ES2305809T3 - Analito nativo como referencia en ensayos de flujo lateral. - Google Patents

Analito nativo como referencia en ensayos de flujo lateral. Download PDF

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ES2305809T3 ES04754221T ES04754221T ES2305809T3 ES 2305809 T3 ES2305809 T3 ES 2305809T3 ES 04754221 T ES04754221 T ES 04754221T ES 04754221 T ES04754221 T ES 04754221T ES 2305809 T3 ES2305809 T3 ES 2305809T3
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Abstract

Un ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de un analito en una muestra de líquido, el mencionado ensayo comprendiendo: (a) una primera región que comprende un reactivo marcado, ligado de forma difusible, complementario a un analito en la muestra de líquido, donde el mencionado reactivo marcado ligado en forma difusible y el mencionado analito, forman un primer complejo difusible; (b) una región de prueba que comprende un reactivo de captura ligado de forma no difusible, capaz de formación de complejos con el primer complejo; (c) una región de control que comprende un reactivo de control ligado de forma no difusible, complementario al reactivo marcado ligado de forma difusible; y (d) una región de referencia que comprende un analito ligado de forma no difusible, capaz de formación de complejos con el mencionado reactivo marcado ligado de forma difusible, donde la intensidad de señal entre la mencionada región de prueba y la mencionada región de referencia, son paralelas entre sí en función de la interferencia, caracterizado porque el mencionado analito ligado de forma no difusible tiene una concentración predeterminada, donde la mencionada concentración representa la mínima concentración a la cual puede detectarse la presencia del analito visualmente y sin instrumentación, o mediante un instrumento que tenga un detector capaz de medir la señal a partir del marcador detectable, en ausencia de cualesquiera interferencias.

Description

Analito nativo como referencia en ensayos de flujo lateral.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere a la determinación de la concentración de analito en una muestra de prueba líquida, mediante técnicas inmunocromatográficas.
Los formatos de tira inmunocromatográfica se han hecho cada vez más populares para ensayos cualitativos, semi-cuantitativos y cuantitativos que utilizan esquemas de detección visual. Este tipo de inmunoensayos involucra la aplicación de una muestra de prueba líquida, de la que se sospecha contiene un analito a ser detectado, en una zona de aplicación de una tira de prueba inmunocromatográfica. La tira incluye un material de matriz, a través del cual el medio de prueba líquido y un analito suspendido o disuelto en este, pueden fluir mediante capilaridad desde la zona aplicación hasta una zona de captura donde una señal detectable, o su ausencia, revela la presencia del analito. Típicamente, la tira incluye un medio para fijar de forma inmunoespecífica el analito a ser detectado, con su pareja de conexión específica que soporta el marcador detectable. En un esquema semejante, tal como se revela en la patente de EE.UU. número 4 446 232, la tira contiene una pareja de conexión, móvil, marcada mediante enzima, para el analito, que es una zona de la tira corriente abajo respecto de la zona de aplicación de la muestra. Si el analito está presente en la muestra de prueba, se combina con su socio de conexión marcado, para formar un complejo que fluye a lo largo de la tira hasta una zona de detección, que contiene un sustrato para el marcador de enzima capaz de proporcionar una respuesta coloreada en presencia del marcador de enzima. La tira contiene otra zona en la que el analito es inmovilizado, de forma que el socio de conexión marcado que no combina con el analito debido a la ausencia de una cantidad suficiente de analito en la muestra, es capturado y de ese modo se impide que alcance la zona de detección. Se ha publicado diversas modificaciones de esta técnica, todas las cuales involucran sistemas de conexión específica competitiva, en los que la presencia o ausencia del analito en la muestra de prueba se determina mediante la detección o ausencia de este en el socio de conexión marcado, en la zona de captura.
En la aplicación de patente europea EP 0 462 376 se revela un procedimiento en el que se detecta la señal, en el punto de captura y en el punto de recogida conjugado de una tira inmunocromatográfica, y se determina la concentración de analito mediante la intensidad de la señal en el punto de captura, en relación con la señal en el punto de recuperación. A este respecto son también de interés las patentes de EE.UU. números 5 569 608, 6 183 972 y 6 436 721.
La mayoría de las pruebas inmunoquímicas de flujo lateral están también provistas de un procedimiento de control que típicamente consiste en anticuerpos anti-especie (del anticuerpo unido a la partícula coloreada) ligados a la membrana distal respecto de la línea de prueba. La aparición de la línea coloreada confirma que se utilizó los procedimientos correctos. Así, confirma que la muestra fue añadida, se mezcló con la partícula coloreada desecada en la almohadilla y la solubilizó, y el complejo fluyó a través de la membrana teniendo como resultado la fijación de la partícula coloreada en la línea de control. A continuación la muestra sigue ascendiendo por la tira, hasta la banda de control que contiene una banda inmóvil de IgG anti-especie, para producir la línea de control.
Algunos fabricantes proporcionan además una línea de referencia, que está localizada a medio camino entre las líneas de prueba y de control. Véase la prueba de embarazo SureStep^{TM} hCG Combo (II), Product Insert, con número de catálogo 6018, de Applied Biotech, Inc., San Diego, CA. La línea de referencia está fabricada mediante aplicar una concentración fija de otra inmunoglobulina no específica, el punto medio de la membrana entre la prueba y la línea de control. A la almohadilla, que contiene el anticuerpo de gonadotrofina coriónica humana (hCG) unido a una partícula coloreada, se añade otra partícula coloreada a la que hay unido un anticuerpo de la inmunoglobulina de referencia. La cantidad de inmunoglobulina no específica y la concentración de partícula coloreada, se ajustan para tener como resultado una línea de interferencia que tiene una intensidad equivalente a la de la sensibilidad de la línea de prueba reclamada para detección de embarazo. Así, una intensidad de la línea de prueba igual o mayor que la intensidad de la línea de referencia, sería indicativa de embarazo.
