JP2000232883A - 核酸ミクロアレイを用いる遺伝子発現およびゲノム異常の同時測定 - Google Patents

核酸ミクロアレイを用いる遺伝子発現およびゲノム異常の同時測定

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 核酸ミクロアレイを用いる遺伝子発現および
ゲノム異常の同時測定を提供すること。 【解決手段】 本発明は、組織試料中の遺伝子発現およ
び染色体異常両方の同時検出のための、固体支持体に結
合した核酸標的要素のアレイを用いる多色比較用ハイブ
リダイゼーション検定法を含む。本発明の方法は、第一
蛍光色で標識された組織ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料、
第二蛍光色で標識された組織染色体ＤＮＡ試料、および
第三蛍光色で標識された少なくとも一つの対照核酸のア
レイへの比較用ハイブリダイゼーションを用いる。少な
くとも二つの標的要素それぞれでの蛍光色存在および強
度を検出し、そして（ｉ）第一および第三色の、および
（ｉｉ）第二および第三色の蛍光比を測定する。このよ
うにして、遺伝子発現および染色体異常を同時に検出す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】政府権利 米国は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｓｔａｎｄａｒｄｓａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに
よるＡＴＰプロジェクト第９４−０５−００２１号、授
与番号７０ＮＡＮＢ５Ｈ１１０８の付与によって本発明
の当然の権利を有する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明は、概して、ヒトまた
は動物の組織試料中の核酸の評価に関する。より詳しく
は、本発明は、組織試料中の遺伝子発現および染色体異
常についての同時測定に関する。
【０００３】
【従来の技術】遺伝子の発現における特定の遺伝子の発
現のタイミングおよびレベル双方の異常は、癌および他
のヒト疾患の根本的な原因である。ゲノムＤＮＡ、すな
わち、染色体における異常も、癌および他のヒト疾患の
根本的な原因であり、しばしば、遺伝子の過発現または
発現不足をもたらす。染色体間の平衡転座および逆位、
および塩基対変化などの若干の染色体異常は、ＤＮＡ配
列コピー数の変化を伴わない。他のゲノムＤＮＡ異常
は、染色体ごとの正常な１コピーからのＤＮＡ配列コピ
ー数の変化を含む。これらゲノムＤＮＡ異常は、しばし
ば、コピー数増加に関して遺伝子増幅およびコピー数減
少に関して遺伝子欠失と称される。例えば、乳癌の約２
５−３０％で見られる一つの攻撃的な形の乳癌は、染色
体１７のｑ１２バンドに位置するＨｅｒ−２／ｎｅｕ癌
遺伝子の遺伝子増幅および過発現に起因する。この遺伝
的異常のある乳癌患者は、全生存および無疾患生存双方
について、この異常のない患者よりもかなり予後がかな
りよくない。更に、Ｈｅｒ−２遺伝子の過発現は、その
遺伝子の染色体遺伝子座の遺伝子増幅が不存在の場合、
その疾患の初期のあまり攻撃的でない段階で起こる。Ｂ
ｏｒｇら，“Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０，４３３２−４３
３７（１９９０年７月１５日）。したがって、乳癌につ
いての適切な評価および治療技術には、Ｈｅｒ−２遺伝
子発現の存在およびＨｅｒ−２遺伝子染色体コピー数を
測定する試験が必要である。
【０００４】Ｈｅｒ−２遺伝子コピー数のような染色体
異常は、蛍光インサイチオハイブリッド形成法（“ＦＩ
ＳＨ”）を用いる検定によって評価することができる。
ＦＩＳＨ検定は、組織試料の形態学的に自然のままの中
期塗抹または間期細胞中に存在する染色体ＤＮＡへのＤ
ＮＡプローブのハイブリダイゼーションを行なう。米国
食品医薬品局は、最近、結節陽性乳癌患者におけるＨｅ
ｒ−２コピー数の検出およびアドリアマイシン療法の結
果の予想のためのＶｙｓｉｓｉ，Ｉｎｃ．（ダウナーズ
・グローブ，イリノニイ州）から入手可能なＰａｔｈＶ
ｙｓｉｏｎTMＨｅｒ−２診断用ＦＩＳＨ試験を認可し
た。
【０００５】癌は、乳癌によって代表されるような多発
型の疾患をもたらす多数の遺伝子の異常も伴い、この場
合、大部分の症例でＨｅｒ−２癌遺伝子には異常がな
い。固体基体に結合した多数の核酸プローブの二次元ア
レイへのハイブリダイゼーションを用いる、いわゆる
“ＤＮＡチップ（Ｃｈｉｐ）”または“ミクロアレイ”
試験は、多数の遺伝子発現異常を同時に評価する。例え
ば、米国特許第５，４４５，９３４号，“Ａｒｒａｙ
ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎＳｏｌ
ｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｆｏｄｏｒら、同第５，
８００，９９２号，“Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｄｅｔｅｃ
ｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，”Ｆｏｄｏｒ
ら、および同第５，８０７，５５２号，“Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｆｏｒＦａｂｒｉｃａｔｉｎｇ Ｍｉｃｒｏａｒｒ
ａｙｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎ
ｃｅｓ，”Ｂｒｏｗｎらを参照されたい。それらミクロ
アレイ遺伝子発現試験は、特定の疾患に的をしぼった新
規薬物の開発で益々用いられている。
【０００６】タンパク質レベルでの多数の遺伝子発現
は、基体上の固定された抗原の二次元アレイである“ミ
クロドット”免疫検定の使用によって調べることもでき
る。例えば、１９８２年２月３日優先日の米国特許第
５，４８６，４５２号，“Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｋ
ｉｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ，”Ｇｏｒｄｏｎら、およびＥｋｉｎｓら，
Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２２
７：７３−９６（１９８９）を参照されたい。Ｇｏｒｄ
ｏｎらの固定された抗原には核酸が含まれ、それらは、
１０5／１０平方センチメートル（または１，０００／
ｃｍ2）の密度で配列されるように開示されている。Ｇ
ｏｒｄｏｎらは、更に、そのアレイが、１９８２年に一
般的な（Ｇｏｒｄｏｎら，項目１７を参照されたい）ピ
ペッティング装置の寸法より低い“固有分離度”を有す
るので、より高い密度で抗原を含有しうると開示してい
る。Ｇｏｒｄｏｎらは、それらアレイを、機械的転移装
置、小形アプリケーター、リソグラフィー手順または高
速電子プリントの使用によって製造することができるこ
とを開示している。
【０００７】米国特許第５，６６５，５４９号，“Ｃｏ
ｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ），”Ｐｉｎｋｅｌらは、多数の
遺伝的異常の同時評価方法を開示している。ＣＧＨは、
一つの蛍光色で標識された対照核酸集団および第二蛍光
色で標識された試料核酸集団の、ヒト中期染色体塗抹な
どの対照ゲノムの全部または一部分への比較用多色ハイ
ブリダイゼーションを行なう。得られた蛍光強度の対照
ゲノムの位置での比較は、試料集団における染色体配列
または発現された遺伝子配列のコピー数の決定を可能に
する。ミクロアレイに基づくＣＧＨ試験は、多数のゲノ
ムＤＮＡまたは遺伝子発現異常の評価についても開示さ
れている。米国特許第５，８３０，６４５号，“Ｃｏｍ
ｐａｒａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ａｒｒａｙｓ，”Ｐｉｎｋｅｌら；同時係属および同
一譲渡人の米国特許出願第０９／１８５，６２５号，
“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｅ Ｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ，”Ｍｕｌｌｅｒら；およびＰｉｎｋｅｌ
ら，“Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｖａｒｉ
ａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇ
ｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｉ
ｃｒｏａｒｒａｙｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ，２０巻，１９８８年１０月，２０７−２１１頁を参
照されたい。Ｐｉｎｋｅｌらは、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓで、ゲノムＤＮＡ中の単コピー変化を検出す
るミクロアレイ標的へのＣＧＨの能力を開示している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】今日までのところ、遺
伝子発現および染色体異常についての評価には、追加の
試料処理および試薬経費をもたらす組織試料での別々の
試験が必要である。遺伝子発現および染色体異常につい
て別々に試験することは、入手可能であるよりも多くの
組織を必要とすることもありうる。先行技術では、ミク
ロアレイへの多色ハイブリダイゼーションを用いる遺伝
子発現および染色体異常の同時測定が開示されていな
い。本発明の目的は、組織試料での遺伝子発現および染
色体異常について同時試験を行なうことによって別々の
試験を避けることである。もう一つの目的は、遺伝子発
現および染色体異常を単一核酸ミクロアレイで同時に試
験することである。本発明の他の目的は、以下に詳述さ
れるであろう。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、組織試料中の
遺伝子発現および染色体異常両方の同時検出のための、
固体支持体に結合した核酸標的要素のアレイを用いる多
色比較用ハイブリダイゼーション検定法を含む。本発明
の方法は、第一の検出可能マーカーで標識された組織ｍ
ＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料、第二の検出可能マーカーで
標識された組織ゲノムＤＮＡ試料、および第三の検出可
能マーカーで標識された少なくとも一つの対照核酸のア
レイへの比較用ハイブリダイゼーションを用いる。各標
的要素でのそれぞれのマーカーの存在および強度を検出
し、そして例えば、（１）第一および第三マーカーの、
および（２）第二および第三マーカーのマーカー比率
を、標的要素それぞれについて測定する。遺伝子発現お
よび染色体異常は、このようにして、それらマーカー比
の分析によって同時に検出される。好ましい実施態様に
おいて、それらマーカーは、それぞれ蛍光標識である。
【００１０】本発明は、ヒト疾患の治療技術において療
法選択に指針を与えるより完全な遺伝的評価データを与
えることにより、ヒトおよび動物用薬物開発プログラム
において治療的候補作用を評価することにより、および
細菌およびウイルスの病原体診断において広く用いられ
る。特定の癌は、増幅された遺伝子のｍＲＮＡの過発現
と共役した遺伝子増幅を特徴とし、より攻撃的な疾患で
ありうるし、より攻撃的な療法を必要とする。過発現を
駆動する機序は、治療的介入が適切でありうることを理
解する場合の基礎でありうると考えられる。したがっ
て、本発明の方法による遺伝子発現および増幅両方の特
性決定は、改良された癌療法をもたらすことができる。
【００１１】好ましい実施態様において、本発明は、組
織試料中の遺伝子発現および染色体異常の同時検出方法
であって、 （ａ）固体支持体に結合した核酸標的要素のミクロアレ
イを提供し、ここにおいて、該核酸標的要素は、組織試
料中に存在する遺伝子発現の指標であり且つ染色体配列
の指標である核酸に予め選択されたハイブリダイゼーシ
ョン条件下で実質的に相補的なポリヌクレオチド配列を
含み； （ｂ）少なくとも３種類の標識されたプローブ核酸集
団、（ｉ）第一蛍光色で標識され且つ組織試料からのｍ
ＲＮＡに由来するｃＤＮＡ集団、（ｉｉ）第二蛍光色で
標識され且つ組織試料に由来する染色体ＤＮＡ集団、お
よび（ｉｉｉ）第三蛍光色で標識された少なくとも一つ
の対照核酸集団を提供し； （ｃ）該ミクロアレイと該標識された核酸集団とをハイ
ブリダイゼーション条件下で接触させ；そして （ｄ）少なくとも２種類の標的要素について第一、第二
および第三蛍光標識色それぞれの存在および強度を検出
することを含む上記方法を含む。
【００１２】同じ標的要素でのメッセージ、ゲノムおよ
び対照の核酸のハイブリダイゼーションの測定および比
較は、発現およびゲノム変化の同時評価を提供する。本
発明は、多数の対照核酸、例えば、第三蛍光色で標識さ
れたゲノム対照ＤＮＡおよび第四蛍光色で標識された対
照ｃＤＮＡ集団の使用も含む。それら核酸標的要素は、
ゲノムＤＮＡか、オリゴマーＤＮＡかまたはｃＤＮＡで
ありうる。好ましい実施態様は、ゲノムＤＮＡ標的要素
およびオリゴマーＤＮＡまたはｃＤＮＡ標的要素の混合
物を含むアレイを含み、それらオリゴマーＤＮＡ／ｃＤ
ＮＡ標的は発現を測定し、ゲノムＤＮＡ標的は染色体変
化を測定する。１平方センチメートル未満のチップ表面
中に１，０００種類の異なった遺伝子およびゲノム遺伝
子座を測定できる標的要素密度を有するミクロアレイを
用いることも好ましい。発明の詳細な記述 （１）定義 本明細書中において次の略語を用いる。
【００１３】ｂｐ−塩基対 ＣＧＨ−比較用ゲノムハイブリダイゼーション ＤＡＰＩ−４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール ｄＣＴＰ−デオキシシトシン三リン酸 ＤＮＡ−デオキシリボ核酸（同様に機能しうる類似体を
含めた一本鎖かまたは二本鎖の形の） ｄＵＴＰ−デオキシウリジン三リン酸 ＦＩＳＨ−蛍光インサイチオハイブリダイゼーション ｋｂ−キロベース ｍｍミリメートル ｍＲＮＡ−メッセンジャーＲＮＡ ｎｇ−ナノグラム ｎｌ−ナノリットル ＲＮＡ−同様に機能しうる類似体を含めた一本鎖かまた
は二本鎖の形のリボ核酸 μｇ−マイクログラム μｌ−マイクロリットル μｍ−マイクロメートル μＭ−マイクロモル “核酸”または“核酸分子”という用語は、天然に存在
するヌクレオチドと同様に機能しうる天然ヌクレオチド
の既知の類似体を含めた一本鎖かまたは二本鎖の形のデ
オキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマ
ーを意味する。
【００１４】“エクソン”という用語は、成熟ｍＲＮＡ
産物中に示される分断遺伝子の任意のセグメントを意味
する。若干のタンパク質コーディング遺伝子は、非コー
ディングであるエクソン、例えば、ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝
子のエクソン１を有している。おそらく、タンパク質コ
ーディング遺伝子は全て、部分的にコードしている最初
と最後のエクソンを有する。
【００１５】“単コピー配列”または“ユニーク配列”
という用語は、遺伝子のコーディングエクソン配列など
の、典型的に、ハプロイドゲノム当り１回だけ存在する
核酸配列を意味する。
【００１６】“複雑度”という用語は、本明細書中にお
いて、Ｂｒｉｔｔｅｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．，２９：３６３（１９７４）によって確立
されたようなこの用語の標準的な意味にしたがって用い
られる。核酸複雑度の更に別の説明については、Ｃａｎ
ｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＰａｒｔＩＩＩ，１２２８−
１２３０頁も参照されたい。
【００１７】“標的要素”という用語は、組織試料から
単離された核酸にハイブリダイゼーション可能な固定さ
れたまたは結合した核酸を含有する基体表面の部分を意
味する。
【００１８】“実質的に結合する”という用語は、組織
