CN109688817A - 胺和肼的荧光检测及其分析方法 - Google Patents

胺和肼的荧光检测及其分析方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了制备荧光1‑氰基‑2‑取代的异吲哚化合物或N‑取代的酞嗪鎓化合物的工艺，包括使芳族二醛或芳族醛‑酮化合物与含有伯氨基或肼基的材料反应，以及涉及所述方法的分析方法。

Description

胺和肼的荧光检测及其分析方法
发明背景
过去几十年中，将非荧光或弱荧光试剂与底物进行化学反应来产生荧光产物已应用于分析化学领域。一种这样的反应涉及在氰离子存在下使芳族二醛与伯胺反应，以提供荧光1-氰基-2-取代的异吲哚化合物。另一种反应涉及使芳族二醛与伯肼反应以提供荧光N-取代的酞嗪鎓化合物。用于这些反应中的常见芳族二甲酸包括邻苯二甲醛(OPA)、萘-2,3-二甲醛(NDA)、蒽-2,3-二甲醛(ADA)、3-(4-羧基苯甲酰基)喹啉-2-甲醛(CBQCA)。
已有报道将芳族二醛和伯胺或伯肼之间的反应用于检测烷基伯胺(例如氨基酸)、肼或烷基伯肼(例如，单甲基肼和1,1-二甲基肼)的方法中。参见Collins等人，Analyst,1994,119,1907-1913；美国专利5,719,061；和美国专利4,758,520。然而，对芳族二醛和非烷基胺(特别是缺电子的杂芳基胺)之间的反应的的研究少得多。此外，报道的芳族二醛与伯胺或伯肼之间的反应是在溶液中进行的。未报道在固体载体上进行该反应的效果。
仍存在将芳族二醛和伯胺或伯肼之间的反应应用于固体载体材料中的需求，并针对更多缺电子的胺研发快速且高产的反应条件。这些新的反应条件可在例如珠粒制造和DNA测序的逐步质量控制中得到广泛应用。
发明概述
本文提供了制备荧光1-氰基-2-取代的异吲哚化合物或N-取代的酞嗪鎓化合物的方法，包括使芳族二醛或芳族醛-酮化合物与含有伯氨基或肼基的材料反应，以及涉及该方法的分析方法。
在一个实施方案中，本文提供了制备式(I)化合物的方法：
包括使式(III)化合物：
在氰离子存在下与R-NH2化合物反应，其中X、R、R1、R2、R3和Ra如此处或别处所定义。
在一个实施方案中，本文提供了分析R-NH2化合物的方法，包括：(i)在氰离子存在下使含有所述化合物的样品与式(III)化合物反应以形成式(I)化合物，以及(ii)检测并测量式(I)化合物的荧光。
在一个实施方案中，本文提供了制备式(II)化合物的方法：
包括使式(III)化合物：
与R-NHNH2化合物反应，其中X、R、R1、R2、R3和Ra如此处或别处所定义。
在一个实施方案中，本文提供了分析R-NHNH2化合物的方法，包括：(i)使含有所述化合物的样品与式(III)化合物反应以形成式(II)化合物，(ii)任选地将pH调至适当值；以及(iii)检测并测量式(II)化合物的荧光。
援引加入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过援引并入本文中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特定地和单独地指出通过引用并入。在冲突的情况下，将以本申请(包括本文中的任何定义)为主。
附图简述
图1示出了式(I)的产物的典型荧光发射光谱。
图2示出了式(I)的产物的典型荧光发射的线性校准。
图3示出了式(II)的产物的典型荧光发射光谱。
图4示出了式(II)的产物的典型荧光发射的线性校准。
发明详述
定义
为了便于理解本文所述的公开内容，以下定义了许多术语。通常，本文中所使用的术语和本文所述的有机化学中的实验室程序是本领域公知和普遍使用的。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语一般都具有与本文所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
如本文所用，并且除非另有说明，本文提供的术语“方法”是指本文所描述的可用于制备、分析或使用本文提供的化合物的方法。对本文所述方法的修饰(例如起始材料、试剂、保护基团、溶剂、温度、反应时间、纯化)也涵盖在本公开中。
如本文所用，并且除非另有说明，术语“添加(adding)”、“反应(reacting)”、“处理(treating)”或类似术语是指使一种反应物、试剂、溶剂、催化剂、反应基团等与另一种反应物、试剂、溶剂、催化剂、反应基团等接触。可以单独、同时或分别加入反应物、试剂、溶剂、催化剂、反应性基团等，并且可以能达到所需结果的任何顺序加入。它们可以在存在或不存在加热或冷却设备下加入，并且可以任选地在惰性氛围下加入。
如本文所用，并且除非另有说明，反应“基本上完成”或被驱动到“基本上完成”是指所述反应包含大于约50％的期望产物产率，在一个实施方案中大于约60％产率，在一个实施方案中大于约70％产率，在一个实施方案中大于约80％产率，在一个实施方案中大于约90％产率，在另一个实施方案中大于约95％产率，以及在另一个实施方案中大于约97％产率。
如本文所用，并且除非另有说明，术语“盐”包括但不限于，可存在于本文所述化合物中的酸性或碱性基团的盐。具有碱性性质的化合物能够与各种无机酸和有机酸形成各种各样的盐。可用于制备这些碱性化合物的盐的酸是形成包含阴离子的盐的那些，包括但不限于：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、柠檬酸盐、二氢氯化物、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、哈胺(hydrabamine)、羟基萘甲酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、肌酸盐(muscate)、萘磺酸盐、硝酸盐、泛酸盐、磷酸/二磷酸/三磷酸三磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、三乙基碘化物和双羟萘酸盐。除了上述酸之外，包括氨基的化合物还可以与各种氨基酸形成盐。具有酸性特性的化合物能够与各种阳离子形成碱盐。这些盐的非限制性实例包括：碱金属或碱土金属盐，以及在一些实施方案中，钙、镁、钠、锂、锌、钾和铁盐。具有酸性特性的化合物也能够与包含氨基的化合物形成碱盐。
如本文所用，除非另有说明，术语“烷基”是指直链或支链饱和烃基。除非另有说明，术语“烷基”还包括直链和支链烷基。在某些实施方案中，烷基是具有1-20(C1-20)、1-15(C1-15)、1-12(C1-12)、1-10(C1-10)、或1-6(C1-6)个碳原子的直链饱和烃基，或者3-20(C3-20)、3-15(C3-15)、3-12(C3-12)、3-10(C3-10)、或3-6(C3-6)个碳原子的支链饱和烃基。如本文所用，直链C1-6和支链C3-6烷基也称为“低级烷基”。烷基的实例包括但不限于：甲基、乙基、丙基(包括所有异构形式)、正丙基、异丙基、丁基(包括所有异构形式)、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基(包括所有异构形式)和己基(包括所有异构形式)。例如，C1-6烷基是指具有1-6个碳原子的直链饱和烃基，或具有3-6个碳原子的支链饱和烃基。烷基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。如本文所用，烷基可以是一价基团，或当描述烷基连接至多个基团或部分时，烷基可以是多价基团(例如亚烷基)。
如本文所用，除非另有说明，术语“烯基”是指含有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃基，在一个实施方案中，含有1-5个碳-碳双键。如本领域普通技术人员所理解的，术语“烯基”还包括具有“顺式”和“反式”构型，或者“E”和“Z”构型的基团。除非另有说明，本文所用术语“烯基”包括直链和支链烯基。例如，C2-6烯基是指2-6个碳原子的直链不饱和烃基，或3-6个碳原子的支链不饱和烃基。在某些实施方案中，烯基是2-20(C2-20)、2-15(C2-15)、2-12(C2-12)、2-10(C2-10)、或2-6(C2-6)个碳原子的直链烃基，或3-20(C3-20)、3-15(C3-15)、3-12(C3-12)、3-10(C3-10)或3-6(C3-6)个碳原子的支链烃基。烯基的实例包括但不限于：乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、烯丙基、丁烯基和4-甲基丁烯基。烯基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。如本文所用，烯基可以是一价基团，或当描述烯基连接至多个基团或部分时，烯基可以是多价基团(例如亚烯基)。
如本文所用，除非另有说明，术语“炔基”是指含有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烃基，在一个实施方案中，含有1-5个碳-碳三键。除非另有说明，术语“炔基”还包括直链和支链炔基。在某些实施方案中，炔基是2-20(C2-20)、2-15(C2-15)、2-12(C2-12)、2-10(C2-10)、或2-6(C2-6)个碳原子的直链烃基，或3-20(C3-20)、3-15(C3-15)、3-12(C3-12)、3-10(C3-10)、或3-6(C3-6)个碳原子的支链烃基。炔基的实例包括但不限于：乙炔基(-C≡CH)和炔丙基(-CH2C≡CH)。例如，C2-6炔基是指具有2-6个碳原子的直链不饱和烃基，或具有3-6个碳原子的支链不饱和烃基。炔基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。如本文所用，炔基可以是一价基团，或当描述炔基连接至多个基团或部分时，炔基可以是多价基团(例如亚炔基)。
如本文所用，除非另有说明，术语“环烷基”是指环状饱和或部分饱和的烃基。术语“环烷基”还包括稠合环烷基、桥连环烷基和螺环烷基。在某些实施方案中，环烷基具有3-20(C3-20)、3-15(C3-15)、3-12(C3-12)、3-10(C3-10)、或3-7(C3-7)个碳原子。环烷基的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚烯基、环庚二烯基、环庚三烯基、十氢萘基和金刚烷基。环烷基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。如本文所用，环烷基可以是一价基团，或当描述环烷基连接至多个基团或部分时，环烷基可以是多价基团(例如亚环烷基)。
如本文所用，除非另有说明，术语“芳基”是指含有至少一个芳烃环的单环芳族基团和/或多环芳族基团。在某些实施方案中，芳基具有6-20(C6-20)、6-15(C6-15)或6-10(C6-10)个环原子。芳基的实例包括但不限于：苯基、萘基、芴基、甘菊环基、蒽基、菲基、芘基、二苯基和三苯基。术语“芳基”还指双环、三环或其他多环烃环，其中至少一个环是芳族的，而其它的可以是饱和的、部分不饱和的或芳族的，例如二氢萘基、茚基、茚满基、或四氢萘基(tetralinyl)。芳基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。如本文所用，烷基可以是一价基团，或当描述烷基连接至多个基团或部分时，烷基可以是多价基团(例如亚芳基)。
如本文所用，除非另有说明，术语“杂烷基”是指具有一个或多个选自除碳以外的原子(如氧、氮、硫和磷或其组合)的骨架链原子的烷基。可以给出数值范围来指链的总长度。例如，-CH2OCH2CH3基团被称为“C4”杂烷基。可以通过杂烷基链中的杂原子或碳与母体分子结构连接。杂烷基中的一个或多个杂原子可任选地被氧化。如果存在，一个或多个氮原子也可任选地被季铵化。杂烷基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。如本文所用，杂烷基可以是一价基团，或当描述杂烷基连接至多个基团或部分时，杂烷基可以是多价基团(例如，杂亚烷基)。
如本文所用，除非另有说明，术语“杂芳基”是指含有至少一个芳环的单环芳族基团和/或多环芳族基团，其中至少一个芳环含有一个或多个独立地选自O、S和N的杂原子。杂芳基的每个环可含有一个或两个O原子，一个或两个S原子，和/或一至四个N原子，条件为每个环中杂原子的总数为4个或更少，每个环含有至少一个碳原子。杂芳基可以在任何杂原子或碳原子处与主结构连接，这导致产生稳定的化合物。在某些实施方案中，杂芳基具有5-20个、5-15个、或5-10个环原子。术语“杂芳基”还指双环、三环或其他多环，其中至少一个环是芳族的，而其它的可以是饱和的、部分不饱和的或芳族的，其中至少一个芳环含有一个或多个独立地选自O、S和N的杂原子。单环杂芳基的实例包括但不限于：吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、恶二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。双环杂芳基的实例包括但不限于：吲哚基、苯并噻唑基、苯并恶唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、色酮基(chromonyl)、香豆素基、噌啉基(cinnolinyl)、喹喔啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基和四氢喹啉基。三环杂芳基的实例包括但不限于：咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基和呫吨基。杂芳基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。如本文所用，杂芳基可以是单价基团，或当描述杂芳基连接至多个基团或部分时，杂芳基可以是多价基团(例如，亚杂芳基)。