Sin embargo, a diferencia de las muestras de suero, cuyas composiciones son típicamente muy consistentes por ejemplo en términos de pH, concentración proteica e intensidad iónica, las muestras de orina son de composición considerablemente más variable. Estas diferencias representan factores de interferencia que pueden incidir sobre la conexión inmunoquímica e influir sobre la precisión del resultado. Muchos fabricantes formulan sus pruebas para compensar algunas de estas diferencias de muestra, por ejemplo de pH y niveles proteicos, mediante desecar la partícula coloreada en un tampón con contenido proteico. Sin embargo existen factores de interferencia adicionales, por ejemplo el peso específico de la orina (SG), que inciden sobre la precisión de las pruebas inmunoquímicas de flujo lateral, mediante interferir con la conexión del analito respecto de su reactivo de conexión complementario. La comparación de la intensidad de la línea de prueba respecto de la intensidad de la línea de referencia, es de poco valor salvo que los reactivos inmunoquímicos para la línea de referencia sean idénticos a los de la línea de prueba, y se vean afectados en la misma medida por variaciones en factores de interferencia tales como el peso específico.
El documento WO 00/29 852 describe un método que implica aplicar una muestra a una primera región de la matriz de prueba, se permite a la muestra fluir a una segunda región en la que esta contacta con una molécula inmunointeractiva anti-analito, y un conjugado inmunointeractivo anti-analito marcado. Cualquier complejo analito-anti-analito que se forme es inmovilizado y detectado en esta segunda región, y se permite a cualquier conjugado inmunointeractivo anti-analito marcado no complejo, fluir a una tercera región en la que es detectado. No se describe la provisión de analito ligado no difusible, a una concentración mínima en la cual la presencia del analito pueda ser detectada visualmente y sin instrumentación, en ausencia de interferencia alguna.
Así, existe la necesidad de un sistema reactivo de referencia, similar al que se utiliza para el sistema reactivo de la prueba, de tal forma que las interferencias en la conexión inmunoquímica muestren efectos paralelos sobre ambos sistemas. En el caso ideal, la intensidad de señal observada en la intensidad de la región de referencia sería análoga a la de la región de prueba, para asegurar una mayor fidelidad del resultado. La presente invención satisface esta necesidad, y proporciona asimismo ventajas relacionadas.
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Resumen de la invención
La invención está dirigida a un ensayo de flujo lateral acorde con la reivindicación 1.
La invención proporciona un ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de un analito en una muestra de prueba del líquido, por ejemplo en una muestra de orina. El ensayo de flujo lateral representa una mejora en la capacidad de detectar de forma precisa y con alta fidelidad, la presencia o ausencia de un analito objetivo en una muestra de líquido, en parte mediante abarcar una región de referencia de analito inmovilizado, no difusible, que permite la detección de cualesquiera factores que interfieren con la interacción y la fijación del analito con el reactivo de captura marcado. Cualesquiera influencias sobre la interacción y fijación del analito que está libre en solución en la muestra de prueba en líquido, frente a su reactivo marcado complementario, será detectada en paralelo en la conexión entre el analito inmovilizado en la región de referencia con el reactivo marcado, a medida que este se difunde a través de la región de referencia.
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Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un diagrama que describe la configuración de una matriz en una realización de un ensayo de flujo lateral de la invención. En esta realización, la región de referencia que contiene el analito de conexión no difusible, está localizada entre las regiones de prueba y de control.
La figura 2 muestra la respuesta cinética para una muestra hCG en orina, que tiene tres pesos específicos diferentes.
La figura 3 muestra como la intensidad de la línea de prueba disminuye en función del peso específico.
La figura 4 muestra un esquema de ensayo de flujo lateral, que contiene una región de referencia de analito de conexión no difusible.
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Descripción detallada de la invención
Esta invención está dirigida a un ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de un analito en una muestra líquida. El ensayo de flujo lateral representa una mejora en la capacidad de detectar con precisión y alta fidelidad, la presencia o ausencia de un analito objetivo en una muestra de líquido, en parte mediante abarcar una región de referencia del analito inmovilizado, no difusible, que permite la detección de cualesquiera factores que interfieren con la interacción y fijación del analito con el reactivo de captura marcado. Cualesquiera influencias sobre la interacción y la fijación del analito que está libre en solución en la muestra de prueba de líquido, con su reactivo marcado complementario, se encontrarán simultáneamente en la conexión entre el analito inmovilizado en la región de referencia respecto del reactivo marcado, a medida que este se difunde a través de la región de referencia.
En una realización, el ensayo de flujo lateral de la invención es un ensayo basado en orina. A diferencia de las muestras de suero, las muestras de orina muestran una variación en su composición, debido a una variedad de factores que incluyen por ejemplo el pH, el contenido proteico y la intensidad iónica. Estos y otros factores representan factores interferentes que pueden influir en la interacción entre un analito contenido en la orina, y una pareja de conexión complementaria para el analito concreto. Si bien algunos de estos factores interferentes pueden ser neutralizados adoptando medidas concretas en el diseño del ensayo, otros factores interferentes como por ejemplo las diferencias en el peso específico (SG) de la orina, incidirán en la precisión del ensayo de flujo lateral.
El ensayo de flujo lateral provisto por la invención, abarca una primera región que contiene un reactivo marcado, ligado de forma difusible, complementario a un analito objetivo en la muestra de líquido, en la que el reactivo marcado ligado de forma difusible y el analito objetivo, forman un primer complejo difusible; una región de prueba que contiene un reactivo de captura de conexión no difusible, capaz de la formación de complejos con el primer complejo; una región de control que contiene un reactivo de control de conexión no difusible, que es complementario al reactivo marcado de conexión difusible; y una región de referencia que contiene un analito de conexión no difusible, capaz de formar complejos con el reactivo marcado de conexión difusible. Como se describe más abajo en detalle, la posición relativa de la región de referencia en relación con las regiones primera, de prueba y de control, puede seleccionarse en función de una variedad de factores a tener en cuenta por la persona cualificada. En concreto, la región de referencia puede o bien localizarse entre la primera región y la región de prueba, o alternativamente puede localizarse entre la región de prueba y la región de control.
