CN112730830A - 一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡及检测方法 - Google Patents
一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡及检测方法，包括安装在外壳内的PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间设置检测线和质控线，上外壳对应检测线和质控线开设视窗孔，在视窗孔一侧设置定量标识线，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。本发明通过加样孔加样本，清洗孔加稀释液的方式，以及设置定量标识线能精确控制免疫结合液，不但可提高被检测物的灵敏性、精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和简便特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测卡，特别是涉及一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡及检测方法。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，East African Swine fever,ASF)是猪的一种急性、烈性传染病，该病发病率高、死亡率高，给养猪业造成毁灭性打击，是世界各国重点防范的重大动物疫病之一，对畜牧业的危害和对国家政治、经济因素影响巨大，各国都积极采取了对非洲猪瘟病毒的预防和控制措施。
由于目前非洲猪瘟尚无有效的药物治疗或疫苗进行防控。因此快速准确的早期检出非洲猪瘟病毒是监测和控制非洲猪瘟暴发行之有效的办法。P30是非洲猪瘟病毒主要结构蛋白和强免疫原性蛋白之一，也是非洲猪瘟重要要诊断蛋白。
目前，血细胞吸附实验是国际上最经典的方法，此法敏感性高，但费时、费力，而且细胞的状态直接影响实验效果，需要新鲜细胞，难以用于非洲猪瘟爆发的早期、快速诊断，适用于最终鉴定手段；目前主要是采用间接酶联免疫吸附试验和竞争或阻断酶联免疫吸附试验，检测感染猪的低毒力或中等毒力的非洲猪瘟病毒抗体，是当今筛选鉴别诊断的有效方法。该方法可定量检测，结果直观、特异性强，灵敏度高。缺点是需要酶标仪、温育反应、洗板等条件，操作繁琐、时间长、只能在实验室专业技术人员操作。而快速胶体金非洲猪瘟抗原检测卡虽然检测方便，不需专业技术人员和现场检测，但其检测的灵敏度低，且只能定性检测。因此，研制快速、便捷、可在现场和野外进行精确检测非洲猪瘟抗原定量检测技术显得尤为重要。
鉴于我国当前需要加强控制非洲猪瘟蔓延迅速形势，非洲猪瘟抗原荧光检测卡不仅适用于现场的快速检测，也适用于非洲猪瘟的疫情监测，以及野外现场检测及偏远地区爆发的早期防控快速、敏感、准确的检测方法。
发明内容
本发明的目的：提供一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡及检测方法，能完全解决上述现有技术的不足之处。
本发明为一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，包括安装在外壳内的非洲猪瘟抗原检测条，该非洲猪瘟抗原检测条包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间包被检测线和质控线；
标记物垫上浸染标记镧系荧光微球的非洲猪瘟病毒P30蛋白单抗和标记鸡IgY抗体；检测线上包被另一株非洲猪瘟病毒P30蛋白单抗，质控线上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。
作为优选，所述样品垫上可根据检测物设置滤物垫，如检测全血，滤物垫可为滤血垫。
作为优选，所述外壳包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，在上盖上对应检测线和质控线开设视窗孔，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。
作为优选，所述视窗孔一侧设置有定量标识线。
作为优选，所述定量标识线为一根细实线。
作为优选，所述吸水垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm，稀释垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm，标记物垫与稀释垫相隔5-10mm的间距。
