SK4292001A3 - Methods of nucleic acid amplification and sequencing - Google Patents
Methods of nucleic acid amplification and sequencing Download PDFInfo
- Publication number
- SK4292001A3 SK4292001A3 SK429-2001A SK4292001A SK4292001A3 SK 4292001 A3 SK4292001 A3 SK 4292001A3 SK 4292001 A SK4292001 A SK 4292001A SK 4292001 A3 SK4292001 A3 SK 4292001A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- colony
- sequence
- template
- solid support
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Oblasť techniky
Tento vynález sa týka oblasti amplifikácie a sekvenovania nukleovej kyseliny. Konkrétnejšie sa tento vynález týka spôsobov amplifikácie a sekvenovania nukleovej kyseliny a zariadení a kitov užitočných na amplifikáciu a sekvenovanie nukleových kyselín vo veľkom meradle a s vysokou výrobnou kapacitou.
Doterajší stav techniky
Sekvenčná analýza nukleových kyselín sa stala základom mnohých aktivít v biológii, biotechnológii a medicíne. Schopnosť stanoviť nukleokyselinové sekvencie sa stávala stále dôležitejšou, od začiatku snáh o stanovenie sekvencii veľkých genómov ľudí a iných vyšších organizmov, a napríklad aj pri detegovaní polymorfizmov v jednotlivých nukleotidoch a pri monitorovaní génovej expresie. Genetické informácie poskytnuté sekvenovaním nukleových kyselín majú mnohé aplikácie v oblastiach, akými sú napríklad objavovanie a ohodnotenie terčov liečiv, diagnostika ochorení a vypočítavanie rizika ochorení a identifikácia a charakterizácia organizmov.
Prvým krokom je pri takýchto aplikáciách stanovenie skutočného chemického zloženia študovaných nukleových kyselín, presnejšie, stanovenie sekvencie výskytu štyroch báz, adenínu (A), cytozínu (C), guanínu (G) a tymínu (T) alebo uracilu (U), ktoré nukleové kyseliny obsahujú. Avšak takéto aplikácie vyžadujú sekvenovanie nukleových kyselín vo veľkom meradle, z čo vyplýva extrémna potreba spôsobov sekvenovania nukleových kyselín s vysokou výrobnou kapacitou.
Spôsoby sekvenovania nukleových kyselín sú v oblasti techniky dokumentované. Dva najbežnejšie používané sú chemická štiepiaca technika podľa Maxama a Gilberta, ktorá je založená na bázovo špecifických chemických metódach, a v súčasnosti populárna Sangerová sekvenačná technika, ktorá je založená princípe • ·· ·· ·· ·· ···· ··· · • · · · ··· · · • · ·· ·· ··· · • · · · · · ·· ······· ·· ·· ··
-2enzymatického ukončenia reťazca, a v súčasnosti sa rutinne používa na sekvenovanie nukleových kyselín.
Pri sekvenovaní podľa Sangera sa každý nukleotid, ktorý sa má sekvenovať, replikuje v reakčnej zmesi obsahujúcej DNA polymerázu, deoxynukleotidtrifosfáty (dNTPs) a dideoxynukleotidtrifosfáty (ddNTPs). DNA polymeráza môže do rastúceho DNA reťazca začleňovať tak dNTPs, ako aj ddNTPs. Avšak ak sa začlení ddNTP, 3’ koniec rastúceho DNA reťazca stráca hydroxylovú skupinu a už nie je substrátom na predlžovanie reťazca, čím sa ukončí nukleotidový reťazec. Takže v určitej reakčnej zmesi obsahujúcej jeden typ ddNTP sa produkuje zmes nukleových kyselín s rôznou dĺžkou, ktoré sú ukončené rovnakým ddNTP. Zvyčajne sú pre každý zo štyroch typov ddNTP nastavené oddelené reakcie a denaturačnou gélovou elektroforézou (ktorá rozdeľuje fragmenty nukleovej kyseliny podľa ich veľkosti), alebo modernejšie hmotnostnou spektroskopiou, sa analyzuje distribúcia dĺžok produkovaných fragmentov nukleovej kyseliny. Zvyčajne sa jeden alebo viacero deoxynukleotidtrifosfátov v reakčnej zmesi označí, aby sa umožnila detekcia fragmentov s rôznymi dĺžkami.
Vyššie opísané spôsoby sú nevýhodné, pretože každá nukleová kyselina, ktorá sa má sekvenovať, sa musí spracovávať počas biochemickej reakcie individuálne. Gélová elektroforéza je nepohodlná, pracná a skutočne pomalá, aj keď sa použije kapilárna elektroforéza, a nie je veľmi vhodná na sekvenovanie vo veľkom meradle a s vysokou účinnosťou. Okrem toho je následné stanovenie sekvencie nepohodlné. Hmotnostná spektroskopia je ešte na úrovni prototypu, vyžaduje veľmi nákladnú aparatúru a každá vzorka sa musí analyzovať individuálne.