El ensayo de flujo lateral provisto por la invención, puede ser una prueba inmunoquímica basada en orina, que proporciona una región de referencia de analito de conexión no difusible, que permite la detección de factores de interferencia que afectan a la conexión de cualquier analito contenido en una muestra de líquido, frente al reactivo marcado complementario. Si bien parte del primer complejo movilizado, formado por el reactivo marcado ligado al analito objetivo, formará un complejo con el reactivo de captura en la región de prueba, el reactivo marcado movilizado en exceso ligará, y formará complejo, con el analito de conexión no difusible en la región de referencia. Cualesquiera factores de interferencia, también aludidos aquí como "interferentes", asociados con la muestra de líquido concreta, que afectan a la conexión del analito con el reactivo marcado complementario, afectarán en paralelo a la región de prueba y a la región de interferencia. Por tanto, la invención proporciona una región de referencia que está sometida a, y afectada proporcionalmente por, los mismos factores de referencia que la región de prueba.
El término "analito objetivo" tal como aquí se utiliza, se refiere a un compuesto o una composición a ser detectado o medido en la muestra de prueba. El analito objetivo tendrá al menos un determinante antigénico que puede reconocer un anticuerpo o un fragmento reactivo inmunológico de este. Un analito objetivo puede ser cualquier sustancia antigénica, hapteno, anticuerpo o combinación de estos. Por ejemplo, el analito de interés en un ensayo puede ser una proteína, un péptido, un aminoácido, un ácido nucleico, una hormona, un esteroide, una vitamina, un microorganismo patógeno para el que puede producirse anticuerpos policlonales o monoclonales, una sustancia química natural o sintética, un contaminante, una droga incluidas las administradas con propósitos terapéuticos así como las administradas con fines ilícitos, y metabolitos o anticuerpos de cualquiera de las sustancias anteriores. Un ejemplo preferido de una hormona adecuada para detección, es la gonadotrofina coriónica humana (hCG). El ensayo de flujo lateral provisto por la invención, puede verificar la presencia de una variedad de analitos objetivo, por ejemplo de hormona estimulante del folículo (FSH), hormona luteinizante (LH), antígeno de la gonorrea, antígeno de la clamidia, N telopéptidos reticulados, desoxipiridinolina (Dpd), anticuerpos HIV y proteínas de membrana nuclear 22 (NMP-22).
Analitos objetivo adecuados, a los que puede aplicarse el método de la invención, son cualquiera para el que pueda encontrarse una pareja de conexión específica. En general, la mayoría de los analitos objetivo significativos en sentidos médico y biológico, pueden encontrar socios de conexión específicos en anticuerpos preparados contra estos, o en fragmentos de estos anticuerpos. Así, analitos objetivo adecuados incluyen cualesquiera analitos solubles tales como hormonas, enzimas, lipoproteínas, antígenos bacterianos o víricos, inmunoglobulinas, linfoquinas, citoquinas, drogas, antígenos cancerígenos solubles, etcétera. Estos analitos incluyen varias proteínas tales como protaminas, histonas, proteínas fosforiladas, nucleoproteínas, etcétera, así como por ejemplo transcortina, eritropoyetina, transferrina, varias globulinas, globulina fijadora de tiroxina, las inmunoglobulinas de varias subclases A, G, D, E y M, varios factores complementarios, factores de coagulación de la sangre tales como fibrinógeno, factor VIII, tromboplastina tisular y trombina.
También están incluidos los analitos seleccionables como objetivo, tales como insulina, glucagón, relaxina, tirotropina, somatotropina, gonadotropina, gastrina, bradiquinina, vasopresina y varios factores de liberación. También puede determinarse un amplio rango de polisacáridos antigénicos como los de Chlamydia, Neisseria gononrheae, Pasteurella Destis, Shigella dysentereae, y ciertos hongos tales como Mycosporum y Aspergillus. Otro grupo principal de analitos objetivo adecuados, comprende secuencias de oligonucleótidos que reaccionan específicamente con otros oligonucleótidos u objetivos proteínicos.
En las realizaciones de la invención, es esencial que el reactivo marcado migre con la muestra del líquido a medida que se moviliza mediante difusión a través de la matriz del ensayo. Así, el ensayo de flujo lateral contiene una matriz a través de la cual puede influir la muestra de fluido, por capilaridad.
Tal como se utiliza aquí, el término "matriz" se refiere a cualquier material poroso capaz de proporcionar flujo lateral. Esta incluye materiales tales como nitrocelulosa, mezclas de nitrocelulosa con poliéster o celulosa, papel no tratado, papel poroso, rayón, fibra de vidrio, copolímero de acrilonitrilo o nailon. La persona cualificada en arte estará al tanto de otros materiales porosos útiles en una matriz de la invención, que permitan flujo lateral. Típicamente, la matriz tendrá la forma de una tira, a través de la cual fluye horizontalmente el fluido de la prueba, si bien la matriz podría configurarse en capas, a través de las cuales podría fluir verticalmente el fluido de la prueba, de arriba a abajo o viceversa.
