido contra el epftopo. Los experimentos caracterizaron adicionalmente DSE1. Los inventores prepararon anticuerpos dirigidos contra epftopos encontrados en formas no nativas de SOD1. Los inventores detectaron SOD1 mal plegada de los tejidos medulares de modelos de raton de ALS G85R, G93A y G37R por inmunoprecipitacion usando el anticuerpo contra SED1. Los inventores tambien detectaron SOD1 mal plegada en secciones medulares de modelos de raton de ALS G93A, G37R y de un paciente humano con ALS, usando el anticuerpo contra SED1 como sonda. Los inventores usaron SED1 para determinar la localizacion subcelular de SOD1 mal plegada donde se determino que el sitio principal de deposicion de SOD1 mal plegada es las mitocondrias vacuoladas dentro de las neuronas motoras del asta ventral. Ademas, se detecto SOD1 mal plegada en las fracciones de medula espinal tanto mitocondrial como citoplasmatica, pero se inmunoprecipitaron solamente cantidades minoritarias de fracciones similares de tejidos de hfgado y cerebro del raton G93A. En ratones G85R, SOD1 mal plegada estaba enriquecido en mitocondrias de medula espinal y cerebro en comparacion con la cantidad recuperada del citosol. Los inventores tambien demostraron que SOD1 mal plegada estaba inicialmente ausente, pero se detectaba antes de la aparicion de la enfermedad y se correlaciona con perdida de neuronas motoras en ratones del modelo de ALS.

En el caso donde el peptido aislado correspondiente a un epftopo per se o su analogo no es suficientemente inmunogenico, incluso cuando se administra con adyuvantes convencionales, el peptido aislado o el analogo peptfdico aislado puede administrarse en forma de un "inmunogeno", en que el peptido aislado correspondiente al epftopo o a los analogos se fusiona a o se conjuga con un agente que potencia la inmunogenicidad del peptido. Por tanto, la inmunogenicidad o eficacia de la composicion para tratar la esclerosis lateral amiotrofica, la enfermedad de Alzheimer y/o la enfermedad de Parkinson o para provocar una respuesta inmunitaria tambien puede potenciarse conjugando el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de enfermedad (por ejemplo, tal como un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica) directamente, tal como a traves de un enlace amida, o indirectamente a traves de un enlazador qufmico tal como carbodiimida o cualquier secuencia espaciadora peptfdica tal como una glicina o una secuencia de glicina-serina incluyendo Gly-4-S, a una molecula que potencia la inmunogenicidad del peptido correspondiente al epftopo. Por ejemplo, un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica puede conjugarse con el antfgeno MAP, o hemocianina de lapa californiana (KLH). KLH es una protefna respiratoria encontrada en moluscos. Su gran tamano la hace muy inmunogenica, y la gran cantidad de restos de lisina disponibles para la conjugacion la hacen muy util para unirse a un polipeptido, tal como un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica.

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La conjugacion de KLH puede hacerse a traves de restos de Cys N-terminales anadidos al peptido aislado correspondiente al epftopo, si no hay otro sitio conveniente disponible en el peptido para la conjugacion con KLH.

Por tanto, la composicion para provocar una respuesta inmunitaria puede comprender un inmunogeno. Un "inmunogeno", como se usa en este documento, significa una sustancia que provoca una respuesta inmunitaria y/o causa produccion de un anticuerpo. Ademas de los peptidos aislados, los conjugados y fusiones descritas en este documento, son utiles peptido mimeticos que provocan anticuerpos de reaccion cruzada contra epftopos especfficos de enfermedad de SOD1 (vease 82).

Un experto en la materia apreciara que puede haber otros epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1, tales como otros epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, otros epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer y/u otros epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson. Por ejemplo, otros epftopos especfficos de enfermedad pueden identificarse usando el ensayo de proteccion de epftopos descrito en el documento WO 2005/019828. En otro ejemplo, otros epftopos especfficos de enfermedad pueden identificarse el metodo descrito en Khare et al. (8). Ademas, los epftopos utiles pueden identificarse como aquellos que se presentan selectivamente en SOD1 que esta desnaturalizada o en SOD1 que esta sometida a condiciones desnaturalizantes tales como agentes caotropicos, calor, pH extremos o detergentes conocidos para los expertos en la materia, o tratada de otro modo para inducir la adopcion de una conformacion mal plegada, respecto a una SOD1 de control a pH neutro.

Se describe un metodo de identificacion de epftopos especfficos de enfermedad en protefnas no nativas asociadas a enfermedad. El fundamento de la seleccion de epftopos especfficos de enfermedad se basa en varias consideraciones. Los epftopos peptfdicos lineales seleccionados deben estar ocultos en un estado inaccesible al anticuerpo en la isoforma normal de la protefna diana, pero deben estar expuestos en la superficie de la isoforma mal plegada patologica de modo que los epftopos peptfdicos lineales puedan unirse por un anticuerpo especffico para el epftopo normalmente ocultado. Otras consideraciones incluyen el papel predicho o definido de forma experimental del epftopo especffico definido en la formacion de agregados, y la longitud e inmunogenicidad adecuadas de un peptido correspondiente al epftopo como una diana para inmunizacion o inmunoterapia. Los epftopos especfficos de enfermedad optimos se benefician de la seguridad de la respuesta inmunitaria contra un antfgeno no nativo, con minimizacion de autoinmunidad y la eficacia comparativa de regfmenes de adyuvante mfnimo para vacunas terapeuticas. Los epftopos especfficos de enfermedad optimos tambien se benefician de la eficacia de la neutralizacion e inhibicion de la actividad toxica y dirigida por molde de protefnas mal plegadas por union de anticuerpos. La neutralizacion tambien puede acelerar la degradacion de las especies proteicas mal plegadas por sistemas tales como el sistema retfculo-endotelial y por las celulas efectoras inmunitarias del SNC residentes tales como microglia.

Composiciones que comprenden epftopos para tratar enfermedades neurodegenerativas mediadas por SOD1

Se describe una composicion para tratar la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en una forma no nativa de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, tal como uno farmaceuticamente aceptable. La expresion "peptido aislado" se refiere al peptido que se ha producido, por ejemplo, por tecnicas recombinantes o sinteticas, y se ha retirado de la fuente que produjo el peptido, tal como celulas recombinantes o reactivos residuales de sfntesis peptfdica. El peptido aislado esta opcionalmente "purificado", que significa al menos: un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % de pureza y opcionalmente pureza de calidad farmaceutica.

Un "peptido aislado correspondiente a un epftopo", como se usa en este documento, se refiere al peptido producido que comprende el epftopo o una region del epftopo y es igual o similar en secuencia a un epftopo especffico de enfermedad en SOD1 no nativa. "Epftopo" se usa opcionalmente para hacer referencia al peptido aislado producido que corresponde al epftopo en SOD1 presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1.

En el caso donde el peptido aislado correspondiente al epftopo especffico de enfermedad, per se no es suficientemente inmunogenico, incluso cuando se administra con adyuvantes convencionales, el peptido aislado puede administrarse en forma de un inmunogeno, en que el peptido aislado esta fusionado a o conjugado con un agente que potencia la inmunogenicidad de dicho peptido. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en una forma no nativa de SOD1, que comprende todo o parte de un peptido aislado de la Tabla 2 o de la Tabla 2A mencionado anteriormente en este documento.

Como se usa en este documento, la propiedad de inhibir o reducir la formacion de agregados de SOD1 se revela como una reduccion en la tasa de formacion, cantidad o tamano de agregados neurotoxicos de SOD1, como se revela usando ensayos establecidos para este proposito, y como se ejemplifica en este documento.

Se describe una composicion util para tratar la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, tal como uno farmaceuticamente aceptable, tal como vehfculos

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farmaceuticamente aceptables. En otras descripciones, el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica comprende la secuencia de un peptido aislado de la Tabla 2 o de la Tabla 2A mencionado anteriormente.

Como se usa en este documento, la expresion "tratar la esclerosis lateral amiotrofica", como se usa en este documento, incluye inhibir la enfermedad, prevenir la enfermedad o reducir los sfntomas asociados con la enfermedad.

Composiciones que comprenden epftopos para provocar respuestas inmunitarias

Se describe una composicion para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende una cantidad eficaz de un epftopo aislado presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. Se describe el epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, que comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislado de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describe una composicion para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende una cantidad eficaz de un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, donde el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

La expresion "provocar una respuesta inmunitaria" se define como iniciar, desencadenar, causar, potenciar, mejorar o aumentar cualquier respuesta del sistema inmunitario, por ejemplo, de naturaleza humoral o mediada por celulas. El inicio o potenciacion de una respuesta inmunitaria puede evaluarse usando ensayos conocidos para los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitacion, ensayos de anticuerpos (por ejemplo, ensayos ELISA), ensayos de citotoxicidad especfficos de antfgeno y la produccion de citoquinas (por ejemplo, ensayos ELISPOT).

La composicion para provocar una respuesta inmunitaria puede comprender un inmunogeno. Un "inmunogeno", como se usa en este documento significa una sustancia que provoca una respuesta inmunitaria y/o causa la produccion de un anticuerpo. Se describe el inmunogeno que comprende un peptido aislado seleccionado de los peptidos aislados proporcionados en la Tabla 2 o en la Tabla 2A. Se describe el peptido aislado que se conjuga a un vehfculo adecuado tal como KLH. Ademas de los peptidos aislados descritos en este documento, son utiles peptido mimeticos que provocan anticuerpos de reactividad cruzada contra epftopos especfficos de enfermedad de SOD1. El termino "animal" o "sujeto", como se usa en este documento, incluye todos los miembros del reino de animales incluyendo mamfferos, preferiblemente seres humanos.

Como se usa en este documento, la expresion "cantidad eficaz" significa una cantidad eficaz, a dosificaciones y periodos de tiempo necesarios para conseguir un resultado deseado. Las cantidades eficaces pueden variar de acuerdo con factores tales como la patologfa, edad, genero, peso del animal. El regimen de dosificacion puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapeutica optima.

Composiciones farmaceuticas que comprenden peptidos aislados correspondientes a epftopos especfficos de enfermedad

Las composiciones descritas en este documento pueden prepararse por metodos conocidos per se para la preparacion de composiciones farmaceuticamente aceptables que pueden administrarse a sujetos, opcionalmente como una vacuna, de modo que se combine una cantidad eficaz de la sustancia activa en una mezcla con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Los vehfculos adecuados se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (17). En esta base, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias en asociacion con uno o mas vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables, y contenidas en soluciones tamponadas con un pH adecuado e iso-osmoticas con los fluidos fisiologicos.

Las composiciones farmaceuticas incluyen, sin limitacion, polvos liofilizados o soluciones o suspensiones inyectables esteriles acuosas o no acuosas, que pueden contener adicionalmente antioxidantes, tampones, bacteriostaticos u solutos que vuelven a las composiciones sustancialmente compatibles con los tejidos o con la sangre de un destinatario pretendido. Otros componentes que pueden estar presentes en dichas composiciones incluyen agua, tensioactivos (tales como Tween), alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las soluciones y suspensiones de inyeccion improvisada pueden prepararse a partir de polvos esteriles, granulos, comprimidos o soluciones o suspensiones concentradas. La composicion puede suministrarse, por ejemplo, pero a modo de limitacion, como un polvo liofilizado que se reconstituye con agua esteril o solucion salina antes de su administracion al paciente.

Las composiciones farmaceuticas pueden comprender un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Los vehfculos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen esencialmente composiciones qufmicamente inertes y no toxicas que no interfieren con la eficacia de la actividad biologica de la composicion farmaceutica. Ejemplos de vehfculos

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farmaceuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitacion, agua, soluciones salinas, soluciones de glicerol, etanol, cloruro de N-(1(2,3-dioleiloxi)propil)N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), diolesilfosfatidil-etanolamina (DOPE), y liposomas. Dichas composiciones deben contener una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto, junto con una cantidad adecuada de vehfculo para proporcionar la forma para administracion directa al paciente.

La composicion puede estar en forma de una sal farmaceuticamente aceptable que incluye, sin limitacion, aquellas formadas con grupos amino libres tales como los derivados de acido clorhfdrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de hidroxido de sodio, potasio, amonio, calcio, ferrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procafna, etc.

La inmunogenicidad puede mejorarse significativamente si el agente o agentes inmunizantes o inmunogenos (por ejemplo, peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica o una fusion o conjugado del mismo con un agente inmunopotenciador) y/o composicion se co-inmuniza, independientemente del formato de administracion, con un adyuvante. Habitualmente, se usan adyuvantes como una solucion al 0,05 al 1,0 % en solucion salina tamponada con fosfato. Los adyuvantes potencian la inmunogenicidad de un inmunogeno pero no son necesariamente inmunogenicos en si mismos. Los adyuvantes pueden actuar reteniendo el inmunogeno de forma local cerca del sitio de administracion para producir un efecto de deposito que facilita una liberacion lenta y sostenida del inmunogeno a las celulas del sistema inmunitario. Los adyuvantes tambien pueden atraer a celulas del sistema inmunitario hasta un deposito de inmunogeno y estimulan dichas celulas para provocar respuestas inmunitarias. Por tanto, realizaciones de esta invencion abarcan composiciones que comprenden adicionalmente adyuvantes.

Se han usado adyuvantes durante muchos anos para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedador para, por ejemplo, vacunas. Los adyuvantes intrfnsecos (tales como lipopolisacaridos) normalmente son los componentes de bacterias muertas o atenuadas usadas como vacunas. Los adyuvantes extrfnsecos son inmunomoduladores que se unen tfpicamente de forma no covalente a antfgenos y se formulan para potenciar las respuestas inmunitarias del hospedador. Por tanto, se han identificado adyuvantes que potencian la respuesta inmunitaria contra antfgenos suministrados de forma parenteral. Algunos de estos adyuvantes son toxicos, sin embargo, y pueden causar efectos secundarios indeseables haciendolos inadecuados para su uso en seres humanos y para muchos animales. De hecho, solamente el hidroxido de aluminio, el sulfato de aluminio y el fosfato de aluminio (mencionados habitualmente de forma colectiva como alumbre) se usan rutinariamente como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. Puede usarse alumbre con agentes inmunoestimuladores tales como MPL o 3-DMP; QS21; y aminoacidos monomericos o polimericos tales como acido poliglutamico o polilisina. La eficacia del alumbre en respuestas crecientes de anticuerpos contra toxoide difterico y tetanico esta bien establecida. No obstante, tienen limitaciones. Por ejemplo, el alumbre es ineficaz para vacunacion contra la gripe y provoca de forma incoherente una respuesta inmunitaria mediada por celulas con otros inmunogenos. Los anticuerpos provocados por antfgenos con adyuvante de alumbre son principalmente del isotipo IgG1 en ratones, que puede no ser optimo para la proteccion por algunos agentes de vacuna.

Una amplia gama de adyuvantes extrfnsecos puede provocar respuestas inmunitarias potentes contra inmunogenos. Estos incluyen saponinas tales como Stimulons (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) o partfculas generadas a partir de las mismas tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores) e ISCOMATRIX, en complejo con antfgenos proteicos de membrana (complejos inmunoestimuladores), polfmeros Pluronic con aceite mineral, micobacterias muertas y aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacterianos tales como muramil dipeptido (MDP) y lipopolisacarido (LPS), asf como lfpido A y liposomas.

En un aspecto de esta invencion, los adyuvantes utiles en cualquiera de las realizaciones de la invencion descrita en este documento son los siguientes. Los adyuvantes para inmunizacion parenteral incluyen compuestos de aluminio (tales como hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio e hidroxifosfato de aluminio). El antfgeno puede precipitarse con, o adsorberse sobre, el compuesto de aluminio de acuerdo con protocolos convencionales. Tambien pueden usarse otros adyuvantes tales como RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT) en administracion parenteral.

Los adyuvantes para inmunizacion a la mucosa incluyen toxinas bacterianas (por ejemplo, la toxina colerica (CT), la toxina termo-inestable (LT) de E. coli, la toxina A de Clostridium difficile y la toxina pertussis (PT), o combinaciones, subunidades, toxoides o mutantes de las mismas). Por ejemplo, puede ser util una preparacion purificada de la subunidad B de la toxina colerica nativa (CTB). Tambien son adecuados fragmentos, homologos, derivados y fusiones con cualquiera de estas toxinas, con la condicion de que retengan la actividad adyuvante. Preferiblemente, se usa un mutante que tiene toxicidad reducida. Se han descrito mutantes adecuados (por ejemplo, en el documento WO 95/17211 (mutante Arg-7-Lys CT), en el documento WO 96/6627 (mutante Arg-192-Gly LT), y en el documento WO 95/34323 (mutante Arg-9-Lys y Glu-129-Gly PT)). Mutantes adicionales de LT que pueden usarse en los metodos y composiciones de la invencion incluyen, por ejemplo, mutantes Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp, y Glu-112-Asp. Otros adyuvantes (tales como monofosforil lfpido A (MPLA) bacteriano de diversas fuentes (por ejemplo, E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium, o Shigella flexneri, saponinas, o microesferas de polilactido glicolido (PLGA)) tambien pueden usarse en administracion a la mucosa.

Otros adyuvantes incluyen citoquinas tales como interleuquinas, por ejemplo, IL-1, IL-2 e IL-12, quimioquinas, por

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ejemplo, CXCL10 y CCL5, factor estimulador de macrofagos y/o factor de necrosis tumoral. Otros adyuvantes que pueden usarse incluyen oligonucleotidos CpG (Davis. Curr Top Microbiol Immunol., 247:171-183, 2000).

Las emulsiones de aceite en agua incluyen escualeno; aceite de cacahuete; MF59 (documento WO 90/14387); SAF (Syntex Laboratories, Palo Alto, Calif.); y Ribi™ (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.). Las emulsiones de aceite en agua pueden usarse con agentes inmunoestimuladores tales como muramil dipeptidos (por ejemplo, N- acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), -acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N- acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-di-palmitoxi propilamida (DTP-DPP) teramida (TM)), u otros componentes de la pared celular bacteriana.

Los adyuvantes utiles para inmunizacion a la mucosa y parenteral incluyen polifosfazeno (por ejemplo, documento WO 95/2415), DC-chol (3 b-(N-(N',N'-dimetil aminometano)-carbamoil) colesterol (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.283.185 y documento WO 96/14831) y QS-21 (por ejemplo, documento WO 88/9336).

Un adyuvante puede acoplarse a un inmunogeno para administracion (Livingston. J Immunol., 159: 1383-1392, 1997). Por ejemplo, puede acoplarse directamente un lfpido tal como acido palmftico a uno o mas peptidos de modo que el cambio en la conformacion de los peptidos que comprenden el inmunogeno no afecte a la naturaleza de la respuesta inmunitaria contra el inmunogeno.

La eleccion de un adyuvante puede depender de varios factores, incluyendo la via de administracion, la eficacia del adyuvante, el regimen de dosificacion, la estabilidad de la vacuna que contiene al adyuvante y la especie que se esta vacunando. El adyuvante puede administrarse con un inmunogeno como una composicion individual. Ademas, puede administrarse un adyuvante antes, de forma concurrente con o despues de la administracion del inmunogeno.

La inmunogenicidad o eficacia de la composicion para tratar la esclerosis lateral amiotrofica, la enfermedad de Alzheimer y/o la enfermedad de Parkinson o provocar una respuesta inmunitaria tambien puede potenciarse conjugando el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de enfermedad (por ejemplo, tal como un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica) directamente, tal como a traves de un enlace amida, o indirectamente a traves de un enlazador qufmico tal como carbodiimida o cualquier secuencia espaciadora peptfdica tal como una secuencia de glicina o glicina-serina incluyendo Gly4-S, a una molecula que potencia la inmunogenicidad del epftopo. Por ejemplo, un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica puede conjugarse a hemocianina de lapa californiana (KLH). KLH es una protefna respiratoria encontrada en moluscos. Su gran tamano la hace muy inmunogenica, y la gran cantidad de restos de lisina disponibles para conjugacion la hacen muy util para su fijacion a una protefna, tal como un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica.

Se encuentran otras directrices sobre la tecnica de vacunacion de peptidos en el trabajo que muestra que un epftopo especffico de enfermedad para la protefna de prion mal plegada (6) proporciona una diana para celulas de neuroblastoma infectadas de priones in vitro (7), y que la vacunacion de peptidos de ratones con este epftopo es protectora contra la inoculacion de priones infecciosos.

Los peptidos aislados correspondientes a los epftopos o a los analogos de los mismos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1, incluyendo epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, especfficos de enfermedad de Alzheimer o especfficos de enfermedad de Parkinson se preparan facilmente usando una diversidad de metodos conocidos para los expertos en la materia. Por consiguiente, los peptidos que corresponden a epftopos especfficos de enfermedad tales como epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica pueden prepararse por sfntesis qufmica usando tecnicas bien conocidas en la qufmica de protefnas, tales como sfntesis en fase solida (18) o sfntesis en solucion homogenea (19).

Los peptidos correspondientes a los epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1, incluyendo epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, especfficos de enfermedad de Alzheimer o especfficos de enfermedad de Parkinson tambien producirse por tecnologfa de ADN recombinante. Para preparar peptidos correspondientes a los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica por tecnicas de ADN recombinante, debe prepararse una secuencia de ADN que codifica el peptido correspondiente al epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica. Por consiguiente, se describe el uso de acidos nucleicos purificados y aislados que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica para tratar la esclerosis lateral amiotrofica o para provocar una respuesta inmunitaria.

En una descripcion, la secuencia de acido nucleico que codifica los peptidos correspondientes a epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1, se incorpora en un vector de expresion adaptado para transfeccion o transformacion de una celula hospedadora. En otra descripcion, la secuencia de acido nucleico que codifica los peptidos correspondientes a epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica se incorpora en un vector de expresion adaptado para transfeccion o transformacion de una celula hospedadora. Las moleculas de acido nucleico pueden incorporarse de un modo conocido en un vector de expresion apropiado que asegura la expresion de la protefna. Los posibles vectores de expresion incluyen, aunque sin limitacion, cosmidos,

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plasmidos o virus modificados (por ejemplo, retrovirus deficientes en replicacion, adenovirus y virus adenoasociados). El vector debe ser compatible con la celula hospedadora usada. Los vectores de expresion son "adecuados para transformacion de una celula hospedadora", lo que significa que los vectores de expresion contienen una molecula de acido nucleico que codifica los peptidos correspondientes a epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1, incluyendo epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer y epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson, y secuencias reguladoras seleccionadas basandose en las celulas hospedadoras a usarse para la expresion, que estan unida de forma funcional a la molecula de acido nucleico. "Unido de forma funcional" pretende indicar que el acido nucleico esta unido a secuencias reguladoras de un modo que permite la expresion del acido nucleico.

Las secuencias reguladoras adecuadas pueden obtenerse de una diversidad de fuentes, incluyendo genes bacterianos, fungicos, vfricos, de mamffero o de insecto (por ejemplo, veanse las secuencias reguladoras descritas en Goeddel (20). La seleccion de secuencias reguladoras apropiadas depende de la celula hospedadora elegida como se analiza a continuacion, y puede conseguirse facilmente por los expertos en la materia. Ejemplos de dichas secuencias reguladoras incluyen: un promotor y potenciador de la transcripcion o secuencia de union a ARN polimerasa, una secuencia de union al ribosoma, incluyendo una senal de inicio de la traduccion. Adicionalmente, dependiendo de la celula hospedadora elegida y del vector empleado, pueden incorporarse otras secuencias, tales como un origen de replicacion, sitios de restriccion de ADN adicionales, potenciadores y secuencias que confieren capacidad de induccion de la transcripcion en el vector de expresion.

Los vectores de expresion recombinantes tambien pueden contener un gen marcador que facilita la seleccion de celulas hospedadoras transformadas o transfectadas con una molecula recombinante descrita en este documento. Ejemplos de genes marcadores de seleccion son genes que codifican una protefna tal como G418 e higromicina que confieren resistencia a ciertos farmacos, p-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, luciferasa de luciernaga o una inmunoglobulina o parte de la misma tal como la parte Fc de una inmunoglobulina preferiblemente IgG. La transcripcion del gen marcador de seleccion se controla por cambios en la concentracion de la protefna marcadora de seleccion tal como p-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa o luciferasa de luciernaga. Si el gen marcador de seleccion codifica una protefna que confiere resistencia a antibioticos tal como resistencia a neomicina, las celulas transformantes pueden seleccionarse con G418. Las celulas que han incorporado el gen marcador de seleccion sobreviviran, mientras que las otras celulas moriran. Esto hace posible visualizar y ensayar la expresion de vectores de expresion recombinantes descritos en este documento y en particular para determinar el efecto de una mutacion sobre la expresion y fenotipo. Se apreciara que los marcadores de seleccion pueden introducirse en un vector diferente del acido nucleico de interes.

Los vectores de expresion recombinantes pueden introducirse en celulas hospedadoras para producir una celula hospedadora transformante. La expresion "celula hospedadora transformante" pretende incluir celulas procariotas y eucariotas que se han transformado o transfectado con un vector de expresion recombinante que codifica los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica. Las expresiones "transformado con", "transfectado con", "transformacion" y "transfeccion" pretenden abarcar la introduccion de acido nucleico (por ejemplo, un vector) en una celula por una de muchas posibles tecnicas conocidas en la tecnica. Las celulas procariotas pueden transformase con acido nucleico por, por ejemplo, electroporacion o transformacion mediada por cloruro de calcio. El acido nucleico puede introducirse en celulas de mamffero mediante tecnicas convencionales tales como co-precipitacion con fosfato de calcio o con cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofectina, electroporacion o microinyeccion. Los metodos adecuados para transformar y transfectar celulas hospedadoras pueden encontrarse en Sambrook et al. (21), y otros libros de texto de laboratorio.

Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen una amplia diversidad de celulas hospedadoras procariotas y eucariotas. Por ejemplo, las protefnas de la invencion pueden expresarse en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de insecto (usando baculovirus), celulas de levadura o celulas de mamffero. Otras celulas hospedadoras adecuadas pueden encontrarse en Goeddel (20).

Mas particularmente, las celulas hospedadoras bacterianas adecuadas incluyen E. coli, B. subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro del genero Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, asf como muchas otras especies bacterianas bien conocidas para los expertos en la materia. Los vectores de expresion bacterianos adecuados preferiblemente comprenden un promotor que funciona en la celula hospedadora, uno o mas marcadores fenotfpicos de seleccion y un origen bacteriano de replicacion. Los promotores representativos incluyen el sistema promotor de p-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (vease Chang et al. (22)), el promotor trp (23) y promotor tac (24). Los marcadores de seleccion representativos incluyen diversos marcadores de resistencia a antibioticos tales como los genes de resistencia a canamicina o ampicilina. Los vectores de expresion adecuados incluyen, aunque sin limitacion, bacteriofagos tales como derivados de lambda o plasmidos tales como pBR322 (vease, Bolivar et al. (25)), los plasmidos pUC pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (vease, Messing (26) y Vieira y Messing (27)), y pNH8A, pNH16a, pNH18a, y Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, Calif.). Los vectores de expresion de fusion tfpicos que pueden usarse se han analizado anteriormente, por ejemplo, pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ejemplos de vectores de expresion no de fusion inducibles incluyen pT rc (28) y pET 11 d (29).

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Las celulas hospedadoras de levadura y fungicas adecuadas incluyen, aunque sin limitacion, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, los generos Pichia o Kluyveromyces y diversas especies del genero Aspergillus. Ejemplos de vectores para la expresion en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (30), pMFa (31), pJRY88 (32), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los protocolos para transformacion de levaduras y hongos son bien conocidos para los expertos en la materia (vease, Hinnen et al. (33); Itoh et al. (34), y Cullen et al. (35)).

Las celulas de mamffero adecuadas incluyen, entre otras: celulas COS (por ejemplo, ATCC N.° CRL 1650 o 1651), BHK (por ejemplo, ATCC N.° CRL 6281), CHO (ATCC N.° CCL 61), HeLa (por ejemplo, ATCC N.° CCL 2), 293 (ATCC N.° 1573) y NS-1. Los vectores de expresion adecuados para dirigir la expresion en celulas de mamffero generalmente incluyen un promotor (por ejemplo, derivado de material vfrico tal como polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 de simio), asf como otras secuencias del control de la transcripcion y la traduccion. Ejemplos de vectores de expresion en mamffero incluyen pCDM8 (36) y pMT2PC (37).

Dados los contenidos proporcionados en este documento, los promotores, terminadores y metodos para introducir vectores de expresion de un tipo apropiado en celulas de plantas, aves e insectos tambien pueden conseguirse facilmente. Por ejemplo, las protefnas descritas en este documento pueden expresarse a partir de celulas vegetales (vease, Sinkar et al. (38), que revisa el uso de vectores de Agrobacterium rhizogenes; vease tambien Zambryski et al. (39), que describe el uso de vectores de expresion de celulas vegetales, incluyendo, entre otros, pAS2022, pAS2023, y pAS2034).

Las celulas de insecto adecuadas incluyen celulas y lfneas celulares de especies Bombyx o Spodotera. Los vectores baculovfricos disponibles para la expresion de protefnas en celulas cultivadas de insecto (celulas SF 9) incluyen la serie pAc (40) y la serie pVL (41). Algunos sistemas de expresion de baculovirus-celulas de insecto adecuados para la expresion de protefnas recombinantes se describen en el documento PCT/US/02442.

Los vectores de expresion recombinantes que contienen las secuencias de nucleotidos que codifican el peptido correspondiente a epftopos presentados selectivamente o accesibles no nativas de SOD1, incluyendo epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer y epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson tambien pueden contener genes que codifican un resto de fusion (es decir, una "protefna de fusion") que proporciona expresion aumentada del peptido recombinante; y ayuda a la purificacion del peptido recombinante diana actuando como ligando en purificacion por afinidad. Por ejemplo, puede anadirse un sitio de escision proteolftico a la protefna recombinante diana para permitir la separacion de la protefna recombinante del resto de fusion despues de la purificacion de la protefna de fusion. Los vectores de expresion de fusion tfpicos incluyen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutation S-transferasa (GST), la protefna de union a maltosa E, o protefna A, respectivamente, a la protefna recombinante.

Composiciones de acido nucleico para tratar enfermedades neurodegenerativas mediadas por SOD1

Se describe una composicion para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende una cantidad eficaz de un acido nucleico que codifica un peptido correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, donde el peptido corresponde a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 seleccionados del grupo que consiste en los peptidos de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describen acidos nucleicos asilados que codifican los peptidos correspondientes a los epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1, incluyendo las siguientes moleculas de ARN, equivalentes de codones sinonimos de las mismas y sus equivalentes de ADN y complementos:

Para RLACGVIGI;

AGGUUAGCUUGUGGUGUUAUAGGUAUA (SEQ ID NO: 19).

Para DLGKGGNEESTKTGNAGS;

GAUUUAGGUAAAGGUGGUAAUGAAGAAAGUACUAAAACUGGUAAUGCUGGUAGU (SEQ ID NO: 20).

Para NPLSRKHGGPKDEE;

AAUCCUUUAAGUCGUAAACACGGAGGACCGAAGGACGAGGAG (SEQ ID NO: 21).

Para IKGLTEGLHGF;

AUAAAGGGGAAAACAGAAGGACUCCACGGCUUU (SEQ ID NO: 22).

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Para HCIIGRTLVVH;

CACUGUAUUAUUGGCAGGACCCUCGUUGUUCAC (SEQ ID NO: 23).

Otros acidos nucleicos utiles incluyen:

Para RLACGVIGI (DSE1: 143-151);

CGUUUGGCUUGUGGUGUAAUUGGGAUC (SEQ ID NO: 24).

Para ACGVIGI (DSE1: 145-151);

GCUUGUGGUGUAAUUGGGAUC (SEQ ID NO: 25).

Para DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2: 125-142);

GACUUGGGCAAAGGUGGAAAUGAAGAAAGUACAAAGACAGGAAACGCUGGAAGU (SEQ ID NO: 26).

Para NPLSRKHGGPKDEE (DSE3: 65-78);

AAUCCUCUAUCCAGAAAACACGGUGGGCCAAAGGAUGAAGAG (SEQ ID NO: 27).

Para KAVCVLK (DSE4: 3-9);

AAGGCCGUGUGCGUGCUGAAG (SEQ ID NO: 28).

Para IKGLTEGLHGF (DSE5: 35-45);

AUUAAAGGACUGACUGAAGGCCUGCAUGGAUUC (SEQ ID NO: 29).

Para HCIIGRTLVVH (DSE6: 110-120);

CAUUGCAUCAUUGGCCGCACACUGGUGGUCCAU (SEQ ID NO: 30).

Para GLHGFHVH (DSE7: 41-48);

GGCCUGCAUGGAUUCCAUGUUCAU (SEQ ID NO: 31).

Los acidos nucleicos se mencionan en este documento como "acidos nucleicos de la Tabla 2C".

Se describe una composicion para tratar la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto, que comprende una cantidad eficaz de un acido nucleico aislado que codifica un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica aislado en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, donde el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos de la Tabla 2 o de la Tabla A, o un analogo de los mismos.

Se describe una composicion para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende una cantidad eficaz de un acido nucleico aislado que codifica un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica aislado en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado, donde el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describen acidos nucleicos aislados que codifican los peptidos correspondientes a epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, incluyendo las siguientes moleculas de ARN, equivalentes de codones sinonimos de las mismas y sus equivalentes de ADN enumerados en los acidos nucleicos de la Tabla 2C.

Un experto en la materia apreciara que hay varios modos de administracion disponibles cuando se usa una composicion que contiene una molecula de acido nucleico aislada que codifica un peptido correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, incluyendo un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica aislado, un epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer aislado y un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson aislado. Las moleculas recombinantes descritas anteriormente pueden introducirse directamente en celulas o en tejidos in vivo usando vehfculos de suministro tales como vectores retrovfricos, vectores adenovfricos y vectores de virus ADN. Tambien pueden introducirse en celulas in vivo usando tecnicas ffsicas tales como microinyeccion y electroporacion o metodos qufmicos tales como co-precipitacion e incorporacion de ADN en liposomas. Las moleculas recombinantes tambien pueden suministrarse en forma de un aerosol o por lavado. Las moleculas de acido nucleico descritas en este documento tambien pueden aplicarse de

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forma extracelular, tal como por inyeccion directa en las celulas.

Metodo de tratamiento medico de la enfermedad usando acidos nucleicos

Los vectores que contienen las moleculas de acido nucleico descritas en este documento se administran opcionalmente al SNC de mamfferos, preferiblemente seres humanos, en terapia genica usando tecnicas descritas a continuacion. Los polipeptidos producidos a partir de las moleculas de acido nucleico se administran facilmente al SNC de mamfferos, preferiblemente seres humanos. La descripcion se refiere a un metodo de tratamiento medico de un mamffero, preferiblemente un ser humano, administrando al mamffero un vector de la invencion o una celula que contiene un vector descrito en este documento. Las enfermedades neurales tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y esclerosis lateral amiotrofica se tratan como se describe en esta solicitud o usando metodos conocidos en la tecnica (patentes de Estados Unidos n.° 7175840, 7157098, 7141044, 6.309.634; 6936594; solicitudes de Estados Unidos n.° 2006073119; 2004265283; 2002107213; 2006122116). Las enfermedades, tales como enfermedades hematologicas o enfermedades neurales (neurodegenerativas), se tratan como se describe en esta solicitud y se conoce en la tecnica. Las enfermedades nerviosas de celulas madre a tratarse por trasplante de celulas madre neurales incluyen enfermedades que provocan dano o perdida de celulas neurales, por ejemplo, paralisis, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ALS, esclerosis multiple. El vector de la invencion es util como marcador de celulas madre y para expresar genes que causan que las celulas madre se diferencien (por ejemplo, factor de crecimiento).

Metodos de tratamiento usando peptidos aislados correspondientes a epftopos especfficos de enfermedad

Un aspecto de la invencion es las composiciones de la invencion para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto que lo necesite.

Se describe un metodo de tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una composicion que comprende un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica, en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado.

Se describe el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica que comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Metodos de tratamiento usando acidos nucleicos aislados

Se describe un metodo de tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto un acido nucleico aislado que codifica un peptido correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. En ciertas descripciones, los acidos nucleicos comprenden acidos nucleicos seleccionados del grupo de acidos nucleicos de la Tabla 2C.

En una descripcion, el epftopo comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describe un metodo de tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una composicion que comprende un acido nucleico que codifica un peptido correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. En una descripcion, el acido nucleico comprende un acido nucleico seleccionado del grupo de acidos nucleicos de la Tabla 2C.

En una descripcion adicional, el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describe un metodo para tratar a un sujeto que tiene una afeccion, enfermedad o trastorno medico mediado por una forma mal plegada de la superoxido dismutasa (SOD), comprendiendo el metodo la etapa de administrar al sujeto una composicion que comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable y un agente seleccionado de (1) un anticuerpo que se une selectivamente a la forma mal plegada de SOD y/o (2) un inmunogeno que provoca la produccion de dicho anticuerpo por dicho sujeto, y/o (3) una secuencia de acido nucleico que codifica (1) o (2).

Metodos para provocar una respuesta inmunitaria usando un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de enfermedad

Las composiciones descritas pueden usarse para provocar una respuesta inmunitaria en un animal y pueden usarse en metodos para provocar una respuesta inmunitaria en un animal contra un epftopo presentado selectivamente o accesible en SOD1 no nativa, incluyendo el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica, el epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer o el epftopo especffico de enfermedad de Parkinson.

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Se describe un metodo para provocar una respuesta inmunitaria en un animal usando una de las composiciones de la invencion.

Se describe un metodo para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, usando una composicion que comprende un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, que es un peptido seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describe un metodo para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, usando una composicion que comprende un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica que es un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Metodo para provocar una respuesta inmunitaria usando un acido nucleico aislado

Se describe un metodo para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, usando una composicion que comprende un acido nucleico que codifica un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo que comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describe un metodo para provocar una respuesta inmunitaria en un animal, usando una composicion que comprende un acido nucleico que codifica un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica aislado en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica que es un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Uso de un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de enfermedad en la fabricacion de un medicamento

Se describe el uso de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en la fabricacion de un medicamento para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo que comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Uso de un acido nucleico aislado en la fabricacion de un medicamento

Se describe el uso de un acido nucleico aislado que codifica un peptido que corresponde a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en la fabricacion de un medicamento para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo que comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Como se ha descrito anteriormente, la inmunogenicidad y, por tanto, la eficacia de una vacuna puede mejorarse significativamente si el agente de inmunizacion (por ejemplo, el peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1) y/o composiciones del mismo se co- inmunizan con un adyuvante. Por consiguiente, los metodos descritos y usos incluyen el uso de un adyuvante.

Uso de acidos nucleicos aislados correspondientes a epftopos especfficos de enfermedad para tratar enfermedades neurodegenerativas mediadas por SOD1

Se describe el uso de un acido nucleico aislado que corresponde a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. Se describe el uso de un acido nucleico aislado que codifica un peptido que corresponde a un epftopo especffico de enfermedad. Se describe el acido nucleico que codifica un peptido que corresponde a un epftopo especffico de enfermedad que comprende un peptido seleccionado del grupo que consiste en los peptidos de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Se describe el uso de un peptido aislado correspondiente a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. Se describe el peptido aislado correspondiente a un epftopo que comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

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Composiciones y usos de agentes de union especfficos para los epftopos especfficos de enfermedad que se unen a epftopos especfficos de enfermedad

Los epftopos presentados en SOD1 mal plegada pueden unirse y/o neutralizarse por varios agentes naturales o modificados por ingenierfa diferentes, tales como anticuerpos, otros polipeptidos, moleculas pequenas, aficuerpos (Wahlberg et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100:3185-3190, 2003); anticalinas (Schlehuber y Skerra, Biophys Chem., 96:213-28, 2002); y aptameros de acido nucleico y proteicos (Cullen et al. Cell, 58: 423-466, 1989). En ciertas descripciones, el agente es un anticuerpo que se une selectivamente a un epftopo especffico de enfermedad o un analogo del mismo presentado o accesible en SOD1 no nativa.

Generacion de anticuerpos

Los epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 pueden usarse para preparar anticuerpos. Se describen anticuerpos especfficos para moleculas de SOD1 mal plegada, preferiblemente moleculas de SOD1 mal plegada asociadas con enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y/o esclerosis lateral amiotrofica.

En una descripcion, los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica pueden usarse para preparar anticuerpos especfficos para los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica. En una descripcion, los anticuerpos son especfficos para las moleculas de SOD1 mal plegada. En otras descripciones, los anticuerpos son anticuerpos aislados.

En otra descripcion, el anticuerpo aislado especffico para el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica se preparar administrando una de las composiciones descritas en este documento a un animal.

Otra descripcion incluye un anticuerpo aislado para un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica, donde el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

El termino "anticuerpo", como se usa en este documento, pretende incluir anticuerpos monoclonales incluyendo anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados, anticuerpos policlonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y anticuerpos quimericos. El anticuerpo puede ser de fuentes recombinantes y/o producirse en animales transgenicos. La expresion "fragmento de anticuerpo", como se usa en este documento, pretende incluir Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dfmeros, minicuerpos, diacuerpos y multfmeros de los mismos y fragmentos de anticuerpo biespecfficos. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando tecnicas convencionales. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 pueden generarse tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante puede tratarse para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab'. La digestion con papafna puede conducir a la formacion de fragmentos Fab. Los fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dfmeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpo biespecfficos y otros fragmentos tambien pueden sintetizarse por tecnicas recombinantes. Los anticuerpos son opcionalmente de cualquier isotipo util, incluyendo IgM que, en una realizacion, se usa para aplicaciones de diagnostico e IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 que es una realizacion que se usa para aplicaciones terapeuticas.

"Anticuerpo aislado" se refiere al anticuerpo producido in vivo o in vitro que se ha retirado de la fuente que produjo el anticuerpo, por ejemplo, un animal, hibridoma u otra lfnea celular (tal como celulas recombinantes que producen anticuerpo). El anticuerpo aislado esta opcionalmente "purificado", que significa al menos: un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % de pureza y opcionalmente pureza de calidad farmaceutica.

"Anticuerpo endogeno" se refiere al anticuerpo producido por un sujeto, tal como un mamffero (por ejemplo, ser humano), como parte de una respuesta inmunitaria en el sujeto.

"Anticuerpo exogeno" se refiere a un anticuerpo que es no propio o foraneo para un sujeto, tal como un mamffero (por ejemplo, un ser humano). La expresion "anticuerpo exogeno" abarca un anticuerpo aislado, asf como un anticuerpo aislado y purificado. Para producir anticuerpos monoclonales, pueden recogerse celulas productoras de anticuerpos (linfocitos) de un sujeto inmunizado con un inmunogeno que comprende un peptido aislado correspondiente a un epftopo especffico de SOD1 mal plegada, incluyendo un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica, un epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer o un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson, y puede fusionarse con celulas de mieloma por procedimientos convencionales de fusion de celulas somaticas inmortalizando de ese modo estas celulas y produciendo celulas de hibridoma. Dichas tecnicas son bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, la tecnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (42), asf como otras tecnicas tales como la tecnica de hibridoma de celulas B humanas (43), la tecnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (44), y la exploracion de bibliotecas combinatorias de anticuerpos (45)). Las celulas de hibridoma pueden explorarse de forma inmunoqufmica para la produccion de anticuerpos especfficamente reactivos con los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica y los anticuerpos monoclonales pueden aislarse.

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Los anticuerpos especfficos o fragmentos de anticuerpo, reactivos contra antfgenos o moleculas particulares, tales como epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas mal plegadas de SOD1, incluyendo epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica, epftopos especfficos de enfermedad de Alzheimer o epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson tambien pueden generarse explorando bibliotecas de expresion que codifican genes de inmunoglobulina o partes de los mismos, expresados en bacterias con componentes de superficie celular. Por ejemplo, los fragmentos Fab completos, las regiones VH y las regiones FV pueden expresarse en bacterias usando bibliotecas de expresion en fagos (vease, por ejemplo, Ward et al. (46); Huse et al. (45); y McCafferty et al. (47)).

La expresion "anticuerpo humanizado", como se usa en este documento, significa que el anticuerpo o fragmento comprende regiones flanqueantes conservadas humanas (mencionadas alternativamente como regiones constantes) y las regiones hipervariables (mencionadas alternativamente como el dominio de union a antfgeno) que son de origen no humano. Por ejemplo, la region hipervariable puede ser de un raton, rata u otra especie. La inmunizacion de anticuerpo a partir de especies no humanas se ha descrito bien en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, el documento EP-B1 0 239400 y Carter y Merchant 1997 (Curr Opin Biotechnol 8, 449-454, 1997). Los anticuerpos humanizados tambien se obtienen facilmente en el mercado (por ejemplo, Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretana.).

Las formas humanizadas de anticuerpos de roedor se generan facilmente por injerto de CDR (Riechmann et al. Nature, 332:323-327, 1988). En este enfoque, los seis bucles de CDR que comprenden el sitio de union a antfgeno del anticuerpo monoclonal de roedor se unen a las correspondientes regiones flanqueantes humanas. El injerto de CDR a menudo produce anticuerpos con afinidad reducida ya que los aminoacidos de las regiones flanqueantes pueden influir en el reconocimiento del antfgeno (Foote y Winter. J Mol Biol, 224: 487-499, 1992). Para mantener la afinidad del anticuerpo, a menudo es necesario remplazar ciertos restos flanqueantes por mutagenesis dirigida al sitio u otras tecnicas recombinantes y puede asistirse por modelado informatico del sitio de union a antfgeno (Co et al. J Immunol, 152: 2968-2976, 1994).

Las formas humanizadas de anticuerpos se obtienen opcionalmente por recubrimiento (Pedersen et al. J Mol Biol, 235: 959-973, 1994). En este enfoque, solamente se humanizan los restos superficiales de un anticuerpo de roedor.

La expresion "anticuerpos humanos", como se usa en este documento, se refiere a anticuerpos que son, o corresponden a, anticuerpos que se producen de forma endogeno en un sujeto humano, sin embargo, los anticuerpos humanos tambien se producen opcionalmente de forma exogena a traves de tecnicas bioqufmicas. Los anticuerpos humanos especfficos para un antfgeno particular pueden identificarse por una estrategia de presentacion en fagos (Jespers et al. Bio/Technology, 12: 899-903, 1994). En un enfoque, la cadena pesada de un anticuerpo de roedor dirigido contra un antfgeno especffico se clona y aparea con un repertorio de cadenas ligeras humanas para presentarse como fragmentos Fab en fagos filamentosos. El fago se selecciona por union al antfgeno. La cadena ligera humana seleccionada posteriormente se aparea con un repertorio de cadenas pesadas humanas para su presentacion en fagos, y el fago se selecciona de nuevo por union al antfgeno. El resultado es un fragmento Fab de anticuerpo humano especffico para un antfgeno particular. En otro enfoque, se producen bibliotecas de fagos donde los miembros presentan diferentes fragmentos de anticuerpo humano (Fab o Fv) sobre sus superficies externas (Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty et al., documento WO 92/01047). Los fagos que presentan anticuerpos con una especificidad deseada se seleccionan por enriquecimiento de afinidad para un antfgeno especffico. El fragmento Fab o Fv humano identificado a partir de cualquier enfoque puede volver a clonarse para su expresion como un anticuerpo humano en celulas de mamffero.

Los anticuerpos humanos se obtienen opcionalmente de animales transgenicos (patentes de Estados Unidos n.° 6.150.584; 6.114.598 y 5.770.429). En este enfoque, se deleciona el gen de la region de union de cadena pesada (Jh) en un raton mutante quimerico o de la lfnea germinal. La serie del gen de inmunoglobulina de lfnea germinal humana posteriormente se transfiere a dicho raton mutante. El raton transgenico resultante entonces es capaz de generar un repertorio completo de anticuerpos humanos tras exposicion al antfgeno.

Los anticuerpos humanizados o humanos se seleccionan de cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo: IgM, IgG, IgD, IgA o IgE; y cualquier isotipo, incluyendo: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. El anticuerpo humanizado o humano puede incluir secuencias de uno o mas de un isotopo o clase. Ademas, estos anticuerpos se producen tfpicamente como fragmentos de union a antfgeno tales como Fab, Fab' F(ab')2, Fd, Fv y fragmentos de anticuerpo de un unico dominio, o como anticuerpos de cadena sencilla en que las cadenas pesada y ligera estan unidas por un espaciador. Ademas, los anticuerpos humanos o humanizados pueden existir en forma monomerica o polimerica. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprende una cadena no humana y una cadena humanizada (es decir, una cadena pesada o ligera humanizada).

Adicionalmente, los anticuerpos especfficos para los epftopos de la invencion se afslan facilmente explorando bibliotecas de presentacion en fagos de anticuerpos. Por ejemplo, opcionalmente se explora una biblioteca en fagos de anticuerpos usando un epftopo especffico de enfermedad de la presente invencion para identificar fragmentos de anticuerpos especfficos para el epftopo especffico de enfermedad. Los fragmentos de anticuerpo identificados opcionalmente se usan para producir una diversidad de anticuerpos recombinantes que son utiles con diferentes

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realizaciones de la presente invencion. Las bibliotecas de presentacion en fagos de anticuerpos estan disponibles en el mercado, por ejemplo, a traves de Xoma (Berkeley, California). Los metodos para explorar bibliotecas en fagos de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica.

Tambien se describen anticuerpos que compiten selectivamente con anticuerpos creados usando un inmunogeno que comprende un peptido aislado de la Tabla 2 y de la Tabla 2A y analogos de los mismos. Se realizan ensayos de competicion para proporcionar un metodo de determinacion de si un anticuerpo de ensayo desplaza a un anticuerpo descrito en este documento, que comprende poner en contacto un epftopo presentado en una forma no nativa de SOD1 con un anticuerpo de ensayo y un anticuerpo creado usando un inmunogeno que comprende un peptido aislado de la Tabla 2, Tabla 2A o analogos de los mismos y a continuacion determinando si el anticuerpo de ensayo desplaza selectivamente el anticuerpo descrito en este documento de la union del epftopo. El anticuerpo de ensayo se considera que desplaza selectivamente el anticuerpo descrito en este documento si el anticuerpo de ensayo tiene al menos 1,5 veces o al menos 2 veces mayor afinidad de union por el epftopo.

Estos anticuerpos especfficos para epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 pueden usarse para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. En una realizacion, los anticuerpos de la invencion pueden usarse para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. Por ejemplo, la infusion pasiva de anticuerpos especfficos para un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica puede inhibir la formacion de agregados de SOD1 y/o puede bloquear el mal plegamiento dirigido por molde de SOD1.