如本文所用，并且除非另有说明，术语“杂环基”(或“杂环”)是指单环非芳族环系和/或包含至少一个非芳族环的多环体系，其中一个或多个非芳环原子是独立地选自O、S或N的杂原子；剩下的环原子是碳原子。术语“杂环基”还包括稠合的杂环基、桥连的杂环基和螺杂环基。在某些实施方案中，杂环基或杂环基团具有3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、4-7个、或5-6个环原子。在某些实施方案中，氮或硫环原子可任选地被氧化，并且氮环原子可任选地被季铵化。术语“杂环基”还指双环、三环或其他多环，其中至少一个环是非芳族的，而其它环可以是饱和的、部分不饱和的或芳族的，其中至少一个非芳族的环含有一个或多个独立地选自O、S和N的杂原子。杂环基可以在任何杂原子或碳原子处连接到主结构，这导致产生稳定的化合物。这种杂环基团的实例包括但不限于：吖啶基、吖庚因基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、苯并异恶唑基、苯并异恶嗪基、苯并二恶烷基、苯并二氧戊环基、苯并呋喃酮基、苯并呋喃基、苯并萘并呋喃基、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并三唑基、苯并噻喃基、苯并恶嗪基、苯并恶唑基、苯并噻唑基、β-咔啉基、咔唑基、色满基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氢异喹啉、二苯并呋喃基、二氢苯并异噻嗪基、二氢苯并异恶嗪基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氧戊环基、二氢吡嗪、二氢吡啶基、二氢吡唑基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氧戊环基、1,4-二噻烷基、呋喃酮基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲唑基、二氢吲哚基、吲嗪基、吲哚基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、异色满基、异香豆素基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噻唑基、异恶唑烷基、异恶唑基、吗啉基、萘啶基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、恶二唑基、恶唑烷酮基、恶唑烷基、恶唑酮吡啶基、恶唑基、环氧乙烷基、嘧啶基、菲啶基、邻菲咯啉基(phenathrolinyl)、吩吡嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩恶嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、蝶啶基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、吡啶并吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢呋喃基、四氢异喹啉、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四唑基、噻二唑酮嘧啶基、噻二唑基、硫代吗啉基、噻唑烷基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基和1,3,5-三噻烷基。杂环基或杂环基团可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。如本文所用，杂环基可以是单价基团，或当描述杂环基连接至多于一个基团或部分时，杂环基可以是多价基团(例如，亚杂环基)。
如本文所用，除非另有说明，术语“卤素”、“卤化物”或“卤代”是指氟、氯、溴和/或碘。
如本文所用，除非另有说明，术语“烷氧基”是指-O-(烷基)，其中烷基如上所定义。
如本文所用，除非另有说明，术语“芳氧基”是指-O-(芳基)，其中芳基如上所定义。
如本文所用，除非另有说明，术语“环烷氧基”是指-O-(环烷基)，其中环烷基如上所定义。
如本文所用，除非另有说明，术语“杂环基氧基”是指-O-(杂环基)，其中杂环基如上所定义。
如本文所用，除非另有说明，术语“杂芳氧基”是指-O-(杂芳基)，其中杂芳基如上所定义。
如本文所用，除非另有说明，术语“羧基(carboxyl)”和“羧基(carboxy)”是指-COOH。
如本文所用，除非另有说明，术语“烷氧基羰基”是指-C(＝O)O-(烷基)，其中烷基如上所定义。这种烷氧基羰基的实例包括但不限于：-C(＝O)O-CH3、-C(＝O)O-CH2CH3、-C(＝O)O-(CH2)2CH3、-C(＝O)O-(CH2)3CH3、-C(＝O)O-(CH2)4CH3、-C(＝O)O-(CH2)5CH3等。
如本文所用，除非另有说明，术语“酰基”是指-C(O)-Rt，其中Rt可以是但不限于：氢、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。在某些实施方案中，Rt可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。
如本文所用，除非另有说明，术语“酰氧基”是指-OC(O)-Rt，其中Rt可以是但不限于：氢、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。在某些实施方案中，Rt可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。
如本文所用，除非另有说明，术语“氨基”是指-N(Ro)(Ro)，其中每个Ro独立地可以是但不限于：氢、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。当-N(Ro)(Ro)基团具有两个除氢以外的Ro时，它们可以与氮原子结合形成环。在一个实施方案中，环是3、4、5、6、7或8元环。在一个实施方案中，一个或多个环原子是独立地选自O、S或N的杂原子。如本文所用，除非另有说明，术语“伯氨基”是指到-NH2。术语“氨基”还包括N-氧化物-N+(Ro)(Ro)O-。在某些实施方案中，每个Ro或由-N(Ro)(Ro)形成的环可以独立地是未取代的或被一个或多个取代基取代。
如本文所用，除非另有说明，术语“肼”或“肼基”是指-N(Ro)N(Ro)(Ro)，其中每个Ro独立地可以是但不限于：氢、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。当-N(Ro)N(Ro)(Ro)基团具有两个除氢以外的Ro时，它们可以与氮原子结合形成环。在一个实施方案中，所述环是3、4、5、6、7或8元环。在一个实施方案中，一个或多个环原子是独立地选自O、S或N的杂原子。如本文所用，并且除非另有说明，术语“伯肼基”是指-NHNH2。在某些实施方案中，每个Ro或由-N(Ro)(Ro)形成的环独立地可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。
如本文所用，除非另有说明，术语“酰胺”或“酰氨基”是指-C(O)N(Ro)2或-NRoC(O)Ro，其中每个Ro独立地可以是但不限于：氢、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。当-C(O)N(Ro)2基团具有两个除氢以外的Ro时，它们可以与氮原子结合形成环。在一个实施方案中，所述环是3、4、5、6、7或8元环。在一个实施方案中，一个或多个环原子是独立地选自O、S或N的杂原子。在某些实施方案中，每个Ro或由-N(Ro)(Ro)形成的环独立地可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。
如本文所用，除非另有说明，术语“硫烷基”、“硫化物”或“硫代”是指-S-Rt，其中Rt可以是但不限于：烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。在某些实施方案中，Rt可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。
如本文所用，除非另有说明，术语“亚砜”是指-S(O)Rt，其中Rt可以是但不限于：烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。在某些实施方案中，Rt可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。
如本文所用，除非另有说明，术语“磺酰基”或“砜”是指-S(O)2-Rt，其中Rt可以是但不限于：烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。在某些实施方案中，Ra可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。
如本文所用，除非另有说明，术语“磺酰氨基”或“磺酰胺”是指-S(＝O)2-N(Ro)2或-N(Ro)-S(＝O)2-Ro，其中每个Ro独立地可以是但不限于：氢、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环基，其各自如上所定义。当-S(＝O)2-N(Ro)2基团具有两个除氢以外的Ro时，它们可以与氮原子结合形成环。在一个实施方案中，环是3、4、5、6、7或8元环。在一个实施方案中，一个或多个环原子是独立地选自O、S或N的杂原子。在某些实施方案中，每个Ro或由-N(Ro)(Ro)形成的环独立地可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。
当本文所述的基团被称为“被取代的”时，它们可以被任何适当的取代基取代。取代基的说明性实例包括但不限于：在本文所述的示例性化合物和实施方案中发现的那些，以及卤素(氯、碘、溴或氟)；烷基；烯基；炔基；羟基；烷氧基；烷氧基烷基；氨基；烷基氨基；羧基；硝基；氰基；巯基；硫醚；亚胺；酰亚胺；脒；胍；烯胺；氨基羰基；酰氨基；膦酸盐；膦；硫代羰基；亚磺酰基；砜；磺胺；酮；醛；酯；尿素；尿烷；肟；羟胺；烷氧基胺；芳氧基胺，芳烷氧基胺；N-氧化物；肼；肼；腙；叠氮化物；异氰酸盐/酯；异硫氰酸盐/酯；氰酸盐/酯；硫氰酸盐/酯；氧代(＝O)；B(OH)2，O(烷基)氨基羰基；环烷基，其可以是单环或稠合或非稠合多环(例如，环丙基、环丁基、环戊基或环己基)，或杂环基，其可以是单环或稠合或非稠合多环(例如，吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或噻嗪基)；单环或稠合或非稠合多环芳基或杂芳基(例如，苯基、萘基、吡咯基、吲哚基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、吖啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、苯并咪唑基、苯并噻吩苯基或苯并呋喃基)芳氧基；芳烷氧基；杂环氧基；和杂环基烷氧基。
如本文所用，除非另有说明，术语“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅在原子的空间排列方式上不同的异构体。“阻转异构体”是关于单键的受阻旋转的立体异构体。“对映异构体”是一对彼此不可重叠地镜像的立体异构体。任何比例的一对对映异构体的混合物可称为“外消旋”混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子、但不是彼此镜像的立体异构体。可以根据Cahn-Ingold-Prelog R-S系统指定绝对立体化学构型。当化合物是对映异构体时，每个手性碳的立体化学可以由R或S指定。绝对构型未知的解析的化合物可以指定(+)或(-)，这取决于它们在钠D线波长处平面偏振光旋转的方向(右旋或左旋)。然而，旋光度(+)和(-)的符号与分子的绝对构型R和S无关。本文所述的某些化合物含有一个或多个不对称中心，因此可产生对映体、非对映异构体和其他立体异构形式，就每个不对称原子的绝对立体化学而言，可以定义为(R)-或(S)-。本文的化学实体、药物组合物和方法包括所有这些可能的异构体，包括外消旋混合物、光学上基本上纯的形式和中间体混合物。光学活性(R)-和(S)-异构体可以例如使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“约”或“大约”意指本领域普通技术人员能确定的具体值的可接受误差，其部分取决于这个值是如何测量或确定的。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”表示在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”是指给定值或范围的50％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％以内。
如本文所用，并且除非另有说明，术语“固体载体”或其他语法等同物是指包含和/或可被修饰为包含一个或多个适合于连接或缔合本文公开的组合物(例如，有机分子或部分)的位点(例如，离散的个体位点、预定义位点、随机位点等)的任何材料。示例性固体载体包括但不限于：玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、二氧化硅或二氧化硅基材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束、纳米粒子(如氧化铈(CeO2)、氧化铁(Fe3O4)和氧化钛(TiO2)的无机纳米粒子(NPs)；或脂质的有机和生物有机纳米粒子、纳米笼、树枝状大分子、超分子纳米粒子、自组装纳米粒子)，以及各种其他聚合物。在具体实施方案中，固体载体允许光学检测并且本身不会发出明显的荧光。组合物(例如，有机分子或部分)可以直接或通过连接子连接到大分子上。如本文所用，除非另有说明，术语“连接子”是指连接固体载体和组合物的分子片段或部分。
固体载体可以是平的(平面的)，但是如本领域技术人员所理解的，也可以使用其他构型的固体载体；例如，可以使用三维构型，例如通过将珠子嵌入多孔塑料块中，其允许样品进入珠粒并使用共聚焦显微镜进行检测。类似地，珠粒可以放置在管子的内表面上，用于流通样品分析以使样品体积最小化。在某些方面，固体载体包括光纤束和平面固体载体，如玻璃、聚苯乙烯和其他塑料和丙烯酸树脂。珠粒包括小的离散颗粒，其组成取决于所用探针的类别和合成方法。合适的珠粒组合物包括用于肽、核酸和有机部分合成的那些，包括但不限于：塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、胶乳或交联葡聚糖(如琼脂糖(sepharose))、纤维素、尼龙、交联胶束和特氟龙均可以使用。参见，例如，来自Bangs Laboratories，Fishers IN的“MicrosphereDetection Guide”。
除非另有说明，含有反应性官能团(例如但不限于：羧基、羟基和氨基部分)的本文提供的化合物(包括可用于制备本文提供的化合物的中间体)还包括它们的受保护的衍生物。“受保护的衍生物”是其中一个或多个反应性位点被一个或多个保护基团(也称为封闭基团)封闭的那些化合物。合适的保护基团是本领域普通技术人员所熟知的。T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis(Third Ed.,Wiley,New York,1999)中描述了选择和使用保护基以及安装和除去保护基的反应条件，该文献通过引用整体并入本文。
应该注意的是，如果所描述的结构与给予该结构的名称之间存在差异，则所描述的结构将被赋予更多的权重。另外，如果结构或结构的一部分的立体化学未用例如粗体或虚线表示，则结构的结构或部分应解释为包括其所有立体异构体。
工艺和分析方法
在一个实施方案中，本文提供了制备式(I)化合物的工艺：
包括在氰离子存在下使式(III)化合物：
与R-NH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，X为CRa。在一个实施方案中，本文提供了制备式(I-a)的化合物的工艺：