La tira puede prepararse a partir de cualquier material de matriz, a través del cual puedan fluir por capilaridad el fluido de la prueba y un analito contenido en este. La matriz puede ser de un material que sea capaz de flujo lateral de no absorbente. Típicamente, la matriz cromatográfica comprende una fase sólida que puede tener forma rectangular, de forma que la muestra de líquido puede aplicarse en, o cerca de, el primer extremo de la fase sólida de la matriz cromatográfica, y difundirse por una acción de capilaridad a través de la matriz. Este tipo de flujo se describe en la patente de EE.UU. número 4 943 522, como un flujo de líquido en el que todos los componentes disueltos o dispersos del líquido, son transportados a través de la matriz a velocidades sustancialmente iguales, y con un flujo relativamente no deteriorado, frente a la retención preferente de uno o más componentes como sería el caso si el material de la matriz fuera capaz de adsorber o contener, uno o más de los componentes. Un ejemplo de un material de matriz semejante, es el material de lámina de polietileno de alta densidad o peso molecular ultra-elevado, o cualquier otro material absorbente o poroso adecuado como medio para cromatografía en capas delgadas, de analitos y conjugados analito-anticuerpo, tales como nitrocelulosa, nailon, rayón, celulosa, papel, sílice u otros materiales sintéticos no tejidos o porosos. La matriz cromatográfica cada puede ser precalentada o modificada, según se requiera. La matriz cromatográfica puede ser translúcida, de forma que la señal que aparece sobre esta puede verse desde cualquier lado.
En término "flujo lateral" se refiere al flujo de líquido por capilaridad, en el que la totalidad de los componentes disueltos o dispersos del líquido, son transportados a velocidades sustancialmente iguales y con un flujo relativamente no deteriorado, lateralmente a través de la matriz, a diferencia de la retención preferente de uno o más componentes como ocurriría con matrices capaces de absorber, o contener, uno o más componentes.
El término "ligado de forma difusible" tal como aquí se utiliza, significa que un reactivo está unido o impregnado, pero es capaz de dispersarse con la muestra de líquido y ser transportado por la muestra de líquido en el flujo lateral. El término "ligado de forma no difusible" tal como aquí se utiliza, se refiere a reactivos que están unidos al soporte, de forma que el flujo lateral de la muestra de líquido no afecta a la ubicación del reactivo inmóvil, en la región discreta de la matriz. Tal sujeción puede ser a través de medios covalentes o iónicos. Las personas cualificadas en el arte estarán al tanto de medios de sujeción para fijar de forma no difusible diversos reactivos.
El término "reactivo marcado" tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier partícula, proteína o molécula que reconoce al analito objetivo en cuestión, o se fija a este, y tiene unida, conjugada o ligada, ya sea de forma química, covalente o no covalente, iónica o no iónica, cualquier sustancia capaz de producir una señal que es detectable por medios visuales o instrumentales. El reactivo marcado está ligado de forma difusible a la matriz, en la primera región del ensayo de flujo lateral de la invención. El reactivo tiene unido un componente marcador, que es capaz de producir una señal. Los componentes de marcador adecuados del reactivo marcado incluyen cromóforos, catalizadores, compuestos fluorescentes, material coloidal y partículas no metálicas, partículas de pigmento, enzimas o sustratos, polímeros orgánicos, partículas de látex, liposomas con sustancias productoras de señal, etcétera. El componente reactivo del reactivo marcado puede ser una partícula o molécula capaz de reconocer el analito, y puede ser bien natural o artificial, preferentemente un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento de este. En una realización de la invención, el reactivo marcado puede ser un anticuerpo monoclonal frente a hCG, o frente a \beta-determinante-antigénico de hCG ligado a solución coloidal de oro, o micro-gotas de poliestireno.
El término "muestra" tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier muestra biológica que pueda contener un analito para ser detectado. Preferentemente la muestra biológica está en forma líquida, o puede transformarse a forma líquida. Preferentemente la muestra es una muestra de orina.
El término "reactivo de captura" tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier partícula o molécula que reconoce el analito objetivo en cuestión, o se fija a este. El reactivo de captura es capaz de formar un complejo ligado con el primer complejo formado por el reactivo marcado y el analito, en la muestra. El reactivo de captura está ligado de forma no difusible, al material poroso que constituye la región de prueba de la matriz del ensayo de flujo lateral. El reactivo de captura no es movilizado por el flujo lateral de la muestra de líquido, debido a que está ligado de forma no difusible al material de matriz poroso. El reactivo de captura puede ser una molécula natural o no natural, en concreto sintética. Una vez que el primer complejo se ha difundido con el flujo lateral de la muestra del líquido, a la región de prueba donde el reactivo de captura está ligado de forma no difusible, el reactivo de captura se fija al primer complejo que consiste en el reactivo marcado y el analito. En una realización de la invención, el reactivo marcado puede ser un anticuerpo monoclonal frente a hCG intacto, que ha reconocido un determinante antigénico diferente respecto del reconocido por el reactivo marcado.
Como se ha descrito aquí, el ensayo de flujo lateral de la invención incluye una región de referencia que comprende un analito nativo ligado de forma no difusible. La presencia de la región de referencia permite la detección de interferencias en la conexión entre el analito que está libre en la solución en la muestra de líquido, y el reactivo marcado ligado de forma no difusible, que está inmovilizado en la primera región de la matriz. Al contener analito nativo ligado de forma no difusible, la región de referencia sirve como indicador indirecto de la presencia de cualesquiera factores interferentes que afectan a la conexión del analito con el reactivo marcado. En concreto, debido a que los sistemas interactivos son el mismo, las intensidades de señal entre la región de prueba y la región de interferencia son análogas entre sí, como una función de la interferencia que se ha encontrado en la conexión entre el analito y su reactivo complementario. Como se ha descrito aquí, un elevado SG de una muestra de orina influye de forma similar en la conexión con el reactivo marcado, tanto del analito libre en la solución en la muestra de orina a medida que esta penetra en la primera región, como en el analito ligado de forma no difusible presente en la región de referencia.