Composiciones que comprenden anticuerpos

Un aspecto adicional de la invencion es una composicion para tratar la esclerosis lateral amiotrofica, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo especffico para un epftopo que consiste en DSE5 o en DSE7 o un analogo que consiste en DSE5 o en DSE7, comprendiendo el analogo la modificacion de un aminoacido por oxidacion o nitracion en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado. Se describe el epftopo que comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Un aspecto de la invencion es una composicion para tratar la esclerosis lateral amiotrofica, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo especffico para un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica que consiste en DSE5 o en DSE7 o un analogo que consiste en DSE5 o en DSE7, comprendiendo el analogo la modificacion de un aminoacido por oxidacion o nitracion en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado.

En una realizacion, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. En otra realizacion, los anticuerpos se administran a la sangre o al fluido espinal de un sujeto con esclerosis lateral amiotrofica.

Se describen metodos y usos de los anticuerpos para tratar la esclerosis lateral amiotrofica.

Metodo de tratamiento: inmunizacion pasiva

Se describe un metodo de tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo que se une a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado.

Ademas de anticuerpos, los epftopos presentados en SOD1 mal plegada pueden unirse y/o neutralizarse por varios agentes naturales o modificados por ingenierfa diferentes tales como otros polipeptidos, moleculas pequenas, aficuerpos (Wahlberg et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100:3185-3190, 2003); anticalinas (Schlehuber y Skerra, Biophys Chem., 96:213-28, 2002); y aptameros de acido nucleico y proteicos (Cullen et al. Cell, 58: 423-466, 1989).

Los aficuerpos son protefnas de union modificadas por ingenierfa basadas en la estructura de triple helice del dominio Z derivado de la protefna A de estafilococos (Wahlberg et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100:3185-3190, 2003). El dominio Z consiste en 58 restos que se unen a la parte Fc de IgG de diferentes especies (Nygren y Uhlen. Curr Opin Struct Biol., 7:463-469, 1997). Aleatorizando simultaneamente 13 posiciones de aminoacido localizadas en las dos helices que componen la superficie de union a Fc del dominio Z, se crea una biblioteca de protefnas de union (aficuerpos) y se usa para explorar la union a dianas deseadas por tecnologfa de presentacion en fagos (Nord, et al. Protein Eng., 8:601-608, 1995; Nord et al. Nat Biotechnol. 15:772-777, 1997). Los aficuerpos tienen una estructura secundaria similar al dominio Z nativo y tienen constantes de disociacion (KD) en el intervalo micromolar para sus dianas respectivas (Nord et al. Nat Biotechnol., 15:772-777, 1997).

Las anticalinas son una clase de protefnas de union a ligando modificadas por ingenierfa derivadas de la estructura proteica de lipocalina (Schlehuber y Skerra, Biophys Chem., 96:213-28, 2002; Weiss y Lowman. Chem. Biol., 7:R177-R184, 2000; Skerra. J Biotechnol., 74:257-275, 2001). El proceso de preparacion de las anticalinas se describe en el documento EP1017814. El sitio de union a ligando de las anticalinas puede volver a modificarse por ingenierfa por sustituciones de aminoacido, u otros enfoques recombinantes, para alterar la especificidad de union de la protefna. Las anticalinas son similares a los anticuerpos porque poseen alta afinidad y especificidad por sus

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ligandos prescritos. Sin embargo, las anticalinas tienen varias ventajas sobre los anticuerpos, incluyendo un tamano mas pequeno; una composicion peptfdica sencilla; y un sitio de union que se manipula facilmente.

Los aptameros son cortos oligonucleotidos de ADN monocatenario, oligonucleotidos de ARN o polipeptidos con la capacidad de reconocer diversas moleculas diana con alta afinidad y especificidad (Cullen et al. Cell, 58: 423-466, 1989). Los aptameros se identifican opcionalmente por un proceso de evolucion y seleccion in vitro llamado SELEX (evolucion sistemica de ligandos por enriquecimiento exponencial), y los metodos para obtener aptameros especfficos para un polipeptido de interes son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Brody E N, Gold L. J Biotechnol. Marzo de 2000; 74(1):5-13. Los metodos para la seleccion eficaz de aptameros que se unen a cualquier polipeptido de interes se describen en la publicacion de Estados Unidos n.° 20050142582.

Como los anticuerpos, los aptameros asumen una forma tridimensional especffica y estable in vivo, que proporciona union especffica a moleculas diana y provocan una respuesta biologica. Ademas, las afinidades de union de los aptameros son analogas a las de los anticuerpos (revisado en Nimjee et al. Annu Rev Med, 56: 555 - 83, 2005). Los aptameros tienen varias ventajas sobre los anticuerpos, incluyendo estabilidad a 80 °C, semivida larga, baja inmunogenicidad (Retina, 22: 143-152, 2002), baja variabilidad entre lotes, amplia distribucion tisular debido a su pequeno tamano, se modifican facilmente para alterar su distribucion tisular y propiedades de eliminacion, por ejemplo, por pegilacion (Tucker et al. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 732: 203-212, 1999).

En una descripcion, el epftopo comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Uso de anticuerpos para tratar la enfermedad

Se describe el uso de un anticuerpo que se une a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en mezcla con un diluyente o vehfculo adecuado para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. En una descripcion, el epftopo comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2A, o un analogo de los mismos.

Uso del anticuerpo en la fabricacion de un medicamento

Se describe el uso de un anticuerpo que se une a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 en la fabricacion de un medicamento para tratar la esclerosis lateral amiotrofica. En una descripcion, el epftopo comprende un peptido aislado seleccionado del grupo que consiste en los peptidos aislados de la Tabla 2 o de la Tabla 2a, o un analogo de los mismos.

Los siguientes ejemplos se describen unicamente con fines de ilustracion y no pretenden limitar el alcance de la invencion.

Metodos de administracion de las composiciones

Las composiciones de la invencion se administran facilmente, por ejemplo, por administracion parenteral, intravenosa, subcutanea, intramuscular, intracraneal, intraventricular, intratecal, intraorbital, oftalmica, intracapsular, intramedular, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, en aerosol u oral.

En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra de forma sistemica.

En otras realizaciones, la composicion farmaceutica se administra directamente al cerebro u otra parte del SNC. Por ejemplo, dichos metodos incluyen el uso de un cateter implantable y una bomba, que servirfa para descargar una dosis predeterminada a traves del cateter al sitio de infusion. Un experto en la materia reconocerfa adicionalmente que el cateter puede implantarse por tecnicas quirurgicas que permiten la visualizacion del cateter para posicionar el cateter adyacente al sitio deseado de administracion o infusion en el cerebro. Dichas tecnicas se describen en Elsberry et al., patente de Estados Unidos 5.814.014 "Techniques of Treating Neurodegenerative Disorders by Brain Infusion". Los inventores tambien han contemplado otros metodos tales como los descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos 20060129126 (Kaplitt y During "Infusion device and method for infusing material into the brain of a patient"). Los dispositivos para suministrar farmacos al cerebro y otras partes del SNC estan disponibles en el mercado (por ejemplo, SynchroMed® EL Infusion System; Medtronic, Minneapolis, Minnesota).

En otra realizacion, la composicion farmaceutica se administra al cerebro usando metodos tales como modificacion de los compuestos de la invencion para permitir el transporte mediado por receptor a traves de la barrera hematoencefalica.

Otras realizaciones contemplan la co-administracion de los compuestos de la invencion con moleculas biologicamente activas que se sabe que facilitan el transporte a traves de la barrera hematoencefalica.

En otra realizacion, los compuestos de la invencion se reformulan como protefnas de fusion o quimericas para

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posibilitar su transporte a traves de la barrera hematoencefalica. Dichas tecnologfas se describen en la patente de Estados Unidos 4902505, "Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier".

La invencion tambien contempla metodos adicionales para administrar los compuestos a traves de la barrera hematoencefalica tales como los dirigidos a aumentar de forma transitoria la permeabilidad de la barrera hematoencefalica como se describe en la patente de Estados Unidos 7012061 "Method for increasing the permeability of the blood brain barrier".

Un experto en la materia reconocera la diversidad de metodos adecuados para administrar los compuestos de la invencion directamente al cerebro o a traves de la barrera hematoencefalica y sera capaz de modificar estos metodos para administrar de forma segura los productos de la invencion.

Dosis y formulaciones

La forma de dosificacion es opcionalmente una forma lfquida de dosificacion. La expresion "forma lfquida de dosificacion" se refiere a formas no solidas de dosificacion adecuadas para, aunque sin limitacion, administracion parenteral, intravenosa, subcutanea, intramuscular, intracraneal, intraventricular, intratecal, intraorbital, oftalmica, intracapsular, intramedular, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, en aerosol u oral. Pueden prepararse soluciones de un compuesto de la invencion en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, DMSO y mezclas de los mismos con o sin alcohol, y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Un experto en la materia conocerfa el modo de preparar formulaciones adecuadas. Los procedimientos convencionales e ingredientes para la seleccion y preparacion de formulaciones adecuadas se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (2003 - 20a edicion) y en la Farmacopea de Estados Unidos: The National Formulary (USP 24 NF19) publicada en 1999. Las formulaciones contienen opcionalmente excipientes incluyendo, aunque sin limitacion, agentes tamponantes, un antioxidante, un estabilizante, un vehfculo, un diluyente y un agente para el ajuste del pH.

Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion improvisada de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida que exista facilidad de inyeccion.

Un experto en la materia reconocerfa que la forma de dosificacion y formulacion elegidas depende de las caracterfsticas de la composicion. Por ejemplo, un experto en la materia sabrfa que una composicion que comprende un anticuerpo puede requerir una formulacion diferente que una composicion que comprende un acido nucleico y elegirfa una formulacion y una forma de dosificacion adecuadas a la composicion.

Los factores adicionales que afectan a la dosis eficaz de una formulacion incluyen la via de administracion, el sitio diana, el estado fisiologico del sujeto, la especie del sujeto, si el tratamiento es profilactico o terapeutico, si se estan administrando otras medicaciones y si tambien se administra un adyuvante.

La cronologfa de las inmunizaciones opcionalmente varfa de una vez al dfa, a una vez a la semana, a una vez al mes, a una vez al ano, a una vez cada diez anos. Un regimen tfpico incluye una inmunizacion seguida por inyecciones de refuerzo a intervalos de 6 semanas. Otro regimen consiste en inmunizacion seguida por inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses despues. Como alternativa, las inyecciones de refuerzo variaran dependiendo de la respuesta inmunitaria y el estado fisiologico del sujeto.

Para inmunizacion pasiva usando un anticuerpo dirigido contra un epftopo derivado de una forma no nativa de SOD1, la dosis varfa opcionalmente de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, de 0,5 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg y de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg del peso corporal del sujeto. En otras realizaciones, la dosis varfa de aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 5 g/kg, de aproximadamente 500 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg y de aproximadamente 750 mg/kg a aproximadamente 1.5 g/kg del peso corporal del sujeto.

Para inmunizacion activa usando inmunogenos que comprende peptidos aislados o moleculas relacionadas correspondientes a epftopos especfficos de enfermedad de formas no nativas de SOD1, la dosis varfa opcionalmente de aproximadamente 0,0001 microgramos a 10 gramos, de aproximadamente 0,01 microgramos a aproximadamente 1 gramo, de aproximadamente 1 microgramos a aproximadamente 1 mg, y de aproximadamente 100 a 250 microgramos por tratamiento. En una realizacion, la cronologfa de administracion del tratamiento es en uno o mas de los siguientes: 0 meses, 2 meses, 6 meses, 9 meses, y/o 12 meses. En un regimen, la dosificacion es a 2, 6, 9, y 12 meses despues de la primera inmunizacion. En otro regimen, la dosificacion es a 2 y 4 semanas despues de la primera inmunizacion, y despues mensualmente despues de ello. En un regimen alternativo, la dosificacion varfa dependiendo del estado fisiologico del sujeto y/o la respuesta del sujeto a las inmunizaciones previas. La via de administracion opcionalmente incluye, aunque sin limitacion, inyecciones intramusculares e intraperitoneales. En una realizacion, la composicion se inyecta en el musculo deltoides.

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Cuando un peptido aislado correspondiente a un epftopo es demasiado pequeno para ser inmunogenico, o cuando la inmunogenicidad esta mejorada, el peptido se une opcionalmente o acopla a un vehfculo adecuado. Los vehfculos adecuados incluyen, aunque sin limitacion, hemocianina de lapa californiana, antfgeno MAP, albuminas sericas, moleculas de inmunoglobulina y toxoides de bacterias patogenicas. Los peptidos pueden unirse a vehfculos por reticulacion qufmica, por ejemplo, para formar dendrfmeros. En alternativa, los peptidos inmunogenicos pueden expresarse como protefnas de fusion con vehfculos.

Pueden usarse anticuerpos monoclonales tales como mAb humanizados por infusion intravenosa. La concentracion terapeutica del anticuerpo humanizado contra SOD1 DES puede ser de 1-10 microgramos por ml de concentracion local en el SNC. En el entorno de una barrera hematoencefalica (BBB) no alterada, solamente 1-100 a 1-1000 de IgG penetra en el SNC. Por tanto, la concentracion del anticuerpo terapeutico en la circulacion periferica necesaria para alcanzar esta concentracion en el SNC serfa del orden de 100 microgramos/ml a como maximo 10 mg/ml, cerca del nivel de pre-tratamiento de IgG en plasma humano. Considerando que el volumen de sangre humana es de aproximadamente 5 litros, la dosificacion de 50 gramos serfa el lfmite superior, que es similar a la dosis de inmunoglobulina intravenosa policlonal combinada (IVIG) usada para tratar muchos trastornos inflamatorios y autoinmunitarios. Considerando que la degradacion de IgG humana requiere 3-4 semanas, la dosificacion una vez cada 3 semanas constituirfa un regimen eficaz. Sin embargo, la dosificacion de anticuerpos monoclonales humanizados anti-DSE podrfa ser muy inferior que el calculo anterior, basandose en los experimentos de tratamiento en ratones proporcionados en los siguientes ejemplos. Se ha descubierto que la dosificacion en ratones G93A por via intraperitoneal de 1 mg de anticuerpo contra-DSE2 era terapeuticamente eficaz. Considerando que el volumen de sangre en un raton es de 6-7 ml por 100 gramos de peso corporal, la concentracion en circulacion del mAb contra DSE2 era del orden de 1 mg/ml. Para dosificar a un ser humano con ALS, esto se traducirfa en 1/10 de la IgG normal en circulacion (habitualmente aproximadamente 10 mg/ml). El volumen de sangre humana es del orden de 5 litros, lo que sugerirfa una dosis terapeutica eficaz de anticuerpo humanizado contra DSE2 del orden de 5 gramos mediante infusion i.v. Ademas, se ha apreciado leve alteracion de la BBB en ALS, que presumiblemente es maxima en regiones de mayor neuroinflamacion, es decir, aquellas regiones en que la enfermedad es mas manifiesta, como las neuronas motoras del asta anterior, y las neuronas motoras corticales, asf como ciertos tramos de fibras que estan favorecidos por neuronas motoras corticales. Por tanto, es posible que la alteracion selectiva de BBB en regiones de enfermedad maxima permita la eficacia terapeutica para concentraciones en circulacion inferiores de anticuerpos contra SOD1 anti-DSE.

Los mAb humanizados contra DSE pueden usarse para infusion directa en el SNC mediante la via intraventricular o por la via intratecal. Ejemplos de dispositivos medicos que se usan para este proposito se fabrican por MedTronic. Como el CSF recircula varias veces al dfa, se requiere infusion continua, en lugar de un regimen de dosificacion de 3-4 semanas. La concentracion final de 1-10 microgramos por ml se conseguira por infusion de como mucho 5 mg al dfa en los 500 ml por dfa de CSF.

Terapias de combinacion

Los metodos descritos, por tanto, proporcionan la aplicacion inmunoterapeutica de anticuerpos contra SOD1 en el tratamiento de afecciones, trastornos o enfermedades marcadas por la presencia de SOD1 mal plegada o monomerica.

El tratamiento de un sujeto afectado puede realizarse por monoterapia, del modo justamente descrito, administrando un anticuerpo seleccionado o una vacuna basada en epftopos seleccionada. En realizaciones de la presente descripcion, el presente metodo puede realizarse administrando mas de una especie de anticuerpo o mas de una especie de epftopo. Por ejemplo, el metodo puede realizarse administrando un anticuerpo a la estructura de bucle electrostatico [dSe 2] y un anticuerpo contra un epftopo accesible solamente sobre la superficie de contacto del dfmero de SOD [DSE1a]. En una realizacion, el metodo de la presente descripcion se realiza usando anticuerpos que se unen selectivamente a al menos dos epftopos diferentes accesibles selectivamente sobre SOD1 mal plegada, tal como un epftopo de superficie sobre el dfmero de SOD, y un epftopo interfacial sobre el monomero de SOD. Asimismo, el metodo puede realizarse administrando dos epftopos diferentes, en forma de vacunas utiles para crear anticuerpos contra esos dos epftopos diferentes sobre SOD1 mal plegada o monomerica. En una descripcion, el metodo implica la administracion de dos o mas epftopos, por ejemplo, DSE1a y DSE2. En otra descripcion, el metodo implica la administracion de tres o mas epftopos, por ejemplo, DSE1a, DSE2 y DSE5. Ademas, el metodo puede realizarse usando una combinacion de inmunoterapia pasiva y tambien inmunoterapia activa, en que el sujeto se trata para recibir tanto un anticuerpo seleccionado como una vacuna basada en epftopos seleccionada.

El metodo tambien puede realizarse como una terapia de combinacion en que el anticuerpo contra SOD1 y/o epftopos seleccionados se administra en combinacion con otro agente util terapeuticamente en el tratamiento o control de la enfermedad particular.

En terapias de combinacion para el tratamiento de ALS, los presentes agentes terapeuticos pueden usarse en combinacion con riluzol y otros inhibidores de glutamato.

Los inventores tambien han descubierto que se retiene cobre en SOD1 oxidada catalizada por metal, que es una

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especie agregada inmunorreactiva de DSE2. Los inventores tambien han descubierto que SOD1 oxidada por tratamiento con peroxido de hidrogeno presenta inmunorreactividad de DSE2 (Figura 2). El anticuerpo contra DSE2, que reacciona contra el bucle electrostatico de SOD1 del sitio activo, puede estar bloqueando ffsicamente el acceso al cobre retenido de la especie mal plegada, y por tanto reduciendo la catalisis del oxfgeno reactivo y de la especie de nitrogeno a traves de la reaccion de Haber-Weiess, la reaccion de Fenton y otras. De forma notable, altas concentraciones de ascorbato en el SNC pueden estar facilitando el ciclo redox del cobre unido por SOD1 mal plegada, potenciando su capacidad de generar ROS y RNS. El estado agregado de SOD1, que se ha secretado p refe rente me nte de las neuronas (1), altera su eliminacion y degradacion, "atrapando" cobre en una forma neurotoxica catalfticamente activa en cercana proximidad a neuronas motoras en ALS, y en neuronas del hipocampo y en otras neuronas en AD. Se aprecia la posibilidad de que Abeta pueda contribuir a este ciclo redox toxico del cobre en AD (83).

Por consiguiente, en una terapia de combinacion particularmente util, los presentes agentes terapeuticos se usan en combinacion con un antioxidante, para el tratamiento de ALS, AD y PD, asf como para otros trastornos en que SOD1 disfuncional y/o la agregacion de SOD1 provoca la acumulacion toxica de especies reactivas de oxfgeno (ROS) o de especies reactivas de nitrogeno (RNS). Los antioxidantes son un grupo bien conocido de agentes facilmente disponibles, e incluyen las vitaminas acido ascorbico y alfa-tocoferol, y agentes farmacologicos tales como N- acetilcistefna. En realizaciones del presente metodo, el antioxidante es una SOD sintetica funcional, que imita la accion enzimatica de SOD endogena para reducir la acumulacion de radicales superoxido. Los farmacos utiles relacionados incluyen aquellos que estabilizan el dfmero de SOD, como se describe, por ejemplo, por Lansbury et al. en el documento US 2006/0194821. Otros farmacos que tienen el mismo efecto son utiles tambien. En realizaciones particulares, el antioxidante es un quelante de cobre, tal como penicilamina, clioquinol, 8-hidroxiquinolina y derivados tales como los descritos en el documento US2006/0089380, cuprizona, compuestos basados en acido picolfnico, compuestos de molibdeno, L-taurina y otros farmacos que tiene el efecto de inhibir el ciclo redox mediado por iones de cobre. Otros antioxidantes utiles mas incluyen eliminadores de superoxido, eliminadores de peroxido y eliminadores de RNS. En una realizacion particular de la invencion, los presentes agentes terapeuticos se usan en combinacion con resveritrol, un antioxidante presente en uvas rojas y vino tinto. En una realizacion especffica, el anticuerpo contra DSE2 o epftopo se usa en combinacion con resveritrol.

Cuando se usa en combinacion con los presentes agentes terapeuticos, el agente de combinacion se administra del modo prescrito para ese agente, de acuerdo con la practica convencional.

Diagnostico

Los anticuerpos especfficos para epftopos especfficos de enfermedad por SOD1 tales como epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica tambien pueden usarse para diagnosticar la esclerosis lateral amiotrofica. Por tanto, se describe un metodo de deteccion o de diagnostico de la esclerosis lateral amiotrofica en un sujeto, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo de dicho sujeto con un anticuerpo de la invencion, donde el

anticuerpo se une a un epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica para producir un complejo de

anticuerpo-antfgeno;

(b) medir la cantidad del complejo de anticuerpo-antfgeno en la muestra de ensayo; y

(c) comparar la cantidad del complejo de anticuerpo-antfgeno en la muestra de ensayo con un control.

Donde una diferencia en la cantidad del complejo de anticuerpo-antfgeno en la muestra de ensayo en comparacion con el control es indicativa de esclerosis lateral amiotrofica.

Opcionalmente, en el caso donde el epftopo esta enmascarado dentro del agregado de SOD1, el metodo comprende la etapa adicional de tratar la muestra en condiciones de disgregacion, usando, por ejemplo, clorhidrato de guanidinio, para liberar la SOD1 mal plegada para su posterior deteccion.

La expresion "detectar o controlar la esclerosis lateral amiotrofica" se refiere a un metodo o proceso de determinacion de si un sujeto tiene o no tiene esclerosis lateral amiotrofica o del grado de la esclerosis lateral amiotrofica. Ademas, los anticuerpos de la invencion pueden usarse para detectar o controlar la aparicion y progresion de agregacion de SOD1, y por tanto la progresion de la enfermedad. Los anticuerpos son adicionalmente utiles para controlar la progresion de la enfermedad durante el tratamiento con un metodo de la invencion.

El termino "control", como se usa en este documento, se refiere a una muestra de un sujeto o de un grupo de sujetos que sabe que tienen esclerosis lateral amiotrofica o que no tienen esclerosis lateral amiotrofica. Un experto en la materia apreciara que la diferencia en la cantidad del complejo de anticuerpo-antfgeno variara dependiendo del control. Por ejemplo, si se sabe que el control tiene esclerosis lateral amiotrofica, entonces menos complejo de anticuerpo-antfgeno medible en la muestra de ensayo en comparacion con el control indica que el sujeto no tiene esclerosis lateral amiotrofica o que tiene menor grado de esclerosis lateral amiotrofica. Si se sabe que el control tiene esclerosis lateral amiotrofica, entonces igual cantidad o mayor de complejo de anticuerpo-antfgeno medible en la muestra de ensayo en comparacion con el control indica que el sujeto tiene esclerosis lateral amiotrofica. Si se

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sabe que el control no tiene esclerosis lateral amiotrofica, entonces una cantidad menor o igual de complejo de anticuerpo-antfgeno medible en la muestra de ensayo en comparacion con el control indica que el sujeto no tiene esclerosis lateral amiotrofica. Si se sabe que el control no tiene esclerosis lateral amiotrofica, entonces mayor cantidad de complejo de anticuerpo-antfgeno medible en la muestra de ensayo en comparacion con el control indica que el sujeto tiene esclerosis lateral amiotrofica.

El termino "muestra", como se usa en este documento, se refiere a cualquier muestra de fluido, de celulas o de tejido de un sujeto que puede ensayarse para SOD1 mal plegada. En una realizacion, la muestra comprende, sin limitacion, fluido cefalorraqufdeo, plasma, suero sangufneo, sangre completa, tejido de medula espinal, celulas del cerebro, neuronas motoras, una parte del asta dorsal o celulas sangufneas perifericas, tales como eritrocitos, celulas mononucleares, linfocitos, monocitos y granulocitos.

Opcionalmente, en el caso donde el epftopo esta enmascarado dentro del agregado de SOD1, el metodo comprende la etapa adicional de tratar la muestra en condiciones de disgregacion, usando, por ejemplo, clorhidrato de guanidinio, para liberar la SOD1 mal plegada para posterior deteccion.

En una descripcion, los anticuerpos se usan para determinar si SOD1 mal plegada esta presente en la muestra. En otra realizacion, los anticuerpos se marcan con un marcador detectable.

En otra realizacion, los epftopos se usan para controlar la aparicion y tftulo de los anticuerpos introducidos en o creados dentro de un destinatario. En esta descripcion, una muestra del paciente se muestra con el epftopo, y preferiblemente con un epftopo marcado, y se determina la presencia o cantidad de anticuerpo unido.

El marcador es preferiblemente capaz de producir, directa o indirectamente, una senal detectable. Por ejemplo, el

1 11 3 14 32 35 123 125 131 J '

marcador puede ser radiopaco o un radioisotopo, tal como H, C, P, S, I, I, I; un compuesto fluorescente (fluoroforo) o quimioluminiscente (cromoforo), tal como isotiocianato de fluorescefna, rodamina o luciferina; una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rabano rusticano; un agente de imagenes; o un ion metalico.