作为优选，所述标记物垫为加入有色素的标记物垫。这种设计使样本液在侧流液迹更明显，利于目测、仪器自动检测控制“液迹”到达位置、加稀释液时间和控制检测时间，提高试剂检测的敏感性和精密性，实现精准检测。当视窗孔看到或仪器监测到含有色素的结合液迹到达定量标识线(M)时，提示加稀释液(或清洗液)；当视窗孔再次看到深些色素时，应停止对检测卡的检测。
现有层析技术采用的方式是硝酸纤维素膜一端设置吸水垫，另一端设置标记物垫，在标记物垫上由下至上依次设置样品垫和加样孔。无论是样本还是样本稀释液在加入加样孔后，在吸水垫的引力作用下，样本液迅速向吸水垫方向侧流，由于样本基质和稀稠度不同，使样本垫中的定量的标记抗原(或抗体)不能完全地与加入的样本液进行充分免疫反应，导致检测T线和参考C线捕获地免疫结合物量产生偏差，直接影响检测结果的精密性和稳定性。
本发明提供了一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，在硝酸纤维素膜一端设置吸水垫，另一端设置稀释垫，标记物垫设置在稀释垫前方(吸水垫方向为前方)，并在标记物垫和稀释垫之间保留了5～10mm硝酸纤维素膜裸露空间。标记物垫上依次设置样品垫、滤血垫、加样孔，稀释垫上方设置清洗孔。当样本加入加样孔后，样本经过滤血垫、样本垫和标记物垫后，样本与标记的抗原或抗体免疫反应复合液，在吸水垫和稀释垫作用下，沿着硝酸纤维素膜向吸水垫和稀释垫两个方向侧流层析。
采用两个方向扩散层析复合液的特征与现有技术具有本质差异：
(1)对加样量进行两次控制，第一次是加样量的控制，第二次是依据液迹量来控制。可减少样本基质稀稠度的影响。如对太稠检测样本，按常规加样，液迹无法层析到定量控制线，可以通过补加样本或稀释液，使其“实现一致”的加样过程；
(2)增加免疫反应时间渗透入硝酸纤维素膜的样本的免疫复合液的流速会减慢直至停滞，这个停滞过程相比现有技术而言，就增加了样本和标记抗原或抗体物免疫复合反应时间，可达到提高灵敏度的作用。
(3)与现有技术中免疫反应复合液快速释放到硝酸纤维素膜(T)线上不同，本发明在加入样本后，免疫反应复合液流入硝酸纤维素膜之时，标记物垫处于半干半湿状态，标记物垫、样品垫和滤血垫的吸水性远远低于硝酸纤维素膜，因此，当稀释垫加入稀释液后，在吸水垫的作用下，稀释液带着复合液顺着硝酸纤维素膜向前侧流，来不及流入样品垫和标记物垫，稀释液只能将仅存于硝酸纤维素膜上的那部分样本和复合物稀释侧流至吸水垫，而未进入硝酸纤维素膜的剩余复合物和样本液只有极少量向硝酸纤维素膜中渗透，不会对检测结果造成影响，从而保证了检测的稳定性，提高检测的精密性。
附图说明
图1是本发明的结构示意图；
图2是外壳的俯视图；
图3是P30琼脂糖电泳鉴定图；
图4是SDS-PAGE分析图。
下面结合实施例和附图作进一步说明。
如图1至图4所示，一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，包括安装在外壳9内的非洲猪瘟抗原检测条。
所述非洲猪瘟抗原检测条包括PVC底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、稀释垫4、标记物垫5、质控线6、检测线7、样品垫8和滤物垫14。
所述硝酸纤维素膜3固定在PVC底板1上，在硝酸纤维素膜3左端搭接吸水垫2，右端搭接稀释垫4，在硝酸纤维素膜3中部靠右的位置设置标记物垫5，标记物垫5上设置样品垫8、滤物垫14，在硝酸纤维素膜3上吸水垫2与标记物垫5之间设置检测线7和质控线6。外壳9上对应检测线7和质控线6开设视窗孔10，并在视窗孔10右侧设有定量标识线(M)13，该定量标识线(M)13为一根细实线，对应样品垫8开设加样孔11，对应稀释垫4开设清洗孔12。
所述吸水垫2与硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1～2mm，稀释垫4与硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1～2mm，标记物垫5与稀释垫4之间有5～10mm的间距。
所述标记物垫5上浸染标记镧系荧光微球的非洲猪瘟病毒P30蛋白单抗和标记鸡IgY抗体；检测线7上包被另一株非洲猪瘟病毒P30蛋白单抗，质控线6上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。
作为一种优选的方案，所述标记物垫5中还加入色素组分，使流动的液迹可视或仪器监测。
所述外壳9包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，且视窗孔10、加样孔11和清洗孔12以及定量标识线(M)13位于上盖上。