La concentración del analito ligado de forma no difusible, en la región de referencia, se distribuye en la región de referencia a una concentración predeterminada que representa la concentración mínima o de corte, del analito, para la cual una señal sigue siendo fácilmente detectable mediante medios bien visuales o instrumentales. Así, la señal puede determinarse por medios bien visuales o instrumentales. En ausencia de cualquier interferencia en la conexión entre el analito y sus reactivo marcado complementario, puede esperarse una señal en la región de referencia tras la conexión entre el reactivo marcado, a medida que este se moviliza a través de la región de referencia y enlaza con el analito ligado de forma no difusible, presente en tal región. A la inversa, la ausencia de una señal detectada como resultado del reactivo marcado movilizándose a través de la región de referencia, y ligando con el analito ligado de forma no difusible, podría indicar la presencia de factores que interfieren con la conexión. La capacidad de determinar la presencia de factores que interfieren en la conexión, es significativa en ausencia de una señal positiva en la región de prueba, donde podría esperarse que los mismos factores de interferencia tengan como resultado un impacto análogo sobre la intensidad de señal. En concreto, la ausencia de señal tanto en la región de referencia como en la región de prueba, alerta al usuario de la posibilidad de que pueda haberse obtenido un falso resultado negativo, y justifica pruebas de confirmación para asegurar la precisión del resultado.
Así, la invención proporciona un ensayo de flujo lateral que contiene una región de referencia, de analito ligado de forma no difusible, a una concentración que representa la concentración mínima a la que puede detectarse la presencia del analito, visualmente y sin instrumentación. En una realización relacionada, la invención proporciona un ensayo de flujo lateral que contiene una región de referencia de analito de conexión no difusible, a una concentración que representa la concentración mínima a la que puede detectarse la presencia del analito, mediante un instrumento que tiene un detector capaz de medir la señal a partir de el marcador detectable. La concentración del analito en la región de referencia puede determinarse de tal forma que una señal detectada en la región de referencia, indica que el ensayo es sensible al analito a la mínima concentración detectable. Como se ha descrito aquí, la ausencia de señal tanto en la región de referencia como en la región de prueba, en combinación con la presencia de señal en la región de control, puede indicar la probabilidad de un falso resultado negativo.
La posición de la región de referencia en relación con las regiones primera, de prueba y de control, puede seleccionarse estando localizada bien entre la primera región y la región de prueba, o alternativamente entre la región de prueba en la región de control. La selección de la posición relativa de la región de referencia puede basarse en una variedad de factores, por ejemplo en la respuesta de la prueba a una elevada concentración de analito en la muestra. En concreto, si concentraciones elevadas de analito tienen como resultado una proporción significativa del primer complejo ligado con el reactivo de captura, la región de referencia puede posicionarse de tal forma que el primer complejo la contacte antes de contactar con la región de prueba. A la inversa, si concentraciones elevadas de analito no tienen como resultado una proporción significativa del primer complejo ligando al reactivo de captura en la región de prueba, la región de referencia puede posicionarse entre la región de prueba y la región de control.
En una realización concreta, la invención proporciona un ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de hCG en una muestra de orina, donde el ensayo contiene una primera región que comprende un anticuerpo anti-hCG marcado, fijado de forma difusible, donde el anticuerpo anti-hCG marcado, fijado de forma difusible, y el hCG, forman un primer complejo difusible; una región de prueba que contiene un anticuerpo ligado de forma no difusible a hCG intacto, capaz de la formación de complejos con el primer complejo; una región de control que comprende un anticuerpo de control fijado de forma no difusible, que es un anticuerpo anti-especie diferente al anticuerpo marcado ligado de forma no difusible, de la primera región; y una región de referencia que comprende un hCG ligado de forma no difusible, capaz de formación de complejos con el mencionado anticuerpo anti-hCG marcado, ligado de forma difusible. En la figura 4 se proporciona un esquema que describe un ensayo de prueba lateral de la
invención.
Tal como se utiliza aquí, el término "región de control" se refiere a una región que confirma al usuario que el ensayo ha trabajado según lo previsto. En un ensayo de flujo lateral de la invención, el término se utiliza para la zona que confirma que la muestra de líquido ha traspasado, o fluido a través de, la matriz según lo previsto. La región de control contiene el reactivo de control ligado de forma no difusible, que es complementario al reactivo marcado ligado de forma difusible, de la primera región. Así, la región de control contiene una pareja de conexión, ligada de forma no difusible, por ejemplo un anticuerpo anti-especie que se ligará con el anticuerpo marcado desde la primera región, tal como un anticuerpo anti-ratón si el reactivo marcado se ha derivado de un hibridoma de murina.
Para confirmar que de hecho la prueba se ha completado, la región de control debe estar localizada corriente abajo respecto de la región de prueba en la que se registra el resultado de la prueba. Una señal positiva en la región de control, informa al usuario de que una muestra ha traspasado la distancia requerida a través la matriz de ensayo de flujo lateral.
El término "reactivo de control" tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier partícula o molécula que es capaz de fijar el reactivo de marcado, y que no reconoce ni enlaza con el analito en la muestra. Por ejemplo, el reactivo de captura marcado puede ser un anticuerpo específico para el analito, conjugado con una solución coloidal de oro. En esta realización, el reactivo de control puede ser un anticuerpo anti-especie para el reactivo de captura marcado. Así, el reactivo de control puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, que reconoce el reactivo marcado. El reactivo de control está ligado de forma no difusible a la matriz en la región de control, que está localizada corriente abajo respecto de la región de prueba. El reactivo de control fija el reactivo de captura marcado, y lo inmoviliza. En cuanto al reactivo de captura se fija de forma no difusible en un punto discreto en la matriz, el reactivo de control es además inmovilizado en un punto discreto sobre la matriz, aludido como región de control.
Mediante medir la señal a partir de la propiedad físicamente detectable del marcador detectable, en la zona de referencia que contiene el analito inmovilizado como el medio de conexión, y la señal procedente de la propiedad detectable físicamente del marcador, en la zona de prueba en la que el reactivo de captura inmovilizado contra el primer complejo marcado es el medio de conexión, y determinar la proporción entre estas señales, puede incrementarse la precisión de la prueba para el analito. La precisión se incrementa debido a que esta técnica corrige factores de interferencia que perturban la interacción de conexión entre el analito y el reactivo.