En otra descripcion, la senal detectable es detectable indirectamente. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo secundario que es especffico para el anticuerpo de la invencion y contiene un marcador detectable, para detectar el anticuerpo de la invencion.

Un experto en la materia apreciara que pueden usarse varios metodos para determinar si SOD1 mal plegada esta presente en una mezcla usando los anticuerpos de la invencion, incluyendo inmunoensayos tales como citometrfa de flujo, transferencia de Western, ELISA e inmunoprecipitacion seguida por inmunocitoqufmica por SDS-PAGE.

En una descripcion, se detecta o controla una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad con cuerpos de Lewy y/o esclerosis lateral amiotrofica, en un sujeto usando citometrfa de flujo de una muestra del sujeto, incluyendo celulas sangufneas perifericas, tales como eritrocitos, celulas mononucleares, linfocitos, monocitos y/o granulocitos, o celulas mononucleares encontradas en fluido cefalorraqufdeo. En una realizacion adicional, las celulas ensayadas usando citometrfa de flujo pueden permeabilizarse usando reactivos conocidos para los expertos en la materia incluyendo, sin limitacion, detergentes, etanol, metanol y paraformaldehfdo.

En una descripcion, puede detectarse o controlarse una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y/o enfermedad con cuerpos de Lewy, en un sujeto usando citometrfa de flujo de una muestra del sujeto, incluyendo celulas sangufneas perifericas, tales como eritrocitos, celulas mononucleares, linfocitos, monocitos y/o granulocitos, o celulas mononucleares encontradas en fluido cefalorraqufdeo. En una realizacion adicional, las celulas ensayadas usando citometrfa de flujo pueden permeabilizarse usando reactivos conocidos para los expertos en la materia incluyendo, sin limitacion, detergentes, etanol, metanol y paraformaldehfdo.

En otra descripcion, puede detectarse o controlarse una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y/o enfermedad con cuerpos de Lewy, usando el ensayo de proteccion de epftopos descrito en el documento WO 2005/019828 titulado "Epitope Protection Assay and Method for Detecting Protein Conformations", que entro en fase nacional en los Estados Unidos el 17 de febrero de 2006. En otra descripcion, se detecta o controla la esclerosis lateral amiotrofica usando el ensayo de proteccion de epftopos descrito en el documento WO 2005/019828.

Cualquiera de los metodos descritos para diagnosticar, detectar o controlar la agregacion de SOD1 y el desarrollo de una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada puede usarse ademas de o en combinacion con tecnicas tradicionales de diagnostico para enfermedades relacionadas con SOD1 mal plegada.

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Cualquiera de los metodos descritos para diagnosticar, detectar o controlar la agregacion de SOD1 y el desarrollo de esclerosis lateral amiotrofica puede usarse ademas de o en combinacion con tecnicas tradicionales de diagnostico para esclerosis lateral amiotrofica. Las tecnicas tradicionales de diagnostico para esclerosis lateral amiotrofica incluyen examenes ffsicos y neurologicos, y pueden incluir ensayos de electromiograffa, ensayos de velocidad de la condicion nerviosa e imagenes de resonancia magnetica.

El diagnostico de una enfermedad neurodegenerativa, y el control de la progresion de estos trastornos, es insatisfactorio en estos momentos. El diagnostico definitivo puede hacerse solamente por examen tisular sobre evaluacion de necropsia despues de la muerte, o por biopsia (casi nunca utilizada en enfermedades neurodegenerativas). No es una exageracion indicar que el diagnostico presuntivo antemortem de ALS, de AD y de PD se hace sobre la base de caracterfsticas clfnicas, que a menudo estan compartidas con otras enfermedades, e intentando excluir otros trastornos que imitan la enfermedad en cuestion. Se realiza "diagnostico por exclusion" a traves de neuroimagenes (exploraciones MRI y CAT) y ensayos en sangre para descartar diagnosticos confusos (tales como ensayos de la funcion de la tiroides). El ensayo especializado para trastornos neurodegenerativos diferentes (tales como evaluacion neurosicologica para AD, exploracion PET para PD y electromiograffa para ALS), junto con el examen clfnico, son predictivos del diagnostico en autopsia del 70-90 % de los pacientes con AD y PD, y habitualmente mas del 90 % de pacientes con ALS.

Los anticuerpos de la invencion se describen como utiles para diagnostico y se describen para su uso en la concentracion de bajas cantidades de protefnas mal plegadas presentes en fluidos y tejidos del paciente por metodos de concentracion tales como inmunoprecipitacion. En una descripcion, se usa un anticuerpo que reconoce un epftopo presentado selectivamente en formas no nativas de SOD1 para inmunoprecipitar SOD1 en sangre periferica. La presencia de SOD1 inmunoprecipitada puede detectarse opcionalmente por ELISA.

La invencion tambien incluye kits para diagnosticar la esclerosis lateral amiotrofica, que comprenden un anticuerpo de la invencion e instrucciones para el uso de los mismos. Un experto en la materia apreciara que el anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable.

Se describen kits para diagnosticar ALS, AD y/o PD, que comprenden uno o mas peptidos aislados correspondientes a epftopos especfficos de enfermedad. En una descripcion, el kit comprende un peptido aislado correspondiente a los epftopos especfficos de enfermedad seleccionados del grupo que comprende DSE1, DSE1 a, DSE2, DSE3, DSE4, DSE5, DSE6 y DSE7. Los peptidos aislados pueden incluirse ademas de un anticuerpo que se une a dicho epftopo. En una descripcion, el peptido aislado es un control positivo. En alternativa, el peptido aislado puede ser util per se para explorar una muestra para detectar cualquier anticuerpo contra DSE presente, por ejemplo, en un paciente que experimenta inmunoterapia activa o pasiva basada en dichos peptidos y anticuerpos.

Seleccion de farmacos

Los anticuerpos de la invencion se describen como para usarse para identificar y seleccionar sustancias utiles para el tratamiento o prevencion de la esclerosis lateral amiotrofica o para la formacion de SOD1 mal plegada, que esta asociada con esclerosis lateral amiotrofica. Por ejemplo, el metodo de identificacion de sustancias para tratar, inhibir o prevenir la esclerosis lateral amiotrofica puede incluir:

(a) poner en contacto una muestra de un sujeto tratado con una sustancia con uno cualquiera de los anticuerpos de la invencion, donde la union es indicativa de la presencia de SOD1 mal plegada en la muestra,

(b) detectar el nivel de union en la muestra, y

(c) comparar el nivel de union en la muestra con el nivel de union en un control,

donde un nivel alterado de union en la muestra en comparacion con el control es indicativo de una sustancia para el tratamiento o prevencion de la esclerosis lateral amiotrofica.

Un experto en la materia apreciara que el control puede ser una muestra de un sujeto no tratado con una sustancia o tratado con una sustancia que se sabe que no trata o previene la esclerosis lateral amiotrofica. Por tanto, si el "nivel alterado de union" es un nivel reducido de union en la muestra en comparacion con el control, entonces esto es indicativo de una sustancia util para el tratamiento o prevencion de la esclerosis lateral amiotrofica. Ademas, el control puede ser una muestra del mismo sujeto, pero antes del tratamiento con la sustancia a ensayar o muestras del sujeto tomadas en diferentes puntos temporales durante el tratamiento con la sustancia a ensayar.

Las sustancias para el tratamiento o prevencion de la esclerosis lateral amiotrofica tambien pueden identificarse usando celulas o lfneas celulares. Por ejemplo, las celulas o lfneas celulares pueden ponerse en contacto con una sustancia y despues puede detectarse la presencia de SOD1 mal plegada en las celulas usando las protefnas de union de la invencion y pueden compararse con un control.

Un experto en la materia apreciara que puede explorarse una biblioteca de moleculas controlando el efecto de los compuestos candidatos sobre la inhibicion de la conversion de SOD1 en una conformacion mal plegada o especffica de enfermedad.

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Se describen sustancias identificadas usando los metodos de la invencion, que son utiles para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica o para la formacion de SOD1 mal plegada y/o agregada, que esta asociada con esclerosis lateral amiotrofica.

Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de las realizaciones de la presente invencion:

Ejemplos

Los inmunogenos que comprenden peptidos aislados correspondientes a epftopos especfficos de enfermedad, por ejemplo, DSE1a, pueden referirse en los siguientes ejemplos a secuencias analogas de DSE (por ejemplo, el analogo DSE1 GGGRLAC*GVIGIGSG que comprende secuencias de G N-terminales adicionales) como el numero DSE (por ejemplo, DSE1) que esta relacionado con el analogo.

Ejemplo 1

Generacion de anticuerpos monoclonales contra DSE2

Un peptido aislado correspondiente al epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica (DLGKGGNEESTKTGNAGS) que alberga un resto Cys N-terminal se conjugo con KLH para inmunizacion de ratones BALB/c, y con BSA para exploracion ELISA. Se dieron multiples inyecciones a cada raton a intervalos de 21 dfas. El adyuvante para la primera inyeccion fue adyuvante completo de Freund (Sigma, n.° Cat. F5881-6 x 10 ml). El adyuvante incompleto de Freund (Sigma, n.° Cat. F5506-6 x 10 ml) fue el adyuvante usado para las inyecciones restantes. Se recogio sangre de los ratones 7-10 dfas despues de la 3a inyeccion. La fusion celular se hizo 3-4 dfas despues del refuerzo final sin ningun adyuvante.

El companero de fusion usado fue Sp 2/0-Ag14 (ATCC n.° CRL-1581). La fusion entre el companero de fusion SP2/0 y las celulas esplenicas se hizo a una relacion 1:5 (2,0 x 107:1,0 x 108) en 1 ml de PEG precalentado (MW1450: Sigma, n.° Cat. P7181). Las celulas de fusion se resuspendieron en 50 ml de DMEM con FBS al 10 % y se sembraron en 5 placas de 96 pocillos a 100 pl/pocillo. Se anadieron 100 pl/pocillo de medio HAT DMEM 2 x a las celulas de fusion despues de 24 horas. Los medios se cambiaron en los dfas 5 y 7 con medio HAT 1 x fresco. En el dfa 10-12, se recogieron 50 pl de sobrenadante de cada pocillo para la primera exploracion ELISA. Los clones positivos se transfirieron a placas de 24 pocillos. Tras la confluencia, se exploraron los sobrenadantes de anticuerpo por ELISA con el antfgeno usado para inmunizar los ratones y un antfgeno no relacionado (transferrina humana). Los clones positivos se transfirieron a placas de 6 pocillos para la expansion o la subclonacion de hibridoma. La subclonacion se hizo por dilucion limitante a 50-70 celulas/placa de 90 pocillos.

Ejemplo 2

Produccion a gran escala de anticuerpos monoclonales

Para la produccion a gran escala de anticuerpos, se inyectaron 0,2-0,5 ml de Pristano (Sigma, n.° Cat. T-7640) o IFA cada raton (BALB/c) por i.p. para la sensibilizacion. En el dfa 7-11, se inyectaron de 500.000 a 5.000.000 de celulas de hibridoma en 0,5 ml de PBS 1 x en fase logarftmica a cada raton por i.p. Se permitio que el fluido ascftico se acumulara durante 1-2 semanas. Pueden recogerse 2-5 ml de fluido ascftico de cada raton, con una concentracion de IgG de aproximadamente 1-9 mg/ml. Se uso protefna A para la purificacion de IgG2 y 3, y la protefna G para IgG1.

El clon IgG mAb se denomino 10E11C11. Este anticuerpo presenta propiedades coherentes con su reconocimiento de un epftopo especffico de enfermedad para SOD1 mal plegada. Este mAb se une a SOD1 desnaturalizada en membranas de inmunotransferencia, que reconoce SOD1 desnaturalizada monomerica (no estructurada). El mAb no reconoce la SOD1 dimerica en inmunotransferencia. En inmunoprecipitaciones mediadas por perlas magneticas conjugadas con 10E11C11, no hay union detectable de SOD1 nativa de cerebro humano normal o de cerebro de raton y medula espinal. El mAb no inmunoprecipita de forma eficaz SOD1 deliberadamente mal plegada por bajo pH, el caotropo guanidina, o ambos. De forma mas importante, 10E11C11 inmunoprecipita de forma eficaz SOD1 mal plegada en un modelo de raton de ALS causado por sobreexpresion transgenica de SOD1 mutante (G93A). De forma notable, SOD1 endogena de raton presente en el mismo tejido no se inmunoprecipita, lo que sugiere que la SOD1 mutante humana mal plegada no "co-recluta" SOD de raton normal en este modelo de enfermedad.

Tambien se crearon anticuerpos de una manera similar al epftopo NPLSRKHGGPKDEE, que alberga un resto Cys N-terminal.

Dichos anticuerpos estan facilmente disponibles y pueden obtenerse de Neil Cashman at the Brain Research Centre, UBC Hospital, 2211 Wesbrook Mall, Vancouver, Columbia Britanica, V6T 2B5, Canada
(neil.cashman@utoronto.ca).

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Ejemplo 3

Metodo 2 de generacion de anticuerpos monoclonales contra DSE2

Generacion de anticuerpos monoclonales de raton: 4 ratones BALB/c hembra se inmunizaron inicialmente por inyecciones intraperitoneales con 25 pg de KLH acoplada al peptido correspondiente a DSE2 (DLGKGGNEESTKTGNAGS, mas una cistefna N-terminal para el acoplamiento con KLH por formacion de puente disulfuro) por raton en adyuvante completo de Freund. Se administraron cuatro refuerzos posteriores como anteriormente, espaciados a intervalos de 3 semanas, con adyuvante incompleto de Freund. Cuando el tftulo del suero se habfa elevado mas de 10 veces desde una muestra de suero preinmune, determinado por ELISA, los 2 mayores respondedores de raton se reforzaron cada uno por via intravenosa con 10 pg de KLH acoplado al antfgeno proteico de peptido, en 100 pl de PBS esteril, pH 7,4. Tres dfas despues los ratones donantes se sacrificaron y se recogieron las celulas esplenicas y se combinaron. La fusion de los esplenocitos con celulas de mieloma parentales SP2/0 BALB/c se realizo como se ha descrito previamente (vease el Ejemplo 1 anterior) excepto que se realizo seleccion de una etapa y clonacion de los hibridomas en medio Clone Ez. Este medio semisolido permite la seleccion en HAT y la clonacion en una unica etapa y elimina el crecimiento excesivo de clones deseables de crecimiento mas lento por hibridomas de crecimiento mas rapido, quiza indeseables. Los clones se picaron 11 dfas despues de la fusion y se resuspendieron en pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos en: 200 pl de medio DMEM (Invitrogen) que contenfa suero bovino fetal al 20 %. Despues de 4 dfas, los sobrenadantes se exploraron por ELISA indirecto para la actividad del anticuerpo en placas recubiertas con 1 pl/pocillo de peptido acoplado a BSA.

Condiciones de ELISA:

Para la exploration y el ensayo: El antfgeno DSE-2-BSA se recubrio en la placa en dH2O a 1 pg/pocillo y se seco durante una noche a 37 °C.

Para el ensayo sobre antfgeno de control negativo: se recubrio 0,5 pg/pocillo de antfgeno HT (transferrina humana) sobre la placa en dH2O a 50 pl/pocillo y se seco durante una noche a 37 °C. Bloqueo: Las placas se bloquearon con leche desnatada en polvo al 3 % en PBS (pH 7,4) a 100 pl/pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.

1er anticuerpo: Se anadieron sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma anti-DSE2 de raton y controles monoclonales de anticuerpo a 100 pl netos por pocillo para la exploracion y ensayo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitacion.

2° anticuerpo usado para exploration y ensayo: Se uso anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de raton conjugado con HRP 1/10000 diluido en PBS-Tween (pH 7,4), se anadio a 100 pl/pocillo y se incubo durante 1 hora a 37 °C con agitacion.

Sustrato: Se anadio tampon TMB (BioFx n.° cat. TMBW-1000-01) a 50 pl/pocillo y se incubo en la oscuridad a temperatura ambiente. La reaccion se detuvo con 50 pl de HCl 1 M por pocillo despues de 15 minutos y se leyo a DO450 nm.

La Tabla 3 muestra la exploracion por ELISA de clones de hibridoma para anticuerpos dirigidos contra el epftopo especffico de enfermedad DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2). Los anticuerpos generados por varios de los clones de hibridoma eran altamente especfficos para peptidos correspondientes al epftopo especffico de enfermedad, y no reconocfan de forma detectable el antfgeno de control HT (transferrina humana). Estos resultados muestran que pueden producirse anticuerpos monoclonales contra peptidos correspondientes a epftopos identificados como presentados selectivamente o accesibles en formas mal plegadas de SOD1.

Tabla 3: Exploracion por ELISA de clones de hibridoma para anticuerpos dirigidos contra

DLGKGGNEESTKTGNAGS

Clon

Exp. n.° 1 Antfgeno DSE-2-BSA Exp. n.° 2 Antfgeno DSE-2-BSA Antfgeno HT Isotipo

2A11

2,624 2,000 0,086 IgG

3H1

1,982 1,908 0,081 IgG

5G5

2,712 2,014 0,068 IgG

5G12

2,072 1,755 0,064 IgG

6C3

2,527 1,889 0,071 IgG

6G12

2,093 1,982 0,069 IgG

7E10

2,586 2,047 0,068 IgG

7F8

2,317 1,961 0,079 IgG

8C9

2,087 1,929 0,072 IgG

8D1

2,238 1,931 0,067 IgG

10C12

3,032 1,909 0,061 IgG

10F2

2,599 1,699 0,059 IgG_____

El clon de hibridoma 3H1 (numero de acceso 220207-02) se deposito en la International Depository Authority of

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Clon |Exp. n.° 1 Antigeno DSE-2-BSA |Exp. n.° 2 Antigeno DSE-2-BSA |Antigeno HT \lsotipo

Canada localizada en Winnipeg, Canada el 22 de febrero de 2007.____________________________________

Ejemplo 4

Anticuerpos policlonales contra DSE1 Generation y purification de anticuerpos

La sfntesis de peptidos se realizo usando qufmica basada en Fmoc convencional en un Perseptives Biosystems 9050 Plus Pepsynthesizer. Se sintetizo el peptido multiple antigenico en una resina [Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys- Cys(Acm)-p-Ala-Wang (Advanced ChemTech, SM5104, Louisville, Kentucky) usando aminoacidos protegidos con Fmoc (Advanced ChemTech; Novabiochem, San Diego, California; Applied Biosystems, Foster City, California). La secuencia era Acetil-GGRLACGVIGIGGKG-; la composicion y la secuencia se verificaron por analisis de aminoacidos y por analisis de absorbancia UV en lfnea del sintetizador de peptidos. Este peptido se escindio y purifico por dialisis frente a Tris 10 mM, acetato sodico 10 nM (Sigma); se realizo dialisis a pH 8,0 para permitir la formacion de enlaces disulfuro entre hebras adyacentes del dendrfmero peptfdico. El antigeno MAP tenia un peso molecular de ~11 kDa y se uso sin conjugacion con una protefna de vehfculo. El antigeno se envio a Sigma-Genosys (Oakville, Ontario, Canada) para la produccion de antisuero de conejo ("paquete parcial" del fabricante). La produccion de antisuero siguio el protocolo convencional (Sigma-Genosys) y estaba de acuerdo con el acta de bienestar de animales (EE. UU.).

Se sintetizo un peptido lineal con secuencia identica al antigeno en una resina TentaGel-SH [no escindible] (Advanced ChemTech). Esta resina se desprotegio y compacto en columnas desechables (Evergreen Scientific, Los Angeles, CA) para la purificacion de antisuero. El antisuero se pre-aclaro por centrifugacion (16.000 x g) y se diluyo 1:10 en solucion salina tamponada con tris (TBS) antes de la purificacion. El antisuero diluido se volvio a hacer circular sobre la columna de purificacion por afinidad 3 x a un caudal de ~1 ml/min. a temperatura ambiente para la union. La columna unida al anticuerpo se lavo con un mfnimo de 100 ml de TBS (~1 ml/min.), hasta que el eluyente de lavado no tuvo protefna (A28q = 0). Las fracciones de anticuerpo se eluyeron con glicina 50 mM, pH 2,8 en 1/5 volumenes de Tris 1,5 M enfriado en hielo, NaCl 150 mM, pH 8,0, se mezclaron y se colocaron inmediatamente en hielo. Estas fracciones se centrifugaron 16.000 x g y se determino la concentracion del anticuerpo en el sobrenadante usando un £280 = 220.000 y un peso molecular de IgG de 150.00 Da. La columna de purificacion se regenero por lavado en exceso con glicina 50 mM, pH 2,8, seguido por tratamiento con guanidina-HCl saturado, Tris 50 mM, pH 8,0. La columna se equilibro con TBS antes de la aplicacion de antisuero. Se uso solamente el suero del tercer sangrado o posterior. En todos los casos, el anticuerpo se purifico inmediatamente antes de su uso y se almaceno con 2 mg/ml de BSA para estabilizar el anticuerpo.

SDS-PAGE y transferencia de Western

Se realizo SDS-PAGE usando el sistema de tampon Tris-glicina con geles de gradiente de poliacrilamida al 4-20 % pre-moldeados (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para geles parcialmente desnaturalizantes, la SOD1 de eritrocitos humanos (Sigma) se hirvio durante 15 minutos con betamercaptoetanol (Aldrich) al 4 % en tampon de SDS-carga o se mantuvo en hielo durante 15 minutos en tampon de SDS-carga. Se procesaron 1-5 pg de SOD1 en cada carril con resultados equivalentes. Para transferencia de Western, los geles se transfirieron a membrana de PVDF, se bloquearon durante una noche en leche al 5 %-TBST (solucion salina tamponada con Tris, Tween-20 al 0,05 %). Se usaron 0,2 pg/ml (nota: hasta al menos 5 pg/ml produjeron resultados equivalentes) de anticuerpo SEDI contra SOD (policlonal anti-DSE1) diluido en leche al 5 %-TBSt como anticuerpo primario, y se uso dilucion 1:5000 de anticuerpo anti-IgG de conejo-HRP (Stressgen, Victoria, Canada) como anticuerpo secundario. Las transferencias de Western se revelaron usando ECL-Plus (Amersham, Buckinghamshire, R.U.) y se visualizaron en pelfcula Kodak. Para experimentos de competicion de peptidos, se pre-incubo el anticuerpo SEDI contra SOD diluido con un exceso 500 x (molar) del peptido lineal libre con la misma secuencia que el antigeno a 4 °C durante una noche o durante 1 hora a temperatura ambiente antes de su uso.

Resultados

Diseno y validation de anticuerpos

La investigacion de la conformacion de protefnas in vivo es un problema desafiante. Una posible estrategia es disenar un anticuerpo que reconozca conformaciones mal plegadas especfficas, pero no la protefna nativa. Este enfoque dirigido por hipotesis se ha aplicado previamente a otros trastornos neurodegenerativos que implican la agregacion de protefnas, pero estos disenos han dependido de informacion bioffsica de baja resolucion sobre la estructura de la protefna mal plegada. El enfoque de los inventores emplea el uso de datos de estructura cristalina de rayos X detallada para disenar un anticuerpo contra SOD1 mal plegada SOD1 (6, 71). Se postulo la hipotesis de que un anticuerpo que reconoce un epftopo inaccesible en SOD1 dimerica nativa pero expuesto en agregados de SOD1 e intermedios de agregacion, serfa capaz de detectar selectivamente SOD1 mal plegada in vivo. El examen de la estructura de rayos X del dfmero de SOD1 nativa (codigo pdb: 1SPD) (72) muestra que los restos 145-151

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(ACGVIGI) estan secuestrados en la superficie de contacto del dfmero de SOD1 y estan inaccesibles en SOD1 nativa. Se postula la hipotesis de que un anticuerpo creado contra este epftopo reconoce formas mal plegadas de SOD1 donde la superficie de contacto del dfmero nativo esta alterada y expuesta, tal como en monomeros y oligomeros no nativos. Por consiguiente, los inventores han llamado a este el anticuerpo contra la superficie de contacto del dfmero de SOD1 (anticuerpo SEDI, tambien mencionado como anticuerpo policlonal anti-DSE1). Los inventores sintetizaron un peptido antigenico multiple donde cada brazo del dendrfmero tenia la secuencia ggRLACGVIGlggkg; la secuencia en letras mayusculas es parte de la secuencia de SOD1 (restos 143-151). Los restos de SOD1 143 y 144 se anadieron al peptido antigenico para aumentar su solubilidad; se anadieron enlazadores Gly/Lys N-terminales y C-terminales para contextualizar el epftopo en una secuencia interna, aumentar la solubilidad y aumentar el peso molecular para inmunogenicidad potenciada. El antisuero de conejo producido a partir de la inmunizacion con este antfgeno se purifico por afinidad usando un peptido lineal inmovilizado con secuencia identica al antfgeno. Se realizaron transferencias de Western para examinar si el anticuerpo podia discriminar entre SOD1 dimerica y SOD1 monomerica con el epftopo seleccionado expuesto. SOD1 nativa es suficientemente estable de modo que en condiciones no reductoras SOD1 se procesa principalmente como un dfmero en SDS-PAGE. Cuando se reducen condiciones desnaturalizantes, se procesan predominantemente como el monomero, pero con algun dfmero aun detectable. En estos geles, el anticuerpo SEDI reacciona solamente con SOD1 monomerica y no con SOD1 dimerica nativa. Este anticuerpo, por tanto, reaccionara con conformeros de SOD1 donde el epftopo seleccionado esta expuesto, pero no con SOD1 nativa. Esto contrasta con los anticuerpos disponibles en el mercado contra SOD1 que detectan SOD1 tanto nativa como mal plegada de forma indiscriminada. La competicion con el peptido antigenico confirmo la especificidad del anticuerpo. El anticuerpo SEDI, por tanto, satisface los criterios de diseno y proporciona un inol selectivamente presentado o accesible para ensayar la hipotesis in vivo.