包括在氰离子存在下使式(III-a)的化合物：
与R-NH2化合物反应，
其中：
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，X为N。在一个实施方案中，本文提供了制备式(I-b)的化合物的工艺：
包括在氰离子存在下使式(III-b)的化合物：
与R-NH2化合物反应，
其中：
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一些实施方案中，R任选地被独立地选自以下的一个或多个取代基取代：烷基、卤素、氯、羟基、氨基、肼基、烷氧基、氰基、酰氨基、羧基、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。在一些实施方案中，R任选地被独立地选自以下的一个或多个取代基取代：氯、氨基、肼和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。在这样的实施方案中，–NH-N＝C(H)-寡核苷酸或-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸的寡核苷酸部分是寡核苷酸分别与醛取代基和肼部分或–NHC(O)NHNH2部分的缩合产物。
在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在进一步的实施方案中，R为任选地取代的C2-10烷基或C2-6烷基或C3-5烷基或丙基。在进一步的实施方案中，R为C2-10烷基或C2-6烷基或C3-5烷基或丙基。
在一个实施方案中，R-NH2为任选地取代的氨基酸，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R-NH2为任选地取代的肽，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
在一个实施方案中，R为任选地取代的芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的苯基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
在一个实施方案中，R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的嘧啶基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的三嗪基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一些实施方案中，R为三嗪基，任选地被上文描述的一个或多个取代基所取代。在一些实施方案中，R为三嗪基，任选地被以上描述的一个或多个选自以下的取代基所取代：氯、肼基、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸和-NH-N＝C(H)-寡核苷酸。
在一个实施方案中，R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的嘌呤基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
在一个实施方案中，R-NH2为任选地取代的核碱基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，所述核碱基为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟苷、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或5-甲基胞苷，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，所述核碱基连接至糖部分，糖部分进一步直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，糖部分为核糖或2-脱氧核糖。
在一个实施方案中，R-NH2为任选地取代的核苷，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R-NH2为任选地取代的核苷酸，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
在一个实施方案中，R为–NH-、-烷基-NH-、–NHC(O)NH-、或–烷基-NHC(O)NH-。在其他实施方案中，R为–NHC(O)NH-或–烷基-NHC(O)NH-。在其他实施方案中，R-NH2为–NH-NH2或–NHC(O)NHNH2。在其他实施方案中，R-NH2为任选地取代的烷基-NH-C(O)NHNH2，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在进一步的实施方案中，R-NH2为C3-6烷基-NH-C(O)NHNH2，或为丙基-NH-C(O)NHNH2。
在一个实施方案中，R为缺电子基团或吸电子基团，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R-NH2中–NH2基团的pKa为约7至约10、约7.5至约10、约8至约10、约8.5至约10、或约9至约10。在一个实施方案中，R-NH2基团中–NH2的pKa为约7.4至约10。
在一个实施方案中，R-NH2基团中–NH2的pKa为约7至约8、约8至约9、或约9至约10。
在一个实施方案中，固体载体为以下一种或多种：玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、二氧化硅或二氧化硅基材料包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束和各种其他聚合物。在一个实施方案中，固体载体是平的。在一个实施方案中，固体载体是珠粒(例如球形二氧化硅珠粒、氧化铁(Fe3O4)和金属颗粒(例如金和银)的无机纳米粒子(NP)、磁性纳米颗粒镉基点和无镉点)。特别有用的固体载体包括二氧化硅珠粒和珠粒阵列，如以下文献中所描述的那些：美国专利6,266,459；6,355,431；6,770,441；6,859,570；6,210,891；6,258,568；6,274,320；美国专利申请公开2009/0026082 A1；2009/0127589 A1；2010/0137143 A1；2010/0282617 A1；或PCT公开号WO00/63437；其各自通过引用整体并入本文；或由Illumina,Inc.(San Diego,CA)销售的在BeadArrayTM平台商业化的那些。其他有用的固体载体是用于流动池的那些。示例性的流动池包括但不限于核酸测序装置中使用的那些，如用于以下产品的流动池：由Illumina,Inc.(San Diego,CA)销售的Genome或平台；或由Life Technologies(Carlsbad,CA)销售的SOLiDTM或Ion TorrentTM测序平台。示例性流动池、其组成和制备方法以及应用也描述于例如，PCT公开号WO 2014/142841 A1；美国专利申请公开2010/0111768 A1；以及美国专利8,951,781；其各自通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，R的部分连接至固体载体。R的部分可以是有机部分(例如，碳原子或含碳部分或胺或氧衍生物)或无机部分(例如硅烷)。在一些实施方案中，R可为凝胶或连接至凝胶的连接子。然后，凝胶可以例如通过共价键合或非共价关联连接到固体载体上。有用的凝胶包括但不限于水凝胶，如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮或其衍生物。在一些实施方案中，凝胶可包括两种或更多种形成共聚物的不同种类的化合物。例如，两种或更多种不同种类的丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮或其衍生物可以起到共聚单体的作用，共聚单体聚合形成共聚物水凝胶。有用的水凝胶包括但不限于：不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)聚合物(参见例如，美国专利申请公开2011/0059865 A1，其通过引用整体并入本文)，聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)(参见例如，美国专利9,012,022，其通过引用整体并入本文)，由丙烯酸或含乙烯基的丙烯酸与丙烯酰胺形成的聚丙烯酰胺聚合物例如，如PCT公开号WO 00/31148中所描述，其通过引用整体并入本文；由形成[2+2]光-环加成反应的单体形成的聚丙烯酰胺聚合物例如，如PCT公开号WO 01/01143或WO 03/014392中所描述，其各自通过引用整体并入本文；或聚丙烯酰胺共聚物例如，如美国专利6,465,178、PCT公开号WO01/62982和WO 00/53812中所描述，其各自通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，R的部分通过连接子连接至所述固体载体。在一个实施方案中，连接子包含选自以下的一个或多个连接子单元：单-肼基-1,3,5-三嗪、双-肼基-1,3,5-三嗪或氨基羰基肼。在一个实施方案中，连接子包含一个连接子单元。在一个实施方案中，连接子包含两个连接子单元。在一个实施方案中，连接子包含三个或多个连接子单元。连接子中的多个连接子单元可以为相同的或不同的。
在一个实施方案中，R-NH2化合物为(3-氨丙基)-硅烷。
在一个实施方案中，R-NH2化合物连接到固体载体上，并与所述固体载体一起包含具有下述结构之一的化合物：
在所述结构中[SS]表示固体载体。结构中的波浪线表示与相邻分子的开放连接或H或烷基。在其他实施方案中，R-NH2连接到固体载体上，并且与所述固体载体和任选的连接子一起包含：[SS]-OSi(OZ)2-烷基-NH2，其中每个Z为相邻固体载体所连接基团的烷基、H或硅原子。在一些实施方案中，每个烷基独立地为C2-6烷基。
在其他实施方案中，R-NH2连接到固体载体上，并与所述固体载体一起包含具有下述结构之一的化合物或其互变异构体：
其中链部分是核酸分子，如DNA。结构中的波浪线表示与相邻分子的开放连接或H或烷基。结构中[SS]表示固体载体。在一些实施方案中，R-NHNH2连接到固体载体上，并且与所述固体载体和任选的连接子一起包含：[SS]-OSi(OZ)2-烷基-NHC(O)NHNH2，其中Z为相邻固体载体所连接基团的烷基、H或硅原子。在一些实施方案中，每个烷基独立地为C2-6烷基。
在一些实施方案中，R-NH2通过连接子连接到固体载体上。在一些实施方案中，连接子包含一个或多个官能团，如烷基、杂烷基(例如聚乙二醇)、肽、硅烷、烷氧基硅烷、或其他合适的连接基团。在一些实施方案中，连接子为-OSi(OZ)2-或-OSi(OZ)2-烷基-(NH)0-1，其中Z如上述所定义。在其他实施方案中，所述连接子为–OSi(OZ)2-丙基-或–OSi(OZ)2-丙基-NH-。
在一些实施方案中，X为CRa。在其他实施方案中，X为N。
在一些实施方案中，R1和R2各自为Ra。在其他实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环的芳基或杂芳基环，任选地被一个或多个Ra1取代。在一些实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的苯基或萘基环。在其他实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的单环杂芳基环。
在一些实施方案中，R3为氢、烷基、芳基或杂芳基。在其他实施方案中，R3为氢。
在一些实施方案中，Ra的每一处独立地为氢、卤素、氰基、烷基、羟基或烷氧基。在其他实施方案中，Ra的每一处为氢。
在一些实施方案中，Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。在其他实施方案中，Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、氰基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。在进一步的其他实施方案中，Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基或氰基。
在一些实施方案中，Rb独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。在其他实施方案中，Rb的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、氰基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。在进一步的其他实施方案中，Rb的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、羧基或氰基。
在一个实施方案中，本文提供了制备式(I)化合物的工艺:
包括在氰离子存在下使式(III)化合物：
与R-NH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代；
条件为R不是2-吡啶基或3-吡啶基。
在一个实施方案中，X为CRa。在一个实施方案中，本文提供了制备式(I-a)的化合物的工艺：
包括在氰离子存在下使式(III-a)的化合物：
与R-NH2化合物反应，
其中：
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代；
条件为R不是2-吡啶基或3-吡啶基。
在一个实施方案中，X为N。在一个实施方案中，本文提供了制备式(I-b)的化合物的工艺：
包括在氰离子存在下使式(III-b)的化合物：
与R-NH2化合物反应，
其中：
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代；
条件为R不是2-吡啶基或3-吡啶基。
在一个实施方案中，R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基。在一个实施方案中，R为任选地取代的嘧啶基。在一个实施方案中，R为任选地取代的三嗪基。在一些实施方案中，R为三嗪基，任选地被以上描述的一个或多个取代基所取代。在一些实施方案中，R为三嗪基，任选地被一个或多个选自以下的取代基所取代：氯、肼基、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。
在一个实施方案中，R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基。在一个实施方案中，R为任选地取代的嘌呤基。