Jedným spôsobom ako zvýšiť výrobnú kapacitu je spracovávať mnoho vzoriek paralelne. Používajú sa spôsoby využívajúce DNA hybridizáciu nukleovokyselinových sond a umožňujúce určité zmnoženie procesu počas biochemického a elektroforetického spracovávania, ale za cenu predĺženia ďalších manipulácií.
V súčasnosti sa stávajú dostupnými spôsoby založené na DNA čipoch a DNA hybridizácii (Thomas a Búrke, Exp. Opin. Ther. Patents 8: 503-508 (1998)). Tieto spôsoby sú nevýhodné, pretože pre každú aplikáciu sa najprv musí navrhnúť a vyrobiť DNA čip: to je zdĺhavá operácia a cena jednotlivého čipu klesá, len aj sú • ·· ·· ·· ·· ···· · · ··· • · · · ··· · ·
-3·· · · · · ·· ··· ···· ·· ·· ·· · potrebné veľké množstvá tohto čipu. Čipy tiež nie sú znovu použiteľné a každým čipom môže byť spracovávaná v určitom čase len jedna vzorka nukleovej kyseliny, napr. jeden pacient, ktorému sa má stanoviť diagnóza. Nakoniec, rozsah sekvencie, ktorá sa môže analyzovať takýmto čipom, je obmedzený na menej ako 100 000 báz, a je obmedzený na určité aplikácie, ako napríklad určovanie DNA genotypu a určovanie profilu génovej expresie.
Vo väčšine známych techník na sekvenčnú analýzu nukleových kyselín je nevyhnutným krokom na získanie dostatočného množstva nukleovej kyseliny na analýzu, amplifikácia študovaných nukleových kyselín.
V oblasti techniky je dobre známych a dokumentovaných niekoľko spôsobov amplifikácie nukleovej kyseliny. Nukleová kyselina sa môže napríklad amplifikovať začlenením študovanej nukleovej kyseliny do expresného vektorového konštruktu. Takéto vektory sa potom môžu zaviesť do vhodných biologických hostiteľských buniek a vektorová DNA, vrátane študovanej nukleovej kyseliny, sa môže amplifikovať kultiváciou biologického hostiteľa použitím dobre zavedených protokolov.
Nukleové kyseliny amplifikované takýmito metódami je možné z hostiteľských buniek izolovať spôsobmi, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe a dokumentované. Avšak nevýhodou takýchto spôsobov je, že vo všeobecnosti vyžadujú veľa času, sú pracné a ťažko sa automatizujú.
Technika DNA amplifikácie polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) bola opísaná v roku 1985 (Saiki a ďalší, Science 230, 1350-1354) a v súčasnosti je to v oblasti techniky dobre známy a dokumentovaný spôsob. Cieľový študovaný nukleokyselinový fragment sa môže amplifikovať použitím dvoch krátkych oligonukleotidových sekvencii (zvyčajne sa označujú ako primery), ktoré sú špecifické voči známym sekvenciám ohraničujúcim DNA sekvenciu, ktorá sa má amplifikovať. Primery hybridizujú s opozitnými vláknami dvojvláknového DNA fragmentu potom, ako sa tento denaturuje, a sú orientované tak, aby DNA syntéza prostredníctvom DNA polymerázy postupovala cez oblasť medzi dvoma sekvenciami, pričom sa primerové sekvencie predlžujú postupným začleňovaním nukleotidov polymerázou. Predlžovacie reakcie vytvárajú dve dvojvláknové cieľové oblasti, ktoré sa môžu znova denaturovať a tak pripraviť na druhé kolo hybridizácie • ·· · · ·· ·· ···· ··· ··· • · · · ··· · · • · ···· ·· ··· ···· ·· ·· ·· ·
-4a predlžovania. Tretí cyklus produkuje dve dvojvláknové molekuly, ktoré obsahujú presne cieľovú oblasť v dvojvláknovej forme. Opakovanými cyklami tepelnej denaturácie, hybridizácie primerov a predlžovania sa rýchlo exponenciálne akumuluje špecifický cieľový fragment DNA. Tradične sa tento spôsob uskutočňuje v roztoku a amplifikovaný cieľový fragment nukleovej kyseliny sa purifikuje z roztoku spôsobmi, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe, napríklad gélovou elektroforézou.