Ejemplo 5

Generacion de anticuerpos monoclonales contra DSE1

Generacion de anticuerpos monoclonales de raton: se inmunizaron inicialmente 4 ratones BALB/c hembra por inyecciones intraperitoneales con 25 pg de antfgeno proteico por raton en adyuvante completo de Freund. Se administraron 4 refuerzos posteriores como anteriormente, espaciados a intervalos de 3 semanas, con adyuvante incompleto de Freund. Cuando el tftulo del suero se habfa elevado mas de 10 veces desde una muestra de suero preinmune, determinado por ELISA, los 2 mayores respondedores se reforzaron cada uno por via intravenosa con 10 pg de antfgeno proteico, en 100 pl de PBS esteril, pH 7,4. Tres dfas despues los ratones donantes se sacrificaron y se recogieron y se combinaron las celulas esplenicas. La fusion de los esplenocitos con celulas de mieloma parentales SP2/0 BALB/c se realiza como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1 anteriormente, excepto que se realiza seleccion de una etapa y clonacion de los hibridomas en medio Clone EZ. Este medio semisolido permite la seleccion en HAT y la clonacion en una unica etapa y elimina el crecimiento excesivo de clones deseables de crecimiento mas lento por hibridomas de crecimiento mas rapido, quiza indeseables. Los clones se picaron 11 dfas despues de la fusion y se resuspendieron en pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos en: 200 pl de medio DMEM (Invitrogen) que contenfa suero bovino fetal al 20 %. Despues de 4 dfas, los sobrenadantes se exploraron por ELISA indirecto para la actividad del anticuerpo en placas recubiertas con 1 pg/pocillo de antfgeno proteico.

Condiciones de ELISA:

Para la exploracion y el ensayo: Se recubre el antfgeno DSE-1-BSA sobre la placa en dH2O a 1 pg/pocillo y se seca durante una noche a 37 °C.

Para el ensayo sobre antfgeno de control negativo: se recubren 0,5 pg/pocillo de antfgeno HT (transferrina humana) sobre la placa en dH2O a 50 pl/pocillo y se secan durante una noche a 37 °C.

Bloqueo: Las placas se bloquearon con leche desnatada en polvo al 3 % en PBS (pH 7,4) a 100 pl/pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.

1er anticuerpo: Se anadieron sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma anti-DSE1 de raton y controles monoclonales de raton a 100 pl netos por pocillo para la exploracion y el ensayo. Se anadieron suero inmune anti-DSE1a de raton y suero preinmune de raton diluido 1/800 en el sobrenadante de cultivo tisular SP2/0 a 100 pl/pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitacion.

2° anticuerpo usado para exploracion y ensayo: Se uso anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de raton conjugado con HRP 1/10000. El anticuerpo secundario se diluyo en PBS-Tween (pH 7,4), se anadio a 100 pl/pocillo y se incubo durante 1 hora a 37 °C con agitacion.

Sustrato: Se anadio tampon TMB (BioFx n.° cat. TMBW-1000-01) a 50 pl/pocillo y se incubo en la oscuridad a temperatura ambiente. La reaccion se detuvo con 50 pl de HCl 1 M por pocillo despues de 15 minutos y se leyo a DO450 nm.

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Ejemplo 6

Produccion de anticuerpos contra DSE1a

Se conjugo el peptido aislado correspondiente al epftopo DSE1a (GGGRLAC*GVIGIGSG) con KLH para inmunizacion de ratones BALB/c, y con bSa para exploracion ELISA.

Generacion de anticuerpos monoclonales de raton: se inmunizaron inicialmente 4 ratones BALB/c hembra por inyecciones intraperitoneales con 25 pg de antfgeno proteico por raton en adyuvante completo de Freund. Se administraron 4 refuerzos posteriores como anteriormente, espaciados a intervalos de 3 semanas, con adyuvante incompleto de Freund. Cuando el tftulo del suero se habfa elevado mas de 10 veces de una muestra de suero preinmune, determinado por ELISA, los 2 mayores respondedores se reforzaron cada uno por via intravenosa con 10 pg de antfgeno proteico, en 100 pl de PBS esteril, pH 7,4. Tres dfas despues, los ratones donantes se sacrificaron y se recogieron y se combinaron las celulas esplenicas. La fusion de los esplenocitos con celulas de mieloma parentales SP2/0 BALB/c se realizo como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se realiza seleccion de una etapa y clonacion de los hibridomas en medio Clone EZ. Este medio semisolido permite la seleccion en HAT y la clonacion en una unica etapa y elimina el crecimiento excesivo de clones deseables de crecimiento mas lento por hibridomas de crecimiento mas rapido, quiza indeseables. Los clones se picaron 11 dfas despues de la fusion y se resuspendieron en pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos en: 200 pl de medio DMEM (Invitrogen) que contenfa suero bovino fetal al 20 %. Despues de 4 dfas, los sobrenadantes se exploraron por ELISA indirecto para la actividad del anticuerpo en placas recubiertas con 1 pg/pocillo de antfgeno proteico.

Condiciones de ELISA:

Para la exploration y el ensayo: Se recubrio el antfgeno DSE-1-BSA sobre la placa en dH2O a 1 pg/pocillo y se seco durante una noche a 37 °C.

Para el ensayo sobre el antfgeno de control negativo: se recubrieron 0,5 pg/pocillo de antfgeno HT (transferrina humana) sobre la placa en dH2O a 50 pl/pocillo y se seco durante una noche a 37 °C.

Bloqueo: Las placas se bloquean con leche desnatada en polvo al 3 % en PBS (pH 7,4) a 100 pl/pocillo y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente.

1er anticuerpo: Se anade sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma anti-DSE1 de raton y controles monoclonales de raton a 100 pl netos por pocillo para la exploracion y el ensayo. Se anaden suero inmune anti- DSE1a de raton y suero preinmune de raton diluido 1/800 en el sobrenadante de cultivo tisular SP2/0 a 100 pl/pocillo y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con agitacion.

2° anticuerpo usado para exploration y ensayo: Se usa anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de raton conjugado con HRP 1/10000. El anticuerpo secundario se diluye en PBS-Tween (pH 7,4), se anade a 100 pl/pocillo y se incuba durante 1 hora a 37 °C con agitacion.

Sustrato: Se anade tampon TMB (BioFx n.° cat. TMBW-1000-01) a 50 pl/pocillo y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente. La reaccion se detiene con 50 pl de HCl 1 M por pocillo despues de 15 minutos y se lee a DO450 nm.

La Tabla 4 muestra la exploracion por ELISA de clones de hibridoma para anticuerpos dirigidos contra el peptido correspondiente al epftopo especffico de enfermedad GGGRLAC*GVIGIGSG (DSE1a). Los anticuerpos generados por los clones de hibridoma eran altamente especfficos para el epftopo especffico de enfermedad, y no reconocfan de forma detectable el antfgeno de control HT (transferrina humana). Estos resultados muestran que pueden producirse anticuerpos monoclonales contra peptidos correspondientes a epftopos identificados como presentados o accesibles en formas mal plegadas de SOD1.

Tabla 4: Exploracion por ELISA de clones de hibridoma para anticuerpos dirigidos contra el epftopo

GGGRLAC*GVIGIGSG (DSE1a)

Clon

Exp. n.° 1 Antfgeno DSE-1 a-BSA Exp. n.° 2 Antfgeno DSE-1a-BSA Antfgeno HT Isotipo

3C1

0,484 0,265 0,105 IgG

3C11

0,702 0,186 0,093 IgG

3D2

1,542 1,035 0,058 IgG

3F1

3,072 2,143 0,080 IgG

4B5

0,506 0,238 0,065 IgG

4H6

1,244 0,957 0,085 IgG

5F6

0,862 0,663 0,089 IgG

6D8

2,690 2,186 0,089 IgG

9A4

2,538 2,313 0,071 IgG

9A8

1,489 0,884 0,100 IgG

5

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15

20

25

30

Clon

Exp. n.° 1 Antfgeno DSE-1 a-BSA Exp. n.° 2 Antfgeno DSE-1a-BSA Antfgeno HT Isotipo

10C3

2,446 2,200 0,067 IgG

10C12

2,867 2,016 0,089 IgG

El clon de hibridoma 6D8 (numero de acceso 220207-01) se deposito en Canada localizada en Winnipeg, Canada el 22 de febrero de 2007.

la International Depository Authority of

Se generaron anticuerpos contra DSE4, 6 y 7 usando tecnicas similares.

Ejemplo 7

Anticuerpos dirigidos contra DSE1a no reconocen el peptido DSE1

Se comparo la capacidad del anticuerpo anti-DSEIa de reconocer su secuencia peptfdica affn (DSE1a) con la capacidad del anticuerpo anti-DSEIa de reconocer el peptido no oxidado (DSE1).

Se recubrieron pocillos de placa de microtitulacion con el peptido DSE1 o con el peptido DSE1a acoplado a BSA. Despues se bloquearon los sitios libres de union en cada uno con BSA, se anadieron sobrenadantes de cultivo tisular que contenfan anticuerpos de los clones de hibridoma DSE1a, y se permitio que el anticuerpo se uniera a los peptidos acoplados a BSA. El anticuerpo unido entonces se detecto con un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa. La Figura 1 y la Tabla 5 muestran que todos los anticuerpos ensayados reconocen preferentemente DSE1a sobre DSE1.

Cuando los ratones se inmunizaron con peptido DSE1, principalmente se formaron anticuerpos de isotipo IgM. Un anticuerpo IgM probablemente tiene una afinidad inferior por el epftopo que los anticuerpos contra DSE1a creados como se ha indicado anteriormente, que son del isotipo IgG. La modificacion de DSE1 para que comprenda una cistefna oxidada provoco la produccion de anticuerpos con avidez operativamente mayor.

Tabla 5. ELISA que muestra que los clones de anticuerpo anti-DSEIa reconocen preferentemente el peptido

DSE1a oxidado

Clon

Peptido Peptido Clon Peptido Peptido

DSE1a DSE1 DSE1a DSE1

3C1

1,141 0,243 4H6 0,674 0,233

1,405 0,234 0,685 0,29

Des. Rel.

1,273 0,2385 Des. Rel. 0,6795 0,2615

Promedio

14,66 % 2,67 % Promedio 1,14% 15,41%

DSE1a DSE1 DSE1a DSE1

3C11

1,165 0,197 6D8 2,303 0,366

0,732 0,216 2,168 0,242

Des. Rel.

0,9485 0,2065 Des. Rel. 2,2355 0,304

Promedio

32,28 % 6,51 % Promedio 4,27 % 28,84 %

DSE1a DSE1 DSE1a DSE1

3D2

1,073 0,219 9A4 1,006 0,203

0,93 0,209 0,687 0,343

Des. Rel.

1,0015 0,214 Des. Rel. 0,8465 0,273

Promedio

10,10 % 3,30 % Promedio 26,65 % 36,26 %

DSE1a DSE1 DSE1a DSE1

3D9

0,195 0,223 9A8 2,101 0,21

0,164 0,195 2,194 0,276

Des. Rel.

0,1795 0,209 Des. Rel. 2,1475 0,243

Promedio

12,21 % 9,47 % Promedio 3,06 % 19,21 %

DSE1a DSE1 DSE1a DSE1

3F1

2,948 0,247 10C3 2,227 0,233

3,005 0,269 2,087 0,22

Des. Rel.

2,9765 0,258 Des. Rel. 2,157 0,2265

Promedio

1,35 % 6,03 % Promedio 4,59 % 4,06 %

DSE1a DSE1 DSE1a DSE1

4B5

0,671 0,185 PBST 0,199 0,192

0,481 0,169 0,194 0,166

Des. Rel.

0,576 0,177 Des. Rel. 0,1965 0,179

Promedio

23,32 % 6,39 % Promedio 1,80 % 10,27 %

Ejemplo 8

Produccion de anticuerpos contra DSE5

Generacion de anticuerpos monoclonales de raton: se inmunizaron inicialmente 4 ratones BALB/c hembra por

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20

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30

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40

45

50

55

60

inyecciones intraperitoneales con 25 pg de inmunogeno que comprende el peptido (IKGLTEGLHGF) correspondiente a DSE5 acoplado a KLH por formacion de disulfuro con una cistefna que se anadio a la N por raton en adyuvante completo de Freund. Se administraron 4 refuerzos posteriores como anteriormente, espaciados a intervalos de 3 semanas, con adyuvante incomplete de Freund. Cuando el tftulo de anticuerpo se habfa elevado mas de 10 veces desde una muestra de suero preinmune, determinado por ELISA, los 2 mayores respondedores se reforzaron cada uno por via intravenosa con 10 pg de antfgeno proteico, en 100 pl de PBS esteril, pH 7,4. Tres dfas despues los ratones donantes se sacrificaron y se recogieron y se combinaron las celulas esplenicas. La fusion de los esplenocitos con celulas de mieloma parentales SP2/0 BALB/c se realiza como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1 anteriormente, excepto que se realiza seleccion de una etapa y clonacion de los hibridomas en medio Clone EZ. Este medio semisolido permite la seleccion en HAT y la clonacion en una unica etapa y elimina el crecimiento excesivo de clones deseables de crecimiento mas lento por hibridomas de crecimiento mas rapido, quiza indeseables. Los clones se picaron 11 dfas despues de la fusion y se resuspendieron en pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos en: 200 pl de medio DMEM (Invitrogen) que contenfa suero bovino fetal al 20 %. Despues de 4 dfas, los sobrenadantes se exploraron por ELISA indirecto para la actividad del anticuerpo en placas recubiertas con 1 pg/pocillo de antfgeno proteico.

Condiciones de ELISA:

Para la exploration y el ensayo: Se recubrio el antfgeno DSE5-BSA sobre la placa en dH2O a 1 pg/pocillo y se seco durante una noche a 37 °C.

Para el ensayo sobre antfgeno de control negativo: se recubrieron 0,5 pg/pocillo de antfgeno HT (transferrina humana) sobre la placa en dH2O a 50 pl/pocillo y se secaron durante una noche a 37 °C.

Bloqueo: Las placas se bloquearon con leche desnatada en polvo al 3 % en PBS (pH 7,4) a 100 pl/pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.

1er anticuerpo: Se anadieron sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma anti-DSE5 de raton y controles monoclonales de raton a 100 pl netos por pocillo para la exploracion y el ensayo. Se anadieron suero inmune anti-DSE1a de raton y suero preinmune de raton diluido 1/800 en el sobrenadante de cultivo tisular SP2/0 a 100 pl/pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitacion.

2° anticuerpo usado para exploration y ensayo: Se uso anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de raton conjugado con HRP 1/10000. El anticuerpo secundario se diluyo en PBS-Tween (pH 7,4), se anadio a 100 pl/pocillo y se incubo durante 1 hora a 37 °C con agitacion.

Sustrato: Se anadio tampon TMB (BioFx n.° cat. TMBW-1000-01) a 50 pl/pocillo y se incubo en la oscuridad a temperatura ambiente. La reaccion se detuvo con 50 pl de HCl 1 M por pocillo despues de 15 minutos y se leyo a DO450 nm.

La Tabla 6 muestra la exploracion por ELISA de clones de hibridoma para anticuerpos dirigidos contra el epftopo especffico de enfermedad (IKGLTEGLHGF). Los anticuerpos generados por varios clones de hibridoma eran altamente especfficos para el peptido correspondiente al epftopo, y no reconocfan de forma detectable el antfgeno de control hT (transferrina humana). Estos resultados muestran que pueden producirse anticuerpos monoclonales contra peptidos correspondientes a epftopos identificados como selectivamente presentados o accesibles en formas mal plegadas de SOD1.

Tabla 6: Exploracion por ELISA de clones de hibridoma para anticuerpos dirigidos contra el epftopo _________________________________IKGLTEGLHGF (DSE5)_________________________________

Clon

Exp. n.° 1 antfgeno DSE-5-BSA Exp. n.° 2 antfgeno DSE-5-BSA Antfgeno HT Isotipo

5C6

2,779 1,787 0,079 IgG

El clon de hibridoma 5C6 (numero de acceso 280207-01) se deposito en la International Depository Authority of

Canada localizada en Winnipeg, Canada el 28 de febrero de 2007.

Ejemplo 9

Produccion de anticuerpos contra epftopos especfficos de enfermedad (DSE) y/o determinantes antigenicos DSE

Un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 se conjuga con KLH para inmunizacion de ratones BALB/c para generar celulas B reactivas contra el epftopo. El epftopo para la inmunizacion se selecciona del grupo de peptidos que consiste en: GGGRLACGVIGIGsG (DSE1); gGgRLAC*GVIGIGSG (DSE1a); CDLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2); CNPLSRKHGGPKDEE (DSE3); CIKGLTEGLHGF (DSE5); GSGKAVCVLK (DSE4); y CGLHGFHVH (DSE7). Como alternativa, se conjuga una parte de cualquiera de los peptidos mencionados anteriormente que comprende uno o mas determinantes antigenicos con KLH, que comprenden de forma minima 3 o 5 aminoacidos contiguos de cualquiera de las secuencias peptfdicas que son inmunogenicas en solitario o cuando se acoplan a KLH.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Generacion de anticuerpos monoclonales de raton: se inmunizan inicialmente 4 ratones BALB/c hembra por inyecciones intraperitoneales con 25 pg de antfgeno proteico por raton en adyuvante completo de Freund. Se administran 4 refuerzos posteriores como anteriormente, espaciados a intervalos de 3 semanas, con adyuvante incompleto de Freund. Cuando el tftulo de anticuerpo se habfa elevado mas de 10 veces a partir una muestra de suero preinmune, determinado por ELISA, los 2 mayores respondedores se refuerzan cada uno por via intravenosa con 10 pg de antfgeno proteico, en 100 pl de PBS esteril, pH 7,4. Tres dfas despues los ratones donantes se sacrifican y se recogen y se combinan las celulas esplenicas. La fusion de los esplenocitos con celulas de mieloma parentales SP2/0 BALB/c se realiza como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1 anteriormente, excepto que se realiza seleccion de una etapa y clonacion de los hibridomas en medio Clone EZ. Este medio semisolido permite la seleccion en HAT y la clonacion en una unica etapa y elimina el crecimiento excesivo de clones deseables de crecimiento mas lento por hibridomas de crecimiento mas rapido, quiza indeseables. Los clones se pican 11 dfas despues de la fusion y se resuspenden en pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos en: 200 pl de medio DMEM (Invitrogen) que contiene suero bovino fetal al 20 %. Despues de 4 dfas, los sobrenadantes se exploran por ELISA indirecto para la actividad de los anticuerpos en placas recubiertas con 1 pg/pocillo de antfgeno proteico.

Condiciones de ELISA:

Para la exploration y el ensayo: Se recubre el antfgeno DSE-BSA en la placa en dH2O a 1 pg/pocillo y se seca durante una noche a 37 °C.

Para el ensayo sobre antfgeno de control negativo: se recubren 0,5 pg/pocillo de antfgeno HT (transferrina humana) en la placa en dH2O a 50 pl/pocillo y se secan durante una noche a 37 °C.

Bloqueo: Las placas se bloquean con leche desnatada en polvo al 3 % en PBS (pH 7,4) a 100 pl/pocillo y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente.

1er anticuerpo: Se anaden sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma anti-DSE de raton y controles monoclonales de raton a 100 pl netos por pocillo para la exploracion y el ensayo. Se anaden suero inmune anti- DSE1a de raton y suero preinmune de raton diluido 1/800 en el sobrenadante de cultivo tisular SP2/0 a 100 pl/pocillo y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con agitacion.

2° anticuerpo usado para exploration y ensayo: Se usa anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de raton conjugado con HRP 1/10000. El anticuerpo secundario se diluye en PBS-Tween (pH 7,4), se anade a 100 pl/pocillo y se incuba durante 1 hora a 37 °C con agitacion.

Sustrato: Se anade tampon TMB (BioFx n.° cat. TMBW-1000-01) a 50 pl/pocillo y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente. La reaccion se detiene con 50 pl de HCl 1 M por pocillo despues de 15 minutos y se lee a DO450 nm.

Ejemplo 10

Ensayo de ELISA de anticuerpos dirigidos contra DSE1a por afinidad a SOD1 desnaturalizada

Se exploraron los clones de hibridoma que producen anticuerpos dirigidos contra DSE1a (GGGRLAC*GVIGIGSG) por ELISA para la reactividad especffica a SOD1 plegada de forma nativa (SOD1 en PBS) desnaturalizada o SOD1 mal plegada (SOD1 en tampon de desnaturalizacion con GdnHCl 6 M), o control de BSA plegado de forma nativa y mal plegado.

La Tabla 7 muestra la afinidad de clones de hibridoma por SOD1 plegada de forma nativa y mal plegada. Se detecto la absorbancia de cada muestra a 450 nm (columnas 2 - 5). Cada muestra se ensayo por duplicado. Los valores de las columnas 6 - 7 proporcionan los valores promedio de la afinidad de cada clon y el porcentaje de diferencia entre las dos muestras. La columna 10 representa la afinidad especffica del anticuerpo por la SOD1 plegada de forma nativa (es decir, la afinidad del anticuerpo por SOD1 menos la union no especffica a la protefna bSa irrelevante). La columna 11 representa la afinidad especffica del anticuerpo por la SOD1 no plegada (es decir, la afinidad del anticuerpo por SOD1 menos la union no especffica para BSA). La columna 12 proporciona el aumento factorial de la afinidad especffica por SOD1 mal plegada sobre SOD1 plegada de forma nativa. Estos resultados demuestran la afinidad especffica de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el epftopo DSE1a por SOD1 y que los anticuerpos preferiblemente estan dirigidos a formas mal plegadas de SOD1 con una afinidad 2 - 4 veces mayor que por la forma plegada de forma nativa.

Se seleccionaron los clones 4H6, 6D8, 10C3 para produccion a gran escala.

5

10

15

20

25

Tabla 7: Ensayo de ELISA de clones de hibridoma DSE1a para SOD1 desnaturalizada

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

SOD1 BSA SOD1 BSA

Gdn Gdn Gdn Gdn S-N S-N

PBS HCl PBS HCl PBS HCl PBS HCl (F) (U) U/F

Clon

3C1

0,423 0,712 0,144 0, 170 0,417 0,662 0,145 0,178 0,256 0,501 1,961

0,410 0,612 0,145 0, 185 2 % 11 % 0 % 6 %

3C11

0,352 0,693 0,153 0, 155 0,355 0,668 0,154 0,150 0,203 0,516 2,544

0,357 0,642 0,155 0, 144 1 % 5 % 1 % 5 %

3D2

0,364 0,727 0,134 0, 130 0,357 0,690 0,127 0,125 0,231 0,564 2,442

0,349 0,652 0,119 0, 119 3 % 8 % 8 % 6 %

3D9

0,304 0,661 0,121 0, 124 0,314 0,674 0,137 0,115 0,188 0,548 2,920

0,323 0,687 0,152 0, 106 4 % 3 % 16 % 11 %

3F1

0,354 0,585 0,140 0, 146 0,327 0,577 0,133 0,131 0,195 0,445 2,284

0,299 0,568 0,125 0, 116 12 % 2 % 8 % 16 %

4B5

0,352 0,643 0,145 0, 140 0,338 0,637 0,137 0,137 0,201 0,500 2,491

0,323 0,630 0,129 0, 134 6 % 1 % 8 % 3 %

4H6

0,334 0,615 0,156 0, 122 0,332 0,626 0,135 0,122 0,203 0,498 2,451

0,329 0,637 0,114 0, 122 1 % 2 % 22 % 0 %

6D8

0,380 0,788 0,148 0, 139 0,385 0,732 0,145 0,134 0,246 0,593 2,413

0,390 0,676 0,142 0, 129 2 % 11 % 3 % 5 %

9A4

0,305 0,634 0,144 0, 127 0,302 0,604 0,133 0,125 0,173 0,475 2,740

0,299 0,573 0,122 0, 122 1 % 7 % 12 % 3 %

9A8

0,253 0,601 0,150 0, 115 0,259 0,593 0,139 0,119 0,130 0,464 3,578

0,264 0,585 0,127 0, 123 3 % 2 % 12 % 5 %

10C3

0,284 0,609 0,153 0, 117 0,282 0,628 0,229 0,112 0,112 0,458 4,085

0,280 0,646 0,304 0, 106 1 % 4 % 47 % 7 %

10C12

0,326 0,562 0,121 0, 115 0,313 0,551 0,121 0,122 0,191 0,429 2,244

0,299 0,539 0,121 0, 128 6 % 3 % 0 % 8 %

Bkg

0,112 0,142 0,117 0, 151 0,122 0,143 0,118 0,147

0,132 0,144 0,118 0, 143 12 % 1 % 1 % 4 %

S = senal, N = ruido, F= plegada de forma nativa, U = no plegada/mal plegada

Ejemplo 11

Ensayo de ELISA de anticuerpos dirigidos contra DSE2 para la afinidad por SOD1 desnaturalizada

Se exploraron clones de hibridoma que producen anticuerpos dirigidos contra DSE2 (DLGKGGNEESTKTGNAGS) por ELlSA para la reactividad especffica contra SOD1 plegada de forma nativa (SOD1 en PBS) desnaturalizada o SOD1 mal plegada (SOD1 en tampon de desnaturalizacion con GdnHCl 6 M), o control de BSA plegada de forma nativa y mal plegada.