根据检测样本需要，在所述样品垫8上方可设滤物垫14，如测全血样本滤物垫是用分离全血中的红细胞的滤血垫。
在检测时，从加样孔11加入样品液，加样量为5-70μL。加样量要求应大于样品垫8和标记物垫5的液体承载量之和、远小于吸水垫2和稀释垫4之和。加样量设计依据：加入样品后，样品液经过样品垫8和标记物垫5后进入硝酸纤维素膜3，由于此时稀释垫4和吸水垫2均处于干燥状态，加样液会带着样本中非洲猪瘟抗原组分与标记荧光微球的非洲猪瘟抗体的免疫反应的复合物、标记标记荧光微球的鸡IgY抗体，向硝酸纤维素膜3两侧渗透，停留在硝酸纤维素膜3的定量标识线(M)13附近，且不会流至检测线7；这时，样品液中的P30抗原组分和标记荧光微球的非洲猪瘟病毒P30单抗在硝酸纤维素膜3上就能获得更多的免疫反应时间。当样本液迹出现在定量标识线(M)13时附近时，将稀释液加入清洗孔12，稀释液首先经过稀释垫4，稀释垫4中一般包含有用于消除非特异性反应的试剂组份(如阻断剂)，稀释液与其混合后进入硝酸纤维素膜3，一方面稀释已经释放到硝酸纤维素膜3内的标记免疫反应的复合物，另方面可消除一些非特异的物质的影响，并在吸水垫2的作用下，随着稀释液向吸水垫2方向流动，与检测线7包被的非洲猪瘟单抗和质控线6上包被的抗抗体进行免疫反应，形成包含荧光标记物的免疫结合物，并被捕获停留在检测线7和质控线6上。检测线7上荧光微球的量，直接与被测样本中含有非洲猪瘟抗原的量成正相关，通过荧光强度测定，即可获得被测样本中非洲猪瘟抗原的含量。
免疫反应原理表明：在初始状态硝酸纤维素膜3干燥，样品液和标记物会迅速释放到硝酸纤维素膜3上，基本不受样品差异影响。残留在标记物垫5中的标记物和样品液会缓慢进入到硝酸纤维素膜3，此时的释放过程的快慢受样品基质差异影响较大，直接影响免疫层析的稳定性。基于此，本发明将加样孔11设置在硝酸纤维素膜3中间偏清洗孔12的位置，样品液和标记物渗透到硝酸纤维素膜3上后会向两测层析，甚至样本耗尽并停留在硝酸纤维素膜3上，并通过延迟或满足预设条件后加入稀释液的方式，大大增加免疫反应时间(即样本与标记物之间的反应时间)，从而提高了检测灵敏度和精密度。
本发明通过稀释液注入后终止标记物继续释放的双孔结构设计，以及增加控制结合液量的定量标识线(M),实施两次控制进入硝酸纤维素膜3的样品液的量(第一次是控制加样量。第二次是控制液迹的量)，可以提高非洲猪瘟抗原检测的敏感性和精密性。
本专利通过样品液和稀释液分开加样的方式，可改善以往方法只能依靠样品液自清洗的清洗效率，最大限度地保证视窗孔10中NC膜3的荧光背景。提高检测试剂的敏感性。
下面用实施例对本专利进行具体说明。
(一)非洲猪瘟病毒抗原(ASFV)P30重组蛋白的制备
步骤一、质粒构建
根据GenBank收录的ASFV基因组序列(FR682468)中的CP204L基因设计DNA序列，上游(5‘-端)带有限制性内切酶SacⅡ位点，下游(3‘-端)带有限制性内切酶PacⅠ，以及和His标签以便于重组蛋白的纯化。合成的编码ASFV重组P30蛋白的DNA序列如下：5'_GATCCCCGCGGatggattttattttaaatatatccatgaaaatggaggtcatcttcaaaacggatttaagatcatcttcacaagttgtgtttcatgcgggtagcctgtataattggttttctgttgagattatcaatagcggtagaattgttacgaccgctataaaaacattgcttagtactgttaagtatgatattgtgaaatctgctcgtatatatgcagggcaagggtatactgaacatcaggctcaagaagaatggaatatgattctgcatgtgctgtttgaagaggagacggaatcctcagcatcttcggagaacattcatgaaaaaaatgataatgaaaccaatgaatgcacatcctcctttgaaacgttgtttgagcaagagccctcatcggaggtacctaaagactccaagctgtatatgcttgcacaaaagactgtgcaacatattgaacaatatggaaaggcacctgattttaacaaggttattagagcacataattttattcaaaccatttatggaacccctctaaaggaagaagaaaaagaggtggtaagactcatggttattaaacttttaaaaaaaCATCACCATCACCATCACTAATTAATTAAGGAT-3’
合成的DNA编码的ASFV重组P30蛋白的氨基酸序列如下：
步骤二、P30 DNA克隆