在一个实施方案中，R-NH2为任选地取代的核碱基。在一个实施方案中，所述核碱基为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟苷、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或5-甲基胞苷。在一个实施方案中，所述核碱基连接至糖部分。在一个实施方案中，所述糖部分为核糖或2-脱氧核糖。
在一个实施方案中，R-NH2为任选地取代的核苷。在一个实施方案中，R-NH2为任选地取代的核苷酸。
在一个实施方案中，R为缺电子基团或吸电子基团，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R-NH2中–NH2基团的pKa为约7至约10、约7.5至约10、约8至约10、约8.5至约10、或约9至约10。在一个实施方案中，R-NH2中–NH2基团的pKa为约7.4至约10。
在一个实施方案中，R-NH2中R-NH2的–NH2基团的pKa为约7至约8、约8至约9、或约9至约10。
在一个实施方案中，用于制备式(I)化合物的氰离子由氰化物源提供。在一个实施方案中，氰化物源为氰化钾。在另一个实施方案中，氰化物源为氰化钠。
在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NH2之间的反应在温和碱性条件下发生。在一个实施方案中，所述温和碱性条件的pH为约7.5至约10。
在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NH2之间的反应在溶剂中发生。在一个实施方案中，所述溶剂包含缓冲液。在一个实施方案中，所述溶剂为水溶性溶剂和缓冲液的混合物。在一个实施方案中，所述溶剂为醇和缓冲液的混合物。在一个实施方案中，所述醇为甲醇。在另一个实施方案中，所述醇为乙醇。在一个实施方案中，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液。在另一个实施方案中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，所述溶剂为甲醇和硼酸盐缓冲液(例如，约pH 9.5)的混合物(例如，约1:1混合物)。在一个实施方案中，所述溶剂为乙醇和硼酸盐缓冲液(例如，约pH9.5)的混合物(例如，约1:1混合物)。在一个实施方案中，所述溶剂为甲醇和磷酸盐缓冲液(例如，约pH 7.5–8.5)的混合物(例如，约1:1混合物)。在一个实施方案中，所述溶剂为乙醇和磷酸盐缓冲液(例如，约pH 7.5–8.5)的混合物(例如，约1:1混合物)。
在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NH2之间的反应约1分钟至约6小时达到基本上完成。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NH2之间的反应在约6小时、约4小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟、或约5分钟内，达到至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％、至少99％、至少99.5％、或至少99.9％产率。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NH2之间的反应在约1小时内达到至少70％产率。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NH2之间的反应在约1小时内达到至少90％产率。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NH2之间的反应在约30分钟内达到至少70％产率。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NH2之间的反应在约30分钟内达到至少90％产率。
在一个实施方案中，本文提供了制备式(II)化合物的工艺：
包括使式(III)化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，X为CRa。在一个实施方案中，本文提供了制备式(II-a)的化合物的工艺：
包括使式(III-a)的化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，X为N。在一个实施方案中，本文提供了制备式(II-b)的化合物的工艺：
包括使式(III-b)的化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一些实施方案中，R任选地被独立地选自下组的一个或多个取代基取代：烷基、卤素、氯、羟基、氨基、肼基、烷氧基、氰基、酰氨基、羧基、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。在一些实施方案中，R任选地被独立地选自下组的一个或多个取代基取代：氯、氨基、肼和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。在这样的实施方案中，–NH-N＝C(H)-寡核苷酸或-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸的寡核苷酸部分是寡核苷酸分别与醛取代基和肼部分或–NHC(O)NHNH2部分的缩合产物。
在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在进一步的实施方案中，R为任选地取代的C2-10烷基或C2-6烷基或C3-5烷基或丙基。在进一步的实施方案中，R为C2-10烷基或C2-6烷基或C3-5烷基或丙基。
在一个实施方案中，R为任选地取代的芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的苯基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
在一个实施方案中，R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的嘧啶基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的三嗪基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一些实施方案中，R为三嗪基，任选地被以上描述的一个或多个取代基所取代。在一些实施方案中，R为三嗪基，任选地被一个或多个选自以下的取代基所取代：氯、肼基、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。
在一个实施方案中，R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的嘌呤基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
在一个实施方案中，R为任选地取代的氨基羰基(NH-C＝O)，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基氨基羰基(烷基-NH-C＝O)，其直接或通过连接子连接到固体载体上。在一些实施方案中，R为C2-6烷基-NHC(O)-。在其他实施方案中，R为丙基-NHC(O)-。
在一个实施方案中，所述固体载体为以下一种或多种：玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、二氧化硅或二氧化硅基材料包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束和各种其他聚合物。在一个实施方案中，所述固体载体是平面的。在一个实施方案中，所述固体载体是珠粒(例如球形二氧化硅珠粒、氧化铁(Fe3O4)和金属颗粒(例如金和银)的无机纳米粒子(NPs)、磁性纳米颗粒镉基点和无镉点)。特别有用的固体载体包括二氧化硅珠粒和珠粒阵列，如以下文献中所描述的那些：美国专利6,266,459；6,355,431；6,770,441；6,859,570；6,210,891；6,258,568；6,274,320；美国专利申请公开2009/0026082 A1；2009/0127589 A1；2010/0137143 A1；2010/0282617 A1；或PCT公开号WO 00/63437；其各自通过引用整体并入本文；或由Illumina,Inc.(San Diego,CA)销售的在BeadArrayTM平台商业化的那些。其他有用的固体载体是用于流动池的那些。示例性的流动池包括但不限于核酸测序装置中使用的那些，如用于以下产品的流动池：由Illumina,Inc.(San Diego,CA)销售的Genome或平台；或由Life Technologies(Carlsbad,CA)销售的SOLiDTM或Ion TorrentTM测序平台。示例性流动池、其组合物和制备方法以及应用也描述于例如，PCT公开号WO 2014/142841 A1；美国专利申请公开2010/0111768 A1；以及美国专利No.8,951,781；其各自通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，R的部分连接至所述固体载体。R的部分可以是有机部分(例如，碳原子或含碳部分或胺衍生物)或无机部分(例如硅烷)。在一些实施方案中，R可为凝胶或连接至凝胶的连接子。然后，所述凝胶可以通过共价键合或非共价键合连接到固体载体上。有用的凝胶包括但不限于水凝胶，如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮或其衍生物。在一些实施方案中，所述凝胶可包括两种或更多种形成共聚物的不同种类的化合物。例如，两种或更多种不同种类的丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮或其衍生物可以起到共聚单体的作用，所述共聚单体聚合形成共聚物水凝胶。有用的水凝胶包括但不限于：不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)聚合物(参见例如，美国专利申请公开2011/0059865 A1，其通过引用整体并入本文)，聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)(参见例如，美国专利9,012,022，其通过引用整体并入本文)，由丙烯酸或含乙烯基的丙烯酸与丙烯酰胺形成的聚丙烯酰胺聚合物例如，如PCT公开号WO 00/31148中所描述，其通过引用整体并入本文；由形成[2+2]光-环加成反应的单体形成的聚丙烯酰胺聚合物例如，如PCT公开号WO 01/01143或WO 03/014392中所描述，其各自通过引用整体并入本文；或聚丙烯酰胺共聚物例如，如美国专利No.6,465,178、PCT公开号WO 01/62982和WO 00/53812中所描述，其各自通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，R的部分通过连接子连接至所述固体载体。在一个实施方案中，所述连接子包含选自下组的一个或多个连接子单元：单-肼基-1,3,5-三嗪、双-肼基-1,3,5-三嗪或氨基甲酰肼。在一个实施方案中，所述连接子包含一个连接子单元。在一个实施方案中，所述连接子包含两个连接子单元。在一个实施方案中，所述连接子包含三个或更多个连接子单元。连接子中的多个连接子单元可以为相同的或不同的。在一些实施方案中，连接子包含一个或多个官能团，如烷基、杂烷基(例如聚乙二醇)、肽、硅烷、烷氧基硅烷、或其他合适的连接基团。在一些实施方案中，所述连接子为-OSi(OZ)2-或-OSi(OZ)2-烷基-(NH)0-1，其中Z如上述所定义。在其他实施方案中，所述连接子为–OSi(OZ)2-丙基-或–OSi(OZ)2-丙基-NH-。
在一个实施方案中，R-NHNH2化合物连接到固体载体上，并与所述固体载体一起包含具有下述结构之一的化合物(或其互变异构体)：
其中所述链部分是核酸分子，如DNA。所述结构中的波浪线表示与相邻分子的开放连接或H或烷基。在所述结构中[SS]表示固体载体。在一些实施方案中，R-NHNH2连接到固体载体上，并且与所述固体载体和任选的连接子一起包含：[SS]-OSi(OZ)2-烷基-NHC(O)NHNH2，其中Z为相邻固体载体所连接基团的烷基、H或硅原子。在一些实施方案中，每个烷基独立地为C2-6烷基。
在一个实施方案中，本文提供了制备式(II)化合物的工艺：
包括使式(III)化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的芳基或杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，X为CRa。在一个实施方案中，本文提供了制备式(II-a)的化合物的工艺：
包括使式(III-a)的化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的芳基或杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，X为N。在一个实施方案中，本文提供了制备式(II-b)的化合物的工艺：
包括使式(III-b)的化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的芳基或杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基、芳基或杂芳基。在一些实施方案中，R任选地被独立地选自下组的一个或多个取代基取代：烷基、卤素、氯、羟基、氨基、肼基、烷氧基、氰基、酰氨基、羧基、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。在一些实施方案中，R任选地被独立地选自下组的一个或多个取代基取代：氯、氨基、肼和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。在这样的实施方案中，–NH-N＝C(H)-寡核苷酸的寡核苷酸部分是寡核苷酸与醛取代基和肼部分的缩合产物。
在一个实施方案中，R为任选地取代的烷基。在进一步的实施方案中，R为任选地取代的C2-10烷基或C2-6烷基或C3-5烷基或丙基。在进一步的实施方案中，R为C2-10烷基或C2-6烷基或C3-5烷基或丙基。
在一个实施方案中，R为任选地取代的芳基。在一个实施方案中，R为任选地取代的苯基。
在一个实施方案中，R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基。在一个实施方案中，R为任选地取代的嘧啶基。在一个实施方案中，R为任选地取代的三嗪基。在一些实施方案中，R为三嗪基，任选地被以上描述的一个或多个取代基所取代。在一些实施方案中，R为三嗪基，任选地被一个或多个选自以下的取代基所取代：氯、肼基、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH-N＝C(H)-寡核苷酸和–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。