La Tabla 8 muestra la afinidad de clones de hibridoma por SOD1 plegada de forma nativa y no plegada. Se detecto la absorbancia de cada muestra a 450 nm (columnas 2 - 5). Cada muestra se ensayo por duplicado. Los valores de las columnas 6 - 9 proporcionan los valores promedio de la afinidad de cada clon y el porcentaje de diferencia entre las dos muestras. La columna 10 representa la afinidad especffica del anticuerpo por la SOD1 plegada de forma nativa (es decir, la afinidad del anticuerpo por SOD1 menos la union no especffica a BSA). La columna 11 representa la afinidad especffica del anticuerpo por la SOD1 mal plegada (es decir, la afinidad del anticuerpo de SOD1 menos la union no especffica para BSA). La columna 12 proporciona el aumento factorial de la afinidad especffica por SOD1 mal plegada sobre SOD1 plegada de forma nativa. Estos resultados demuestran la afinidad especffica de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el epftopo DSE2 por SOD1 y que los anticuerpos preferiblemente estan dirigidos a formas mal plegadas de SOD1.

Se seleccionaron los clones 3H1, 5G5 y 8D1 para produccion a gran escala.

Tabla 8: Ensayo de ELISA de clones de hibridoma DSE2 para SOD1 desnaturalizada

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

SOD1 BSA GdnH SOD1 GdnH BSA GdnH S-N S-N

PBS GdnHCl PBS Cl PBS Cl PBS Cl (F) (U) U/F

2A9

0,321 0,593 0,125 0,137 0,316 0,589 0,116 0,141 0,187 0,460 2,460

0,31 0,584 0,107 0,145 2 % 1 % 11 % 4 %

2A11

0,345 0,71 0,119 0,124 0,347 0,719 0,114 0,140 0,220 0,592 2,693

0,348 0,727 0,108 0,156 1 % 2 % 7 % 16 %

3H1

0,257 2,189 0,161 0,165 0,410 2,145 0,156 0,164 0,251 1,986 7,926

5

10

15

20

25

30

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

SOD1 BSA GdnH SOD1 GdnH BSA GdnH S-N S-N

PBS GdnHCl PBS Cl PBS Cl PBS Cl (F) (U) U/F

0,563 2,101 0,15 0,162 53 % 3 % 5 % 1 %

5G5

0,308 1,032 0,22 0,145 0,307 0,879 0,171 0,149 0,147 0,719 4,881

0,306 0,725 0,122 0,152 0 % 25 % 41 % 3 %

5G12

0,346 0,604 0,124 0,131 0,309 0,583 0,135 0,122 0,181 0,455 2,516

0,272 0,562 0,145 0,113 17 % 5 % 11 % 10 %

6C3

0,325 0,67 0,129 0,126 0,317 0,673 0,126 0,136 0,187 0,543 2,909

0,309 0,676 0,122 0,145 4 % 1 % 4 % 10 %

6G12

0,29 0,414 0,125 0,114 0,293 0,558 0,112 0,111 0,181 0,446 2,462

0,295 0,701 0,099 0,107 1 % 36 % 16 % 4 %

7E10

0,34 0,787 0,199 0,179 0,331 0,761 0,171 0,158 0,166 0,597 3,589

0,321 0,735 0,142 0,137 4 % 5 % 24 % 19 %

7F8

0,366 0,605 0,131 0,121 0,327 0,612 0,135 0,121 0,199 0,484 2,430

0,288 0,619 0,138 0,121 17 % 2 % 4 % 0 %

8C9

0,354 0,701 0,131 0,132 0,347 0,713 0,122 0,135 0,218 0,584 2,679

0,339 0,724 0,113 0,138 3 % 2 % 10 % 3 %

8D1

0,516 1,626 0,185 0,167 0,465 1,768 0,173 0,180 0,288 1,591 5,520

0,413 1,909 0,161 0,192 16 % 11 % 10 % 10 %

10F2

0,263 0,632 0,119 0,172 0,413 0,661 0,118 0,174 0,268 0,515 1,925

0,563 0,689 0,116 0,175 51 % 6 % 2 % 1 %

Bkg

0,112 0,142 0,117 0,151 0,122 0,143 0,118 0,147

0,132 0,144 0,118 0,143 12 % 1 % 1 % 4 %

S = senal, N = ruido, F= plegada de forma nativa, U = no plegada/mal plegada

Ejemplo 9

Ensayo de ELISA de anticuerpos dirigidos contra DSE5 para la afinidad por SOD1 desnaturalizada

Se exploraron clones de hibridoma que producen anticuerpos dirigidos contra DSE5 (IKGLTEGLHGF) por ELISA para la reactividad especffica contra SODl plegada de forma nativa (SOD1 en PBS) desnaturalizada o SOD1 mal plegada (SOD1 en tampon de desnaturalizacion con GdnHCl 6 M), o control de BSA plegada de forma nativa y mal plegada.

La Tabla 9 muestra la afinidad de clones de hibridoma por SOD1 plegada de forma nativa y mal plegada. Se detecto la absorbancia de cada muestra a 450 nm (columnas 2 - 5). Cada muestra se ensayo por duplicado. Los valores de las columnas 6 - 9 proporcionan los valores promedio de la afinidad de cada clon y el porcentaje de diferencia entre las dos muestras. La columna 10 representa la afinidad especffica del anticuerpo por la SOD1 plegada de forma nativa (es decir, la afinidad del anticuerpo por SOD1 menos la afinidad no especffica por BSA). La columna 11 representa la afinidad especffica del anticuerpo por la SOD1 mal plegada (es decir, la afinidad del anticuerpo por SOD1 menos la afinidad no especffica para BSA). La columna 12 proporciona el aumento factorial de la afinidad especffica de SOD1 mal plegada sobre SOD1 plegada de forma nativa. Estos resultados demuestran la afinidad especffica de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el epftopo DSE5 por SOD1 y que los anticuerpos preferiblemente estan dirigidos a formas mal plegadas de SOD1.

Tabla 9: Ensayo de ELISA de clones de hibridoma para SOD1 desnaturalizada

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

SOD1 Gdn BSA Gdn SOD1 Gdn BSA Gdn S-N S-N

PBS HCl PBS HCl PBS HCl PBS HCl (F) (U) U/F

DSE

0.14

5

0,272 0,622 0,122 0,188 0,279 0,626 0,113 0,163 1 0,488 3,457

0,286 0,629 0,104 0,138 4 % 1 % 11 % 22 %

Bkg

0,112 0,142 0,117 0,132 0,151 0,122 0,143 0,118 0,147

0,132 0,144 0,118 0,143 12 % 1 % 1 % 4 %

S = senal, N = ruido, F= plegada de forma nativa, U = no plegada/mal plegada

Ejemplo 13

Reconocimiento de SOD1 oxidada por anticuerpos dirigidos contra DSE2

Sucede dano oxidativo de las enzimas en enfermedades neurodegenerativas, y el dano oxidativo a SOD1 provoca mal plegamiento y formacion de SOD1 agregada. Los inventores demostraron que anticuerpos dirigidos contra el epftopo DSE2 (clones de hibridoma 10E11C11 y 3H1) reconocen dicha SOD1 modificada de forma oxidativa

incubando SOD1 purificada con 100 uM a 10 mM de H2O2 o con una mezcla de ascorbato y cloruro de cobre. Se sabe que estos dos tratamientos oxidan los aminoacidos en SOD1. Posteriormente, se permitio que esta SOD1 oxidada se uniera a pocillos de placa de microtitulacion y se anadio uno de dos anticuerpos anti-DSE2 diferentes. Para comparacion, los pocillos de microtitulacion se recubrieron con SOD1 no tratada y plegada normalmente en 5 tampon, o con SOD1 que se desnaturalizo con una solucion de un agente caotropico (cloruro de guanidinio, GdnHCl). Como se muestra en la Figura 2, los anticuerpos anti-DSE2 se unen preferentemente a SOD1 mal plegada en GdnHCl pero mucho menos bien que a SOD1 plegada de forma nativa en tampon. Sin embargo, despues de la oxidacion, SOD1 se reconoce de forma eficaz por los anticuerpos anti-DSE2. Esto demuestra que los anticuerpos anti-DSE2 (tanto 10E11C11 como 3H1) reconocen el tipo de SOD1 modificada de forma oxidativa que sucede en 10 pacientes con enfermedades neurodegenerativas. Estos resultados se presentan en la Tabla 10 a continuacion.

Tabla 10. Reconocimiento de SOD1 oxidada por anticuerpos dirigidos contra DSE2 Tratamiento Clones Tratamiento Clones

PBST 10E11C1 1 3H1

SOD-Gnd

0,118 1,243 2,29

0,092

1,254 2,295

0,086

1,225

Promedio

0,098 66666 7 1,240666 667 2,2925

Des. Tip. Rel.

17,24 % 1,18 % 0,15 %

PBST 10E11C11 3H1

SOD-PBS

0,088 0,357 0,34

0,094

0,362 0,335

0,082

0,389

Promedio

0,088 0,3693333 33 0,337 5

Des. Tip. Rel.

6,82 % 4,66 % 1,05 %

PBST 10E11C1 1 3H1

CuCl 3 h

0,087 1,061 1,717

0,101

1,06 1,621

0,088

1,076

Promedio

0,092 1,065666 667 1,669

Des. Tip. Rel.

8,49 % 0,84 % 4,07 %

PBST 10E11C11 3H1

CuCI 6 h

0,082 1,044 1,379

0,093

0,987 1,489

0,089

1,042

Promedio

0,088 1,0243333 33 1,434

Des. Tip. Rel.

6,33 % 3,16 % 5,42 %

PBST 10E11C1 1 3H1

CuCl 0 h

0,073 0,67 0,527

0,087

0,669 0,59

0,071

0,664

Promedio

0,077 0,667666 667 0,5585

Des. Tip. Rel.

11,32 % 0,48 % 7,98 %

PBST 10E11C11 3H1

CuCI 1 h

0,075 1,023 1,592

0,083

1,035 1,435

0,072

1,026

Promedio

0,076 66666 7 1,028 1,513 5

Des. Tip. Rel.

7,42 % 0,61 % 7,34 %

PBST 10E11C11 3H1 PBST 10E11C1 1 3H1

BSA-PBS

0,073 0,12 0,078 H2O2 100 uM 0,071 0,489 0,436

0,083

0,098 0,076 0,086 0,476 0,425

0,073

0,091 0,107 0,453

0,076

33333 0,472666

Promedio

3 0,103 0,077 Promedio 0,088 667 0,4305

PBST 10E11C11 3H1 PBST 10E11C1 1 3H1

H2O2 1 mM

0,074 0,776 0,744 H2O2 100 mM 0,078 0,836 0,763

0,081 0,752 0,717 0,092 0,84 0,726

0,074 0,781 0,083 0,878

0,076 0,084

33333 0,7696666 0,730 33333 0,851333

Promedio

3 67 5 Promedio 3 333 0,7445

Des. Tip. Rel.

5,29 % 2,01 % 2,61 Des. Tip. Rel. 8,41 % 2,72 % 3,51 %

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Ejemplo 14

Prediccion, sfntesis y refinamiento de epftopos especfficos de ALS

Los epftopos presentados por SOD1 mal plegada y no presentados por SOD1 nativa pueden determinarse analizando la estructura de SOD1 nativa para regiones de secuencia que estan ocultas por la conformacion nativa plegada normalmente de SOD1. Por ejemplo, los bucles DSE2 y DSE3 estan inaccesibles para la union al anticuerpo en la estructura nativa de SOD1, pero se demostro que se estrufan del sitio activo de SOD1 en fibrillas amiloides y estructuras de nanotubos (84). Por tanto, la exposicion de estos bucles puede ser un marcador del mal plegamiento de SOD1, pero tambien constituyen "dominios de reclutamiento" de SOD1 que estan implicados en el mal plegamiento dirigido por molde de SOD1. Los inventores identificaron DSE1, DSE4 y DSE7 como secuencias putativamente ocultas que podrfan quedar accesibles tras el mal plegamiento de SOD1.

Los epftopos presentados por SOD1 mal plegada y no presentados por SOD1 nativa pueden predecirse analizando regiones de secuencia que tienen estructura restringida. Las estructuras restringidas son menos capaces de acomodar cualquier cambio en el plegamiento resultante en cambios conformacionales en la region de secuencia y en la presentacion de epftopos accesibles no presentes en la estructura restringida. Los epftopos DSE2, 3, 5 y 6 se predijeron sobre esta base.

Las dianas peptfdicas para SOD1 agregada mal plegada proporcionan inmunogenos para el desarrollo de anticuerpos monoclonales de raton para caracterizacion bioqufmica de exposicion de epftopos que se sintetizaron y caracterizaron. Estas dianas incluyen la secuencia:

RLACGVIGI (DSE1);

DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2);

NPLSRKHGGPKDEE (DSE 3);

IKGLTEGLHGF (DSE5);

HCIIGRTLVVH (DSE6);

GSGKAVCVLK (DSE4); y CGLHGFHVH (DSE7).

Los peptidos DSE se sintetizaron y conjugaron con KLH (hemocianina de lapa californiana). Los peptidos DSE que tienen una cistefna endogena (DSE1, DSE1a, DSE4 y DSE6) se conjugaron con KLH usando el metodo DMS (reactivo y metodo de Pierce) para conjugacion amino. Los peptidos DSE que no tienen un resto de cistefna endogeno (DSE2, DSE3, DSE5 y DSE7) se conjugaron con KLH usando el metodo de sulfo-MBS (reactivo y metodo de Pierce) para conjugacion de grupos tiol.

Se sintetiza opcionalmente y se caracteriza un epftopo "de control" expuesto sobre la superficie molecular de SOD1 normal nativa. Un epftopo de control es opcionalmente un epftopo que se presenta tanto en SOD1 plegada de forma nativa como mal plegada.

Los epftopos identificados pueden tener multiples determinantes antigenicos. Los epftopos se analizan adicionalmente para determinar sub-partes de los peptidos (por ejemplo, epftopos concretos) que son inmunogenicos. El analisis de inmunogenicidad de SOD1, incluyendo el diagrama de antigenicidad, se usa para identificar epftopos concretos, peptidos aislados correspondientes a estos epftopos concretos, que se sintetizan y un inmunogeno que comprende el peptido aislado correspondiente a uno o mas de estos epftopos concretos se usa para generar anticuerpos. Se generan y ensayan anticuerpos como se describe en otros Ejemplos.

Un ejemplo de un diagrama de antigenicidad se proporciona en la Figura 3. La secuencia de aminoacidos de SOD1 se sometio al metodo informatizado de Hopps y Woods disponible al publico para predecir las localizaciones de determinantes antigenicos proteicos (Figura 3A). Ademas, la secuencia de SOD1 se sometio al metodo de Kolaskar y Tongaonkar (85) de prediccion de determinantes antigenicos (Figura 3B). Este ultimo metodo identifico los aminoacidos 4-11 (AVCVLKGD), los aminoacidos 27-33 (GPVKvWg), los aminoacidos 42-48 (LHGFHVH), los aminoacidos 93-121 GVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHE y los aminoacidos 142-149 (SRLACGVI) de SOD1 (SEQ ID NO: 15) como antigenicos.

Se hacen modificaciones adicionales a las secuencias peptfdicas aisladas correspondientes a los epftopos descritos o a los epftopos concretos identificados para potenciar la inmunogenicidad. Por ejemplo, puede oxidarse un resto de cistefna dentro del peptido aislado en acido cisteico. Un ejemplo es DSE1a donde la cistefna presente en DSE1 se remplaza con cistefna oxidada en forma de acido cisteico y se usa para crear anticuerpos.

Ejemplo 15

Epftopos analogos

Se sintetizan peptidos de epftopos analogos incorporando uno o mas aminoacidos oxidados o nitrados de acuerdo

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con la siguiente lista. El resto de cistefna (C) en DSE1 se oxida en acido sulffnico de cistefna o acido cisteico (es decir, DSE1a). El resto de lisina (K) en DSE2 se oxida en un grupo carbonilo. Uno o mas de los restos de arginina (R), lisina (K) e histidina (H) en DSE3 se oxidan para formar un grupo carbonilo. En DSE4, la lisina (K) se oxida en un grupo carbonilo y/o la cistefna (C) se oxida en acido sulffnico de cistefna o acido cisteico. En DSE5 uno o mas de K y H se oxidan en un grupo carbonilo y/o la fenilalanina se nitra en nitrotriptofano. En DSE6, uno o mas de H o R se oxida en un grupo carbonilo y/o C se oxida en acido sulffnico de cistefna o acido cisteico. En DSE7, H se oxida en un grupo carbonilo y/o F se nitra a nitrotriptofano.

DSE1: 145-151, RLACGVIGI: C

DSE2: 125-142, DLGKGGNEESTKTGNAGS: K

DSE3: 65-78, NPLSRKHGGPKDEE: R, K, H

DSE4: 3-9, KAVCVLK: K, C

DSE5: 35-45, IKGLTEGLHGF: K, H, F

DSE6: 110-120, HCIIGRTLVVH: H, C, R

DSE7: 41-48, GLHGFHVH: H, F

C: cistefna, se oxida en acido sulffnico de cistefna, y adicionalmente se oxida en acido cisteico.

H, R, K: formacion de carbonilo M: oxidacion, sulfoxido de metiona F: nitracion, nitrotriptofano

Se usan analogos peptfdicos sintetizados como inmunogenos para crear anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales y para tratar a individuos que tienen una enfermedad mediada por SOD1 mal plegada tal como ALS, AD y/o PD. Los anticuerpos se exploran frente al analogo peptfdico humanizante para la especificidad. Los clones positivos se ensayan adicionalmente para su capacidad de reconocer SOD1 mal plegada. Los anticuerpos que reconocen especfficamente SOD1 se humanizan y usan para tratar a individuos que tienen una enfermedad mediada por SOD1 mal plegada tal como ALS, AD y/o PD.

Ejemplo 16

Inmunoprecipitacion de tejido cerebral

Se obtiene tejido cerebral de pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson o ALS, y controles coincidentes. Las muestras se congelan inmediatamente en hielo seco y se pesan. El tejido congelado se corta en trozos mas pequenos y se homogeneiza (10 % p/v) en tampon de lisis (NaCl 100 mM, eDtA 10 mM, Tris 10 mM, desoxicolato al 0,5 %, NP-40 al 0,5 %, pH 7,4) y solucion de inhibidor completo de proteasa libre de EDTA Roche 1 x (Roche) con un homogeneizador con mano de mortero de sedimentacion. Este homogeneizado se centrifuga a 2000 x g; el sobrenadante se menciona como la "fraccion soluble" y la fraccion sedimentada se menciona como la "fraccion insoluble". Los homogeneizados tisulares se dividen en alfcuotas inmediatamente y se congelan a -80 °C antes de su uso. Para experimentos con la fraccion insoluble, el sedimento se resuspende en tampon de lisis. La concentracion de protefnas se determina usando el ensayo de protefna BCA (Pierce). Se inmunoprecipitan 100 pg de protefna, diluida a 1 ml con PBS que contenfa inhibidores de proteasa 1 x, con 5-10 pg de un anticuerpo monoclonal que se une a epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 acoplada a perlas magneticas activadas con tosilo Dynabeads M-280 (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los anticuerpos que se unen a epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 incluyen SEDI SOD (anti-DSE1) descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 60/741.462. Este anticuerpo es especffico para el epftopo que comprende la secuencia RLACGVIGI.

En resumen, se dializan 100 pg de IgG SEDI SOD frente a 3 cambios de PBS. Esto se incuba con 300 pl de perlas magneticas de reserva pre-lavadas en PBS a 4 °C durante un mfnimo de 96 h. Esto va seguido por bloqueo con BSA al 0,1 % en Tris 0,2 M, pH 8,5 durante 24 h a 4 °C. En un protocolo alternativo, se usan perlas de protefna G sepharose (Sigma) para precipitar IgG SEDI SOD.

En un protocolo alternativo, se usan otros anticuerpos que se unen a epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 en los experimentos de inmunoprecipitacion, incluyendo los epftopos descritos en el documento WO 2005/019828 (DLGKGGNEESTKTGNAGS y NPLSRKHGGPKDEE), y anticuerpos contra los mismos, creados, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 60/778.379, presentada el 3 de marzo de 2006, y los epftopos descritos en Khare et al. (8) (IKGLTEGLHGF y HCIIGRTLVVH).

Ejemplo 17

Inmunoprecipitacion y deteccion de SOD1 mal plegada a partir de tejido cerebral

Se obtienen tejidos cerebrales de un paciente humano normal, de un raton de tipo silvestre, de un raton transgenico

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que sobreexpresa SOD1 humana de tipo silvestre y de un raton modelo G93A para ALS, que expresa una forma mal plegada de SOD1. Las muestras se congelaron inmediatamente en hielo seco y se pesaron. El tejido congelado se corto en trozos mas pequenos y se homogeneizo (10 % p/v) en tampon de lisis (NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, Tris 10 mM, desoxicolato al 0,5 %, NP-40 al 0,5 %, pH 7,4) y solucion de inhibidor completo de proteasa libre de EDRA Roche 1 x (Roche) con un homogeneizador con mano de mortero de sedimentacion. Este homogeneizado se centrifugo a 2000 x g; el sobrenadante se menciono como la "fraccion soluble" y la fraccion sedimentada se menciona como la "fraccion insoluble". Los homogeneizados tisulares se dividieron en alfcuotas inmediatamente y se congelaron a -80 °C antes de su uso. Para experimentos con la fraccion insoluble, el sedimento se resuspendio en tampon de lisis. Se determino la concentracion de protefnas usando el ensayo de protefna BCA (Pierce). Se inmunoprecipitaron 100 pg de protefna, diluida a 1 ml con PBS que contenfa inhibidores de proteasa 1 x, con 5-10 pg de un anticuerpo monoclonal que se unfa a DLGKGGNEESTKTGNAGS, un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1, acoplado a perlas magneticas activadas con tosilo Dynabeads M-280 (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para la inmunotransferencia, se uso un anticuerpo dirigido contra DLGKGGNEESTKTGNAGS para detectar SOD1 a partir de protefnas celulares de muestras de tejido cerebral que se habfan resuelto por electroforesis en gel.

Como se demuestra en la Figura 4, un anticuerpo dirigido contra DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) inmunoprecipitaba con una forma mal plegada de SOD1 en tejidos cerebrales de ratones mutantes G93A, y a un grado mucho menor SOD1 humana de tipo silvestre sobreexpresada. Este anticuerpo no inmunoprecipitaba formas nativas de SOD1 de raton o humana. Sin embargo, el anticuerpo dirigido contra DSE2 reconocfa SOD1 humana y de raton desnaturalizada por inmunotransferencia directa.

En un protocolo alternativo, se usan otros anticuerpos que se unen a epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 en los experimentos de inmunoprecipitacion, incluyendo los epftopos descritos en el documento WO 2005/019828 (NPLSRKHGGPKDEE), y anticuerpos contra los mismos, creados, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 60/778.379, presentada el 3 de marzo de 2006, y los epftopos descritos en Khare et al. (8) (IKGLTEGLHGF y HCIIGRTLVVH).

Ejemplo 18

Inmunohistoqufmica de tejido cerebral

Se obtiene tejido cerebral de pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson o ALS, y controles coincidentes. Las muestras se incuban con formalina tamponada con fosfato libre de metanol al 10 % (Fisher Scientific). Las muestras tisulares se diseccionan, incrustan en parafina y se cortan secciones de 6 pm de forma longitudinal o transversal usando un microtomo rotatorio. Todas las secciones para inmunohistoqufmica se tratan con H2O2 al 3 % (v/v) y tampon citrato sodico 10 mM, pH 6,0 antes del marcaje. Se usan anticuerpos que se unen a epftopos presentados selectivamente o accesibles a formas no nativas de SOD1. En todos los casos, los anticuerpos primarios se dejan reaccionar durante una noche a 4 °C. Las secciones se revelan usando el sistema DakoCytomation Envison™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando 3,3'-diaminobencidina (DAB) como cromogeno. Para marcaje doble, se usa el kit de tincion doble DakoCytomation Envison™ DoubleStain con nitro-azul de tetrazolio (NBT) como cromogeno. Las secciones tenidas se visualizan usando un microscopio Leica DM 6000 y se obtienen imagenes digitales con una camara digital a color Micropublisher 3.3 RTV (Qimaging).

Ejemplo 19

Inmunohistoqufmica de tejido cerebral de enfermedad de Alzheimer

Los tejidos se prepararon por fijacion en formalina y se incrustaron en parafina. Los tejidos se seccionaron (4 micrometres), se montaron en portaobjetos de microscopio cargados y se calentaron en un horno de secado de tejidos durante 45 minutos a 60 °C. Los portaobjetos se desparafinizaron lavando los portaobjetos en xileno (3 x 5 min.) y se rehidrataron lavando los portaobjetos en concentraciones decrecientes de alcohol (3 x 3 min. usando alcohol al 100 %; 2 x 3 min. usando alcohol al 95 %; 1 x 3 min. usando alcohol al 80 %) y agua destilada. Los portaobjetos se vaporizaron en tampon citrato sodico 0,01 M, pH 6,0 a 99-100 °C durante 20 minutos y se incubaron a TA durante 20 minutos. Los portaobjetos se aclararon en TBS 1 x con Tween (TBST) durante 1 minuto a TA.