El marcador puede ser una entidad cuya presencia puede detectarse fácilmente. Preferentemente, el marcador es un marcador directo, que en su estado natural es fácilmente visible, bien a simple vista o con la ayuda de un filtro óptico y/o de estimulación aplicada, por ejemplo luz ultravioleta para promover fluorescencia. Por ejemplo pequeñas partículas coloreadas, tales como soluciones coloidales de pigmento, soluciones coloidales metálicas (en concreto, de oro) y partículas de látex coloreadas, son marcadores adecuados para un reactivo de la invención. La concentración del marcador en una región o volumen pequeños, debería dar lugar a una señal fácilmente detectable, que puede evaluarse visualmente o mediante instrumentación si se desea.
Puede utilizarse marcadores indirectos tales como enzimas, por ejemplo fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano, pero usualmente estos requieren de la adición de uno o más reactivos de revelado tales como sustratos, antes de que pueda detectarse una señal visible. Si es necesario, tales reactivos adicionales pueden incorporarse en la matriz de forma que se disuelven o dispersan en la muestra líquida acuosa. Alternativamente, los reactivos de revelado pueden añadirse a la muestra antes de contactar con el ensayo de flujo lateral, de forma que la señal se expone a los reactivos de revelado después de que haya tenido lugar la reacción de conexión.
El acoplamiento del marcador al reactivo puede ser por enlace covalente si se desea, o por enlace hidrófobo. Tales técnicas se son practicadas normalmente por las personas cualificadas en el arte. En realizaciones en las que el marcador es un marcador directo, tal como una solución coloidal de oro o partículas de látex coloreadas, se prefiere el enlace hidrófobo.
Tal como se ha descrito aquí, el ensayo de flujo lateral provisto por la invención es una prueba inmunoquímica que proporciona una región de referencia de analito ligado de forma no difusible, que permite la detección de factores de interferencia que afectan a la conexión del analito contenido en una muestra líquida, con el reactivo marcado complementario. En una realización, el ensayo de flujo lateral provisto por la invención es una prueba inmunoquímica basada en orina. Para un ensayo de flujo lateral basado en orina, los factores de interferencia incluyen por ejemplo el peso específico (SG) de la orina, el pH, total proteico, urea o glucosuria. Estos factores interfieren con la conexión inmunoquímica, y de ese modo influyen en la precisión del resultado. Si bien algunos factores interferentes pueden compensarse, por ejemplo mediante el desecado de la partícula coloreada en un tampón de contenido proteico, lo que ayuda a minimizar diferencias en los niveles de pH y proteicos entre varias muestras, otros interferentes como por ejemplo el peso específico (SG) de la orina, que típicamente resulta de variaciones diurnas en la composición y concentración de varias sales así como de urea, incidirán sobre la precisión de las pruebas inmunoquímicas de flujo lateral. El ensayo de flujo lateral de la invención puede incorporar cualesquiera medidas de compensación conocidas en el arte, que estén dirigidas a minimizar la influencia de factores interferentes.
En relación con el peso específico (SG), la figura 2 muestra la respuesta cinética para una muestra de hCG de 20 mIU/ml en orina, que tiene tres SGs diferentes. Como se muestra la figura 2, la intensidad relativa de la línea de prueba es inversamente proporcional al SG de la muestra. Por contraste con una muestra de SG moderadamente elevado (1024), que no es usualmente detectable, las intensidades de línea de prueba para muestras de SG bajo e intermedio pueden ser detectables visualmente tan rápidamente como 120 segundos después de añadir la muestra. Normalmente el SG varía entre 10 y 1025 (1015 de promedio), y es típicamente superior en la primera evacuación matinal. Por lo tanto, la precisión de la prueba puede verse comprometida en particular para muestras que involucran una primera evacuación matinal, y contienen niveles de hCG relativamente bajos. No obstante, la comparación de la intensidad de la línea de prueba frente a la intensidad de la línea de control tiene un valor limitado, puesto que los reactivos inmunoquímicos para la línea de control son diferentes respecto de los de la línea de prueba, y no se ven influidos en la misma medida por las variaciones en el SG. La presente invención proporciona una solución a este problema mediante proporcionar una región de referencia, que produce una intensidad de la línea de referencia que está sujeta a los mismos factores de interferencia que la intensidad de la línea de prueba.
Por tanto, la presente invención está relacionada con el uso de analito nativo, por ejemplo hCG nativo, como material de línea de referencia, debido a que las influencias sobre la conexión entre el analito contenido en la solución de muestra líquida, afectarían de forma similar a la conexión del reactivo marcado con el analito nativo ligado, en la región de referencia, debido a que los dos sistemas reactivos son el mismo. Si bien parte del primer complejo se ligará a la línea de prueba y, en proporción, a la cantidad de analito en la muestra, sigue quedando suficiente reactivo marcado para fijarse a la línea de referencia que contiene hCG de bajo nivel. Esto se debe a que el fabricante típicamente proporciona un gran exceso de reactivo de captura marcado, para ayudar a acelerar la reacción y minimizar los problemas asociados con el denominado efecto gancho a altas dosis, donde se experimenta menos fijación en presencia de concentraciones muy altas de analito.
En una realización concreta de la presente invención, se proporciona un espectrómetro de reflectancia con medios para mover la tira o el detector, uno en relación con el otro, tal como una tabla de muestras sobre la que se coloca la tira, que puede moverse lateralmente bajo la cabeza lectora del detector. En el caso de que la propiedad física detectable sea la reflectancia de la luz a una longitud de onda predeterminada, el detector es un espectrómetro. Más en concreto, la localización de la tira en relación con el detector puede estar bajo el control del microprocesador, de forma que puede determinarse la reflectancia de cualquier región deseada. Así, la invención proporciona un ensayo de flujo lateral que es leído por un espectrómetro de reflectancia, por ejemplo Clinitek Status® de Bayer Diagnostics. La lectura puede proporcionarse mediante el instrumento con un valor K/S derivado de la reflectancia medida.