核酸と標的要素核酸との間の相補的ハイブリダイゼーシ
ョンを意味し、組織ポリヌクレオチド配列の所望の検出
を行なうためにハイブリダイゼーション基剤のストリン
ジェンシーを低下させることによって適合されうる少な
いミスマッチを包含する。
【００１９】“特異的ハイブリダイゼーション”または
“と特異的にハイブリッド形成する”という用語は、組
織核酸が標的要素核酸に実質的に結合するが、規定のス
トリンジェンシー条件下でアレイ中の他の核酸に実質的
に結合しないハイブリダイゼーションを意味する。当業
者は、それらハイブリダイゼーション条件のストリンジ
ェンシーの緩和が、配列ミスマッチを許容させることを
理解するであろう。許容されるミスマッチの程度は、ハ
イブリダイゼーション条件の適当な調整によって調節す
ることができる。
【００２０】当業者は、本明細書中で記載された特定の
核酸の正確な配列を、他のものと“実質的に同一”であ
り、しかも相補的核酸に実質的に結合する能力を保持し
ている組織核酸プローブまたは標的要素核酸を生じるよ
うにある程度まで修飾することができるということも理
解するであろう。このような修飾は、具体的には、本明
細書中の個々の配列に関して述べられる。ポリヌクレオ
チド配列の“実質的な同一性”という用語は、ポリヌク
レオチドが、標準的なパラメーターを用いる下記の方法
を用いて対照配列と比較して少なくとも９０％、より好
ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する配列
を含むことを意味する。
【００２１】二つの核酸配列は、それら二つの配列のヌ
クレオチド配列が、下記のように最大限に一致するため
に並べられた場合に同様であるならば、“同一”である
といわれる。“に相補的”という用語は、本明細書中に
おいて、相補的配列が対照ポリヌクレオチド配列の全部
または一部分に相補的であることを意味するのに用いら
れる。
【００２２】二つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチ
ド間の配列比較は、典型的に、配列類似性を有する局所
部分を確認し且つ比較する“比較窓”の中の二つの配列
について配列を比較することによって行なわれる。本明
細書中で用いられる“比較窓”は、二つの配列を最適に
並列させた後に同数の隣接位置の対照配列と配列を比較
することができる少なくとも約２０個、通常は約５０−
約２００個、より通常は約１００−１５０個の隣接位置
のセグメントを意味する。
【００２３】比較のために配列を最適に並列させること
は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐ
ｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性
アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕ
ｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９
７０）の相同性並列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓ
ｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８
８）の類似性探求法によって、およびこれらアルゴリズ
ムの計算機処理された手段によって行なうことができ
る。
【００２４】“配列同一性百分率”は、二つの最適に並
列された配列を比較窓について比較することによって決
定されるが、この場合、その比較窓内のポリヌクレオチ
ド配列の一部分は、二つの配列の最適並列のための対照
配列（付加または欠失を含まない）と比較される付加ま
たは欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてよい。そ
の百分率は、同一の核酸塩基が両方の配列中にある位置
の数を測定して、対合する位置数を得、その対合位置数
を比較窓内の全位置数で割り、その結果に１００を掛け
て配列同一性百分率を生じることによって計算される。
【００２５】ヌクレオチド配列が実質的に同一であると
いうもう一つの指標は、二つの分子が同様の配列にスト
リンジェント条件下でハイブリッド形成するかどうかで
ある。ストリンジェント条件は配列依存性であり、様々
な環境中で異なるであろう。概して、ストリンジェント
条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配
列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃−約２５℃低いように選
択される。そのＴｍは、ＤＮＡ二重らせんまたはＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリッドの鎖が半分解離するまたは変性す
る温度（規定のイオン強度およびｐＨにおいて）であ
る。
【００２６】本明細書中で用いられる“プローブ”は、
１種類またはそれ以上の化学結合によって、通常は、水
素結合形成によって相補的配列の核酸を含む標的要素に
結合することができる組織核酸分子（ＲＮＡかまたはＤ
ＮＡ）の集団または集合として定義される。それらプロ
ーブ集団は、下記のように直接的にまたは間接的に標識
される。それらプローブ集団は、典型的に、高複雑度を
有し、例えば、組織細胞または組織細胞集団から単離さ
れた全ゲノムＤＮＡまたは全ｍＲＮＡから製造される。 （２）概要 本発明の方法は、ミクロアレイ試験形式によって与えら
れる多数の核酸の評価能力と、ＣＧＨの多色比較用ハイ
ブリダイゼーション能とを組合せて、同一組織試料中の
遺伝子発現およびゲノム異常の両方を同時に評価する。
本発明の方法は、組織試料に由来する核酸集団の多数の
核酸標的要素を含む核酸アレイへの、適当なハイブリダ
イゼーション条件下のハイブリダイゼーションを用い
る。それら核酸標的要素は、発現された遺伝子配列に相
補的なゲノムＤＮＡか、オリゴマーかまたはｃＤＮＡ核
酸、またはそれら２種類の混合物を含む。それら核酸集
団は、異なった検出可能マーカーで別々に標識され、
（１）組織試料中の遺伝子発現を示すｍＲＮＡまたはそ
の相補的ｃＤＮＡの混合物、および（２）組織試料のゲ
ノム状態を示すゲノムＤＮＡの混合物を含む。それら標
識された核酸集団を、１種類またはそれ以上の対照核酸
集団と一緒にアレイに同時ハイブリッド形成させるが、
対照集団もそれぞれ、異なった検出可能マーカーでそれ
自体標識されている。好ましくは、アレイに加えられる
核酸集団全部を、それぞれ異なった蛍光マーカーで標識
する。１種類または複数の対照核酸は、１種類または複
数の対照に相対する組織試料の遺伝子発現状態またはゲ
ノム状態の評価を可能にするように選択される。適当な
ハイブリダイゼーション時間後、蛍光色の存在および強
度をアレイのそれぞれの標的要素で検出する。特定の標
的要素での色間蛍光比の比較により、その標的要素に相
補的であるゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列のコピ
ー数が測定される。
【００２７】ゲノムＤＮＡ配列は、概して、ＲＮＡで発
現された配列の全部または一部分をコードする１個また
はそれ以上の“エクソン”配列、およびヒトゲノム中の
多数の地点で繰返される反復配列も含有することが多い
１個またはそれ以上の非コーディング配列“イントロ
ン”を両方とも含有する。ゲノム標的要素は、したがっ
て、特定のゲノム配列にマッピングされる発現された遺
伝子配列のためのハイブリダイゼーション標的として役
立ちうる。同様に、特定の発現された遺伝子配列に相補
的な標的要素は、ゲノムＤＮＡのエクソン配列にも相補
的である。したがって、ゲノムＤＮＡ標的要素およびｃ
ＤＮＡ標的要素は、それぞれ、ゲノムＤＮＡかまたは発
現された遺伝子配列核酸へのハイブリダイゼーションの
ためのアレイ形式で用いることができる。本発明の方法
で用いられるアレイ形式は、（１）特定のゲノムＤＮＡ
配列または（２）特定の発現された遺伝子配列にそれぞ
れ相補的な別々の核酸標的要素のミクロアレイを含む。
（１）に相補的な若干の標的要素および（２）に相補的
ないくつかを含む標的要素混合物も用いることができ
る。
【００２８】本発明の方法の顕著な利点は、遺伝子発現
および染色体異常両方の同時決定である。Ｈｅｒ−２が
関与する乳癌などの若干の攻撃的な悪性型の癌は、１種
類またはそれ以上の癌遺伝子の過発現およびそれぞれの
癌遺伝子の染色体遺伝子座の遺伝子増幅の両方を特徴と
する。癌遺伝子だけの過発現について調べることは、疾
患状態の完全な特性決定に不適切である。したがって、
本発明の方法を用いる遺伝子発現および染色体異常両方
についての同一組織試料の同時試験は、過発現および過
発現の分子原因の両方を好都合に確認し、それによって
適当な予後評価および療法選択を可能にする。
【００２９】標的要素のゲノム、ｃＤＮＡまたは混合物
の選択は、求められる組織および分析によって異なるこ
とがありうる。例えば、ｃＤＮＡ標的要素は、若干のゲ
ノムＤＮＡ中に存在する反復配列の作用が減少し、発現
される遺伝子のより正確な検出が可能であるので好都合
である。ゲノムＤＮＡ標的要素は、より高い複雑度がよ
り大きいシグナルを生じうるので好都合である。ゲノム
ＤＮＡおよびｃＤＮＡ標的要素の混合物は、より詳細な
ゲノムおよび発現の分析を与えるのに用いることもでき
る。 （３）標的要素中の核酸 標的要素の核酸配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸
またはそれらの混合物が含まれるが、それらに制限され
るわけではない核酸または核酸類似体のいずれの種類も
含むことができるし、ベクター配列も含むクローンとし
て存在しうるしまたは実質的に純粋でありうる。ペプチ
ド核酸を含むアレイは、米国特許第５，８２１，０６０
号，“ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｍａｐｐｉｎｇ
ａｎｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ
Ｕｓｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈｉｐ
ｓ ａｎｄ Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ，”Ｈ．Ａｒ
ｌｉｎｇｈａｕｓらで開示されている。
【００３０】標的要素の核酸は、典型的に、ある選択さ
れたゲノム（例えば、ヒトまたは動物のゲノムライブラ
リーからのクローンまたはいくつか隣接したクローン）
の一定の部分にそれらの起原を有し、または完全であっ
てよいしまたは完全でなくてよいある選択されたゲノム
（例えば、完全または部分ｃＤＮＡ配列）の機能性遺伝
子単位に相当する。それら標的核酸は、インターＡｌ
ｕ、またはクローン化されたＤＮＡに由来する縮重オリ
ゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ産物を含むこともでき
る。
【００３１】標的要素の核酸は、例えば、特定の遺伝子
を含有することができるし、または目的の細胞、例え
ば、腫瘍細胞中に増加したまたは減少したコピー数で存
在すると考えられる染色体部分に由来しうる。例えば、
別々の標的要素は、下の表２に挙げられる癌遺伝子座そ
れぞれに相補的なＤＮＡを含むことができる。その標的
要素は、異常なレベルで転写されると考えられるｍＲＮ
ＡまたはこのようなｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、例え
ば、下の表２の遺伝子座にマッピングされる発現された
遺伝子を含有してもよい。
【００３２】或いは、標的要素は、有意性または位置が
知られていない核酸を含むことができる。このような要
素のアレイは、完全なゲノム、１本の染色体または染色
体の一部分が含まれるが、これらに制限されるわけでは
ないゲノムのいずれか望ましい部分を連続してかまたは
不連続地点でサンプリングする位置を示しうると考えら
れる。標的要素の数およびそれぞれの核酸の複雑度は、
分析の密度を決定すると考えられる。例えば、それぞれ
の標的が異なったゲノムクーンからのＤＮＡを含有する
３００個の標的要素のアレイは、完全なヒトゲノムを１
０メガベース間隔でサンプリングしうる、すなわち、分
析しうると考えられる。それぞれが１００ｋｂのゲノム
ＤＮＡを含有する３，０００個の標的要素のアレイは、
ヒトゲノムのユニーク配列部分の１メガベース間隔でほ
ぼ完全な有効範囲を与えうると考えられる。同様に、ア
ノニマスｃＤＮＡクローンからのまたは発現配列タグ
（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ；
“ＥＳＴｓ”）に相補的な核酸を含む標的要素のアレイ
は、いくつかの目的の細胞中で異なって発現されるかも
しれないそれら発現された遺伝子配列の識別を可能に
し、それによって、これら遺伝子の研究または診断のた
めの発現異常の確認に注意を集中させると考えられる。
【００３３】当業者は、それぞれの標的要素が、異なっ
た長さおよび配列を有する標的核酸の混合物を含むこと
ができるということを理解するであろう。標的要素は、
概して、クローン化されたまたは合成されたＤＮＡ片の
２個以上のコピーを含むであろうが、それぞれのコピー
は、異なった長さのフラグメントに破壊されうる。本発
明の標的要素配列の長さおよび複雑度は、本発明には重
要ではない。当業者は、これら因子を調整して、ある与
えられたハイブリダイゼーション手順に最適なハイブリ
ダイゼーションおよびシグナル生産を提供し且つ異なっ
た遺伝子またはゲノム位置の中で必要な分解能を提供す
ることができる。
【００３４】それら標的要素は、広く利用可能な合成機
を用いて容易に合成されうる８−約１００ｂｐ、好まし
くは、２０−８０ｂｐ、そしてより好ましくは、約４０
−約６０ｂｐの範囲のようなオリゴマーを含むことがで
きる。標的要素中のオリゴマーは、当該技術分野におい
て知られているようないずれかの方法によってアレイ基
体上でインサイチオで合成することもできる。オリゴマ
ー配列情報は、ＧＥＮＢＡＮＫなどの核酸配列データバ
ンク、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ，Ｉｎｃ．（パロ・アルト，カリフォルニア州）製の
ＬＩＦＥＳＥＱなどの市販のデータベース、またはＳＡ
ＧＥ（遺伝子発現の連続分析）の使用によって作成され
るようなＥＳＴデータを含めたいずれかの好都合な源か
ら得ることができる。オリゴマーまたは部分ｃＤＮＡ要
素については、遺伝子のｍＲＮＡの一部分に相補的な、
または遺伝子の識別可能な重要な配列（発現されたタン
パク質、すなわち、受容体結合部位の機能性部分をコー
ドする配列の意味で重要）に相補的な部分配列を合成す
ることだけが必要である。
【００３５】それら標的要素は、より小さいｃＤＮＡに
ついては、合成されたかまたはクローン化された、好ま
しくは、約１００ｂｐ−約５，０００ｂｐの範囲の複雑
度を有する部分または完全長さｃＤＮＡ配列を含むこと
ができる。ｃＤＮＡ標的要素は、慣用法を用いて製造さ
れるまたはＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．
（セント・ルイス，ミズーリ州）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ハンツビル，アラバマ州）およびＣ
ｌｏｎｔｅｃｈ（サウス・サンフランシスコ，カリフォ
ルニア州）によって維持されるライブラリーなどの市販
の源から得られる、所望の組織からの発現された遺伝子
配列ｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができ
る。
【００３６】それらの標的要素は、任意の複雑度である
が、概して、約２０，０００ｂｐ−約２５０，０００ｂ
ｐ、好ましくは、約５０，０００ｂｐ−約１７５，００
０ｂｐの複雑度を有するゲノムＤＮＡ配列を含むことが
できる。ゲノムＤＮＡは、標準的なクローニング手順に
よって生産される任意のマッピングされたゲノムクロー
ンから得ることができるし、またはＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ロ
ックビル，メリーランド州、以下ＡＴＣＣ）によって維
持される染色体特異的ライブラリーなどの市販の源から