Los portaobjetos se incubaron con un bloqueo de protefnas durante 20 minutos, se sondearon con anticuerpo primario durante 45 minutos y se aclararon con TBST. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado durante 30 minutos y despues se aclararon con TBST. Los portaobjetos a continuacion se incubaron en estreptavidina con fosfatasa alcalina durante 30 minutos, se aclararon en TBST y se incubaron con sustrato durante 30 minutos. Despues de aclarar en agua destilada, los portaobjetos se examinaron por microscopia.

Se obtuvo tejido cerebral del hipocampo de la autopsia de una mujer de 78 anos de edad diagnosticada con enfermedad de Alzheimer y tejido normal de hipocampo de control de una mujer de 52 anos de edad. Las muestras se incubaron con formalina tamponada con fosfato libre de metanol al 10 % (Fisher Scientific). Las muestras

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tisulares se diseccionaron, incrustaron en parafina y se cortaron en secciones de 6 pm de forma longitudinal o transversal usando un microtomo rotatorio. Todas las secciones para inmunohistoqufmica se trataron con H2O2 al 3 % (v/v) y tampon citrato sodico 10 mM, pH 6,0 antes del marcaje. Se uso un anticuerpo especffico para el epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) como anticuerpo primario para tenir las secciones tisulares a una concentracion de 5 pg/ml (Figura 5). Los anticuerpos se dejaron reaccionar durante una noche a 4 °C. Las secciones se revelaron usando el sistema DakoCytomation Envison™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando 3,3'-diaminobencidina (DAB) como cromogeno. Para marcaje doble, se usa el kit de tincion doble DakoCytomation Envison™ DoubleStain con nitro-azul de tetrazolio (NBT) como cromogeno. Las secciones tenidas se visualizaron usando un microscopio Leica DM 6000 y se obtuvieron imagenes digitales con una camara digital a color Micropublisher 3.3 RTV (Qimaging). La seccion del hipocampo obtenida de la mujer de 78 anos de edad con enfermedad de Alzheimer en fase tardfa mostro fuerte tincion de placas seniles en el cerebro con enfermedad de Alzheimer con el anticuerpo dirigido contra DSE2 (Figura 5B, panel de la izquierda), asf como tincion aumentada con subconjuntos de neuronas en la seccion del hipocampo con enfermedad de Alzheimer (Figura 5B, panel de la derecha) en comparacion con el hipocampo normal (Figura 5A).

Estos datos demuestran que SOD1 mal plegada esta presente de forma intracelular y extracelular en cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer y que el anticuerpo dirigido contra el epftopo DSE2 CDLGKGGNEESTKTGNAGS reconoce protefnas S0D1 mal plegadas encontradas en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 20

Inmunohistoqufmica de tejido cerebral de enfermedad de Parkinson

Los tejidos se prepararon por fijacion en formalina y se incrustaron en parafina. Los tejidos se seccionaron (4 micrometres), se montaron en portaobjetos de microscopio cargados y se calentaron en un horno de secado de tejidos durante 45 minutos a 60 °C. Los portaobjetos se desparafinizaron lavando los portaobjetos en xileno (3 x 5 min.) y se rehidrataron lavando los portaobjetos en concentraciones decrecientes de alcohol (3 x 3 min. usando alcohol al 100 %; 2 x 3 min. usando alcohol al 95 %; 1 x 3 min. usando alcohol al 80 %) y agua destilada. Los portaobjetos se vaporizaron en tampon citrato sodico 0,01 M, pH 6,0 a 99-100 °C durante 20 minutos y se incubaron a TA durante 20 minutos. Los portaobjetos se aclararon en TBS 1 x con Tween (TBST) durante 1 minuto a TA.

Los portaobjetos se incubaron con un bloqueo de protefnas durante 20 minutos, se sondearon con anticuerpo primario durante 45 minutos y se aclararon con TBST. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado durante 30 minutos y despues se aclararon con TBST. Los portaobjetos a continuacion se incubaron en estreptavidina con fosfatasa alcalina durante 30 minutos, se aclararon en TBST y se incubaron con sustrato durante 30 minutos. Despues de aclarar en agua destilada, los portaobjetos se examinaron por microscopia.

Se obtuvo una muestra de cerebro de una mujer de 79 anos de edad con demencia. La seccion tenida con H y E (Figura 6, panel A) mostro sustancia negra con neuronas dopaminergicas que mostraban cuerpos de Lewy ocasionales coherentes con enfermedad de Parkinson. El anticuerpo anti-DSE2 mostro tincion debil principalmente negativa a inusual en neuronas pigmentadas y no pigmentadas dentro de la sustancia negra (Figura 6, panel B, C, D y E). Los cuerpos de Lewy fueron negativos (Figura 6, panel B). El neuropilo adyacente fue escasamente positivo, y los astrocitos eran de escasamente a ocasionalmente moderadamente positivos. Los cuerpos amilaceos fueron fuertemente positivos. Esta muestra demostro placas seniles inusuales en la materia gris adyacente que era fuertemente positiva (Figura 6, panel F). Se evaluaron secciones en serie adyacentes en ausencia de anticuerpo primario como control y todas fueron negativas.

Estos datos demuestran que S0D1 mal plegada esta presente en cerebros de pacientes con enfermedad de Parkinson y que el anticuerpo dirigido contra el epftopo DSE2 DLGKGGNEESTKTGNAGS reconoce protefnas S0D1 mal plegadas encontradas en los cerebros de pacientes con enfermedad de Parkinson.

Ejemplo 21

Inmunorreactividad de DSE2 de SOD1 en enfermedad

Los inventores han detectado inmunorreactividad de DSE2 en todos los tipos de ALS (formas esporadicas, asf como ALS familiar de S0D1 y ALS familiar sin mutaciones de S0D1). La inmunorreactividad es detectable como depositos densos concretos dentro de algunas neuronas motoras de la medula espinal, incluyendo axones motores en la rafz ventral, asf como depositos marcados extracelulares dentro de las astas anteriores de la medula espinal, y dentro de los axones del tracto motor. Ademas, la inmunorreactividad de DSE2 es detectable de forma intracelular en neuronas del hipocampo en AD, pero no en individuos normales de edad coincidente. Ademas, la inmunorreactividad de DSE2 tambien se aprecia en forma regionalmente difusa en placas seniles y depositos marcados de forma extracelular en el hipocampo. S0D1 mal plegada extracelular en enfermedades neurodegenerativas es claramente una diana para inmunoterapia, que puede "neutralizar" la actividad toxica de las especies mal plegadas acelerando la degradacion por la microglia, y/o por bloqueo de la actividad enzimatica

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anormal de esta protefna mal plegada.

Ejemplo 22

Inmunizacion con epftopo especffico de ALS de ratones de modelo de ALS

Este estudio muestra que la vacunacion con secuencias peptfdicas especfficas de la enzima superoxido dismutasa uno (SOD1) previene la enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrofica (ALS).

Se inmunizan IP ratones transgenicos que expresan SOD1 mutante humana G93A y G37R con epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica acoplado a KLH y peptidos de control cada mes antes de la aparicion de la enfermedad de neurona motoras (4 meses y 6 meses, respectivamente). El retardo o la anulacion de la agregacion de SOD y la aparicion de la enfermedad sucede para epftopos terapeuticamente activos, y se controlan las manifestaciones autoinmunitarias potenciales para los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica y para los epftopos de control.

Estos metodos se usan con los ratones de modelo G93A y G37R. Los ratones de modelo G93A y G37R expresan ciertas formas mutantes de la protefna SOD1 humana y desarrollan una enfermedad tipo ALS de forma clfnica y neuropatologica. Se usan setenta y dos de cada raton modelo para este estudio. Se ensayan siete diferentes epftopos peptfdicos especfficos de ALS para formas no nativas de SOD1 y se comparan con dos grupos de control (uno no tratado y uno tratado con adyuvante en solitario). Cada grupo consistfa en 8 animales.

Se asignaron aleatoriamente ratones transgenicos hemicigoticos de cuatro semanas de edad (transgen y numero de copias confirmados por PCR y transferencia de Southern) en uno de nueve grupos para inmunizacion: sin inmunizacion (NI); hemocianina de lapa californiana (KLH) en solitario mas adyuvante; o una de siete secuencias peptfdicas DSE de SOD1. Todos los peptidos se sintetizan, purifican y acoplan a KLH usando SMCC-Sulfolink. Todos los ratones se inmunizan inicialmente a traves de inyeccion intraperitoneal (IP) con 100 pg de peptido acoplado a KLH o KLH en solitario, emulsionado 1:1 en adyuvante completo de Freund (FCA), en un volumen total inyectado de 100 pl. Tres semanas despues, se da a los ratones una inyeccion subcutanea de peptido acoplado a KLh emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Despues de ello, se da a los ratones inyecciones subcutaneas mensuales de peptido acoplado a KLH emulsionado en IFA. Despues de cuatro inmunizaciones, se recogen 100 pl de sangre de la vena safena, y se determinan los tftulos de anticuerpo en plasma.

Los animales se pesan 2-3 veces por semana. Se evalua el reflejo de extension de la pata cuando los animales se levantan por la base de la cola y se retiran de su jaula para pesarlos. La reduccion en la extension de la pata es un deficit prematuro observado en ratones transgenicos de SOD1 mutante. El comportamiento de los ratones se controla semanalmente usando el ensayo de campo abierto (EthoVision, Noldus Information Technology, Leesburg, VA, EE. UU.) y se hace el analisis de la forma de caminar semanalmente usando DigiGait. Las evaluaciones del comportamiento inicial y la forma de caminar se completan justo antes de la primera inmunizacion y sirven como datos basales.

Se analizan los sistemas de cerebro, medula espinal y otros organos no del SNC postmortem para los indices morfologicos y bioqufmicos de neurodegeneracion.

Los animales se pesan y controlan regularmente para los efectos adversos tales como signos de dolor y sufrimiento que podrfan ser un resultado de las inmunizaciones. Tambien se controla la autoinmunidad.

La vacunacion con epftopos peptfdicos especfficos de ALS previene la enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrofica (ALS). El retardo o anulacion de la agregacion de SOD y la aparicion de la enfermedad suceden para epftopos terapeuticamente activos, y no para los controles.

Ejemplo 23

Inmunizacion con epftopo especffico de ALS para ratones de modelo de ALS

Se asignaron aleatoriamente ratones de modelo G93A o G37R de cuatro semanas de edad en uno de siete grupos para inmunizacion: solucion salina; hemocianina de lapa californiana (KLH); DSE1; DSE1a; DSE2; DSE5; y DSE1a + DSE2 + DSE5. Todos los peptidos se conjugan con KLH. Todas las inmunizaciones se administran junto con un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Los animales se evaluan para cambios en el reflejo de extension de la pata, el comportamiento y la forma de caminar. Se analizan los sistemas de cerebro, medula espinal y otros organos no del SNC postmortem para indices morfologicos y bioqufmicos de neurodegeneracion.

La vacunacion con un acido nucleico que codifica un epftopo especffico de ALS previene la enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrofica (ALS). El retardo o anulacion de la agregacion de SOD y la

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aparicion de la enfermedad suceden para epftopos terapeuticamente activos, y no para los controles.

Ejemplo 24

Inmunizacion de ratones del modelo de ALS con acido nucleico

Se asignan aleatoriamente ratones de modelo G93A o G37R de cuatro semanas de edad para inmunizacion con un acido nucleico que codifica un epftopo especffico de ALS y un acido nucleico de control no relacionado. Todos los acidos nucleicos se administran con un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Los animales se evaluan para cambios en el reflejo de extension de la pata, el comportamiento y la forma de caminar. Se evaluan los sistemas de cerebro, medula espinal y otros organos no del SNC postmortem para los indices morfologicos y bioquimicos de neurodegeneracion.

La vacunacion con un acido nucleico que codifica un epftopo especffico de ALS previene la enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrofica (ALS). El retardo o anulacion de la agregacion de SOD y la aparicion de la enfermedad suceden para epftopos terapeuticamente activos, y no para los controles.

Ejemplo 25

Infusion de anticuerpo contra epftopo especffico de ALS de ratones de modelo de ALS

A ratones G93A y G37R se les infundio por via intravenosa (IV) anticuerpos monoclonales dirigidos contra los epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica tras la aparicion de la enfermedad, para un modelo mas cercano de inmunoterapia de ALS. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos, sin efecto por los anticuerpos de control de isotipo. Se controla la autoinmunidad para el epftopo especffico de esclerosis lateral amiotrofica y para anticuerpos de control, incluyendo epftopo expuesto nativo.

Los ratones de modelo G93A y G37R expresan ciertas formas mutantes de la protefna SOD1 humana y desarrollan una enfermedad tipo ALS de forma clfnica y neuropatologica. Se usan treinta y dos ratones de cada cepa para este estudio, con 8 ratones asignados aleatoriamente a cada uno de dos grupos de tratamiento con anticuerpos dirigidos contra un epftopo presentado selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 y dos grupos de control. Se asignan aleatoriamente ratones de 8 semanas de edad en uno de 4 grupos: 1. Un anticuerpo dirigido contra un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 inyectado por via intraperitoneal (IP); 2. Un anticuerpo dirigido contra un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 infundido por via intracerebroventricular (ICV); 3. PBS inyectada IP (control); y 4. Solucion salina tamponada con fosfato (PBS) infundida ICV (control).

Los ratones reciben inyecciones IP semanalmente de 1 ml de anticuerpo purificado en PBS (250 pl/ml) o PBS en solitario. Para infusion ICV, los ratones se anestesian con gas isoflurano suministrado por una mascarilla, y se les implanta bombas mini-osmoticas (Alzet modelo n.° 2004; longitud: 3 cm, volumen total: 200 ul, caudal: 0,25 ul/h). Esta bomba proporciona infusion constante de 0,125 ug/h (un total de 25 ug por semana) durante al menos 4 semanas. Las bombas que contienen anticuerpo contra DSE2 purificado o PBS se instalan en un kit de infusion cerebral (kit 3 de infusion cerebral Alzet), usando una canula colocada en el tercer ventrfculo. Las bombas se remplazan despues de 4 semanas de uso.

Los ratones se pesan y evaluan para la funcion motora y el comportamiento antes de las inyecciones IP o del implante de las bombas para que sirvan como datos basales. Despues de ello, se realizan estos ensayos una vez por semana. Los ensayos incluyen:

a. ) Reflejo de extension de la extremidad posterior: Reduccion en la extension de la extremidad posterior cuando los animales se levantan por la cola como un deficit prematuro observado en ratones transgenicos de SOD1 mutante. Los animales se levantan por la base de la cola y se valoran los reflejos de extension y postural de la extremidad posterior. El valor 3 indica extension completa y reflejo postural normal. El valor 2 indica extension moderada y reflejo postural normal. El valor 1 indica mala extension y reflejo postural. El valor 0 indica ausencia de movimiento de la extremidad posterior.

b. ) Ensayo de campo abierto: El ensayo de campo abierto se hace semanalmente usando EthoVision Pro Version 3.1 (Noldus Information Technology, Leesburg, VA, EE. UU.). Los animales se colocan en un area circular cerrada (50 cm de diametro) con una parte superior abierta y se registran durante aproximadamente 5 minutos con una videocamara digital suspendida. Se cuantifican fuera de lfnea varios parametros de comportamiento. Se controlan cuatro animales simultaneamente en areas separadas.

c. ) Analisis de la forma de caminar: el analisis de la forma de caminar se hace semanalmente usando DigiGait (Mouse Specifics, Boston, MA, EE. UU.). Se presentan cambios en la colocacion de la pata y en la longitud de zancada como los cambios funcionales mas prematuros observados en ratones transgenicos B6.Cg-Tg SOD1 G93A, evaluados usando DigiGait.

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A las 12 semanas de edad, se recogen 100 pi de sangre de los ratones a traves de la vena safena y se determinan los tftulos de anticuerpo en plasma. Para ratones tratados ICV, la sangre se recoge con anestesia cuando se remplazan las bombas. Los ratones tratados IP tambien se anestesian con isoflurano para facilitar la recogida de sangre.

Los animales se pesan y controlan regularmente para los efectos adversos tales como signos de dolor y sufrimiento mientras dura el estudio. A los animales que parecen tener dolor se les administra Buprenorfina.

Se analizan los sistemas de cerebro, medula espinal y otros organos no del SNC postmortem para los indices morfologicos y bioquimicos de neurodegeneracion.

La inyeccion o infusion de anticuerpos dirigidos contra un epitopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 es eficaz en el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrofica (ALS). El tratamiento de ratones de modelo G93A y G37R a traves de inyeccion o infusion de anticuerpos dirigidos contra un epitopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1: ha neutralizado y eliminado SOD1 mutante; a prevenido la formacion de agregados de SOD1; ha retardado la aparicion de la enfermedad; y/o ha ralentizado la progresion de la enfermedad.

Ejemplo 26

Tratamiento de ratones G93A con anticuerpo contra DSE2

A ratones de modelo G93A se les infundio anticuerpos monoclonales dirigidos contra la secuencia peptfdica DSE2. Los ratones de modelo G93A expresan formas mutantes de la protefna SOD1 humana y desarrollan una enfermedad tipo ALS de forma clfnica y neuropatologica. El anticuerpo se administro por infusion intracerebroventricular (ICV), usando un cateter cerebral (cateteres Alzet®) y una bomba implantada por via subcutanea (bombas osmoticas Alzet®) o por inyeccion intraperitoneal de anticuerpo anti-DSE2.

Para infusion ICV, se asignaron aleatoriamente 8 ratones a cualquier grupo de tratamiento (4 animales) o al grupo de control (4 animales). Para el tratamiento, se llenaron las bombas Alzet con 200 ul de solucion de anticuerpo (de 0,5 a 0,6 mg/ml) en solucion salina, o en solucion salina en solitario para el control. El anticuerpo se suministro a un caudal de 0,125 ug/h durante 4 semanas. A 2 ratones adicionales se les infundio por inyeccion intraperitoneal (IP) 1 mg de anticuerpo anti-DSE2, seguido por 3 inyecciones adicionales de 1 mg de anticuerpo anti-DSE2 en solucion salina a intervalos semanales. A 2 ratones se les inyecto el control con solucion salina sin anticuerpo.

Se controlo la progresion de la enfermedad en ratones tratados y no tratados usando el analisis de la forma de caminar (DigiGait, Mouse Specifics Inc, Boston, MA). El analisis Digigait permite una medicion muy precisa de los cambios en los parametros de la forma de caminar en este modelo de raton que permite una evaluacion muy precisa y objetiva de la progresion de la enfermedad (Wooley CM, Sher RB, Kale A, Frankel WN, Cox GA, Seburn KL.; Gait analysis detects early changes in transgenic SOD1 (G93A) mice. Muscle Nerve. Julio de 2005;32(1):43-50). Segun progresa la enfermedad, aumenta el tiempo de zancada. Los inventores han descubierto que el tiempo de zancada es un parametro sensible para medir la progresion de la enfermedad.

La Tabla 11 muestra los resultados de las mediciones del tiempo de zancada usando analisis Digigait de animales tratados despues de 25 dfas de tratamiento (inyeccion IP) y de 28 a 35 dfas de tratamiento (infusion ICV). El tiempo de zancada se mide en segundos y se promedia sobre la longitud del estudio y las cuatro patas. El tiempo de zancada promedio 0,3238 segundos en el control infundido ICV. La progresion de la enfermedad, medida por el tiempo de zancada, se retarda significativamente despues de 35 dfas de tratamiento. El tiempo de zancada es menor en animales tratados y se reduce hasta 0,2988 segundos. El tiempo de zancada tambien se mejora en ratones inyectados IP. El tiempo de zancada promedio 0,3366 segundos para animales de control y mejoro hasta 0,3206 segundos despues de 28 dfas de tratamiento.

Para la comparacion y para demostrar el efecto de la progresion de la enfermedad, se determino el tiempo de zancada para ratones no tratados en un promedio de 66 y 122 dfas de edad (edad del animal en el mismo intervalo que los grupos de tratamiento). A los 66 dfas, los ratones no tratados tienen un tiempo de zancada promedio de 0,3254 segundos (DES.TIP. 0,0313). A los 122 dfas, el tiempo de zancada ha aumentado hasta 0,3492 segundos (DES.TIP. 0,0288). Claramente, en ausencia de tratamiento, este parametro aumenta con alta significancia estadfstica. Los inventores descubrieron que ambos metodos de tratamiento revierten el alargamiento del tiempo de zancada que se observas en los animales no tratados con el tiempo. Esto demuestra la eficacia de este tratamiento de anticuerpo para revertir la enfermedad asociada al fenotipo del modelo de raton de ALS.

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Tabla 11. Retardo en la progresion de la enfermedad: Tiempo de zancada de animales tratados con ____________________anticuerpos contra SOD1 especifica de enfermedad____________________

Estudio

Grupo Tiempo de zancada

Infusion ICV

Tratamiento Promedio 0,2988 s

DES.TIP. 0,0044

Control Promedio 0,3238 s

DES.TIP. 0,0449

Valor P 4,30E-02

Inyeccion IP

Tratamiento Promedio 0,3206 s

DES.TIP. 0,0044

Control Promedio 0,3366 s

DES.TIP. 0,0148

Valor P 1,82E-02

Progresion de la enfermedad

66 dfas Promedio 0,3254 s

DES.TIP. 0,0313

122 dfas Promedio 0,3492 s

DES.TIP. 0,0288

Valor P 1,04E-05

Ejemplo 27

Inmunizacion de ratones transgenicos TgCRND8

El raton TgCRND8 es un modelo murino de enfermedad de Alzheimer. Estos ratones expresan un transgen pAPP695 humano mutante (K670N/M671L y V717F) bajo la regulacion del promotor del prion de hamster sirio en el fondo de la cepa C3H/B6. Estos ratones tienen defectos de aprendizaje espacial a los 3 meses de edad que estan acompanados por niveles crecientes de Ap soluble en SDS y tambien de cantidades crecientes de placas amiloides que contienen Ap en el cerebro. Vease Janus C et al. (65).

A los ratones TgCRND8 se inmunizan IP con KLH acoplada a un epftopo presentado selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 o a un peptido de control a las 6, 8, 12, 16 y 20 semanas.

Los ratones se ensayan en una version de memoria de referencia del ensayo de laberinto de agua de Morris a las 11, 15, 19 y 23 semanas (vease, Janus C et al. (65); Janus C (66); Gass P et al. (67); y Wehner JM (6B)).

El retardo o la anulacion de la agregacion de SOD1 y la aparicion de la enfermedad sucede para el epftopo terapeuticamente activo, y se controlan las manifestaciones autoinmunitarias. Ademas de la agregacion de SOD1, se evalua la deposicion de Ap fibrilar cerebral (vease, Janus C et al. (65)).

Ejemplo 28

Infusion de anticuerpos de ratones transgenicos TgCRND8

A ratones TgCRND8 se les infunden anticuerpos que se unen a epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 o a anticuerpos de control de isotipo. Como se ha descrito anteriormente, los ratones se ensayan en una version de memoria de referencia del ensayo de laberinto de agua de Morris.

La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 y la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos, sin efecto de los anticuerpos de control de isotipo. Se controla la autoinmunidad.

Ademas de la agregacion de SOD1, se evalua la deposicion de Ap fibrilar cerebral (vease, Janus C et al. (65)).

Ejemplo 29

Inmunizacion de ratones transgenicos TgCRND8 con acido nucleico

El raton TgCRND8 es un modelo murino de enfermedad de Alzheimer. Estos ratones expresan un transgen pAPP695 humano mutante (K670N/M671L y V717F) bajo la regulacion del promotor del prion de hamster sirio en el fondo de la cepa C3H/B6. Estos ratones tienen defectos de aprendizaje espacial a los 3 meses de edad que estan acompanados por niveles crecientes de Ap soluble en SDS y tambien de cantidades crecientes de placas amiloides que contienen Ap en el cerebro. Vease Janus C et al. (65).

A los ratones TgCRND8 se inmunizan IP con KLH acoplada a un acido nucleico que codifica un epftopo presentado selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 o a un acido nucleico de control a las 6, 8, 12, 16 y 20 semanas.

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Los ratones se ensayan en una version de memoria de referenda del ensayo de laberinto de agua de Morris a las 11, 15, 19 y 23 semanas (vease, Janus C et al. (65); Janus C (66); Gass P et al. (67); y Wehner JM (6B)). Ademas de la agregacion de SOD1 se puede evaluar la deposicion de Ap fibrilar cerebral (vease, Janus C et al. (65)).

La vacunacion con un acido nucleico que codifica un epftopo presentado selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 previene la enfermedad de Alzheimer. El retardo o anulacion de la agregacion de SOD y la aparicion de la enfermedad sucede para el acido nucleico terapeuticamente activo, y no para los controles.

Ejemplo 30

Inmunizacion de ratones Ha-Syn Tg

Se usan ratones transgenicos heterocigoticos que expresan ha-syn bajo el control regulador del promotor del factor p de crecimiento derivado de plaquetas (Masliah E et al. (69)). Estos animales se usan porque son un modelo para la enfermedad de Parkinson y para la enfermedad con cuerpos de Lewy (Masliah E et al. 70)).

Los ratones transgenicos ha-syn tg se inmunizan IP con KLH acoplada a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 o a un peptido de control a las 2, 6, 8, 12, 16 y 20 semanas.

El retardo o anulacion de la agregacion de SOD y la aparicion de la enfermedad sucede para el epftopo terapeuticamente activo, y se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

La progresion de la enfermedad se evalua controlando la acumulacion de ha-syn en el cerebro de los ratones y las caracterfsticas clfnicas de implicacion neurologica (vease, Masliah E et al. (70)).