在一个实施方案中，R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基。在一个实施方案中，R为任选地取代的嘌呤基。
在一个实施方案中，R-NHNH2化合物为4,6-二肼基-N-(3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基))1,3,5-三嗪-2-胺。在一个实施方案中，R-NHNH2化合物为N-(2-(三甲氧基甲硅烷基)乙基)氨基甲酰肼。在其他实施方案中，R-NHNH2化合物为被肼取代的三嗪，以及任选地进一步被一个或多个下述基团取代：氨基、烷基氨基、肼基、或–NH-N＝C(H)-寡核苷酸。在其他实施方案中，R-NHNH2化合物为被–NHC(O)NHNH2取代的三嗪，以及任选地进一步被一个或多个下述基团取代：氨基、烷基氨基、
–NHC(O)NHNH2、或–NHC(O)NHN＝C(H)-寡核苷酸。
在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在温和碱性条件下发生。在一个实施方案中，所述温和碱性条件的pH为约9至约10。
在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在溶剂中发生。在一个实施方案中，所述溶剂包含缓冲液。在一个实施方案中，所述溶剂为水溶性溶剂和缓冲液的混合物。在一个实施方案中，所述溶剂为醇和缓冲液的混合物。在一个实施方案中，所述醇为甲醇。在另一个实施方案中，所述醇为乙醇。在一个实施方案中，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液。在另一个实施方案中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，所述溶剂为甲醇和硼酸盐缓冲液(例如，约pH9-10)的混合物(例如，约1:1混合物)。在一个实施方案中，所述溶剂为乙醇和硼酸盐缓冲液(例如，约pH 9-10)的混合物(例如，约1:1混合物)。
在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应约1分钟至约6小时达到基本上完成。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在约6小时、约4小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟、或约5分钟内达到至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％、至少99％、至少99.5％、或至少99.9％产率。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在约1小时内达到至少70％产率。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在约1小时内达到至少90％产率。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在约30分钟内达到至少70％产率。在一个实施方案中，式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在约30分钟内达到至少90％产率。
在一些实施方案中，X为CRa。在其他实施方案中，X为N。
在一个实施方案中，R1和R2为Ra。
在一个实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环芳基环。在一个实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选取代的苯环。
在一个实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选取代的单环杂芳基环。
在一个实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成双环稠合的芳基环。在一个实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选取代的萘基环。
在一个实施方案中，R3为氢、烷基、芳基或杂芳基。
在一个实施方案中，R3为氢。
在一个实施方案中，R3为烷基。
在一个实施方案中，R3为苯基。
在一个实施方案中，所述式(III)化合物为：
在一个实施方案中，所述式(III)化合物为
其中n为0、1、2、3或4；并且m为0、1、2、3或4。
在一个实施方案中，n为0。在一个实施方案中，n为1。在一个实施方案中，n为2。在一个实施方案中，n为3。在一个实施方案中，n为4。
在一个实施方案中，m为0。在一个实施方案中，m为1。在一个实施方案中，m为2。在一个实施方案中，m为3。在一个实施方案中，m为4。
在一个实施方案中，所述式(III)化合物为
在一个实施方案中，所述式(III)化合物为
在一些实施方案中，Ra的每一处独立地为氢、卤素、氰基、烷基、羟基或烷氧基。在其他实施方案中，Ra为氢。
在一个实施方案中，Ra1的每一处独立地为卤素、或基于碳或氮的官能团。在一个实施方案中，Ra的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。在其他实施方案中，Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、氰基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。在进一步的其他实施方案中，Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基或氰基。
在一个实施方案中，Rb的每一处独立地为卤素、或基于碳或氮的官能团。在一个实施方案中，Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。在其他实施方案中，Rb的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、氰基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。在进一步的其他实施方案中，Rb的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、羧基或氰基。
在一个实施方案中，所述式(III)化合物为
在一个实施方案中，不被特定理论束缚的情况下，本文提供的式(I)化合物显示荧光信号。在一个实施方案中，本文提供的式(I)化合物在约400nm至约600nm的波长处显示荧光信号。在一个实施方案中，本文提供的式(I)化合物在酸性条件下显示荧光信号。在一个实施方案中，所述性条件的pH为约2至约4。在一个实施方案中，所述信号的强度与所述式(I)化合物的浓度成比例。
在一个实施方案中，不被特定理论束缚的情况下，本文提供的式(II)化合物显示荧光信号。在一个实施方案中，本文提供的式(II)化合物在约400nm至约600nm的波长处显示荧光信号。在一个实施方案中，本文提供的式(II)化合物在酸性条件下显示荧光信号。在一个实施方案中，所述性条件的pH为约2至约4。在一个实施方案中，所述信号的强度与所述式(II)化合物的浓度成比例。
在一个实施方案中，本文提供了分析R-NH2化合物的方法，包括：(i)在氰离子存在下使含有所述化合物的样品与式(III)化合物反应，以形成式(I)化合物，以及(ii)检测并测量式(I)化合物的荧光。
在一个实施方案中，本文提供了分析R-NH2化合物的方法，包括以下步骤：
在氰离子存在下，使含有R-NH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
形成式(I)化合物：
以及(ii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，本文提供了分析R-NH2化合物的方法，包括以下步骤：
在氰离子存在下，使含有R-NH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
形成式(I)化合物：
以及(ii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，R不是2-吡啶基或3-吡啶基。
在一个实施方案中，本文提供了分析R-NHNH2化合物的方法，其包括：(i)使含有所述化合物的样品与式(III)化合物反应以形成式(II)化合物，(ii)任选地将pH调至适当值；以及(iii)检测并测量所述式(II)化合物的荧光。
在一个实施方案中，本文提供了分析R-NHNH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)使含有R-NHNH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(II)化合物：
(ii)任选地将pH调至适当值；以及
(iii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，本文提供了分析R-NHNH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)使含有R-NHNH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(II)化合物：
(ii)任选地将pH调至适当值；以及
(iii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的芳基或杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
在一个实施方案中，步骤(ii)中的适当pH值为约1至约4。在一个实施方案中，所述pH为约3。不被特定理论束缚的情况下，以下示例性反应可在pH调节至酸性时发生：
在一个实施方案中，本文提供的分析方法可用于在特定应用中制备或使用的固体载体的质量评估。以非限制性实例的方式，以下描述了将所述方法用于珠粒生产的质量控制的应用。本领域技术人员应理解所述方法可类似地应用于其他固体载体的评估和表征。在一个实施方案中，所述质量控制是逐步实施的。
在一个实施方案中，珠粒材料中–NH2基团的起始密度由本文提供的分析方法来测定。然后–NH2基团被转变为不同的官能团，并且–NH2基团的剩余量任选地由本文提供的分析方法来测定。然后，官能团被转变为–NHNH2基团，并且珠粒材料中–NHNH2基团的密度由本文提供的分析方法来测定。然后，–NHNH2基团被转变为不同的官能团，并且–NHNH2基团的剩余量任选地由本文提供的分析方法来测定。
在一个实施方案中，本文提供了珠粒生产的质量控制方法，包括：
(a)提供含有–NH2基团的材料；
(b)任选地，通过在氰离子存在下使材料中–NH2基团与本文提供的式(III)化合物反应,以形成本文提供的式(I)化合物，以及检测并测量式(I)化合物的荧光，从而测定材料中–NH2基团的密度；
(c)使–NH2基团与反应以提供基团；
(d)任选地，通过重复步骤(b)测定所述材料中–NH2基团的剩余量；
(e)使基团与肼反应以提供基团；以及
(f)任选地，通过使材料中–NHNH2基团与本文提供的式(III)化合物反应以形成本文提供的式(II)化合物，任选地调节pH至适当值，以及检测并测量式(II)化合物的荧光，从而测定材料中–NHNH2基团的密度。
在一个实施方案中，所述质量控制的方法还包括：
(g)使基团与含醛的DNA反应以提供基团；以及
(h)任选地，通过重复步骤(f)，测定所述材料中–NHNH2基团的剩余量。
在一个实施方案中，实施步骤(b)、(d)、(f)和(h)中的至少一个控制步骤。在一个实施方案中，实施步骤(b)、(d)、(f)和(h)中的至少两个控制步骤。在一个实施方案中，实施步骤(b)、(d)、(f)和(h)中的至少三个控制步骤。在一个实施方案中，实施步骤(b)、(d)、(f)和(h)中的所有四个控制步骤。
在一个实施方案中，本文提供的分析方法可用于监测含有–NH2基团的材料(例如，固体载体材料)的稳定性。在一个实施方案中，本文提供的分析方法可用于监测含有–NHNH2基团的材料的稳定性。所述方法包括分析在一个时间段内材料中–NH2基团或–NHNH2基团的量，其中量的减少表明所述材料在所述时间段内不稳定。
在一个实施方案中，本文提供的分析方法可用于测定样品中DNA分子的浓度。在一个实施方案中，本文提供的分析方法用于间接地通过–NHNH2基团的测定来检测样品中的DNA分子的亚纳摩尔/mg浓度。
在一个实施方案中，本文提供的分析方法可用于根据反应速度和/或荧光信号的强度以及波长的不同，来区分不同的–NH2基团或–NHNH2基团。
实施例
本文提供的某些实施方案通过以下非限制性实施例来说明。
如以下实施例中所述，在某些示例性实施方案中，根据以下一般程序制备化合物。应当理解，尽管一般方法描述了本公开内容的某些化合物的合成，但是如本文所述，以下一般方法和本领域普通技术人员已知的其他方法可以应用于所有化合物和这些化合物中每一种的亚类及种类。
在以下说明性实施例中，除非另有说明，反应在室温或环境温度下进行，温度范围为18-25℃。将有机溶液用无水硫酸镁或硫酸钠干燥，并使用旋转蒸发器在减压下蒸发溶剂。通常，反应过程后为TLC或LCMS，反应时间是代表性的。产率仅用于说明，并非通过大量工艺开发获得的产率。
实施例1.与含有氨基的材料反应
将来自相应制造步骤的20mg干燥的含氨基珠粒样品溶解在1mL甲醇中。确切地按给定顺序添加1mL 0.05M硼酸钠缓冲液(pH 9.5)、0.5mL氰化钠试剂和0.5mL NDA试剂。将小瓶用聚四氟乙烯衬里的螺旋盖密封，并在室温下搅拌15分钟。然后用1mL 0.05M磷酸盐缓冲液(pH 7)-甲醇(40+60，v/v)稀释25μL NDA衍生化溶液。以氙灯泡脉冲率为100个脉冲/秒，在420nm(激发)和480nm(发射)下测定NDA衍生物的线性荧光响应。
将50μL胺(例如己胺)母液溶解在0.95mL甲醇中。确切地按给定顺序加入1mL0.05M硼酸钠缓冲液(pH9.5)、0.5mL氰化钠试剂和0.5mL NDA(4mg配制于8mL甲醇中)试剂。将小瓶用聚四氟乙烯衬里的螺旋盖密封，并在室温下搅拌20分钟。然后用1mL 0.05M磷酸盐缓冲液(pH 7)-甲醇(40+60，v/v)稀释25μL NDA衍生化溶液。对于不同浓度的胺(例如，己胺)，以氙灯泡脉冲速率为100脉冲/秒，在420nm(激发)和490nm(发射)下测定NDA衍生物的线性荧光响应。
绘制线性校准曲线。检测限为每mg二氧化硅珠粒中己胺的亚纳摩尔浓度。典型的荧光发射光谱如图1所示(λex＝419nm，λem＝480nm)。式(I)产物的典型荧光发射线性校准示于图2中。