得ることができる。好ましいゲノムライブラリー源は、
Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓによって維持されるヒト
ＤＮＡ ＢＡＣライブラリーである。
【００３７】標的要素中で用いるのに選択されるゲノム
ＤＮＡまたはｃＤＮＡの識別は、既知のまたは増幅され
た若しくは欠失したと確認される染色体配列の、または
過発現されたまたは発現不足の遺伝子の位置によって決
定することができる。ゲノムまたはｃＤＮＡクローンの
識別は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗｗ．ｇｄ
ｂ．ｏｒｇ／ｇｄｂｔｏｐ．ｈｔｍｌのＵ．Ｓ．Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
ｏｒ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａ Ｂａｓｅに
よって維持されるＧｅｎｅ Ｍａｐ′９８の遺伝子デー
タを用いてプライマー配列対を設計することによって行
なわれる。例えば、Ｈｅｒ−２遺伝子は、約４０ｋｂの
ゲノム配列を含むと考えられ、ＰＣＲプライマー対は、
公表されたｈｅｒ−２配列に基づいて設計することがで
きる。次に、そのＰＣＲプライマー対またはＰＣＲアン
プリコン産物を用いてゲノムＤＮＡライブラリーをスク
リーニングして、相補的配列を含有するクローンを識別
することができる。そのスクリーニングで識別されるゲ
ノムＤＮＡクローンを、本発明の方法においてアレイ上
で用いて、Ｈｅｒ−２遺伝子座のゲノム異常を識別する
ことができる。
【００３８】ヒトの遺伝的異常の検出と同時に、ウイル
スおよびウイルス遺伝子発現を検出するアレイの使用に
ついて、標的要素は、既知のまたは識別されたウイルス
配列に相補的な配列を含むことができる。それらアレイ
標的要素は、ヒトまたは動物のゲノム中のウイルス組込
み部位を検出するように設計することもできる。このよ
うな病原体アレイの使用は、例えば、ヒト子宮頸癌とヒ
トパピローマウイルス、およびヒト胃腸癌とｈ．ピロリ
（ｐｙｌｏｒｉ）の既知の関係ゆえに、医学的に有意で
ある。同様に、既知の細菌遺伝子配列を用いて、標的要
素の核酸を設計することができる。病原体配列に基づく
アレイの使用は、食品および環境の試験でも用いること
ができる。 （４）標的要素 標的要素は、種々の寸法、形状および面積を有すること
ができる。それら標的要素は、プリント法、例えば、機
械的転写、グラビア、インクジェットまたは捺印法によ
って生じる物理的に隔てられたスポットを含むことがで
きる。それら標的要素は、米国特許第５，４４５，９３
４号の写真平板インサイチオアレイ合成によって製造さ
れるもののように、近くに隣接していることもできる。
それら標的要素は、好ましくは、平面上の概して丸い形
状である。概して、より小さい要素が好ましく、典型的
な標的要素は、直径が５００ミクロン未満である。特に
好ましい標的要素寸法は、高密度を得るように直径が約
５ミクロン−２５０ミクロンである。
【００３９】標的要素密度は、任意の望ましい密度であ
りうるが、好ましくは、核酸ミクロアレイに特有の、す
なわち、標的要素約１００個／平方センチメートルより
大きい密度である。ヒト疾患治療技術における好ましい
使用には、標的要素密度は、好ましくは、チップ表面の
１平方センチメートル当り約１００−約１０，０００個
の標的要素の範囲である。より高いまたはより低い密度
が望ましいことがあり、より高い密度は、より多数の発
現された遺伝子配列の検査を可能にする薬物開発で用い
るのに好ましいことがありうる。 （５）アレイ製造 ミクロアレイは、任意の望ましい方式で製造することが
でき、アレイ製造のためのロボット付着および合成イン
サイチオ法の両方が知られている。例えば、米国特許第
５，４８６，４５２号、同第５，８３０，６４５号、同
第５，８０７，５５２号、同第５，８００，９９２号お
よび同第５，４４５，９３４号を参照されたい。ロボッ
ト付着方法および装置を用いてミクロアレイを製造する
ことは好ましく、これは、１９８８年５月２７日出願の
同時係属の同一譲渡人の米国特許出願第０９／０８５，
６２５号，“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔ
ｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，”Ｍｕｌｌｅｒら（以下、
“Ｍｕｌｌｅｒら”）で開示されたように、細管針また
はピンによる核酸のロボット付着を用いて、クロムで被
覆された基体上の列および段に固定される物理的に隔て
られたすなわち“スポットの”標的要素の二次元ミクロ
アレイを生じる。
【００４０】多数の細管針を含むロボットアプリケータ
ーを用いることができる。異なった核酸の適用の間に洗
浄されるピンを用いる、またはロボットピン交換器を用
いる単針アプリケーターを用いることもできる。用いら
れる針は、好ましくは、３３ゲージ、１インチ長さステ
ンレス鋼製細管注射針である。その針を核酸貯槽、好ま
しくは、Ｌｕｅｒロックシリンジ先端に連結させる。好
ましい針および貯槽は、ＥＦＤ（イースト・プロビデン
ス，ロード・アイランド州）から商業的に入手可能であ
る。それぞれ異なった核酸を付着している多数の細管針
を用いることが好ましく、それによって、付着の間の洗
浄工程が省かれる。
【００４１】任意の適当な量の核酸をそれぞれの標的要
素中に付着させるが、その標的要素寸法は、付着される
量に依る。それぞれの標的要素について、その量は、１
μｇ／μｌの核酸濃度の核酸溶液を約０．０５ｎｌ−約
５．０ｎｌでありうる。標的要素１，０００個／ｃｍ2
の密度について、標的要素当りの付着される個々の量
は、１μｇ／μｌ溶液を約０．２ｎｌ−約２．０ｎｌで
ある。核酸は、変性核酸の付着を可能にするであろう任
意の溶媒中で与えられる。好ましくは、核酸は、１００
ｍＭ ＮａＯＨ中において１μｇ／μｌ濃度で与えられ
る。
【００４２】ロボット製造を助けるために、自動追跡お
よび標識の方法および装置を、例えば、特定の標的要素
での付着に正しい核酸を供給する場合に用いることがで
きる。例えば、異なった核酸を含有する細管ピンのバー
コード化またはトランスポンダ標識または追跡は、所望
の標的要素へ正しい核酸を確実に供給するのに有用であ
る。バーコード化またはトランスポンダ標識の使用も、
製造工程のより良い計算機制御を可能にする。
【００４３】ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ両方の標的要
素を含むミクロアレイは、いずれの配置でも生じること
ができる。例えば、ｃＤＮＡ要素は、アレイの１か所に
位置することができるし、またはゲノムＤＮＡ標的要素
の中に散在することができる。平坦な基体表面上の二次
元アレイの規則性は、容易な蛍光検出および分析を可能
にするのに好ましいが、そのアレイは、いずれか望まし
い配置で製造することができる。
【００４４】個々の標的要素は、１回だけ生じることが
できるしまたは結果の分析に統計学的分析能を与えるよ
うに反復試験することができる。標的要素３，０００個
／ｃｍ2の密度のアレイについて、それぞれの標的をそ
のアレイ上で３回反復試験するようにアレイを製造し
て、それら結果についてより良い較正を提供することが
好ましい。出願人らは、１ｃｍ2未満の基体表面積のミ
クロアレイを用いる場合、それら反復試験片を、それら
結果に重大な作用をもたらすことなく、互いに隣接して
または分離して置くことができることを確認している。
【００４５】好ましくは、個々のミクロアレイを、大型
の基体プレートまたはウェファー上で製造し、これに、
半導体産業で周知の手順を用いて個々のチップに分ける
ために刻みをつける。クロム被覆ガラスプレートまたは
ウェファーは、Ｎａｎｏｆｉｌｍ（ウェストレーク・ビ
レッジ，カリフォルニア州）から商業的に入手可能であ
り、慣用法を用いて刻みをつけることができる。したが
って、多数のチップは、一つのロボットアプリケーター
を用いて同一ウェファー上で一度に製造した後、個々の
チップに分けることができる。プリントする前に、それ
らウェファーを、好ましくは、蒸留水、イソプロパノー
ル、メタノールおよび蒸留水の洗浄を順に用いて洗浄す
る。窒素を用いて過剰の水を送風除去し、洗浄されたウ
ェファーを乾燥させる。
【００４６】好ましいＭｕｌｌｅｒら装置は、それぞれ
の核酸を付着させるために低空気圧の噴出を適用する細
管ピンアプリケーターのためのＸ−ＹおよびＺ軸制御器
を用いる。Ｍｕｌｌｅｒらの装置で適当なＺ軸制御器を
用いて、細管ピンを基体表面と接触させないことは更に
好ましい。その表面上、例えば、約１００μｍ上にピン
の位置を定めることは、より良いスポットサイズ規則性
およびより低い空気圧の使用を可能にする。
【００４７】プリントを開始する場合、そのプレートま
たはウェファーを室温まで平衡させる。次に、各チップ
のＺ軸高さを、ロボット制御器によって用いるために決
定する。好ましくは、プリントは、並列調整のための各
チップの一方の隅の３００μ直径“マーカー”スポット
の付着で始める。窒素圧は低く、好ましくは、約１ｐｓ
ｉまたはそれ未満であり、付着されるその粘度および量
が与えられる特定の核酸を付着する十分な圧力である。
窒素パルス長さは、概して、約１０ミリセカンドであ
る。
【００４８】種々の対照標的要素、例えば、（１）全ゲ
ノムＤＮＡ、（２）ベクターＤＮＡ、（３）各標的要素
からのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのプールされた混合
物、（４）正常組織からの全ＲＮＡ、または（５）既知
の異常がある組織からの全ゲノムまたはｃＤＮＡを含む
標的要素などを含むことも好ましい。それら対照標的要
素は、それぞれが特定の発現された遺伝子またはゲノム
配列の既知のコピー数の核酸を含む一連の標的要素を含
むこともできる。例えば、ヒトＸ染色体の１、２、３、
４および５コピーを含む細胞系から抽出されたゲノムＤ
ＮＡを用いることができる。
【００４９】好ましいロボット付着製造の品質管理に
は、製造されたアレイを、立体顕微鏡およびＣＣＤカメ
ラを用いて画像化することが好ましい。各チップの画像
を捕捉し且つ分析する。失われた、寸法を誤ったまたは
形の歪んだ標的要素を有するチップを識別し、印をつけ
る。
【００５０】クローン化ｃＤＮＡまたはクローン化ゲノ
ムＤＮＡを用いる場合、ベクター配列は、いずれか適当
な処理で付着する前に除去することができるし、または
それらがハイブリダイゼーションを有意に妨げないなら
ば保持することができる。クローン化ゲノムＤＮＡおよ
びｃＤＮＡには、ベクター配列を除去しないことが好ま
しい。
【００５１】米国特許第５，４４５，９３４号および同
第５，８０７，５５２号で開示されたものを含めたいず
れか適当な基体を用いることができる。その基体は、例
えば、ガラス；ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカー
ボネート、ポリスルホンおよびポリエステルなどのプラ
スチック；クロムおよび銅などの金属；金属被覆基体；
および任意の材料のフィルターでありうるが、これらに
制限されるわけではない。固定された核酸を有する基体
表面は、好ましくは平坦であるが、アレイ標的要素を隔
てる、例えば畝および溝を有する基体を含めたいずれか
望ましい表面を用いることができる。それら核酸は、別
個に識別可能であるビーズに結合させることもできる。
Ｍｕｌｌｅｒらの平坦なクロム被覆ガラス基体が好まし
い。
【００５２】標的要素の核酸は、それらをハイブリダイ
ゼーションに利用可能にさせる共有結合または非共有結
合を含めたいずれか適当な方式で基体に結合させること
ができる。Ｍｕｌｌｅｒらの非共有結合法が好ましい。 （６）組織核酸 核酸集団は、ヒト、植物および動物の組織を含めた任意
の組織源に由来しうる。その組織試料は、新規に得られ
た試料、凍結試料、生検試料、血液試料、羊水穿刺試
料、パラフィン包埋固定組織試料などの保存組織（すな
わち、組織塊）、または細胞培養物を含めた任意の組織
を含む。したがって、その組織試料は、全血試料、皮膚
試料、上皮細胞、軟組織細胞、胎児細胞、羊膜細胞、リ
ンパ球、顆粒球、疑わしい腫瘍細胞、器官組織、割球お
よび極体を含むことができる。検査される組織は、顕微
解剖から得られて、より均一な細胞集団を生じることが
できる。パラフィン固定組織は、ろうを除去するいずれ
か適当な処理で予め処理されるが、パラフィン前処理キ
ットは、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能で
ある。体外受精操作中に検査されるヒト割球細胞などの
単細胞を含めた任意の適当な量の組織を用いることがで
きる。母親の血液試料から分離されるヒト胎児細胞を調
べる場合のように、１個だけまたは数個の細胞が入手で
きる場合、核酸の量を増幅させる核酸増幅技術を用いる
ことができる。
【００５３】組織に由来する核酸集団は、いずれか適当
な核酸分離法または精製法によって製造する。ゲノムＤ
ＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ両方の核酸分離法は、
Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮＡ単離用ＱＩＡａｍｐ組織キット
などが商業的に入手可能である。例えば、ｍＲＮＡは、
組織から抽出した後、逆転写酵素での処理によってｃＤ
ＮＡに変換することができる。不十分なｃＤＮＡしか入
手できない場合、そのｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応
によって増幅させることができる。この周知の方法は、
ＲＴ／ＰＣＲと称される。ｃＤＮＡを相補的ＲＮＡ
（“ｃＲＮＡ”）に変換することも可能である。
【００５４】概して、組織から約１００万個を越える細
胞が入手できる場合、組織核酸を抽出し、そして増幅さ
せることなく用いることができる。約１００万個未満の
細胞しか入手できない場合、好ましくは、核酸増幅また
は濃縮を用いる。好ましくは、このような増幅技術はＰ
ＣＲである。ＰＣＲでは、混入する何等かの人為物を避
けるまたは識別するように注意し且つ適当に管理すべき
である。 （７）対照核酸 対照核酸集団は、対照として役立つように選択される任
意の適当な核酸集合物である。例えば、対照集団は、正
常組織からの全ヒトゲノムＤＮＡ、検査され且つｃＤＮ
Ａに変換される組織の正常試料から抽出される全ｍＲＮ
Ａ、または特定の発現される遺伝子の合成または天然に
存在するｃＤＮＡ混合物でありうる。対照はｃＲＮＡ集
団でありうる。対照は、制御分析を可能にする“内標準
化された（ｓｐｉｋｅｄ）”既知量の特定のゲノムまた
はｃＤＮＡ配列を含むこともできる。 （８）標識付け 用いられる標識は、いずれの検出法によっても検出可能
な任意の適当な非放射性マーカーでありうる。例えば、
それら標識は蛍光分子でありうるし、またはタンパク
質、ハプテンまたは酵素でありうる。更に、スズのいろ
いろな同位体のような“質量スペクトル”標識は、ＭＡ
ＬＤＩ（マトリックス介助レーザーデソープションイオ
ン化）などのレーザー分離および質量分析法によって、
アレイへのハイブリダイゼーション後に容易に検出する
ことができる。Ｗｕら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ６６，１６３７（１９９４）およびＷｕ
ら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，７，１４２
（１９３３）を参照されたい。好ましくは、それら標識
はそれぞれ、フルオレセイン、テキサスレッドおよび５
−（および６−）カルボキシテトラメチルローダミンの
ような、広範な“クロストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌ
ｋ）”補正を必要とすることなく互いに容易に区別され
るように充分にスペクトルが分離している蛍光マーカー
である。核酸への結合に有用な蛍光標識化合物の広範な
リストは、米国特許第５，４９１，２２４号，“Ｄｉｒ
ｅｃｔ Ｌａｂｅｌ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｅｄ Ｄ
ＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ Ｍ
ａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，”Ｂｉｔｔｎｅｒらで明らかで
ある。使用に適した蛍光化合物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅ（ユージーン，オレゴン州）から商業的に入
手可能である。フルオレセインで標識されたアビジンな
どの蛍光タンパク質との接触によってアレイへのハイブ
リダイゼーション後に蛍光標識される、ビオチンおよび
フィコエリトリンのような間接標識も用いることができ
る。
【００５５】１種類または複数の対照集団、および組織
核酸集団は、末端標識、ニックトランスレーションまた
は化学形質転換などによるいずれか適当な方法で標識さ
れる。好ましくは、ＲＴかまたはＰＣＲ処理中に、標識
組込み工程を用いて、得られたｃＤＮＡを望ましい蛍光
色で標識する。分離された染色体ＤＮＡは、末端標識、
ニックトランスレーションおよび化学標識を含めたいず
れか適当な標識化学を用いて標識することができる。ニ
ックトランスレーションを用いて、蛍光ｄＵＴＰまたは
ｄＣＴＰを用いる適当な蛍光色で染色体ＤＮＡを標識す
ることは好ましい。適当な蛍光標識されたｄＣＴＰの製
造は、以下、“Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ”と称される
Ｋ．Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｎｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｇ
ｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｌａｓ
ｅｒ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ，”（印刷中）で開示されている。適当
なニックトランスレーションキットは、商業的に入手可
能である。
【００５６】好ましくは、対照集団としての全ヒトゲノ
ムＤＮＡの使用には、米国特許第５，５０６，３５０
号，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅＲｅｇｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｉｏ
ｎ，”Ｂｉｔｔｎｅｒらで開示されている重亜硫酸塩触
媒アミノ交換法によって標識付けを行なう。このような
方法で標識された全ヒトゲノムＤＮＡは、Ｖｙｓｉｓ，
Ｉｎｃ．（ダウナーズ・グローブ，イリノイ州）から商
業的に入手可能である。
【００５７】用いられる標識法は、核酸への発蛍光団の
直接結合を用いる場合、好ましくは、約０．３−約６．
０モル％標識ヌクレオチドの核酸集団それぞれの標識含
量をもたらす。用いられる標識組織核酸および対照核酸
それぞれの量は、好ましくは、約１００ｎｇ−約１μ
ｇ、好ましくは、約３００ｎｇ−約４２５ｎｇの範囲で
ある。 （９）アレイハイブリダイゼーション 組織および対照核酸集団を、適当なハイブリダイゼーシ
ョン条件下、すなわち、ストリンジェンシーで、単コピ
ーゲノム配列のハイブリダイゼーションの検出を可能に
するように選択される一定時間、アレイにハイブリッド
形成させる。そのハイブリダイゼーション条件には、緩
衝液、ホルムアミドなどの変性剤、塩添加剤および促進
剤の選択が含まれる。ＬＳＩ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）などの、
ホルムアミドおよび硫酸デキストランを含有する規定の
ｐＨおよび塩類条件のハイブリダイゼーション緩衝液
は、商業的に入手可能である。緩衝液は、好ましくは、
約６．８−約７．２のｐＨ、約１．５×ＳＳＣ−約２．
５×ＳＳＣの塩分、および約４０−５０％のホルムアミ
ド含量を有する。適当な条件には、約４０−約８０摂氏
度の温度、およびゲノムおよび発現両方のバックグラウ
ンドを越えるシグナルを検出するのに充分な時間、約１
−約７２時間、好ましくは、１２−２４時間が含まれう
る。硫酸デキストランなどのハイブリダイゼーション促
進剤は、所望ならば用いることができる。組織および核
酸集団を全ての標的要素と接触させる適当な拡散が必要
である。これは、単純な拡散によって、或いは揺動など
による機械的混合、またはアレイが入っているハイブリ
ダイゼーション室を出入りする標識集団の微量流体ポン
プ輸送などによる流体拡散を含めたいずれか適当な手段
を用いて拡散を促進するまたは拡散限界を克服すること
によって達成できる。ハイブリダイゼーション後洗浄
は、好ましくは、ハイブリダイゼーションの場合より大
きいストリンジェンシーにおいて行われる。
【００５８】ヒトゲノムＤＮＡ標的要素を含むアレイを
用いる場合、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．から入手可能なＣｏｔ１ ＤＮＡなどの過剰の未
標識ヒト反復配列ＤＮＡをハイブリダイゼーション混合
物に加えて、組織核酸集団中または用いられるならば対
照ゲノムＤＮＡ中に存在する標識反復配列のハイブリダ
イゼーションから得られる非特異的シグナルを抑制する
ことも好ましい。未標識反復配列ＤＮＡの使用は、概し
て、全標識ゲノムＤＮＡ（組織および対照両方）１ｎｇ
当り約０．０２−約５．０μｇ、好ましくは、全標識ゲ
ノムＤＮＡ１ｎｇ当り約０．１−約０．５μｇの量であ
る。
【００５９】ハイブリダイゼーションは、アレイと接触
しているそれら集団を適当な時間維持するであろういず
れか適当な装置中で行なうことができる。例えば、標識
集団をアレイに加え、カバースリップで覆った後、オー
ブン中において予め選択された温度でインキュベートす
ることができる。好ましくは、その底面とアレイ基体上
部との間に望ましいハイブリダイゼーション容積を与え
るように設計されたカバースリップを用いる。標識集団
は、１９９６年２月７日公開の欧州特許出願第０６９５
９４１Ａ１号，“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａ
ｔｕｓ ｆｏｒＰａｃｋａｇｉｎｇ ａ Ｃｈｉｐ，”
で開示されたような密封カートリッジ装置中に含有され
たアレイに微量流体注入および循環によって加えること
ができる。ハイブリダイゼーションは、１９９７年１月
２３日公開のＰＣＴ特許出願第ＷＯ９７／０２３５７
号，“Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ，”で開示され
たような小形ハイブリダイゼーションおよび検定チップ
で行なうこともできる。このような小形チップは、中規
模で製造される、すなわち、１０-8および１０-9リット
ルの量で測定される流路および反応室の容積を有して製
造されるといわれる。
【００６０】図１−５は、好ましいハイブリダイゼーシ
ョンカートリッジの成分を示す。図１は、第一成分であ
って、ミクロアレイ３２の固定された核酸標的要素３１
を含有するクロム被覆ガラス“チップ”３０を示す。ミ
クロアレイ３２は、好ましくは、示されているようにチ
ップ３０の中心に位置する。好ましい形式において、チ
ップは、２５．４ｍｍ長さ×１６．９３ｍｍ幅×０．７
ｍｍ厚みであり、ミクロアレイは１０．５ｍｍ長さ×６
ｍｍ幅の面にわたる。図２で示される第二成分は、“ア
レイ窓”３４の四角および円形の２種類の別の形状で示
される“プローブクリップ”３３である。プローブクリ
ップ３３は、いずれか適当な材料、好ましくはプラスチ
ックから製造することができる。アレイ窓３４は透明な
材料から成り、ミクロアレイを容易に画像化させるよう
な位置および大きさである。プローブクリップ３３は、
ハイブリダイゼーション室を形成し、保持装置および保
護カバーとしてアレーの上にぴったり適合している。好
ましくは、アレイ窓３４は、直径１．２７ｍｍで、２
５．４ｍｍ長さ×１６．７６ｍｍ幅のプローブクリップ
３３の中心に位置する。
【００６１】図３および４は、第四成分であるチップホ
ルダー３６の平面図および側面図であり、これは好まし
くは、物理的安定性を損なうことなく必要なハイブリダ
イゼーション温度に耐えることができる耐衝撃性ポリス
チレンなどの頑丈な射出成形可能プラスチックから製造
される。チップホルダー３６は、チップを保持するのに
望ましい任意の寸法でありうるが、好ましくは、２５．
４ｍｍ幅×７６．２ｍｍ長さ×３．２ｍｍ厚みである。
示されているように、一方の先端近くに、チップホルダ
ー３６は、ミクロアレイ３２を有するチップ３０を許容
する大きさの、好ましくは、２６ｍｍ長さ×１８．５ｍ
ｍ幅×１．７ｍｍ深さのキャビティ３７を含有する。キ
ャビティ３７は、その長さに沿って両側に僅かに、好ま
しくは、０．５ｍｍ広くなって、アクセスギャップ３８
を作り、プローブクリップおよび顕微鏡カバースリップ
の一層容易な着脱を可能にする。キャビティ底面には、
浅い溝の刻みをつけて、チップを適所に保持するように
考案された接着剤または固定剤の塗抹を容易にする。キ
ャビティ３７の反対側の端のチップホルダー３６は、そ
の上面のホルダーの幅に沿って微かに刻みをつけて、使
用者がより把握しやすい表面を与えることができる。チ
ップホルダー底部は、アレイ読取り機での並列を容易に
するように溝を刻むことができる。
【００６２】完成したカートリッジの製造においては、
望ましい標的要素を含むミクロアレイを上記のように製
造した後、いずれか適当な接着剤でキャビティ３７の底
部に接着する。次に、そのアレイを有するチップホルダ
ー３６を収縮包装し、プローブクリップ３３、アレイ画
像化で用いられるカバースリップ、および核酸を標識す
る若しくは抽出するおよび／またはハイブリダイゼーシ
ョンを実施するための任意の他の望ましい試薬と一緒に
キット中に密閉する。本発明の方法を行なうために、使
用者は、適当な緩衝剤および標識核酸集団（対照および
組織）を含むハイブリダイゼーション溶液をミクロアレ
イ表面に適用し、プローブクリップ３３をそのミクロア
レイの上に置く。完成したカートリッジを図５で示す。
図５で更に重なって示されているのは、Ｃｈｅの好まし
い画像化システムのカメラ視野３５である。次に、その
カートリッジを、オーブン中において望ましい湿度調整
を用いて望ましいハイブリダイゼーション温度で所望の
時間インキュベートする。
【００６３】ハイブリダイゼーションが完了したら、プ
ローブクリップ３３を除去し、そのチップを望ましいス
トリンジェンシーで、好ましくは、順に、２×ＳＳＣを
用いて室温で５分間、２×ＳＳＣおよび５０％ホルムア
ミドを用いて４０℃で３０分間、および２×ＳＳＣを用
いて室温で１０分間洗浄して、ハイブリッド形成したプ
ローブを除去する。Ｇｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｇ
ａ，フォスターシティー，カリフォルニア州）およびＤ
ＡＰＩをアレイに適用し、１８ｍｍ×１８ｍｍガラス顕
微鏡カバースリップを、まだホルダー３６中にあるアレ
イ上に密封する。次に、カバーされたチップを画像化し
て、ハイブリダイゼーション結果を検出する。 （１０）アレイ検出 ハイブリダイゼーション後、それぞれの標識色について
蛍光の存在および強度を、いずれか適当な検出器または
読取り装置および方法によって検出し且つ測定する。レ
ーザーによるアレイ走査検出器は、当該技術分野で知ら
れている。米国特許第５，５７８，８３２号，“Ｍｅｔ
ｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓｆｏｒ Ｉｍａｇ
ｉｎｇ ａ Ｓａｍｐｌｅ ｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ，”Ｔ
ｒｕｌｓｅｎらを参照されたい。アレイハイブリダイゼ
ーションの光導波管検出法も開示されている。米国特許
第５，８４３，６５１号，“Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅ
ｒｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｖｅｎｔｓ，”Ｄ．Ｓｔｉｍ
ｐｓｏｎらを参照されたい。好ましくは、１９９８年３
月２７日出願の同時係属、同一譲渡人の米国特許出願第
０９／０４９，７９８号，“Ｌａｒｇｅ−Ｆｉｅｌｄ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｄｅｖｉｃ
ｅ，”Ｄ．Ｃｈｅ（以下、“Ｃｈｅ”と称する）で開示
されたような大視野画像化装置および方法を用いる。
【００６４】Ｃｈｅの大視野蛍光画像化装置は、高電力
白色光源によって生じる励起ビームをミクロアレイ表面
上につなぐ反射光学素子を用いて高い照度を与え、その
高い照度をアレイ検出器の高検出効率と組合せて高画像
捕捉率を与える。光源によって生じる白色光を平行に
し、計算機制御フィルターを通して励起ビームを与え
る。その励起ビームは、視野絞りを通過して明瞭なビー
ムパターンを形成した後、凹面鏡を用いてアレイ表面上
に投映される。その凹面鏡は、試料上の視野絞りを画像
化するように配置されて、画像化光学素子の視野に対合
する照明範囲を画成する。試料中で生じる蛍光は、励起
色の散乱光を排除するように色フィルターを通され、そ
して画像化光学素子によってアレイ検出器上に画像化さ
れて試料の蛍光画像が得られる。
【００６５】アレイ画像化装置および方法は、画像化装
置からのディジタル画像データのデータ分析、記憶およ
び表示のために、プログラム化された計算機で用いられ
るディジタル画像処理アルゴリスムを用いることができ
る。いずれの適当なディジタル画像処理、データ記憶お
よび表示ソフトウェアも、アレイハイブリダイゼーショ
ン結果の分析に用いることができる。ディジタル画像化
法は、例えば、米国特許第５，６６５，５４９号，“Ｃ
ｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ，”Ｋａｌｌｉｏｎｅｍｉらおよび米国
特許第５，８３０，６４５号で開示されたように、当業
者に知られている。
【００６６】ハイブリダイゼーション画像は、好ましく
は、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ（スコッツデール，アリ
ゾナ州）製のＰＳＩインタフェースＳｅｎＳｙｓ１６０
０Ｃａｍｅｒａなどの、検出光学素子から直接的に大視
野画像を受像する高解像度ディジタル画像化カメラの使
用によって捕捉され且つ分析される。他のいずれか適当
なカメラも用いることができる。カメラによって捕捉さ
れた生画像データをいずれか適当な計算機データベース
またはデータ記憶ファイル中に記憶する。その生画像デ
ータを、適当な画像分析アルゴリズムを用いて処理し、
ミクロアレイのそれぞれの標的要素でのマーカー強度を
測定する。画像分析アルゴリズムは当業者に周知であ
り、多数のこのようなアルゴリズムのパッケージは、Ｉ
ＰＬａｂとしてＳｃａｎａｌｙｔｉｃｓ（フェアファッ
クス，バージニア州）から入手可能である。
【００６７】好ましくは、画像分析アルゴリズムは、適
当な計算機ソフトウェアで実行される次の操作を行な
う。（ｉ）必要に応じたバックグラウンド補正；（ｉ
ｉ）個々のアレイ要素の識別のためのアレイ標的要素す
なわち“スポット”のセグメンテーション；（ｉｉｉ）
各スポットへの段数および列数のスポットグリッド割当
て；（ｉｖ）有効性および人工物の存在の検証、反復試
験スポットのデータの平均化、全スポットからのデータ
の規格化、および多重実験比較および分析を含めたスポ
ットデータ分析；（ｖ）それぞれの蛍光マーカー色の全
強度、平均ＤＡＰＩ対比染色強度、蛍光強度の画素当り
の比率の平均、モード、メディアンおよび相関係数、お
よび“質量比”と称される、全組織核酸マーカー強度対
対照強度の比率を含めた単スポット計算値；（ｖｉ）ス
ポットの有効反復試験数、スポット当りの質量比の平均
および変動係数、および全スポットにわたる画素当り比
率の相関係数を含めた標的要約分析。好ましくは、用い
られる画像分析は、窓に基づくモード推定値を用いてモ
ード値が１．００であるように平均質量比を規格化す
る。
【００６８】各標的要素での蛍光データを自動的に比較
して、任意の望ましい組織および対照間のまたは組織間
の比率を生じることができる。例えば、４種類の組織核
酸（一次腫瘍ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、および転移