\newpage
Como se ha descrito aquí, las intensidades de señal en un ensayo de flujo lateral de la invención, pueden detectarse y evaluarse, visualmente o mediante instrumentación. Para la detección instrumental de hCG en una muestra de líquido, puede utilizarse por ejemplo un analizador de sobremesa basado en reflectancia, que utiliza una pantalla táctil para el interfaz de usuario principal, por ejemplo Clinitek Status® de Bayer Diagnostics, adaptado para hCG y denominado Clinitest® hCG, tal como se describe en el documento de Brock et al., Clinical Chemistry suplemento 49(6), 2003, A151 (F20). Un analizador basado en reflectancia puede leer una variedad de ensayos inmunológicos de flujo lateral en formatos tanto de tira como de casete plástico, así como químicas de orina existentes, por ejemplo Multistix® de Bayer Diagnostics, que está equipado con una tabla accionada por motor que contiene un inserto reversible para alinear pruebas de tira o basadas en casete. Una tira de química de orina dosificada o un ensayo de flujo lateral, pueden colocarse sobre una tabla que determina automáticamente la identificación de la prueba y el tiempo de lectura asociado, necesario para el rendimiento óptimo, y los resultados de hCG pueden notificarse como "negativo" (por ejemplo menos de 2 mIU/mL) o "positivo" (por ejemplo, mayor de 25 mIU/ml), con resultados intermedios notificados como "dudoso, nuevo ensayo en 48 - 72 horas". Los resultados finales de la prueba pueden comunicarse tanto a través de la pantalla táctil, como mediante copia impresa con la impresora incorporada que utiliza bien papel de alimentación continua, o material de etiquetas. La detección instrumental con un medio de reflectancia, por ejemplo Clinitek Status@ de Bayer Diagnostics, puede eliminar la variabilidad entre lectores, o la variabilidad de un mismo lector, debidas por ejemplo a diferencias en la agudeza visual y/o la iluminación ambiental.
Los siguientes ejemplos están previstos para ilustrar, pero no limitar, la presente invención.
Ejemplo 1
Detección Cualitativa de hCG en Orina, Utilizando una Línea de Referencia para Corregir Potenciales Interferencias
Este ejemplo demuestra la detección cualitativa de hCG utilizando una línea de referencia que contiene hCG inmovilizado, que permite la corrección de potenciales interferencias con la fijación de hCG libre en solución en la muestra, y anticuerpos monoclonales anti-hCG beta, marcados.
Una tira inmunoquímica que contiene una almohadilla de muestra (aplicación de muestra, tratamiento de muestra y filtrado), una almohadilla conjugada (que contiene anticuerpos monoclonales anti-hCG beta, marcados, en solución coloidal de oro), una membrana de nitrocelulosa (la línea de prueba son anticuerpos de cabra anti-hCG, la línea de referencia es hCG, y la línea de control es IgG de cabra anti-ratón), y una almohadilla absorbente. Esta tira se ilustra en la figura 1.
Preparación de Tarjetas de Reactivo
Las tarjetas de reactivo se preparan mediante ensamblar los diversos componentes secundarios sobre una lámina de plástico adhesivo, y después cortar tiras de reactivo de varias anchuras, para su uso bien en formato de varilla de medida, o bien en formato basado en casete. Un ejemplo de formato de varilla de medida es SureStrip^{TM} hCG Pregnancy Test, de Applied Biotech, Inc., número de catálogo 6007, que es una tira de 5 mm de anchura. El producto Clinitest® hCG Pregnancy Test, también fabricado por Applied Biotech, Inc., contiene una tira de prueba de 8 mm de ancho, recubierta en un casete de plástico (Bayer Corporation, US D456, 082S).
Aplicación de Reactivos Críticos
La almohadilla conjugada (de 7 mm de longitud) es saturada con una dilución de 1:10 de la solución que contiene 0,048 mg de anti-hCG de ratón (en solución salina fosfatada, de pH 7,4)/mL de solución coloidal de oro (absorbancia a 520 nm, de 4,0 para partículas de 40 nm de diámetro), y desecada. El anti-hCG de cabra (1,5 mg/mL de solución salina fosfatada, pH de 7,4) se dispone en tiras sobre nitrocelulosa, en la posición de la línea de pruebas. En la región de referencia, se dispone en tiras hCG purificado (en solución salina fosfatada, pH de 7,4), a una concentración que tendría como resultado una intensidad en línea de referencia, equivalente a la aplicación de 200 uL de una solución de prueba de hCG de 25 mIU/mL. Además, se dispone en tiras 2,0 mg/mL de IgG de cabra anti-ratón, en solución salina fosfatada de 7,4 de pH, en la región de control. Subsiguientemente, se seca la matriz preparada.
Después se ensambla el dispositivo de prueba, primero mediante fijar la matriz de membrana dispuesta en tiras y secada (25 mm de largo) sobre la longitud de lámina de plástico de 60 mm de longitud por 25 cm de ancho. Se añade la almohadilla conjugada, desecada, es añadida, de forma que 0,5 mm de la almohadilla conjugada contactan con la matriz que consiste en membrana de nitrocelulosa. A continuación la almohadilla de muestra (25 mm de longitud) se fija sobre la almohadilla conjugada, exponiendo 0,5 mm de la segunda almohadilla. Finalmente, se fija la almohadilla absorbente (16 mm de longitud) al extremo opuesto de la tira. Ahora, la tarjeta ensamblada puede cortarse bien en tiras de 5 mm de anchura para su uso en un formato de varilla de medida, o en tiras de 8 mm de anchura para su uso en casete.