Ejemplo 31

Inmunizacion de ratones Ha-Syn Tg son acido nucleico

Se usan ratones transgenicos heterocigoticos que expresan ha-syn bajo el control regulador del promotor del factor p de crecimiento derivado de plaquetas (Masliah E et al. (69)). Estos animales se usan porque son un modelo para la enfermedad de Parkinson y para la enfermedad con cuerpos de Lewy (Masliah E et al. 70)).

Los ratones transgenicos ha-syn tg se inmunizan IP con un acido nucleico que codifica a un epftopo presentado selectivamente o accesible en formas no nativas de SOD1 o a un acido nucleico de control a las 2, 6, 8, 12, 16 y 20 semanas.

La progresion de la enfermedad se evalua controlando la acumulacion de ha-syn en el cerebro de los ratones y las caracterfsticas clfnicas de implicacion neurologica (vease, Masliah E et al. (70)).

La vacunacion con un acido nucleico que codifica un epftopo presentado selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 previene la enfermedad de Parkinson. El retardo o anulacion de la agregacion de SOD y la aparicion de la enfermedad sucede para el acido nucleico terapeuticamente activo, y no para los controles.

Ejemplo 32

Infusion de anticuerpos de ratones Ha-Syn Tg

Los ratones ha-syn tg se infunden con anticuerpos que se unen a epftopos presentados selectivamente o accesibles en formas no nativas de SOD1 o a anticuerpos de control de isotipo.

La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 y la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos, sin efecto de los anticuerpos de control de isotipo. Se controla la autoinmunidad.

La progresion de la enfermedad se evalua controlando la acumulacion de ha-syn en el cerebro de los ratones y las caracterfsticas clfnicas de implicacion neurologica (vease, Masliah E et al. (70)).

Ejemplo 33

Administracion de peptidos aislados a pacientes con ALS

Se administran las composiciones que comprenden epftopos especfficos de ALS tales como GGGRLAC*GVIGIGSG (DSE1a), DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) y IKGLTEGLHGF (DSE5) a pacientes humanos con ALS. Las composiciones se administran a pacientes con aLs.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y progresion de

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la enfermedad.

Los sujetos se controlan de forma regular para los efectos adversos tales como signos de dolor y sufrimiento que podrfan ser un resultado de las inmunizaciones. Se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

La administracion de los epftopos especfficos de ALS GGGRLAC*GVIGIGSG (DSE1a), DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) y IKGLTEGLHGF (DSE5) ralentiza la progresion de ALS. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para epftopos terapeuticamente activos.

Ejemplo 34

Administracion a pacientes con ALS: anticuerpos

Se administran anticuerpos dirigidos contra los epftopos especfficos de ALS que comprenden GGGRLAC*GVIGIGSG (DSE1a), DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) y IKGLTEGLHGF (DSE5) a pacientes humanos con ALS. Los anticuerpos se administran a los sujetos a las 2, 6, 8, 12, 16 y 20 semanas.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y progresion de la enfermedad. Tambien se controlas las manifestaciones autoinmunitarias.

Los sujetos se controlan de forma regular para los efectos adversos tales como signos de dolor y sufrimiento que podrfan ser un resultado de las inmunizaciones. Se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

La administracion de anticuerpos dirigidos contra los epftopos especfficos de ALS GGGRLAC*GVIGIGSG (DSE1a), DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) y IKGLTEGLHGF (DSE5) ralentiza la progresion de ALS. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para epftopos terapeuticamente activos.

Ejemplo 35

Administracion de anticuerpos humanizados a pacientes con ALS

Se administran directamente anticuerpos humanizados dirigidos contra epftopos especfficos de esclerosis lateral amiotrofica a pacientes humanos con ALS. Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y la progresion de la enfermedad. La administracion de un anticuerpo humanizado dirigido contra un epftopo especffico de la enfermedad ALS ralentiza la progresion de la enfermedad ALS en los pacientes. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos.

Se administran anticuerpos humanizados dirigidos contra los epftopos especfficos de ALS que comprenden los peptidos GGGRLAC*GVIGIGSG (DSE1a), DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) y IKGLTEGLHGF (DSE5) a pacientes humanos con ALS. Se administra una composicion farmaceutica que comprende 1-140 gramos (hasta 2 gramos/kilogramo) de los anticuerpos humanizados por infusion intravenosa para producir una concentracion local que varfa de 1 a 10 microgramos por ml en el SNC. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo especffico de ALS. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido contra un epftopo diferente especffico de ALS. El regimen de dosificacion variara con el estado fisiologico de los pacientes y con la respuesta del paciente al tratamiento. En un regimen de dosificacion, la dosificacion es una vez cada 3 o 4 semanas. En otros regfmenes, la dosificacion es una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana o una vez cada 2 semanas.

Ejemplo 36

Administracion intraventricular o intratecal de anticuerpos humanizados a pacientes con ALS

Se administran directamente anticuerpos humanizados contra epftopos especfficos de ALS al SNC de pacientes con ALS por infusion intraventricular o intratecal usando una bomba de infusion tal como las bombas de infusion producidas por MedTronics (Minneapolis, MN, EE. UU.). A los pacientes con ALS se les infunden de 0,5 a 5 mg por dfa de anticuerpo humanizado para obtener una concentracion final de 1 - 10 microgramos por ml en el SNC infundidos a una tasa maxima de 1 ml/h. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo especffico de ALS. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido contra un epftopo diferente especffico de ALS.

Cuando los anticuerpos humanizados se administran a pacientes con ALS por inyeccion intratecal, se extrae un volumen igual de fluido cefalorraqufdeo a traves de la misma aguja usada para la inyeccion para evitar un aumento en la presion debido al volumen de inyeccion. Se da a los sujetos una dosis que varfa del 1 % al 10 % de la dosis sistemica correspondiente. Los sujetos reciben una unica dosis de la formulacion de anticuerpo humanizado. Como

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alternativa, los sujetos reciben multiples dosis de la formulacion de anticuerpo humanizado. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo espedfico de ALS. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido contra un epftopo diferente espedfico de ALS. En regfmenes alternativos, la dosificacion es una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana o una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas o una vez al mes. En otro regimen, la dosificacion vana dependiendo del estado fisiologico del sujeto y de la respuesta del sujeto al tratamiento.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y progresion de la enfermedad. La administracion del anticuerpo humanizado dirigido contra un epftopo espedfico de la enfermedad ALS ralentiza la progresion de la enfermedad ALS en los pacientes. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos.

Ejemplo 37

Administracion a pacientes con enfermedad de Alzheimer: epftopos

El epftopo espedfico de enfermedad de Alzheimer DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) se administra a seres humanos con enfermedad de Alzheimer. Los epftopos se administran.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y la progresion de la enfermedad. En particular, se ensaya la memoria de los sujetos y se controla su comportamiento. Tambien se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

Los sujetos se controlan de forma regular para los efectos adversos tales como signos de dolor y sufrimiento que podnan ser un resultado de las inmunizaciones. Tambien se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

La administracion del epftopo espedfico de enfermedad de Alzheimer DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) ralentiza la progresion de la enfermedad de Alzheimer. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para epftopos terapeuticamente activos.

Ejemplo 38

Administracion a pacientes con enfermedad de Alzheimer: anticuerpos

Se administra un anticuerpo dirigido contra el epftopo espedfico de enfermedad de Alzheimer DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) a pacientes humanos con enfermedad de Alzheimer.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y la progresion de la enfermedad. En particular, se ensaya la memoria de los sujetos y se controla su comportamiento. Tambien se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

Los sujetos se controlan de forma regular para los efectos adversos tales como signos de dolor y sufrimiento que podnan ser un resultado de las inmunizaciones. Tambien se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

La administracion de un anticuerpo dirigido contra el epftopo espedfico de enfermedad de Alzheimer DLGKGGNEESTKTGNAGS (DSE2) ralentiza la progresion de la enfermedad de Alzheimer. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos.

Ejemplo 39

Administracion de anticuerpos humanizados a pacientes con enfermedad de Alzheimer

Se administran directamente anticuerpos humanizados dirigidos contra epftopos espedficos de enfermedad de Alzheimer a pacientes humanos con enfermedad de Alzheimer. Los anticuerpos humanizados se administran por infusion intravenosa a una concentracion que vana de 1 a 10 microgramos por ml de concentracion local en el sNc. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo espedfico de enfermedad de Alzheimer. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido contra un epftopo diferente espedfico de enfermedad de Alzheimer. En un regimen de dosificacion, la dosificacion es una vez cada 3 semanas. En otros regfmenes, la dosificacion es una vez por semana, dos veces por semana, tres veces a la semana o una vez cada 2 semanas. Como alternativa, la dosificacion vana dependiendo del estado fisiologico de los pacientes y de la respuesta del paciente al tratamiento.

Como alternativa, se administran directamente anticuerpos humanizados contra el epftopo espedfico de enfermedad de Alzheimer en el SNC de pacientes con enfermedad de Alzheimer por infusion intraventricular o intratecal. MedTronics (Minneapolis, MN, EE. UU.) proporciona dispositivos medicos para su uso en este ejemplo. La

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concentracion final de 1-10 microgramos por ml se consigue por infusion de como mucho 5 mg del anticuerpo humanizado por dfa a una tasa maxima de 1 ml/h. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido contra un epftopo diferente especffico de enfermedad de Alzheimer. Los anticuerpos humanizados se administran a pacientes con enfermedad de Alzheimer por inyeccion intratecal. Para evitar un aumento en la presion debido al volumen de inyeccion, se extrae un volumen igual de fluido cefalorraqufdeo a traves de la misma aguja usada para la inyeccion. Se da a los sujetos una dosis que varfa del 1 % al 10 % de la dosis sistemica correspondiente. Los sujetos reciben una unica dosis de la formulacion de anticuerpo humanizado. Como alternativa, los sujetos reciben multiples dosis de la formulacion de anticuerpo humanizado. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido contra un epftopo diferente especffico de enfermedad de Alzheimer. En regfmenes alternativos, la dosificacion es una vez por semana, dos veces por semana, tres veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes. En otro regimen, la dosificacion varfa dependiendo del estado fisiologico del sujeto y de la respuesta del sujeto al tratamiento.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y la progresion de la enfermedad. La administracion de un anticuerpo humanizado dirigido contra un epftopo especffico de enfermedad de Alzheimer ralentiza la progresion de la enfermedad de Alzheimer en los pacientes. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos.

Ejemplo 40

Administracion a pacientes con enfermedad de Parkinson: epftopos

Se administra un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson a pacientes humanos con enfermedad de Parkinson.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y la progresion de la enfermedad. En particular, se controla la forma de caminar, reflejo y comportamiento de los sujetos. Tambien se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

Los sujetos se controlan de forma regular para los efectos adversos tales como signos de dolor y sufrimiento que podrfan ser un resultado de las inmunizaciones.

La administracion de un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson ralentiza la progresion de la enfermedad de Parkinson. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para epftopos terapeuticamente activos.

Ejemplo 41

Administracion a pacientes con enfermedad de Parkinson: anticuerpos

Se administra un anticuerpo dirigido contra el epftopo especffico de enfermedad de Parkinson a pacientes humanos con enfermedad de Parkinson.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y la progresion de la enfermedad. En particular, se controla la forma de caminar, reflejo y comportamiento de los sujetos. Tambien se controlan las manifestaciones autoinmunitarias.

Los sujetos se controlan de forma regular para los efectos adversos tales como signos de dolor y sufrimiento que podrfan ser un resultado de las inmunizaciones. La administracion de un compuesto dirigido contra un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson ralentiza la progresion de la enfermedad de Parkinson en los pacientes. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos.

Ejemplo 42

Administracion de anticuerpos humanizados a pacientes con enfermedad de Parkinson.

Se administran directamente anticuerpos humanizados dirigidos contra epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson a pacientes humanos con enfermedad de Parkinson. Los anticuerpos humanizados se administran por infusion intravenosa a una concentracion que varfa de 1 a 10 microgramos por ml de concentracion local en el SNC. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido

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contra un epftopo diferente especffico de enfermedad de Parkinson. En un regimen de dosificacion, la dosificacion es una vez cada 3 semanas. En otros regfmenes, la dosificacion es una vez por semana, dos veces por semana, tres veces a la semana o una vez cada 2 semanas. Como alternativa, la dosificacion varfa dependiendo del estado fisiologico de los pacientes y de la respuesta del paciente al tratamiento.

Como alternativa, se administran directamente anticuerpos humanizados contra epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson al SNC de pacientes con enfermedad de Parkinson por infusion intraventricular o intratecal. MedTronics (Minneapolis, MN, EE. UU.) proporciona dispositivos medicos para su uso en este ejemplo. La concentracion final de 1-10 microgramos por ml se consigue por infusion de como mucho 5 mg del anticuerpo humanizado por dfa a una tasa maxima de 1 ml/h. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido contra un epftopo diferente especffico de enfermedad de Parkinson.

Los anticuerpos humanizados contra epftopos especfficos de enfermedad de Parkinson se administran a pacientes con enfermedad de Parkinson por inyeccion intratecal. Para evitar un aumento en la presion debido al volumen de inyeccion, se extrae un volumen igual de fluido cefalorraqufdeo a traves de la misma aguja usada para la inyeccion. Se da a los sujetos una dosis que varfa del 1 % al 10 % de la dosis sistemica correspondiente. Los sujetos reciben una unica dosis de la formulacion de anticuerpo humanizado. Como alternativa, los sujetos reciben multiples dosis de la formulacion de anticuerpo humanizado. En un regimen, la formulacion comprende un anticuerpo dirigido contra un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson. En otro regimen, la formulacion comprende dos o mas anticuerpos humanizados, cada uno dirigido contra un epftopo diferente especffico de enfermedad de Parkinson. En regfmenes alternativos, la dosificacion es una vez por semana, dos veces por semana, tres veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes. En otro regimen, la dosificacion varfa dependiendo del estado fisiologico del sujeto y de la respuesta del sujeto al tratamiento.

Los pacientes se controlan para indicaciones de ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD y la progresion de la enfermedad. La administracion de un anticuerpo humanizado dirigido contra un epftopo especffico de enfermedad de Parkinson ralentiza la progresion de la enfermedad de Parkinson en los pacientes. La ralentizacion o detencion de la agregacion de SOD1 o la anulacion de la progresion de la enfermedad sucede para anticuerpos terapeuticamente activos.

Ejemplo 43

Reproduccion de los modelos de raton de ALS G93A y G37R

Se cruzaron animales G93A y G37R macho hemicigoticos fundadores con ratones hembra de tipo silvestre de la misma cepa de fondo (C57BL/6). Las hembras no se cruzaron mas de 6 veces. Los machos G93A heterocigoticos se retiraron como reproductores a los 3 meses de edad, los ratones G37R heterocigoticos se retiraron como reproductores a los 6 meses de edad.

Quince ratones macho G93A (o G37R) hemicigoticos y 30 ratones hembra C57BL/6 formaron 15 trios de reproduccion. Dos ratones hembra se alojaron inicialmente juntas, y se les indujo el celo exponiendo las hembras al lecho sucio de su companero (efecto Whitten). Al siguiente dfa, las hembras se introdujeron en las jaulas de los machos (2 hembras por macho). Las hembras se comprobaron cada manana para los tapones.

La descendencia se identifico con perforacion en la oreja a las 3 semanas de edad, y el tejido perforado se uso para genotipado y para determinar el numero de copias del transgen. Si las perforaciones en la oreja no proporcionaban suficiente material para el genotipado y ensayo para el numero de copias del transgen, se realizaba entonces un recorte de la cola.

El destete tuvo lugar cuando la descendencia era de 3 semanas de edad, y los ratones hemicigoticos se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento experimentales.

Despues del destete, los animales se mantuvieron 4 por jaula.

Se uso un programa de reproduccion similar para ambas cepas, con ajustes apropiados para la supervivencia de los animales hemicigoticos que desarrollaban fenotipos de enfermedad (supervivencia de g93A - 145 dfas, supervivencia de G37R - 335 dfas).

Los ratones heterocigoticos G93A desarrollaban debilidad predominantes en las extremidades posteriores en aproximadamente 100 dfas de edad. La debilidad progresaba hasta un punto de paralisis de las extremidades posteriores, y los animales no eran capaces de alimentarse o de beber (es decir, incapaces de alcanzar su alimento y el agua). Este punto se observo en aproximadamente 145 dfas. En este punto, los animales se sacrificaron por eutanasia. Los animales se sacrificaron por eutanasia de forma prematura si el peso corporal disminufa en un 20 % o si presentaban otros signos de morbilidad grave.

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El transgen G37R causaba signos clfnicos similares que al transgen G93A, sin embargo, la edad de aparicion de la debilidad en los heterocigotos era de aproximadamente 300 dfas, punto desde el cual la debilidad progresaba hasta paralisis de las extremidades posteriores. Los puntos finales fueron los mismos que para los ratones G93A, sin embargo, los puntos finales habitualmente se cumplieron en aproximadamente 335 dfas en el transgenico G37R (lfnea 29).

Los ratones reproductores se pesaron semanalmente y se sacrificaron por eutanasia si perdfan el 15 % o mas de su peso corporal. Sin embargo, una perdida de peso menor del 15 % combinada con otros signos de morbilidad grave, es decir, arrugamiento de la piel, aspecto encorvado, deshidratacion obvia, etc., se consideraron un punto final humanitario para estos animales.

Ejemplo 44

Desarrollo de modelos de propagacion de ALS

En ALS, como en enfermedad por priones, la muerte neuronal se "propaga" por todo el neuroeje, implicando un mecanismo patologico para la propagacion del proceso patologico de una celula a otra. Se desarrolla un modelo de propagacion del mal plegamiento de SOD1 en sistemas sin celulas, en ensayos celulares in vitro y en animales basados en sistemas modelo similares en enfermedad de priones. Estos modelos proporcionan sistemas mas "relevantes para la enfermedad" para ensayar inmunoterapias, y evitaran los potenciales resultados falsos negativos y falsos positivos de los modelos actuales.

Los depositos biologicos de las lfneas celulares de hibridomas se hicieron de acuerdo con el Tratado de Budapest y estan disponibles en la International Depository Authority of Canada 1015 Arlington Street, Winnipeg, Canada R3E 3R2.

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<221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4)

<223> Cistefna oxidada a acido cisteico <400>8

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<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> ACETILACION

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<210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

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Cys Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu 15 10 15

<210> 13 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens

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<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2)

<223> Cistefna oxidada a acido cisteico <400> 13

Ala Cys Gly val lie Gly lie 1 5

<210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

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<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8)

<223> Cistefna oxidada a acido cisteico <400> 15

Cys Gly Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly Val lie Gly lie Gly Ser Gly 15 10 15

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Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin 15 10 15

Gly lie lie Asn Phe Glu Gin Lys Glu Ser Asrt Gly Pro Val Lys Val 20 25 30

Trp Gly Ser lie Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 40 45

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Phe Asn Pro Leu ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg 65 70 75 80

His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala 85 90 95

Asp Val Ser lie Glu Asp Ser Val lie Ser Leu Ser Gly Asp His Cys 100 105 110

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Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg 130 135 140

Leu Ala cys Gly val lie Gly lie Ala Gin 145 150

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ccaaaggatg aagagaggca tgttggagac ttgggcaatg tgactgctga 420

caaagatggt

gtggccgatg tgtctattga agattctgtg atctcactct caggagacca 480

ttgcatcatt

ggccgcacac tggtggtcca tgaaaaagca gatgacttgg gcaaaggtgg 540

aaatgaagaa

agtacaaaga caggaaacgc tggaagtcgT ttggcttgtg gtgtaattgg 600

gatcgcccaa

taaacattcc cttggatgta gtctgaggcc ccttaactca tctgttatcc 660

tgcragctgt

agaaatgtat cctgataaac attaaacact gtaatcttaa aagtgtaatt 720

gtgtgacttt

ttcagagttg ctttaaagta cctgtagtga gaaactgatt tatgatcact 780

tggaagattt

gtatagtttt ataaaactca gttaaaatgt ctgtttcaat gacctgtatt 840

ttgccagact

taaatcacag atgggtatta aacttgtcag aatttctttg tcattcaagc 900

ctgtgaataa

aaaccctgta tggcacttat tatgaggcta ttaaaagaat ccaaattcaa 960

actaaaaaaa

aaaaaaaaaa a 981

<210> 19 <211> 27 <212>ADN <213> Homo sapiens

<400> 19

agguuagcuu gugguguuau agguaua 27

<210> 20 <211> 54 <212>ADN <213> Homo sapiens

<400> 20

gauuuaggua aaggugguaa ugaagaaagu acuaaaacug guaaugcugg uagu 54

<210> 21 <211> 42 <212>ADN <213> Homo sapiens

<400> 21

aauccuuuaa gucguaaaca cggaggaccg aaggacgagg ag 42

<210> 22 <211> 33 <212>ADN <213> Homo sapiens

<400> 22

auaaagggga aaacagaagg acuccacggc uuu 33

<210> 23 <211> 33 <212>ADN <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 23

cacuguauua uuggcaggac ccucguuguu cac 33

<210> 24 <211> 27 <212>ADN <213> Homo sapiens

<400> 24

cguuuggcuu gugguguaau ugggauc

<210> 25 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

27

<400> 25

gcuuguggug uaauugggau c 21

<210> 26 <211> 54 <212>ADN <213> Homo sapiens

<400> 26

gacuugggca aagguggaaa ugaagaaagu acaaagacag gaaacgcugg aagu

<210> 27 <211> 42 <212>ADN <213> Homo sapiens

<400> 27

aauccucuau ccagaaaaca cggugggcca aaggaugaag ag

<210> 28 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

42

<400> 28

aaggccgugu gcgugcugaa g 21

<210> 29 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 29

auuaaaggac ugacugaagg ccugcaugga uuc 33

<210> 30 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 30

cauugcauca uuggccgcac acuggugguc cau 33

<210> 31 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 31

ggccugcaug gauuccaugu ucau

54

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Una composicion adecuada para tratar la esclerosis lateral amiotrofica (ALS), comprendiendo dicha composicion un vehfculo farmaceuticamente aceptable y un agente seleccionado de:

   (1) un anticuerpo exogeno o un fragmento del mismo que se une selectivamente a un epftopo que consiste en:

   (a) IKGLTEGLHGF [DSE5];

   (b) GLHGFHVH [DSE7]; o

   (c) un analogo que consiste en IKGLTEGLHGF [DSE5] o GLHGFHVH [DSE7], comprendiendo el analogo una modificacion de un aminoacido por oxidacion o nitracion; y

   (2) un inmunogeno que comprende un peptido de menos de 20 restos de SOD1 que comprende:

   a) IKGLTEGLHGF [DSE5]; o

   b) GLHGFHVH [DSE7]; o

   c) un analogo de a) o b), comprendiendo el analogo una modificacion de un aminoacido por oxidacion o nitracion.
2. 2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el agente es un anticuerpo monoclonal, policlonal, quimerico o humanizado.
3. 3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el agente es dicho inmunogeno.
4. 4. Un anticuerpo aislado que se une selectivamente a un epftopo que consiste en:

   a) IKGLTEGLHGF [DSE5] o GLHGFHVH [DSE7]; o

   b) un analogo que consiste en IKGLTEGLHGF [DSE5] o GLHGFHVH [DSE7], comprendiendo el analogo una modificacion de un aminoacido por oxidacion o nitracion.
5. 5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que el anticuerpo se produce por el hibridoma denominado 5C6 depositado con el numero de acceso 280207-01 en la International Depository Authority of Canada.
6. 6. Un inmunogeno que comprende un peptido de menos de 20 restos de SOD1 que comprende:

   a) IKGLTEGLHGF [DSE5] o GLHGFHVH [DSE7]; o

   b) un analogo que consiste en IKGLTEGLHGF [DSE5] o GLHGFHVH [DSE7], comprendiendo el analogo una modificacion de un aminoacido por oxidacion o nitracion.
7. 7. El inmunogeno de la reivindicacion 6, o la composicion de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 3, en el que dicho inmunogeno comprende adicionalmente una molecula que potencia la inmunogenicidad preferiblemente en el que la molecula es hemocianina de lapa californiana.
8. 8. La composicion, el anticuerpo aislado o el inmunogeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el epftopo o peptido consiste en:

   a) IKGLTEGLHGF [DSE5]; o

   b) un analogo que consiste en IKGLTEGLHGF [DSE5], comprendiendo el analogo una modificacion de un aminoacido por oxidacion o nitracion.
9. 9. La composicion, el anticuerpo aislado o el inmunogeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho epftopo o peptido consiste en:

   a) GLHGFHVH [DSE7]; o

   b) un analogo que consiste en GLHGFHVH [DSE7], comprendiendo el analogo una modificacion de un aminoacido por oxidacion o nitracion.
10. 10. La composicion, el anticuerpo aislado o el inmunogeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica (ALS).
11. 11. La composicion, el anticuerpo aislado o el inmunogeno para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la ALS es ALS familiar.
12. 12. La composicion, el anticuerpo aislado o el inmunogeno para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la ALS es ALS esporadica.
13. 13. Un metodo para obtener un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 5, que comprende cultivar dicho hibridoma y aislar dicho anticuerpo.
14. 14. El hibridoma denominado 5C6 depositado con el numero de acceso 280207-01 en la International Depository 5 Authority of Canada.
15. 15. Un kit para diagnosticar a un sujeto que tiene esclerosis lateral amiotrofica (ALS), comprendiendo dicho kit un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4, 5, 8 o 9 e instrucciones para su uso.