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）を２種類の対照（その腫
瘍と同種の細胞の正常組織からの全ゲノムおよび全ｃＤ
ＮＡ）と一緒に用いる場合、少なくとも８種類の異なっ
た比率を計算することがありうる（それぞれの組織でそ
れぞれの対照の比率）。
【００６９】画像分析は、好ましくは、（ｖｉｉ）飽和
組織または対照色チャネルを有する画素を含むスポット
の排除；（ｖｉｉｉ）排除のためのスポット寸法および
形状判定基準；および（ｉｘ）域値未満の相対係数を用
いるスポットの“関連係数”排除を含めた、個々の使用
者による有効分析についての判定基準設定の方法も含
む。アレイデータ分析は、個々の試験からのデータを、
疾患の遺伝子型および表現型を含有するデータベース
（すなわち、特定の疾患についての遺伝子発現および染
色体異常のリスト）と比較する比較アルゴリズムも含む
ことができ、個々の試験結果に基づいて可能な診断また
は療法の選択を決定することができる。
【００７０】好ましくは、画像分析は、例えば、計算機
モニタ表示および計算機印刷について当業者に知られて
いるような計算機表示および印刷アルゴリズムを用い
る。データ表示は、組織および対照核酸の個々の蛍光色
について使用者によって選択される“プソイドカラー”
画像を含むことができる。アレイデータ表示は、慣用的
な染色体イディオグラムの表示を用いて、本発明の方法
によって確認される一層明確な詳細染色体異常および発
現遺伝子異常に結びつけることができる。典型的なイデ
ィオグラムについては、米国特許第５，６６５，５４９
号の図９を参照されたい。好ましくは、アレイデータ
は、更に、分析から排除されるスポットに、使用者が容
易に識別するための印をつけるように表示される。これ
は、“誤差色”中のまたは周りに着色環を有するその標
的要素を表示することによって行なうことができる。
【００７１】好ましい実施態様において、アレイ読取り
機およびソフトウェアは、（１）ＤＡＰＩ対比染色
（青）、（２）組織ＤＮＡ（緑）、（３）組織ｃＤＮＡ
（赤）および（４）対照ＤＮＡ（橙）に特異的なそれぞ
れのチップの４種類の画像を自動的に捕捉する。これら
画像を着色面と称する。しかしながら、より多くのまた
は異なった着色面の画像を得ることができる。ソフトウ
ェアの画像分析部分は、好ましくは、標的要素およびそ
れらのグリッド中の位置を識別する色（好ましくは、Ｄ
ＡＰＩ画像）の一つを用いる。全てのスポットがいった
ん識別されたら、そのソフトウェアは、それぞれのスポ
ット下のそれぞれの画素を残りの着色面それぞれの強度
について分析する。適当なアルゴリズムを用いて、これ
ら着色面それぞれの局所バックグラウンドを測定した
後、これをそれぞれの色の全強度から差し引く。次に、
バックグラウンドで補正された強度を、特定の標的スポ
ットまたはスポット群下の全ての画素について平均する
ことができ、この画素当りの平均強度（例えば、ＤＡＰ
Ｉ強度についてＡ、組織ＤＮＡ強度についてＢ、組織ｃ
ＤＮＡ強度についてＣおよび対照強度についてＤ）を様
々な分析に用いることができる。
【００７２】例えば、強度Ａは、ＤＡＰＩ染色の強度
が、標的スポットにおいて結合したＤＮＡの全量の関数
であるので、標的スポット品質の指示薬として用いるこ
とができる。Ａについてある値未満（制御染色条件下）
での標的要素ＤＮＡの量は、速度限界になりうる。対照
ＤＮＡの強度Ｄは、この試薬が、好ましくは、所定の濃
度で与えられ且つ品質管理されているので、ハイブリダ
イゼーション効率の指示薬として用いることができる。
【００７３】好ましい分析において、最も重要な情報
は、バックグラウンドで補正された対照強度に対するバ
ックグラウンドで補正された組織強度の比率、すなわ
ち、上の実施例に関して、Ｂ／ＤおよびＣ／Ｄの比率で
ある。２種類以上の対照を用いる場合、追加の比率は、
有益なデータを与えるように得ることができる。これら
の比率は、スポット群、単スポット、またはそれぞれの
スポット下のそれぞれの画素について決定することがで
きる。
【００７４】最も好ましい態様においておよび上に挙げ
た例に関して、Ｂ／ＤおよびＣ／Ｄ強度比は、それぞれ
の画素について決定されるが、これは、いずれの色でも
それらの絶対強度とは無関係なはずである。言い換える
と、Ｂ対Ｄのプロットは、例えば、それぞれのスポット
下のそれぞれの画素について、直線の周りにばらつきを
生じるはずであり、バックグラウンド補正が適切である
としても、ＸおよびＹ軸両方と０で交差するはずであ
る。（適当なアルゴリズムは、デイスプレイ中のある与
えられた標的スポットまたはスポット群の上で“クリッ
クすること”によってこのようなプロットを生じること
ができる。）このプロットは、２種類の情報を示してい
る。
【００７５】第一に、線型回帰線の周りのばらつきの量
は、データの品質を示すものであり、統計学的に評価し
て、理想的なスポットについては１である（すなわち、
全ての画素値が回帰線上に来る）相関係数を生じること
ができる。１未満の値は、完全なデータより劣ることを
示し、０．８またはそれ未満の値は、好ましくは、この
ようなスポットからのデータを疑わしいと考えるべきで
あるということを示すものとされる。このばらつきスポ
ットは、単スポットまたはスポット群について生成する
ことができる。第二に、この回帰線の勾配は、ある与え
られたスポットまたはスポット群について、それぞれＢ
／ＤまたはＣ／Ｄ強度比である。
【００７６】所望の生物学的情報を抽出するために、そ
のＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比を、好ましくは、対照スポット
またはスポット群に関して規格化するが、これら比率
を、試験プローブ混合物中の既知のレベルのＤＮＡまた
はＲＮＡ配列に相関させることができる。これは、次の
ように行なわれる。
【００７７】ゲノムＤＮＡの分析には、組織ＤＮＡ配列
の大部分が、それらの標準コピー数、すなわち、ゲノム
当り２個（試験組織が男性ドナー由来である場合、性染
色体からの配列を除く）で実際に存在していると仮定す
る。対照ＤＮＡについては、これが全ての配列（対照Ｄ
ＮＡが男性ドナー由来である場合、ＸまたはＹ染色体か
らのものを除く）について真であると仮定する。これら
の仮定に基づいて、ソフトウェアは全ての標的スポット
のＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比を比較し、極めて類似している
と思われる比率群を選択する。この比率群は、試験組織
中で標準である標的を示すと仮定され、その比率の平均
を用いて他の比率を全て規格化する。言い換えると、全
てのスポットのＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比を、この“標準
群”の平均Ｂ／ＤまたはＣ／Ｄ比それぞれで割る。した
がって、全ての標準スポットのＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比は
１に近づくはずであるが、異数体である（２より大きい
または少ないコピー数で存在する）標的からのＢ／Ｄま
たはＣ／Ｄ比は、約０．５またはそれ未満（欠失）また
は１．５以上（付加または増幅）であろう。
【００７８】本発明の同時の発現およびゲノム分析組合
せは、上記の比率を次のように用いることによって遺伝
子コピー数への発現レベルの相関を可能にする。
【００７９】Ｂが組織ゲノムＤＮＡの強度であり、Ｃが
組織ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の強度であり、そしてＤが対
照ゲノムＤＮＡの強度である検定を行なったと仮定す
る。次に、得られる比率は次のようである。 （Ｂ／Ｄ）＝バックグラウンドで補正された平均画素強
度比 （Ｂｇ／Ｄｇ）＝“標準”組のバックグラウンドで補正
された平均画素強度比 （Ｂ／Ｄ）／（Ｂｇ／Ｄｇ）＝規格化されたＢ／Ｄ比＝
Ｂｎ／Ｄｎ （Ｃ／Ｄ）＝バックグラウンドで補正された平均画素強
度比 （Ｃｇ／Ｄｇ）＝“標準”組のバックグラウンドで補正
された平均画素強度比 （Ｃ／Ｄ）／（Ｃｇ／Ｄｇ）＝規格化されたＣ／Ｄ比＝
Ｃｎ／Ｄｎ Ｂｎ／Ｄｎ比は、ある与えられた標的配列のゲノムコピ
ー数を示し、Ｃｎ／Ｄｎ比は、ゲノム配列当りのｍＲＮ
Ａコピーの相対数を示し、Ｃｎ／Ｂｎ比は、相対ｍＲＮ
Ａコピー数が、ゲノムコピー数変化の相対変化と相関す
るかどうかを示すと考えられる。 （１１）アレイの例 本発明の方法において有用なミクロアレイの種類を代表
するものは、反復試験片を含まない約１００個の標的要
素の出生前アレイであって、これは、（ａ）（ｉ）全ヒ
トテロメアおよび（ｉｉ）全ヒト動原体（腕ｐおよびｑ
双方から得られる）の反復配列領域のすぐ隣のユニーク
配列領域；（ｂ）ディ・ジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇ
ｅ）、スミス・マジェニス（Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉ
ｓ）、ダウン（Ｄｏｗｎｓ）、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ）、ヴェロカルディオフェイシャル（Ｖｅｌｏ
ｃａｒｄｉｏｆａｃｉａｌ）、アラジル（Ａｌａｇｉｌ
ｌｅ）、ミラー・ディーカー（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋ
ｅｒ）、ウォルフ・ヒルシュホルン（Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒ
ｓｃｈｈｏｒｎ）、ネコ鳴き（Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａ
ｔ）、ネコ眼（Ｃａｔ Ｅｙｅ）、ランガー・ジーディ
オン（Ｌａｎｇｅｒ−Ｇｉｅｄｉｏｎ）、カルマン（Ｋ
ａｌｌｍａｎｎ）およびプラーダー・ヴィリ（Ｐｒａｄ
ｅｒ−Ｗｉｌｌｉ）／アンジェルマン（Ａｎｇｅｌｍａ
ｎ）症候群の“微少欠失”症候群領域；および（ｃ）ス
テリルスルファターゼ欠損症、筋ジストロフィーおよび
男性不妊症で確認される欠失領域からのゲノムＤＮＡ配
列、およびそれぞれの染色体上のサブテロメアのユニー
ク配列領域の欠失を伴う精神遅滞につながると考えられ
るものを含む。
【００８０】表１は、このようなアレイにおいて有用な
ヒトゲノムＤＮＡクローンを挙げる。この出生前アレイ
は、遺伝病を引起こす多数の粗大染色体変化を確実に検
出するその能力ゆえに、強力な医学的有用性を有する。
ヒト出生前アレイは、割球および極体についての出生後
試験、胎児細胞試験および着床前遺伝子試験についても
有用である。表１には、染色体遺伝子座およびそれぞれ
の遺伝子座に相関する疾患が含まれる。
【００８１】
【表１】
【００８２】
【表２】
【００８３】
【表３】
【００８４】
【表４】
【００８５】もう一つの例は、表２で挙げられる５２種
類の癌遺伝子座または増幅遺伝子座それぞれのゲノム配
列を含有するＡｍｐｌｉＯｎｃTMゲノムＤＮＡ標的要素
アレイである。
【００８６】
【表５】
【００８７】
【表６】
【００８８】
【表７】
【００８９】表２で挙げられたクローンに由来するゲノ
ムＤＮＡ標的要素は、ＰＡＣ、Ｐ１またはＢＡＣベクタ
ー中の約５０ｋｂ−約２００ｋｂのヒトゲノムＤＮＡイ
ンサートを含有する。このアレイは、ベクター配列を分
離することなく製造される。このアレイの使用は、これ
ら癌遺伝子座それぞれのゲノム増幅、更には、これら領
域をマッピングする遺伝子の発現の同時識別を可能にす
る。
【００９０】さらに別の例は、ＡｍｐｌｉＯｎｃＩＩア
レイであり、これは、ｐ５３、ＲＢ１、ＷＴ１、ＡＰ
Ｃ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＭＥＮ１、ＭＥＮＺＡ、
ＤＰＣ４、ＭＳＨ２、ＭＣＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、
Ｐ５７／ＫＩＰ２、ＰＴＣＨ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ
２、Ｐ１６／ＣＤＫＮ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＥ
Ｎ／ＭＭＡＣ１、ＡＴＭおよびＴＰ７３遺伝子のヒト腫
瘍サプレッサー遺伝子座からのゲノムＤＮＡによって補
足された表２の癌遺伝子座からのゲノムＤＮＡを含有す
る。それらゲノムＤＮＡ標的要素は、ヒトゲノムライブ
ラリーからこれら腫瘍サプレッサー遺伝子の遺伝子座を
マッピングするゲノムＤＮＡクローンを選択することに
よって製造される。この選択は、遺伝子座または遺伝子
からのＰＣＲプライマー対の製造、および引続きクロー
ンを識別するライブラリースクリーニングによって行な
われる。この実施態様において、腫瘍サプレッサー遺伝
子座のクローンは、約２０ｋｂ−２５０ｋｂの複雑度で
ありうるが、好ましくは、約５０ｋｂ−約２００ｋｂで
ある。 （１２）発明の有用性 本発明の方法は、遺伝的研究、ヒト疾患治療技術、ヒト
疾患臨床研究、ヒト疾患薬物開発および薬理ゲノム学
（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ヒト遺伝子研
究、動物用薬物開発、動物疾患治療技術、動物遺伝子研
究、および植物遺伝子研究の分野でかなり有用である。
特に、疑わしい癌組織をより正確に遺伝的に詳しく説明
可能にすることにより、本発明は、より注文通りの診断
および療法選択によって改良された疾患治療技術を提供
するであろう。それら方法は、ウイルスの存在、染色体
中へのウイルス組込み、およびウイルス遺伝子の発現を
確認するのに用いることもできる。その方法を用いて、
ヒトゲノムＤＮＡ異常、ヒト遺伝子発現、および細菌遺
伝子の遺伝子発現を同時に検出することもできる。
【００９１】本発明の方法は、癌および他の疾患のゲノ
ム疾患治療技術に特に有用である。例えば、それら方法
は、乳癌、前立腺癌、肺（小細胞または非小細胞）癌、
卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、頭部および頸部癌、膵臓
癌、胃癌、脳癌、軟組織および皮膚癌、および白血病お
よびリンパ腫などの様々な血液またはリンパ系癌を含め
た癌の遺伝子型および表現型を分類するのに有用であ
る。腫瘍組織遺伝子型および表現型が本発明の方法によ
っていったん分類されると、医師は、このデータを他の
臨床データと組合せて、診断、予後、療法および療法へ
の予想応答を決定することができる。
【００９２】本発明の多色法によって与えられる性能
は、薬物開発における迅速な比較試験を可能にする。例
えば、癌細胞系に推定上の薬物化合物を用いて且つ望ま
しい時間間隔で投薬することができ、その後、細胞試料
を取出すことができる。取出される細胞試料をそれぞ
れ、例えば、投薬後０時間、１０時間、２０時間および
３０時間に集め、核酸抽出処理をした後、核酸を別々の
フルオル（ｆｌｕｏｒ）でそれぞれ標識する。次に、そ
れら４種類の集団を適当な対照と一緒にアレイに適用す
る。このようにして、発現および初期染色体状態への薬
物の経時追跡作用を評価する。染色体変化は、概して、
より長期間にわたって起こり、この実施例中に変化する
とは考えられない。その方法は、特に、遺伝子増幅によ
って薬物耐性を生じることがありうるような薬物耐性細
胞系において薬物効力を評価するのに適用することもで
きる。
【００９３】
【実施例】次の実施例は、本発明を単に詳しく説明する
ためのものであり、制限すると解釈すべきではない。 実施例１ （Ａ）方法 （ｉ）試験アレイ製造：４インチ×４インチのクロム被
覆プレート（Ｎａｎｏｆｉｌｍ）は、Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅｃ
ｉｓｉｏｎ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（エルジン，
イリノイ州）によって刻みをつけられ、その刻みは２４
の等寸のチップに印をつけた。１８０標的要素ミクロア
レイをそれぞれのチップ上に製造した。核酸付着の前
に、そのプレートを、蒸留水、イソプロパノール、メタ
ノールおよび蒸留水で連続して洗浄し、乾燥させ、室温
まで平衡させた。そのミクロアレイは各チップの中央に
置かれ、チップ表面の約５ｍｍ×６ｍｍを占めた。その