合成的ASFV重组CP204L双链DNA，经SacⅡ/Pac I双酶切PCR产物后，克隆至pOET-1载体中。构建重组质粒称pOET-P30。进行扩增和提取后，质粒用于转染使用。重组质粒pOET-p30，经SacⅡ/PacⅠ双酶切、琼脂糖电泳并修溴化乙锭染色鉴定，紫外灯下目的片段大小约为610bp，与预期结果相符。测序鉴定也与预期结果相符。
步骤三、重组杆状病毒的制备及鉴定
Lipofectin转染参照试剂说明书步骤，将flashBAC DNA和pOET-P30按照flashBAC表达系统说明书制备P1代重组杆状病毒。将P1代重组病毒悬液接种Sf9细胞，经两代扩增与传代，得到P3代重组病毒。
步骤四、ASFV重组P30蛋白(rp30)的纯化和鉴定
将P3代重组病毒的上清液接种Sf9细胞，27℃培养48h，收集并裂解细胞。裂解液中的重组P30蛋白采用His GraviTrap亲和柱按照产品说明书进行纯化。裂解细胞液和提纯的蛋白后进行SDS-PAGE电泳；考马斯亮蓝染色，或采用半干法将电泳产物转印至硝酸纤维素膜上，以2％的BSA封闭2h，以SFV阳性血清(1∶200)为一抗和羊抗猪IgG-HRP(1∶10 000)为二抗，进行western blot鉴定。
(二)ASFV重组蛋白P30蛋白的单克隆抗体制备
非洲猪瘟真核表达的P30重组抗原免疫小鼠，检测结果显示与P30重组蛋白反应效价较强时，取出小鼠脾脏，在铜网上研碎收集好和SP/0骨髓瘤细胞一起加到融合管内融合，最后在96怨细胞培养板上用5％CO2培养内培养，克隆长至孔底面积1/10时，吸出上清检测抗体，筛选杂交瘤细胞，再进行亚克隆，经过多次亚克隆后得到制备纯的单克隆抗体杂交瘤细胞，制备的单克隆抗体利用间接ELISA方法进行初筛，最后再进行亚类鉴定，确定的单克隆抗体制备。
(三)非洲猪瘟病毒抗原检测卡制备
检测原理(双抗体夹心法)：如图1所示的检测卡，参考线6包被羊抗鸡IgY的IgG、检测线7包被非洲猪瘟病毒P30单抗。当含有非洲猪瘟病毒P30蛋白样本加入时，经过标记物垫时，非洲猪瘟病毒P30蛋白与标记镧系荧光微球非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体结合形成复合物，加稀释液让复合物在NC膜上流动，被T线上的另一株非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体捕获，形成双抗体夹心复合物而使T线含有镧系荧光微球；当样本中不含有非洲猪瘟病毒P30蛋白时，T线上的非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体不能与标记有非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体的镧系荧光微球形成夹心，T线就没有镧系荧光微球；标记有鸡IgY的镧系荧光微球被C线上的羊抗鸡IgY的IgG捕获，而使C线含有镧系荧光微球；通过荧光免疫分析仪检测荧光强度，即可测定被测样本中非洲猪瘟抗原的含量。
步骤一，把NC膜(Sartorius CN140)粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在NC膜上喷涂羊抗鸡IgY的IgG质控工作液，形成C线；喷涂非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体工作液，形成检测线T线；然后在37℃的温度下烘制16小时；
步骤二，制备标记有鸡IgY的镧系荧光微球和标记有非洲猪瘟病毒P30结合蛋白抗体的镧系荧光微球。将1mL的镧系荧光微球加入到5mL的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.05M，pH7.2)中，再加入10mg碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液(pH8.2)复溶，加入2mg透析过的鸡IgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2～8℃)，即得标记有鸡IgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体的镧系荧光微球；
步骤三，把标记有鸡IgY和标记有非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体的镧系荧光微球分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml混在一起，采用点膜喷金机器将其喷涂在聚酯膜上构成标记物垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