实施例2.与含有肼的材料反应
肼三嗪与2,3-萘二甲醛的高度化学选择性反应后荧光发射(λex＝400nm)，用于在珠粒制造中对Illumina珠粒上的肼-三嗪部分的超灵敏定量。加合物在温和的酸性条件下(例如，在乙酸中)发荧光，因为质子化的2-甲基苯并[g]酞嗪-2-鎓为高荧光，同时在320nm或400nm激发(反应时间响应<10min，λex＝400nm且λem＝495nm)。2,3-萘二甲醛试剂的化学选择性针对可能的氨基官能性(6-肼基-N2,N4-二丙基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的标准1mM溶液用作校准的模型化合物)进行检查，并且显示为肼三嗪的高度特异性试剂。
将来自相应制造步骤的20mg含肼的干燥珠粒样品溶解在1mL甲醇中。确切地按给定的顺序加入1mL 0.05M硼酸钠缓冲液(pH9.5)和0.5mL NDA(4mg配制于8mL甲醇中)试剂。将小瓶用聚四氟乙烯衬里的螺旋盖密封，并在室温下搅拌20分钟。然后用1mL冰醋酸稀释50μL NDA衍生化溶液。以氙灯泡脉冲率为100个脉冲/秒，在400nm(激发)和490nm(发射)下测定NDA衍生物的线性荧光响应。
将50μL肼(例如，6-肼基-N2,N4-二丙基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺)母液溶解在0.95mL甲醇中。确切地按照给定的顺序加入1mL 0.05M硼酸钠缓冲液(pH 9.5)和0.5mL NDA试剂。对于不同浓度的肼(例如，6-肼基-N2,N4-二丙基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺)，以氙灯泡脉冲率为100个脉冲/秒，在400nm(激发)和490nm(发射)下测定NDA衍生物的线性荧光响应。
绘制线性校准曲线。检测限为每mg二氧化硅珠粒中肼-三嗪的亚纳摩尔浓度。典型的荧光发射光谱如图3所示。(λex＝400nm，λem＝495nm)。式(II)产物的典型荧光发射线性校准示于图4中。
以上描述的实施方案仅仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或将能够使用不超过常规的实验来确定具体化合物、材料和程序的多种等同方式。所有这些等同方式均被认为是在所要求保护的主题的范围内，并且包含在所附权利要求中。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.制备式(I)化合物的工艺：
包括使式(III)化合物：
在氰离子存在下与R-NH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧基羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
2.如权利要求1所述的工艺，其中X为CRa。
3.如权利要求1所述的工艺，其中X为N。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
5.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
6.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
7.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
8.如权利要求7所述的工艺，其中R为任选地取代的苯基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
9.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
10.如权利要求9所述的工艺，其中R为任选地取代的嘧啶基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
11.如权利要求9所述的工艺，其中R为任选地取代的三嗪基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
12.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
13.如权利要求12所述的工艺，其中R为任选地取代的嘌呤基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
14.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R-NH2为任选地取代的核碱基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
15.如权利要求14所述的工艺，其中所述核碱基为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟苷、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或5-甲基胞苷，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
16.如权利要求14或15所述的工艺，其中所述核碱基连接至糖部分，所述糖部分进一步直接或通过连接子连接到固体载体上。
17.如权利要求16所述的工艺，其中所述糖部分为核糖或2-脱氧核糖。
18.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R-NH2中–NH2基团的pKa为约7至约10、约7.5至约10、约8至约10、约8.5至约10、或约9至约10。
19.如权利要求18所述的工艺，其中R-NH2中–NH2基团的pKa为约7.4至约10。
20.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为凝胶或连接至凝胶的连接子。
21.如权利要求20所述的工艺，其中所述凝胶为水凝胶。
22.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中所述R-NH2化合物连接到固体载体上，并与所述固体载体一起包含具有下述结构之一的化合物：
其中[SS]表示固体载体。
23.如权利要求1-22中任一项所述的工艺，其中所述固体载体为以下一种或多种：玻璃、改性或官能化的玻璃、塑料、多糖、尼龙、硝化纤维素、树脂、二氧化硅、硅、改性硅、碳、金属、无机玻璃和光纤束。
24.如权利要求1-22中任一项所述的工艺，其中所述固体载体为珠粒。
25.如权利要求24所述的工艺，其中所述珠粒为以下一种或多种：球形二氧化硅珠、无机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、镉基点和无镉点。
26.制备式(I)化合物的工艺:
包括使式(III)化合物：
在氰离子存在下与R-NH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代；
条件为R不是2-吡啶基或3-吡啶基。
27.如权利要求26所述的工艺，其中X为CRa。
28.如权利要求26所述的工艺，其中X为N。
29.如权利要求26-28中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基。
30.如权利要求29所述的工艺，其中R为任选地取代的嘧啶基。
31.如权利要求29所述的工艺，其中R为任选地取代的三嗪基。
32.如权利要求26-28中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基。
33.如权利要求32所述的工艺，其中R为任选地取代的嘌呤基。
34.如权利要求26-28中任一项所述的工艺，其中R-NH2为任选地取代的核碱基。
35.如权利要求34所述的工艺，其中所述核碱基为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟苷、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或5-甲基胞苷。
36.如权利要求34或35所述的工艺，其中所述核碱基连接至糖部分。
37.如权利要求36所述的工艺，其中所述糖部分为核糖或2-脱氧核糖。
38.如权利要求26-28中任一项所述的工艺，其中R-NH2中–NH2基团的pKa为约7至约10、约7.5至约10、约8至约10、约8.5至约10、或约9至约10。
39.如权利要求38所述的工艺，其中R-NH2中–NH2基团的pKa为约7.4至约10。
40.如权利要求1-39中任一项所述的工艺，其中用于制备式(I)化合物的氰离子由氰化钾或氰化钠的氰化物源提供。
41.如权利要求1-40中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NH2之间的反应在温和碱性条件下发生。
42.如权利要求41所述的工艺，其中所述温和碱性条件的pH为约7.5至约10。
43.如权利要求1-42中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NH2之间的反应在溶剂中发生，所述溶剂为水混溶性溶剂和缓冲液的混合物。
44.如权利要求40所述的工艺，其中所述溶剂为甲醇和硼酸盐缓冲液的混合物，乙醇和硼酸盐缓冲液的混合物，甲醇和磷酸盐缓冲液的混合物，或乙醇和磷酸盐缓冲液的混合物。
45.如权利要求1-44中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NH2之间的反应在约1小时内达到至少70％的产率。
46.制备式(II)化合物的工艺：
包括使式(III)化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
47.如权利要求46所述的工艺，其中X为CRa。
48.如权利要求46所述的工艺，其中X为N。
49.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
50.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
51.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基。
52.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的芳基。
53.如权利要求52所述的工艺，其中R为任选地取代的苯基。
54.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基。
55.如权利要求54所述的工艺，其中R为任选地取代的嘧啶基。
56.如权利要求54所述的工艺，其中R为任选地取代的三嗪基。
57.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基。
58.如权利要求57所述的工艺，其中R为任选地取代的嘌呤基。
59.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的氨基羰基(NH-C＝O)，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
60.如权利要求59所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基氨基羰基(烷基-NH-C＝O)，或为C2-6烷基-NHC(O)-或为丙基-NHC(O)-，其各自直接或通过连接子连接到固体载体上。
61.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R-NHNH2化合物连接到固体载体上，并与所述固体载体一起包含具有下述结构之一的化合物或其互变异构体：
其中[SS]表示固体载体并且链部分是核酸分子。
62.如权利要求61所述的工艺，其中所述核酸分子为DNA。
63.如权利要求46-62中任一项所述的工艺，其中所述固体载体为以下一种或多种：玻璃、改性或官能化的玻璃、塑料、多糖、尼龙、硝化纤维素、树脂、二氧化硅、硅、改性硅、碳、金属、无机玻璃和光纤束。
64.如权利要求46-62中任一项所述的工艺，其中所述固体载体为珠粒。
65.如权利要求64所述的工艺，其中所述珠粒为以下一种或多种：球形二氧化硅珠、无机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、镉基点和无镉点。
66.制备式(II)化合物的工艺：
包括使式(III)化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的芳基或杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
67.如权利要求66所述的工艺，其中X为CRa。
68.如权利要求66所述的工艺，其中X为N。
69.如权利要求66-68中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的芳基。
70.如权利要求69所述的工艺，其中R为任选地取代的苯基。
71.如权利要求66-68中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基。
72.如权利要求71所述的工艺，其中R为任选地取代的嘧啶基。
73.如权利要求71所述的工艺，其中R为任选地取代的三嗪基。
74.如权利要求66-68中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基。
75.如权利要求74所述的工艺，其中R为任选地取代的嘌呤基。
76.如权利要求66-68中任一项所述的工艺，其中R-NHNH2化合物为任选地取代的三嗪，或为4,6-二肼基-N-(3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基)-1,3,5-三嗪-2-胺或N-(2-(三甲氧基甲硅烷基)乙基)氨基甲酰肼。
77.如权利要求46-76中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在温和碱性条件下发生。
78.如权利要求77所述的工艺，其中所述温和碱性条件的pH为约9至约10。
79.如权利要求46-78中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在溶剂中发生，所述溶剂为水混溶性溶剂和缓冲液的混合物。
80.如权利要求79所述的工艺，其中所述溶剂为甲醇和硼酸盐缓冲液的混合物，或乙醇和硼酸盐缓冲液的混合物。
81.如权利要求46-80中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在约1小时内达到至少70％的产率。