ミクロアレイは、Ｎｅｗ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ノースブルック，イリノイ州）に
よって供給された計算機制御された単針流体付着ロボッ
トを用いて製造された。そのロボットは、レーザーによ
るＺ軸制御器、付着ピンに掛けられた圧力調整用窒素ガ
スライン、および１２個の４″×４″プレートを保持す
る大きさの定盤を加えることによって変更された。その
ロボットは、ＥＦＤ製のＬｕｅｒロックシリンジ先端に
連結されたそれぞれが３３ゲージ、１インチ長さの鋼製
細管注射針である多数の付着ピンを用いた。それら細管
ピンにはそれぞれ、異なったゲノムＤＮＡを針のルア
（Ｌｕｅｒ）ロック部分に充填することによって充填し
た。その針は、定盤上の全てのチップ上にそれぞれの標
的要素を付着後に手動によって交換した。ミクロアレイ
は、標的要素中心間がＸおよびＹ両方向に約４００ミク
ロン間隔となるように製造された。
【００９４】ロボットは、そのロボットと一緒に与えら
れた計算機ソフトウェアで制御されたが、細管ピンをチ
ップ表面と接触させるように、しかも接触時にそのピン
の上に微量噴出窒素圧を与えるように変更された。接触
および微量噴出時間は、標的要素当り約１０ミリセカン
ドであった。ガス圧は約１ｐｓｉであり、必要に応じて
手動調節されて、充分な量の粘稠なゲノムＤＮＡをピン
から押出した。制御条件は、約０．３ｎｌ／スポットの
１００ｍｍ ＮａＯＨ中１μｇ／μｌ核酸を付着させる
ように設定された。付着した要素はほぼ円形であり、Ｄ
ＡＰＩ染色後の顕微鏡検査下で容易に目につく変形を伴
った。スポット寸法は、ＤＮＡの粘度によっても異なっ
た。個々のチップを手動で分離した。
【００９５】ミクロアレイは、３１個のヒトの推定上の
増幅遺伝子座からのゲノムＤＮＡを含むスポット、１個
の全ヒトゲノムＤＮＡスポット、それぞれのスポットが
これら癌遺伝子座の内１０個のゲノムＤＮＡの等量のプ
ールであるプールされたゲノムＤＮＡの３個の対照スポ
ット、および１個のλファージＤＮＡスポットを含ん
だ。これら３６スポットをミクロアレイ上で各５回繰返
して１８０個のスポットのミクロアレイを製造した。３
１個のヒトの推定上の増幅遺伝子座を以下に挙げるが、
これらは、ＢＡＣ、ＰＡＣまたはＰＩクローニングベク
ター中に挿入されたゲノムヒトＤＮＡであった。これら
遺伝子座のゲノムＤＮＡそれぞれを、単ＢＡＣ、ＰＡＣ
またはＰＩクローンのＤＮＡを用いて製造したが、個々
のインサート寸法は一定ではなかった。これらＢＡＣク
ローンは、入手可能なゲノムライブラリーを次のような
遺伝子座それぞれのプライマー配列を用いてスクリーニ
ングすることによって得られた。
【００９６】
【表８】
【００９７】（ｉｉ）組織抽出および標識付け：ＡＴＣ
Ｃから入手したＳＪＳＡ−１およびＣｏｌｏ３２０細胞
系それぞれについて、それら細胞４℃において７，００
０ｒｐｍで遠心分離して細胞ペレットを生じた。上澄み
を捨てた。それらペレットを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製
のＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＫｉｔのＳｏｌｕｔ
ｉｏｎ＃２中に再懸濁させた。それらペレットは、機械
的ホモジナイザーを中位の設定で用いて均一化された。
プロナーゼを加えて、各試験管中で１００μｇ／ｍｌの
プロナーゼ濃度にした。それら試験管を６０℃で振とう
しながら１時間インキュベートした。試験管を氷上に１
０分間置いた。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＤＮＡ Ｅｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＃３を加え、
それら試験管を再度氷上に５分間置いた。試験管を４℃
において８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してタン
パク質沈殿をペレット化した。その上澄みをデカントし
た。ＲＮアーゼをその上澄みに加えて２０μｇ／ｍｌの
ＲＮアーゼ濃度にし、その上澄みを３７℃で１５分間イ
ンキュベートした。２倍容量のエタノールを加えた後、
１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄みを
デカントした。それらＤＮＡペレットを、Ｓｐｅｅｄ
Ｖａｃを用いた真空下で乾燥させた。それらＤＮＡペレ
ットを水中に再懸濁させ、９９５μｌの５０ｍＭ水酸化
ナトリウムを加えた。
【００９８】Ａｍｅｒｓｈａｍ（アーリントン・ハイ
ツ，イリノイ州）からのＣｙ−５ｄＵＴＰおよびＣｒｕ
ｉｃｋｓｈａｎｋによって製造されたフルオレセイン標
識ｄＣＴＰを、抽出されたＤＮＡを標識するニックトラ
ンスレーションで用いた。ＳＪＳＡ−１取込みのための
Ｃｙ−５ｄＵＴＰのニックトランスレーションには、Ｐ
ｒｏｍｅｇａ（マディソン，ウィスコンシン州）ニック
トランスレーションキットを用いる標準的なプロトコー
ルを用いた。Ｃｏｌｏ３２０については、１０μｌのニ
ックトランスレーション酵素および５μｌのニックトラ
ンスレーション緩衝液（両方ともＶｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．
製）を、１μｇの抽出Ｃｏｌｏ３２０ ＤＮＡ、各４μ
ｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１μｌのｄＣ
ＴＰ、２μｌのＣｒｕｉｃｋｓｈａｎｋによって製造さ
れたフルオレセインｄＣＴＰ、および５０μｌの溶液を
生じるための充分な水と混合した。その混合物を３７℃
で３０分間インキュベートした。その酵素は８０℃で１
０分間加熱することによって熱失活した。その溶液をＧ
−２５ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎで精製し、標識された
プローブをＳｐｅｅｄ Ｖａｃ．で４０分間乾燥させ
た。
【００９９】（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション：ニッ
クトランスレーションされたＤＮＡ（各４１５ｎｇ）、
対照ＤＮＡ（４１５ｎｇのＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇ
ｅＴａｔａｌ Ｈｕｍａｎ ＤＮＡ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎ
ｃ．））およびＣｏｔ−１ＤＮＡ（１００μｇ）（ＬＴ
Ｉ，ベセスダ，メリーランド州）を、約１５μｌのＬＳ
Ｉ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｙ
ｓｉｓ，Ｉｎｃ．）と混合して、２５μｌのハイブリダ
イゼーション混合物を生じた。そのハイブリダイゼーシ
ョン混合物を、図１−５で示されているチップホルダー
中に入っているチップ上にピペットで移した。そのチッ
プを、ＲＴＶ１０３シリコーンゴムシーラント（ＧＥ，
ウォーターフォード，ニューヨーク州）を用いてホルダ
ー中の適所に接着した。図１−５のプローブクリップ３
３を上記のように用いた。次に、ホルダーを密閉給湿室
内において３７℃で一晩中インキュベートした。ハイブ
リダイゼーション後、そのプローブクリップを除去し、
そのチップを、２×ＳＳＣを用いて室温で５分間、２×
ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを用いて４０℃で３０
分間、そして次に、２×ＳＳＣを用いて室温で１０分間
洗浄した。洗浄されたチップを暗所において室温で乾燥
させた。１０μｌのＧＥＬ／Ｍｏｕｎｔ TMおよびＤＡＰ
Ｉを加え、１８ｍｍ×１８ｍｍガラスカバークリップを
ホルダー中のアレイ上に置いた。
【０１００】（ｉｖ）画像捕捉および分析：Ｃｈｅのブ
レッドボード画像化装置を用いて、ハイブリッド形成さ
れたアレイの大視野画像をアレイ窓によってプローブク
リップまたはカバースリップを除去することなく捕捉し
た。ブレッドボード画像には二重フィルターホイール
（Ｌｕｄｌ）が含まれ、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｓ
ｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅおよびＣｙ５それぞれのた
めの単バンドパスフィルター（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，バトルボロ，バーモント州）を励起およ
び発光に用いた。画像データは、次の工程を実施するＭ
ａｃｌｎｔｏｓｈ計算機作動アルゴリズムを用いて処理
された。（１）各標的要素スポットをＤＡＰＩ画像から
配置し、そのグリッド位置を割当てる；（２）各スポッ
トの各フルオルの蛍光強度を測定する；（３）モード、
メディアンおよび質量による蛍光比を各スポットについ
て計算する；（４）スポット寸法および強度域値に基づ
く排除判定基準；（５）複合画像を作成し、計算機モニ
タで表示する；（６）表示される画像には、各スポット
の周りに描かれた白色環およびグリット位置の数が含ま
れる；（７）慣用的な計算機によるプリンターの印刷性
能；および（８）生および処理データおよび画像記憶。 （Ｂ）結果 対照と比較されるＣｏｌｏ３２０の蛍光比を表３に示
す。表３に示されるように、癌遺伝子ＣＭＹＣをＣｏｌ
ｏ３２０細胞中で３２倍に増幅させた。これは、２９±
６倍（公開データの平均から計算される）のＣｏｌｏ３
２０中で知られているＣＭＹＣの増幅に匹敵する。ハイ
ブリダイゼーション結果のプソイドカラー複合画像は、
ＣＭＹＣ要素の有意の色強度を示し、ＣＭＹＣ遺伝子座
の増幅も示した。表４は、対照と比較されるＳＪＳＡ−
１細胞についての蛍光比分析結果を示す。表４は、ＧＬ
Ｉ（９．４倍）、ＭＤＭ２（７．５倍）およびＣＤＫ４
／ＳＡＳ（１２．１倍）遺伝子座がＳＪＳＡ−１細胞中
でそれぞれ増幅されることを示している。ハイブリダイ
ゼーション結果のプソイドカラー複合画像は、ＧＬＩ、
ＭＤＭ２およびＣＤＫ４／ＳＡＳ要素の有意の色強度を
示し、増幅も示した。表５は、大部分の標的のＳＪＳＡ
−１シグナルと比較されるＣｏｌｏ３２０シグナルの蛍
光比か約１であることを示している。しかしながら、Ｇ
ＬＩ（０．１２）、ＭＤＭ２（０．１３）およびＣＤＫ
４／ＳＡＳ（０．０９）のより低い比率は、これら遺伝
子座が、Ｃｏｌｏ３２０細胞に相対してＳＪＳＡ−１細
胞中で増幅されたことを示している。標的ＣＭＹＣ（４
０）の高い比率は、Ｃｏｌｏ３２０細胞中でのＣＭＹＣ
増幅を示している。一つのチップに同時にハイブリッド
形成した３種類のプローブ（二つの試料プローブおよび
一つの対照プローブ）で認められた遺伝子増幅は、ＳＪ
ＳＡ−１およびＣｏｌｏ３２０のＤＮＡの別々のチップ
への別々のハイブリダイゼーションによって得られるも
のと同様であった。（データ収集後、ＡＫＴ２遺伝子座
のクローンが正しくマッピングされなかったことが判っ
た。したがって、ＡＫＴ−２標的要素について表３、４
および５、および図６−１３で示されているデータは無
意味である。） この実施例１は、３種類以上の別々に標識された核酸集
団の同一アレイへの比較ハイブリダイゼーションについ
て出願人が承知している最初の実例である。これら結果
は、組織核酸の状態を検出するためのミクロアレイへの
３種類の別々に標識された核酸集団の同時ハイブリダイ
ゼーションを示している。
【０１０１】
【表９】
【０１０２】
【表１０】
【０１０３】
【表１１】
【０１０４】実施例２ （Ａ）方法 （ｉ）アレイ：実施例１と同様の１８０要素ミクロアレ
イを用いた。
【０１０５】（ｉｉ）組織抽出および標識付け：この実
験では、共にＡＴＣＣからの２種類の細胞系Ｃｏｌｏ３
２０およびＫ５６２を用いた。それぞれ５百万個の細胞
を回転させて（１．５Ｋ，１０分間）ペレット化した。
デカントした後、１００μｌのＲＮアーゼ溶液および３
００μｌの溶解溶液をそのペレットに加え、その混合物
を高速で簡単に回転させた。それぞれの細胞系のｍＲＮ
Ａを、ニトロセルロース−ポリＴによって、製造者（ア
ンビオン，テキサス州）によって与えられた単離プロト
コールを用いて単離した。
【０１０６】単離されたｍＲＮＡをエタノール沈殿さ
せ、Ｃｙ−５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下
において慣用的なプロトコールを用いて逆転写し、ラン
ダムｐＮ９によって開始されてＣｙ５標識ｃＤＮＡプロ
ーブを製造し、その５分の１をそれぞれのハイブリダイ
ゼーション検定に用いた（各検定につき１００万個の細
胞）。ＤＮＡをそれぞれの細胞系について、慣用的なフ
ェノール−クロロホルム抽出を用いて単離し、実施例１
の場合のようにフルオレセインｄＣＴＰの存在下におい
てニックトランスレーションを用いて標識してｇＤＮＡ
を生じた。
【０１０７】（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション：ハイ
ブリダイゼーションはそれぞれ、１５μｌのＬＳＩハイ
ブリダイゼーション緩衝液（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）、
２００ｎｇの細胞系ｇＤＮＡプローブ、２００ｎｇの細
胞系ｃＤＮＡプローブ、対照として２００ｎｇのＳｐｅ
ｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ Ｔａｔａｌ ＨｕｍａｎＧｅ
ｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）、２０μ
ｇのサケ精子ＤＮＡおよび４０μｇのＣｏｔ−１ ＤＮ
Ａから成る２５μｌの全容量においてであった。ハイブ
リダイゼーションは、実施例１の場合のようにプローブ
チップを含むチップホルダー中のミクロアレイに対して
であり、密閉給湿室内において４２℃で３日間行なわれ
た。各細胞系について、ハイブリダイゼーションは二つ
のチップで二重に試験された。全工程を下に示す。
【０１０８】
【化１】
【０１０９】（ｉｖ）画像捕捉およびデータ分析：ハイ
ブリッド形成されたチップの蛍光画像を、実施例１の場
合のようにＣｈｅのブレッドボード二重フィルターホイ
ール画像化システムを用いて得、分析した。単バンドパ
スフィルターを励起および発光両方に用いた。画像は、
実施例１の場合と同様にソフトウェアを用いて分析し
た。 （Ｂ）結果 図面の一般的な説明：データは、散布図および／または
棒グラフとして示されている。特定の標的クローンに該
当するそれぞれの点を含む散布図は、データセットの統
計学的表現として役立つ。任意の与えられた標的クロー
ンについての情報は、棒グラフから抽出することができ
る。
【０１１０】（ｉ）シグナル強度：ミクロアレイ中の遺
伝子についてのバックグラウンド補正されたシグナルの
強度は、組織ｃＤＮＡ（１０秒間暴露で１６５カウント
の平均値）と組織ｇＤＮＡ（１０ｓ暴露で１８７カウン
トの平均値）との間で同様であった。ｃＤＮＡ検出に関
係したバックグラウンドは、ｇＤＮＡの７３カウントと
比較したところ、より高い１３２カウントであった。ｃ
ＤＮＡおよびｇＤＮＡ双方に関して、最も弱いシグナル
でさえも、充分なプローブがチップ上に付着していると
いう条件ならば、６０秒間暴露で充分にバックグラエウ
ンドを越えた（Ｓ／Ｂ＞１）。
【０１１１】（ｉｉ）データ信頼度：図６は、細胞系そ
れぞれについて２回のハイブリダイゼーションから得ら
れたゲノムＤＮＡハイブリダイゼーションデータの相関
を示す。Ｃｏｌｏ３２０およびＫ５６２についてのデー
タの線型回帰相関は、それぞれ０．９９６３および０．
９９９９であり、データについて高い信頼度を示す。予
想されるように、ヒト対照ｇＤＮＡに対する組織ｇＤＮ
Ａの比率は、大部分の標的要素遺伝子の集落を形成した
（規格化後のものの周囲）。その集落から遠く隔たった
比率は、該当する遺伝子の細胞系中での遺伝子増幅を示
している（Ｃｏｌｏ３２０中のＣＭＹＣおよびＫ５６２
中のＡＢＬ）。試験された両方の細胞系について、“標
準”集落が０．５−１．５の比率範囲にわたると示され
ていることは興味深い。この範囲内の比率の値は、実験
間で極めて再現性があり、それらは、欠失するまたは増
幅されるこの集落内の任意の特定の遺伝子を識別するこ
とは信頼できないと考えられるように分布していた。
【０１１２】図７は、各細胞系について２回のハイブリ
ダイゼーションから得られた遺伝子発現ハイブリダイゼ