Formato de Varilla de Medida
Para evaluar el efecto del peso específico sobre la cinética de fijación del hCG, se inyectó una solución de material de hCG en orina de varón mezclada, para producir una solución de prueba de hCG de 20 mIU/mL, en orina de pesos específicos bajo (1006), medio (1014) y alto (1024). Se sumergió (formato de varilla de medida) tiras ensambladas de 5 mm de ancho (réplicas de cinco) en las muestras de orina durante 15 segundos, a temperatura ambiente, y se midió y registró las amplitudes máximas resultantes (intensidad relativa) cada 15 segundos, durante un tiempo de desarrollo del ensayo de 5 minutos, sobre el instrumento de Clinitek Status®. Los resultados se muestran en la figura 2.
Formato de Casete
Para confirmar la incidencia del peso específico sobre la intensidad de conexión en la línea de prueba, se pinchó muestras de orina de veintisiete varones y 11 hembras no embarazadas, con una solución de material de hCG, para producir muestras que contienen hCG de 25 mIU/mL. Se realizó medidas de peso específico de orina individual, con un medidor de TS. En resumen, se añadió 200 uL de orina a la prueba de casete, y el dispositivo se colocó en el instrumento de Clinitek Status®, que lee automáticamente la intensidad de la línea de prueba 5 minutos después de la dosificación. La muestra se probó sobre tres instrumentos diferentes de Clinitek Status®, sobre cada uno de los dos lotes de tarjetas de reactivo. Los resultados de este estudio combinado (muestra de orina pinchada de varón y hembra) se muestran en la figura 3, con barras de error que describen el intervalo de confianza del 95%.
Como se muestra en la figura 3, la intensidad de la línea de prueba disminuye en función del peso específico. Sin embargo, con hCG en tiras en la región de referencia, la intensidad de conexión relativa de la línea de referencia es paralela a la línea de prueba, produciendo una relación constante que es función del peso específico, y permitiendo la corrección de diferencias en el peso específico.
Si bien la invención se ha descrito con referencia a las realizaciones reveladas, las personas cualificadas en el arte apreciarán fácilmente que los ejemplos y estudios específicos detallados arriba son solo ilustrativos de la invención. Por consiguiente, la invención está limitada solo por las siguientes reivindicaciones.
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Referencias citadas en la descripción
La lista de referencias citadas por el solicitante es solo para comodidad del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tomado especial cuidado en recopilar las referencias, no puede descartarse errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.
Documentos de patente citados en la descripción
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Bibliografía no de patentes, citada en la descripción
\bulletBROCK et al., Clinical Chemistry, 2003, vol. 49 (6), 151 [0043]

Claims (19)

1. Un ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de un analito en una muestra de líquido, el mencionado ensayo comprendiendo:
(a)
una primera región que comprende un reactivo marcado, ligado de forma difusible, complementario a un analito en la muestra de líquido, donde el mencionado reactivo marcado ligado en forma difusible y el mencionado analito, forman un primer complejo difusible;
(b)
una región de prueba que comprende un reactivo de captura ligado de forma no difusible, capaz de formación de complejos con el primer complejo;
(c)
una región de control que comprende un reactivo de control ligado de forma no difusible, complementario al reactivo marcado ligado de forma difusible; y
(d)
una región de referencia que comprende un analito ligado de forma no difusible, capaz de formación de complejos con el mencionado reactivo marcado ligado de forma difusible, donde la intensidad de señal entre la mencionada región de prueba y la mencionada región de referencia, son paralelas entre sí en función de la interferencia,
caracterizado porque el mencionado analito ligado de forma no difusible tiene una concentración predeterminada, donde la mencionada concentración representa la mínima concentración a la cual puede detectarse la presencia del analito visualmente y sin instrumentación, o mediante un instrumento que tenga un detector capaz de medir la señal a partir del marcador detectable, en ausencia de cualesquiera interferencias.
2. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, que comprende además una matriz a través de la cual la muestra líquida puede fluir por capilaridad.
3. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 2, en el que la mencionada matriz comprende nitrocelulosa.
4. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que la mencionada línea de referencia permite la detección de interferencia, en la conexión entre el analito y el mencionado reactivo marcado ligado, en la mencionada primera región.
5. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 4, en el que la muestra de líquido comprende orina.
6. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 5, en el que el mencionado analito está seleccionado entre el grupo que consiste en hormona estimulante del folículo (FSH), gonadotrofina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante (LH), antígeno de la gonorrea, antígeno de la clamidia, N telopéptidos reticulados, desoxipiridinolina (Dpd), anticuerpos HIV y proteínas de membrana nuclear 22 (NMP-22).
7. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 6, en el que el mencionado analito es gonadotrofina coriónica humana (hCG).
8. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 6, en el que el mencionado analito es hormona luteinizante (LH).
9. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 5, en el que la mencionada interferencia es debida al peso específico (SG) de la mencionada orina.
10. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 5, en el que la mencionada interferencia es debida al pH, al total de proteínas, a la urea o a la glucosuria.
11. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que la mencionada región de referencia está localizada entre la mencionada primera región y la mencionada región de prueba.
12. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que la mencionada región de referencia está localizada entre la mencionada región de prueba y la mencionada región de control.
13. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que el mencionado reactivo marcado, ligado de forma difusible, comprende un anticuerpo.
14. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que el mencionado reactivo marcado, ligado de forma difusible, comprende un anticuerpo anti-hCG capaz de fijar específicamente hCG para formar un primer complejo del mencionado anticuerpo anti-hCG marcado y el mencionado hCG.
15. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que el mencionado marcador es una solución coloidal de oro.
16. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que el mencionado marcador consiste en partículas de látex coloreadas.
17. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que una señal detectada en la región de referencia, indica que el ensayo es sensible al analito a la mínima concentración detectable.
18. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que la ausencia de señal tanto en la mencionada región de referencia como en la mencionada región de prueba, en combinación con la presencia de señal en la región de control, indica la probabilidad de un falso resultado negativo.
19. El ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en el que el mencionado instrumento es un espectrómetro de reflectancia.
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