82.分析R-NH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)在氰离子存在下，使含有R-NH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(I)化合物：
以及(ii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
83.分析R-NH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)在氰离子存在下，使含有R-NH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(I)化合物：
以及(ii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
84.如权利要求83所述的方法，其中R不是2-吡啶基或3-吡啶基。
85.分析R-NHNH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)使含有R-NHNH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(II)化合物：
(ii)任选地将pH调至适当值；以及
(iii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
86.分析R-NHNH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)使含有R-NHNH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(II)化合物：
(ii)任选地将pH调至适当值；以及
(iii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的芳基或杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中步骤(ii)中的适当pH值为约1至约4。
88.珠粒生产的质量控制方法，包括：
(a)提供含有–NH2基团的材料，其中所述–NH2通过连接子连接到固体载体；
(b)任选地，通过在氰离子存在下使所述材料的一部分中的–NH2基团与本文提供的式(III)化合物反应以形成本文提供的式(I)化合物，以及检测并测量式(I)化合物的荧光，从而测定所述材料中–NH2基团的密度；
(c)使步骤(b)中未使用的材料中的–NH2基团与反应以提供基团；
(d)任选地，通过对来自步骤(c)中反应的材料的一部分重复步骤(b)，测定步骤(c)中反应后所述材料中剩余–NH2基团的量；
(e)使步骤(d)中未使用的、来自步骤(c)的反应的材料中的基团与肼反应以提供基团；以及
(f)任选地，通过使步骤(e)中产生的材料的一部分中的–NHNH2基团与本文提供的式(III)化合物反应以形成本文提供的式(II)化合物，任选地调节pH至适当值，以及检测并测量式(II)化合物的荧光，从而测定步骤(e)中产生的材料中–NHNH2基团的密度，
其中实施步骤(b)、(d)和(f)中至少一个。
89.如权利要求88所述的方法，还包括：
(g)使基团与含醛的DNA反应以提供基团；以及
(h)任选地，通过对步骤(g)中产生的材料的一部分重复步骤(f)，测定所述材料中–NHNH2基团的剩余量。
90.如权利要求89所述的工艺或方法，其中所述连接子包含一种或多种选自以下的官能团：烷基、杂烷基(例如聚乙二醇)、肽、硅烷、烷氧基硅烷和其它合适的连接子基团。
91.如权利要求90所述的工艺或方法，其中所述连接子为-OSi(OZ)2-或-OSi(OZ)2-烷基-(NH)0-1，其中Z如上文所定义。
92.如权利要求91所述的工艺或方法，其中所述连接子为–OSi(OZ)2-丙基-或–OSi(OZ)2-丙基-NH-。
93.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地被一个或多个Ra1取代的单环或多环的芳基或杂芳基环。
94.如权利要求93所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地被一个或多个Ra1取代的单环的芳基环。
95.如权利要求94所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的苯环。
96.如权利要求93所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的单环杂芳基环。
97.如权利要求93所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的二环稠合的芳基环。
98.如权利要求97所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的萘基环。
99.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R1和R2各自为Ra。
100.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中R3为氢、烷基、芳基或杂芳基。
101.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R3为氢。
102.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R3为烷基。
103.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R3为苯基。
104.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中Ra的每一处独立地为氢、卤素、氰基、烷基、羟基或烷氧基。
105.如权利要求104所述的方法，其中Ra的每一处为氢。
106.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。
107.如权利要求106所述的工艺或方法，其中Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、氰基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。
108.如权利要求107所述的工艺或方法，其中Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基或氰基。
109.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。
110.如权利要求109所述的工艺或方法，其中Rb的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、氰基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。
111.如权利要求110所述的工艺或方法，其中Rb的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、羧基或氰基。
112.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中所述式(III)化合物为：
113.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中所述式(III)化合物为：
其中n为0、1、2、3或4；并且m为0、1、2、3或4。
114.如权利要求113所述的工艺，其中所述式(III)化合物为：
115.如权利要求114所述的工艺或方法，其中所述式(III)化合物为：
116.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R-NH2连接到固体载体上，并且与所述固体载体和任选的连接子一起包含：[SS]-OSi(OZ)2-烷基-NH2，其中[SS]为固体载体，并且每个Z为相邻固体载体所连接基团的烷基、H或硅原子。
117.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R-NHNH2连接到固体载体上，并且与所述固体载体和任选的连接子一起包含：[SS]-OSi(OZ)2-烷基-NHC(O)NHNH2，其中[SS]为固体载体，并且每个Z为相邻固体载体所连接基团的烷基、H或硅原子。

Claims (118)

1.制备式(I)化合物的工艺：
包括使式(III)化合物：
在氰离子存在下与R-NH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧基羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
2.如权利要求1所述的工艺，其中X为CRa。
3.如权利要求1所述的工艺，其中X为N。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
5.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
6.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
7.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
8.如权利要求7所述的工艺，其中R为任选地取代的苯基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
9.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
10.如权利要求9所述的工艺，其中R为任选地取代的嘧啶基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
11.如权利要求9所述的工艺，其中R为任选地取代的三嗪基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
12.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
13.如权利要求12所述的工艺，其中R为任选地取代的嘌呤基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
14.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R-NH2为任选地取代的核碱基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
15.如权利要求14所述的工艺，其中所述核碱基为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟苷、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或5-甲基胞苷，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
16.如权利要求14或15所述的工艺，其中所述核碱基连接至糖部分，所述糖部分进一步直接或通过连接子连接到固体载体上。
17.如权利要求16所述的工艺，其中所述糖部分为核糖或2-脱氧核糖。
18.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R-NH2中–NH2基团的pKa为约7至约10、约7.5至约10、约8至约10、约8.5至约10、或约9至约10。
19.如权利要求18所述的工艺，其中R-NH2中–NH2基团的pKa为约7.4至约10。
20.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中R为凝胶或连接至凝胶的连接子。
21.如权利要求20所述的工艺，其中所述凝胶为水凝胶。
22.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中所述R-NH2化合物连接到固体载体上，并与所述固体载体一起包含具有下述结构之一的化合物：
其中[SS]表示固体载体。
23.如权利要求1-22中任一项所述的工艺，其中所述固体载体为以下一种或多种：玻璃、改性或官能化的玻璃、塑料、多糖、尼龙、硝化纤维素、树脂、二氧化硅、硅、改性硅、碳、金属、无机玻璃和光纤束。
24.如权利要求1-22中任一项所述的工艺，其中所述固体载体为珠粒。
25.如权利要求24所述的工艺，其中所述珠粒为以下一种或多种：球形二氧化硅珠、无机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、镉基点和无镉点。
26.制备式(I)化合物的工艺:
包括使式(III)化合物：
在氰离子存在下与R-NH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代；
条件为R不是2-吡啶基或3-吡啶基。
27.如权利要求26所述的工艺，其中X为CRa。
28.如权利要求26所述的工艺，其中X为N。
29.如权利要求26-28中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基。
30.如权利要求29所述的工艺，其中R为任选地取代的嘧啶基。
31.如权利要求29所述的工艺，其中R为任选地取代的三嗪基。
32.如权利要求26-28中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基。
33.如权利要求32所述的工艺，其中R为任选地取代的嘌呤基。
34.如权利要求26-28中任一项所述的工艺，其中R-NH2为任选地取代的核碱基。
35.如权利要求34所述的工艺，其中所述核碱基为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟苷、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或5-甲基胞苷。
36.如权利要求34或35所述的工艺，其中所述核碱基连接至糖部分。
37.如权利要求36所述的工艺，其中所述糖部分为核糖或2-脱氧核糖。
38.如权利要求26-28中任一项所述的工艺，其中R-NH2中–NH2基团的pKa为约7至约10、约7.5至约10、约8至约10、约8.5至约10、或约9至约10。
39.如权利要求38所述的工艺，其中R-NH2中–NH2基团的pKa为约7.4至约10。
40.如权利要求1-39中任一项所述的工艺，其中用于制备式(I)化合物的氰离子由氰化钾或氰化钠的氰化物源提供。
41.如权利要求1-40中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NH2之间的反应在温和碱性条件下发生。
42.如权利要求41所述的工艺，其中所述温和碱性条件的pH为约7.5至约10。