ーションデータの信頼度を示す。Ｃｏｌｏ３２０および
Ｋ５６２についての２組のデータの線型回帰相関は、そ
れぞれ０．９９８９および０．９７９０であった。
【０１１３】（ｉｉｉ）検定多重性：図８（Ｋ５６２細
胞系について）および図９（Ｃｏｌｏ３２０細胞系につ
いて）は、新規検定形式を用いて得られた検定多重性を
示す。別々のゲノムＤＮＡ検定を用いると、標的配列
（緑色棒）のゲノムコピー数（ヒト対照に相対する）の
みを検出しうると考えられる。発現ｃＤＡ検定を用いる
と、発現プロフィール（赤色棒の若干当量）を検出する
だけでありうると考えられる。本発明の方法を用いる
と、ゲノムおよび発現データが同時に得られた。
【０１１４】（ｉｖ）発現検定の対照としての標準ヒト
全ｇＤＮＡの使用：通常は、“普遍的”すなわち“標
準”対照がないので、２種類の試料の発現レベルは、そ
れら２種類の試料の発現検定を別の検定において同一チ
ップで行なう場合にのみ信頼して比較することができ
る。実施例２は、発現検定のための対照核酸として全標
準ヒトｇＤＮＡを用いた。異なった色の蛍光色素で標識
された組織ｃＤＮＡおよび対照ｇＤＮＡを用いる場合、
ハイブリダイゼーション後、それら二つの色の蛍光強度
比は、プローブ溶液中のｃＤＮＡおよび対照ｇＤＮＡの
初期濃度比を反映しているはずである。特定の対照ｇＤ
ＮＡが容易に入手可能であり、しかもその遺伝子特異的
配列のコピー数が変化しない（すなわち、“安定”して
いる）または無視しうる変化しかしないならば、それを
全ての発現検定の普遍的対照として用いることができ
る。その発現プロフィールは、図１０で示されるよう
に、対照ｇＤＮＡに対するｃＤＮＡの比率として表すこ
とができる。この比率プロフィールは、いろいろある試
料に依存性であるにすぎない。言い換えると、同一試料
の２回の発現検定を、同一アレイを含む２種類の異なっ
たチップ上において２回の別々のハイブリダイゼーショ
ンで行なうならば、それら２回の検定から得られる発現
プロフィールは、全ての標的について一定であるスケー
リング因子によってのみ異なるはずである。種々の試料
は、異なった発現プロフィール（対照ゲノムＤＮＡに対
する比率として表される）を示すであろう。図７および
１０の比較は、それら発現プロフィールが、実際に、い
ろいろある試料に依存性であるにすぎないことを示して
いる。本発明の方法において発現分析の対照として全ヒ
トゲノムＤＮＡを用いると、種々の試料の発現プロフィ
ールは、それら検定が別個に且つ独立して行なわれると
しても比較することができる。
【０１１５】（ｖ）遺伝子過発現へのゲノム増幅の相
関：図１１および１２は、Ｋ５６２およびＣｏｌｏ３２
０細胞系それぞれについてのゲノムコピー数対ｃＤＮＡ
（両方とも対照ゲノムＤＮＡに相対する）のプロットで
ある。
【０１１６】予想されるように、細胞系内では、増幅さ
れた遺伝子がなけれけば、分析される遺伝子の残りの遺
伝子の発現レベルは広く異なったが、それらのゲノムコ
ピー数は比較的一定に維持される。図１０で示されるよ
うに、両方の細胞系において、ＪＵＮＢ、ＨＲＡＳ１、
ＧＬＩなどの若干の遺伝子についてのｃＤＮＡはより豊
富であるが、ＰＤＧＦＲＡ、ＢＥＫ、ＭＤＭ２などのそ
の他のｃＤＮＡはあまり豊富でない。有意には、Ｃ−Ｍ
ＹＣおよびＡＢＬについて、それらの発現レベルは２種
類の細胞について極めて異なり、その傾向は、ゲノムレ
ベルでのそれらの増幅に従う。Ｃｏｌｏ３２０中でのＣ
−ＭＹＣおよびＫ５６２中でのＡＢＬの過発現は、遺伝
子増幅に起因することがありうる。図１３は、それら２
種類の細胞系の間の“遺伝子発現”比対“遺伝子コピー
数”比のプロットである。興味深いことに、それら二つ
の数の間には顕著な相関があった。（線型回帰結果，Ｙ
＝０．２６２Ｘ＋０．７２４，相関０．９８５）。グラ
フ中において、両方の細胞系中で増幅されない遺伝子は
集落を形成するが、２種類の細胞系中で不釣合に増幅さ
れる遺伝子は、その集落とは別に隔たてられている。こ
のグラフ、またはより一般的には、同時ゲノムおよび発
現検定は、過発現または発現不十分が確かに遺伝子増幅
または欠失によるものとすることを助ける。
【０１１７】本出願明細書は、発明の範囲を制限するた
めのものではない。本明細書中に引用される特許、特許
出願および公表された参考文献は全て、本明細書中に援
用される。本発明の範囲は、請求の範囲によって決定さ
れ、それらの同等物はいずれも全て含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の方法を実施する場合に用い
るのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの
成分を示す。
【図２】 図２は、本発明の方法を実施する場合に用い
るのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの
成分を示す。
【図３】 図３は、本発明の方法を実施する場合に用い
るのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの
成分を示す。
【図４】 図４は、本発明の方法を実施する場合に用い
るのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの
成分を示す。
【図５】 図５は、本発明の方法を実施する場合に用い
るのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの
成分を示す。
【図６】 図６は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する
組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は
赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および
橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイ
ブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータ
を示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現
および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性
能を示している。
【図７】 図７は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する
組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は
赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および
橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイ
ブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータ
を示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現
および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性
能を示している。
【図８】 図８は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する
組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は
赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および
橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイ
ブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータ
を示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現
および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性
能を示している。
【図９】 図９は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する
組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は
赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および
橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイ
ブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータ
を示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現
および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性
能を示している。
【図１０】 図１０は、それぞれがヒト癌細胞系に由来
する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一
方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、お
よび橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団との
ハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデ
ータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子
発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法
の性能を示している。
【図１１】 図１１は、それぞれがヒト癌細胞系に由来
する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一
方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、お
よび橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団との
ハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデ
ータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子
発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法
の性能を示している。
【図１２】 図１２は、それぞれがヒト癌細胞系に由来
する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一
方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、お
よび橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団との
ハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデ
ータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子
発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法
の性能を示している。
【図１３】 図１３は、それぞれがヒト癌細胞系に由来
する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一
方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、お
よび橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団との
ハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデ
ータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子
発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法
の性能を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 597060357 3100 Ｗｏｏｄｃｒｅｅｋ Ｄｒｉｖｅ, Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎ ｏｉｓ 60515−5400，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ディピン・チェ アメリカ合衆国イリノイ州60559，ウエス トモント，デミング・プレイス 217 (72)発明者 ワン・リアン・リ アメリカ合衆国イリノイ州60532，ライル, パークスレッグ・コート 6415 (72)発明者 ウーベ・リヒャルト・ミュラー アメリカ合衆国イリノイ州60545，プラノ, リバー・ロード 11714 (72)発明者 スティーブン・エイ・シーリング アメリカ合衆国イリノイ州60565，ネイパ ービル，フォックスクロフト 19，アパー トメント 119 (72)発明者 ジュファン・シ アメリカ合衆国イリノイ州60522，ヒンズ デール，ワシントン・ストリート 5719

Claims (78)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組織試料中の遺伝子発現および染色体異
    常の同時検出方法であって、 （ａ）固体支持体に結合した核酸標的要素のアレイを提
    供し、ここにおいて、該核酸標的要素は、組織試料の遺
    伝子発現および染色体配列を示す核酸に予め選択された
    ハイブリダイゼーション条件下で実質的に相補的なポリ
    ヌクレオチド配列を含み； （ｂ）少なくとも３種類の標識された核酸集団、 （ｉ）第一マーカーで標識され且つ組織試料に由来する
    ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ集団、 （ｉｉ）第二マーカーで標識され且つ組織試料に由来す
    る染色体ＤＮＡ集団、および （ｉｉｉ）第三マーカーで標識された少なくとも一つの
    対照核酸集団を提供し； （ｃ）該アレイと該標識された核酸集団とをハイブリダ
    イゼーション条件下で接触させ；そして （ｄ）少なくとも２種類の標的要素への第一、第二およ
    び第三マーカーそれぞれの存在および強度を検出するこ
    とを含む上記方法。
  2. 【請求項２】 前記標的要素がゲノムＤＮＡを含む請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記標的要素がｃＤＮＡを含む請求項１
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記組織試料がヒトに由来する請求項１
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記アレイがｃＤＮＡおよびゲノムＤＮ
    Ａ標的要素を含む請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記アレイが、標的要素を１００−１
    ０，０００個の標的要素／平方センチメートルの範囲の
    密度で含む請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 第一、第二および第三マーカーが、それ
    ぞれ異なった蛍光標識を含む請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 検出工程（ｃ）からのデータをプログラ
    ム化された計算機で処理し、そのままのおよび処理され
    たデータをデータベース中に記憶し、そしてそのままの
    および処理されたデータを表示することを更に含む請求