步骤四，把标记物垫切成8mm长，样品垫也切成8mm长，然后通过双面胶叠加粘在一起，然后用连续切割机切成5mm宽的加样条，并把它们组装在检测卡外壳上盖的加样孔下面；
步骤五，把305mm长、12mm宽的稀释垫和305mm长、17mm宽的吸水垫对应粘在PVC底板上的NC膜两端(叠加的宽度均为1-2mm)，组装成大卡，再用连续切割机切成5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳下盖内，把检测卡的上、下盖扣合在一起即得到本非洲猪瘟病毒P30蛋白检测卡。
非洲猪瘟检测卡检测
进行检测时，在加样孔中加入50μL血清或血浆样本，3分种后样本水印移到至检测窗口定量控制线，再在清洗孔中加入80μL清洗液层析12分钟，最后通过荧光分析仪器进行判读结果。
取新鲜待检样品(以某一阳性血清为例)，按实试例1,加样方式加入50uL样品，当液迹出现并停留在视窗孔边沿时(3分钟)，在清洗孔再加入80uL稀释液，共计免疫层析时间15min，然后用手机操控WR-1608型荧光免疫分析仪(成都微瑞生物科技有限公司产品)对双孔非洲猪瘟抗原荧光检测卡进行检测，获取检测线和质控线的荧光信号，荧光分析仪通过蓝牙把检测数据传到客户端，客户端根据检测数据计算出检测线的荧光信号强度值和质控线的荧光信号强度值，客户端通过扫描此批检测卡的条形码从云平台获得被检测非洲猪瘟病毒P30蛋白标准曲线，再根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测样本中非洲猪瘟病毒P30蛋白的含量。检测结果为13.26ng/mL，按上述方法操作，重复检测5次，检测结果分别为为14.78ng/mL、13.04ng/ml、13.18ng/ml和12.86ng/ml。检测结果显示稳定性很好，偏差CV＝5.77％。
上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不限以限制于本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，包括安装在外壳内的非洲猪瘟抗原检测条，其特征在于：该非洲猪瘟抗原检测条包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间包被检测线和质控线；
标记物垫上浸染标记非洲猪瘟病毒P30蛋白单抗的镧系荧光微球和标记鸡IgY抗体的镧系荧光微球；检测线上包被非洲猪瘟病毒P30蛋白单抗，质控线上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，其特征在于：所述外壳包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，在上盖上对应检测线和质控线开设视窗孔，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。
3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，其特征在于：所述视窗孔一侧设置有定量标识线。
4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，其特征在于：所述定量标识线为一根细实线。
5.根据权利要求1所述的非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，其特征在于：所述吸水垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm，稀释垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm，标记物垫与稀释垫之间有5-10mm的间距。
6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，其特征在于：所述标记物垫为加入有色素的标记物垫。
7.根据权利要求1所述的非洲猪瘟抗原双孔快速检测卡，其特征在于：所述样品垫上设有滤物垫。
8.一种非洲猪瘟抗原快速检测方法，包括权利要求1-7任一项所述的快速检测卡，其特征在于：从加样孔加入样品液，当液迹到达定量标识线时，向清洗孔中加入稀释液，待检测卡免疫反应结束，通过荧光免疫分析仪检测试剂卡的检测线和质控线的荧光强度、再经“标准曲线”运算，即时快、定量测定被测样本中非洲猪瘟抗原的含量。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述样品液的加入量为5-60μL。
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