43.如权利要求1-42中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NH2之间的反应在溶剂中发生，所述溶剂为水混溶性溶剂和缓冲液的混合物。
44.如权利要求40所述的工艺，其中所述溶剂为甲醇和硼酸盐缓冲液的混合物，乙醇和硼酸盐缓冲液的混合物，甲醇和磷酸盐缓冲液的混合物，或乙醇和磷酸盐缓冲液的混合物。
45.如权利要求1-44中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NH2之间的反应在约1小时内达到至少70％的产率。
46.制备式(II)化合物的工艺：
包括使式(III)化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
47.如权利要求46所述的工艺，其中X为CRa。
48.如权利要求46所述的工艺，其中X为N。
49.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
50.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基、芳基或杂芳基，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
51.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基。
52.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的芳基。
53.如权利要求52所述的工艺，其中R为任选地取代的苯基。
54.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基。
55.如权利要求54所述的工艺，其中R为任选地取代的嘧啶基。
56.如权利要求54所述的工艺，其中R为任选地取代的三嗪基。
57.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基。
58.如权利要求57所述的工艺，其中R为任选地取代的嘌呤基。
59.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的氨基羰基(NH-C＝O)，其直接或通过连接子连接到固体载体上。
60.如权利要求59所述的工艺，其中R为任选地取代的烷基氨基羰基(烷基-NH-C＝O)，或为C2-6烷基-NHC(O)-或为丙基-NHC(O)-，其各自直接或通过连接子连接到固体载体上。
61.如权利要求46-48中任一项所述的工艺，其中R-NHNH2化合物连接到固体载体上，并与所述固体载体一起包含具有下述结构之一的化合物或其互变异构体：
其中[SS]表示固体载体并且链部分是核酸分子。
62.如权利要求61所述的工艺，其中所述核酸分子为DNA。
63.如权利要求46-62中任一项所述的工艺，其中所述固体载体为以下一种或多种：玻璃、改性或官能化的玻璃、塑料、多糖、尼龙、硝化纤维素、树脂、二氧化硅、硅、改性硅、碳、金属、无机玻璃和光纤束。
64.如权利要求46-62中任一项所述的工艺，其中所述固体载体为珠粒。
65.如权利要求64所述的工艺，其中所述珠粒为以下一种或多种：球形二氧化硅珠、无机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、镉基点和无镉点。
66.制备式(II)化合物的工艺：
包括使式(III)化合物：
与R-NHNH2化合物反应，
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的芳基或杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
67.如权利要求66所述的工艺，其中X为CRa。
68.如权利要求66所述的工艺，其中X为N。
69.如权利要求66-68中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的芳基。
70.如权利要求69所述的工艺，其中R为任选地取代的苯基。
71.如权利要求66-68中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的5元或6元的单环杂芳基。
72.如权利要求71所述的工艺，其中R为任选地取代的嘧啶基。
73.如权利要求71所述的工艺，其中R为任选地取代的三嗪基。
74.如权利要求66-68中任一项所述的工艺，其中R为任选地取代的9元或10元的二环稠合杂芳基。
75.如权利要求74所述的工艺，其中R为任选地取代的嘌呤基。
76.如权利要求66-68中任一项所述的工艺，其中R-NHNH2化合物为任选地取代的三嗪，或为4,6-二肼基-N-(3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基)-1,3,5-三嗪-2-胺或N-(2-(三甲氧基甲硅烷基)乙基)氨基甲酰肼。
77.如权利要求46-76中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在温和碱性条件下发生。
78.如权利要求77所述的工艺，其中所述温和碱性条件的pH为约9至约10。
79.如权利要求46-78中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在溶剂中发生，所述溶剂为水混溶性溶剂和缓冲液的混合物。
80.如权利要求79所述的工艺，其中所述溶剂为甲醇和硼酸盐缓冲液的混合物，或乙醇和硼酸盐缓冲液的混合物。
81.如权利要求46-80中任一项所述的工艺，其中式(III)化合物和R-NHNH2之间的反应在约1小时内达到至少70％的产率。
82.分析R-NH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)在氰离子存在下，使含有R-NH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(I)化合物：
以及(ii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
83.分析R-NH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)在氰离子存在下，使含有R-NH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(I)化合物：
以及(ii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
84.如权利要求83所述的方法，其中R不是2-吡啶基或3-吡啶基。
85.分析R-NHNH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)使含有R-NHNH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(II)化合物：
(ii)任选地将pH调至适当值；以及
(iii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为直接或通过连接子连接到固体载体上的部分；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
86.分析R-NHNH2化合物的方法，包括以下步骤：
(i)使含有R-NHNH2化合物的样品与式(III)化合物反应：
以形成式(II)化合物：
(ii)任选地将pH调至适当值；以及
(iii)检测并测量式(I)化合物的荧光；
其中：
X为CRa或N，
R1和R2为Ra；或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成单环或多环稠合的芳基或杂芳基环，其任选地被一个或多个Ra1取代；
R3为氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
R为任选地取代的芳基或杂芳基；
Ra的每一处独立地为氢、卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；
Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个Rb取代；以及
Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、羧基、磺酰基、磺酰氨基、酰基、酰氧基、烷氧羰基或磷酸根；其各自任选地被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中步骤(ii)中的适当pH值为约1至约4。
88.珠粒生产的质量控制方法，包括：
(a)提供含有–NH2基团的材料；
(b)任选地，通过在氰离子存在下使所述材料中的–NH2基团与本文提供的式(III)化合物反应以形成本文提供的式(I)化合物，以及检测并测量式(I)化合物的荧光，从而测定所述材料中–NH2基团的密度；
(c)使–NH2基团与反应以提供基团；
(d)任选地，通过重复步骤(b)测定所述材料中–NH2基团的剩余量；
(e)使基团与肼反应以提供基团；以及
(f)任选地，通过使–NHNH2基团与本文提供的式(III)化合物反应以形成本文提供的式(II)化合物，任选地调节pH至适当值，以及检测并测量式(II)化合物的荧光，从而测定所述材料中–NHNH2基团的密度。
89.如权利要求88所述的方法，还包括：
(g)使基团与含醛的DNA反应以提供基团；以及
(h)任选地，通过重复步骤(f)，测定所述材料中–NHNH2基团的剩余量。
90.如权利要求1-25、46-65、82、85和87-89中任一项所述的工艺或方法，其中R-NH2通过连接子连接到固体载体上。
91.如权利要求90所述的工艺或方法，其中所述连接子包含一种或多种选自以下的官能团：烷基、杂烷基(例如聚乙二醇)、肽、硅烷、烷氧基硅烷和其它合适的连接子基团。
92.如权利要求91所述的工艺或方法，其中所述连接子为-OSi(OZ)2-或-OSi(OZ)2-烷基-(NH)0-1，其中Z如上文所定义。
93.如权利要求92所述的工艺或方法，其中所述连接子为–OSi(OZ)2-丙基-或–OSi(OZ)2-丙基-NH-。
94.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地被一个或多个Ra1取代的单环或多环的芳基或杂芳基环。
95.如权利要求94所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地被一个或多个Ra1取代的单环的芳基环。
96.如权利要求95所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的苯环。
97.如权利要求94所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的单环杂芳基环。
98.如权利要求94所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的二环稠合的芳基环。
99.如权利要求98所述的工艺或方法，其中R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的萘基环。
100.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R1和R2各自为Ra。
101.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中R3为氢、烷基、芳基或杂芳基。
102.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R3为氢。
103.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R3为烷基。
104.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R3为苯基。
105.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中Ra的每一处独立地为氢、卤素、氰基、烷基、羟基或烷氧基。
106.如权利要求105所述的方法，其中Ra的每一处为氢。
107.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。
108.如权利要求107所述的工艺或方法，其中Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、氰基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。
109.如权利要求108所述的工艺或方法，其中Ra1的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基或氰基。
110.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中Rb的每一处独立地为卤素、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。
111.如权利要求110所述的工艺或方法，其中Rb的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、氰基、酰胺基、羧基、酰基、酰氧基或烷氧羰基。
112.如权利要求111所述的工艺或方法，其中Rb的每一处独立地为卤素、烷基、羟基、烷氧基、羧基或氰基。
113.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中所述式(III)化合物为：
114.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中所述式(III)化合物为：
其中n为0、1、2、3或4；并且m为0、1、2、3或4。
115.如权利要求114所述的工艺，其中所述式(III)化合物为：
116.如权利要求115所述的工艺或方法，其中所述式(III)化合物为：
117.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R-NH2连接到固体载体上，并且与所述固体载体和任选的连接子一起包含：[SS]-OSi(OZ)2-烷基-NH2，其中[SS]为固体载体，并且每个Z为相邻固体载体所连接基团的烷基、H或硅原子。
118.如前述权利要求中任一项所述的工艺或方法，其中R-NHNH2连接到固体载体上，并且与所述固体载体和任选的连接子一起包含：[SS]-OSi(OZ)2-烷基-NHC(O)NHNH2，其中[SS]为固体载体，并且每个Z为相邻固体载体所连接基团的烷基、H或硅原子。
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