    項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 未標識の保護核酸の添加を更に含む請求
    項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ヒトの療法の選択における上記方法に
    由来するデータの使用を更に含む請求項４に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 それぞれの標的要素で（ｉ）第一色お
    よび第三色間の（ｉｉ）第二色および第三色間の蛍光比
    を測定することを更に含む請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記組織が細胞系試料を含む請求項１
    に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記組織試料が１種類の細胞を含む請
    求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記組織試料がヒト腫瘍試料を含む請
    求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記組織試料が血液細胞を含む請求項
    １に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記ゲノムＤＮＡが、２０ｋｂ−２５
    ０ｋｂの範囲の複雑度を有するヒトゲノムＤＮＡを含む
    請求項２に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記ｃＤＮＡが、１００ｂｐ−５，０
    ００ｂｐの範囲の複雑度を有するｃＤＮＡを含む請求項
    ３に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記標的核酸要素が少なくとも一つの
    ペプチド核酸を含む請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記方法を中規模装置で行なう請求項
    １に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 組織試料中の遺伝子発現および染色体
    異常の同時検出方法であって、 （ａ）固体支持体に結合したゲノムＤＮＡを含む核酸標
    的要素のアレイを提供し、ここにおいて、該核酸標的要
    素は、組織試料の遺伝子発現および染色体配列を示す核
    酸に予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で実
    質的に相補的なポリヌクレオチド配列を含み； （ｂ）少なくとも３種類の標識された核酸集団、 （ｉ）第一蛍光色で標識され且つ組織試料に由来するｍ
    ＲＮＡまたはｃＤＮＡ集団、 （ｉｉ）第二蛍光色で標識され且つ組織試料に由来する
    染色体ＤＮＡ集団、および （ｉｉｉ）第三蛍光色で標識された少なくとも一つの対
    照核酸集団を提供し； （ｃ）該アレイと該標識された核酸集団とをハイブリダ
    イゼーション条件下で接触させ；そして （ｄ）少なくとも２種類の標的要素での第一、第二およ
    び第三蛍光色それぞれの存在および強度を検出すること
    を含む上記方法。
  21. 【請求項２１】 前記アレイが、基体の平面上に少なく
    とも１００個の標的要素を含む請求項２０に記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】 前記アレイが、標的要素を１００−１
    ０，０００個の標的要素／平方センチメートルの範囲の
    密度で含む請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 それぞれの標的要素で（ｉ）第一色お
    よび第三色間の（ｉｉ）第二色および第三色間の蛍光比
    を測定することを更に含む請求項２０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 検出工程（ｃ）からのデータをプログ
    ラム化された計算機で処理し、そのままのおよび処理さ
    れたデータをデータベース中に記憶し、そしてそのまま
    のおよび処理されたデータを表示することを更に含む請
    求項２０に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 未標識の保護核酸の添加を更に含む請
    求項２０に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ヒトの療法の選択における上記方法に
    由来するデータの使用を更に含む請求項２０に記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 染色体ＤＮＡ集団を、ＰＣＲを含む方
    法によって生産する請求項２０に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記組織試料が１種類の細胞を含む請
    求項２０に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記組織試料がヒト腫瘍試料を含む請
    求項２０に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記組織試料が血液細胞を含む請求項
    ２０に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記組織試料がヒト割球細胞またはヒ
    ト極体を含む請求項２０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記組織試料を顕微解剖によって生産
    する請求項２０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記方法を中規模装置で行なう請求項
    ２０に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 組織試料中の遺伝子発現および染色体
    異常の同時検出方法であって、 （ａ）固体支持体に結合した核酸標的要素のアレイを提
    供し、ここにおいて、該核酸標的要素は、組織試料の遺
    伝子発現および染色体配列を示す核酸に予め選択された
    ハイブリダイゼーション条件下で実質的に相補的なポリ
    ヌクレオチド配列を含み； （ｂ）少なくとも３種類の標識された核酸集団、 （ｉ）第一蛍光色で標識され且つ組織試料に由来するｍ
    ＲＮＡまたはｃＤＮＡ集団、 （ｉｉ）第二蛍光色で標識され且つ組織試料に由来する
    染色体ＤＮＡ集団、および （ｉｉｉ）第三蛍光色で標識された少なくとも一つの対
    照核酸集団を提供し； （ｃ）該アレイと該標識された核酸集団とをハイブリダ
    イゼーション条件下で接触させ；そして （ｄ）少なくとも２種類の標的要素での第一、第二およ
    び第三蛍光色それぞれの存在および強度を検出すること
    を含む上記方法。
  35. 【請求項３５】 前記標的核酸要素が、８ｂｐ−約１０
    ０ｂｐの範囲のオリゴマーを含む請求項３４に記載の方
    法。
  36. 【請求項３６】 前記アレイが少なくとも１００個の標
    的要素を含む請求項３４に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記アレイが、標的要素を１００−１
    ０，０００個の標的要素／平方センチメートルの範囲の
    密度で含む請求項３４に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 それぞれの標的要素で（ｉ）第一色お
    よび第三色間の（ｉｉ）第二色および第三色間の蛍光比
    を測定することを更に含む請求項３４に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 検出工程（ｃ）からのデータをプログ
    ラム化された計算機で処理し、そのままのおよび処理さ
    れたデータをデータベース中に記憶し、そしてそのまま
    のおよび処理されたデータを表示することを更に含む請
    求項３４に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 未標識の保護核酸の添加を更に含む請
    求項３４に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ヒトの療法の選択における上記方法に
    由来するデータの使用を更に含む請求項３４に記載の方
    法。
  42. 【請求項４２】 染色体ＤＮＡ集団を、ＰＣＲを含む方
    法によって生産する請求項３４に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記組織試料が１種類の細胞を含む請
    求項３４に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記組織試料がヒト腫瘍試料を含む請
    求項３４に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記組織試料が血液細胞を含む請求項
    ３４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記組織試料を顕微解剖によって生産
    する請求項３４に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記ｃＤＮＡが、１００ｂｐ−５，０
    ００ｂｐの範囲の複雑度を有するｃＤＮＡを含む請求項
    ３４に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記標的核酸要素が少なくとも一つの
    ペプチド核酸を含む請求項３４に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記方法を中規模装置で行なう請求項
    ３４に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記標的要素が、８ｂｐ−約１００ｂ
    ｐの範囲のポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の方
    法。
  51. 【請求項５１】 前記組織試料が膀胱組織を含む請求項
    ４に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記組織試料が肺組織を含む請求項４
    に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記組織試料が前立腺組織を含む請求
    項４に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記組織試料が乳房組織を含む請求項
    ４に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記組織試料が食道組織を含む請求項
    ４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記組織試料が頸部組織を含む請求項
    ４に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記組織試料が卵巣組織を含む請求項
    ４に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記組織試料が結腸組織を含む請求項
    ４に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記組織試料が脳組織を含む請求項４
    に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記組織試料が胃組織を含む請求項４
    に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記組織試料が皮膚組織を含む請求項
    ４に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記組織試料が膵臓組織を含む請求項
    ４に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記組織試料がヒト割球を含む請求項
    ４に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 前記組織試料がヒト極体を含む請求項
    ４に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 少なくとも２種類の対照核酸集団の使
    用を含む請求項１に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 少なくとも４種類の対照核酸集団の使
    用を含む請求項１に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 少なくとも２種類の対照核酸集団の使
    用を含む請求項２０に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 少なくとも２種類の対照核酸集団の使
    用を含む請求項３４に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 少なくとも２種類の対照核酸集団の使
    用を含む請求項４に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記組織試料が癌細胞系を含む請求項
    ４に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 少なくとも４種類の別個の蛍光標識さ
    れた核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請
    求項２０に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 少なくとも８種類の別個の蛍光標識さ
    れた核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請
    求項２０に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 少なくとも４種類の別個の蛍光標識さ
    れた核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請
    求項５に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 少なくとも４種類の別個の蛍光標識さ
    れた核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請
    求項３４に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 少なくとも８種類の別個の蛍光標識さ
    れた核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請
    求項３４に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 少なくとも一つの染色体イデオグラム
    をアレイデータと一緒に表示することを更に含む請求項
    ８に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 少なくとも一つの染色体イデオグラム
    をアレイデータと一緒に表示することを更に含む請求項
    ２４に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 少なくとも一つの染色体イデオグラム
    をアレイデータと一緒に表示することを更に含む請求項
    ４０に記載の方法。
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