V súčasnosti však boli opísané spôsoby využívajúce primer ukotvený na povrchu v spojení s voľnými primermi v roztoku. Tieto spôsoby umožňujú simultánnu amplifikáciu a pripojenie PCR produktu na povrch (Oroskar, A.A. a ďalší, Clinical Chemistry 42: 1547 (1996)). WO 96/04404 a WO 98/36094 (Mosaic Technologies, Inc. a ďalší) opisujú spôsob detekcie cieľovej nukleovej kyseliny vo vzorke, ktorá potenciálne obsahuje cieľovú nukleovú kyselinu. Spôsob zahŕňa amplifikáciu cieľovej nukleovej kyseliny založenú na PCR, len keď sa cieľová nukleová kyselina v testovanej vzorke nachádza. Na amplifikáciu cieľovej sekvencie sa oba primery pripoja na tuhý podklad, čoho výsledkom je to, že amplifikované sekvencie cieľových nukleových kyselín sú takisto pripojené na tuhý podklad. Amplifikačná technika opísaná v tomto dokumente sa niekedy označuje ako mostová amplifikačná technika. Pri tejto technike sú dva primery, ako pri bežnej PCR, špecificky navrhnuté tak, aby ohraničovali konkrétnu cieľovú DNA sekvenciu, ktorá sa má amplifikovať. Takže, ak sa konkrétna cieľová nukleová kyselina nachádza vo vzorke, môže cieľová nukleová kyselina hybridizovať s primermi a môže byť amplifikované prostredníctvom PCR. Prvým krokom v tomto PCR amplifikačnom procese je hybridizácia cieľovej nukleovej kyseliny s prvým špecifickým primerom pripojeným na podklad (primer 1). Prvý amplifikačný produkt, ktorý je komplementárny s cieľovou nukleovou kyselinou, sa potom vytvára predlžovaním sekvencie primeru 1. Pôsobením denaturačných podmienok na podklad sa cieľová nukleová kyselina uvoľní a potom sa zúčastňuje na ďalších hybridizačných reakciách s inými sekvenciami primeru 1, ktoré môžu byť pripojené na podklad. Prvý amplifikačný produkt, ktorý je pripojený na podklad, môže potom hybridizovať s druhým špecifickým primerom (primer 2) pripojeným na podklad a druhý amplifikačný produkt obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny
-5···· ··· · · · • · · · ··· · · • · · · · ·· ··· ···· ·· · ·· · komplementárnu s prvým amplifikačným produktom sa môže vytvoriť predlžovaním sekvencie primeru 2 a je tiež pripojený na podklad. Takže, cieľová nukleová kyselina a prvý a druhý amplifikačný produkt sú schopné sa podieľať na mnohých hybridizačných a predlžovacích procesoch, obmedzovaných len počiatočnou prítomnosťou cieľovej nukleovej kyseliny a množstvom sekvencií primeru 1 a primeru 2, ktoré sú prítomné na začiatku, a výsledkom je množstvo kópií cieľovej sekvencie pripojenej na podklad.
Keďže pri uskutočňovaní tohto spôsobu sa amplifikačné produkty vytvárajú len ak je prítomná cieľová nukleová kyselina, z monitoringu podkladu, či je alebo nie je na ňom prítomný jeden alebo viacero amplifikačných produktov, vyplýva prítomnosť alebo absencia špecifickej cieľovej sekvencie.
Mosaicova technika môže byť použitá na dosiahnutie viacnásobného množstva tak, že niekoľko rôznych cieľových sekvencií nukleových kyselín sa môže amplifikovať zároveň zoskupením rôznych sád prvých a druhých primerov, ktoré sú špecifické pre každú odlišnú cieľovú nukleokyselinovú sekvenciu, v odlišných oblastiach tuhého podkladu.
Nevýhoda Mosaicového procesu spočíva v tom, že prvá a druhá primerová sekvencia musia byť špecifické pre každú cieľovú nukleovú kyselinu, ktorá sa má amplifikovať, a teda môže byť použitý len na amplifikáciu známych sekvencií. Okrem toho, výrobná kapacita je obmedzená počtom odlišných sád špecifických primerov a následne amplifikovaných cieľových nukleokyselinových molekúl, ktoré môžu byť zoskupené v odlišných oblastiach daného tuhého podkladu, a časom potrebným na zoskupenie nukleových kyselín v odlišných oblastiach. Mosaicov proces vyžaduje aj to, aby sa 2 odlišné primery homogénne pripájali 5’ koncom na podklad v určitej oblasti, v ktorej sa vytvára amplifikačný produkt. To nie je možné dosiahnuť v súčasnosti dostupnou technológiou na výrobu DNA čipov, a musí sa to dosahovať určitými prostriedkami na rozdeľovanie vzorky. Takže hustota, ktorú je možné dosiahnuť týmto prístupom, má rovnaké obmedzenie ako iné klasické zoskupovacie technológie. Ďalším obmedzením je rýchlosť monitoringu jednotlivých oddelených oblastí podkladu z hľadiska prítomnosti alebo neprítomnosti amplifikovaných cieľových nukleových kyselín.
-6• ·· ·· ·· ·· ···· ··· · · · • · · · · ·· · · • · ···· · · 9 ··· ···· ·· ·· ·· ···
Zoskupovanie DNA vzoriek sa klasicky uskutočňuje na membránach (napr. nylonovej alebo nitrocelulózovej membráne). Použitie vhodných robotizovaných zariadení (napr. Q-bot™, Genetix Ltd, Dorset BH23 3TG UK) umožňuje získať hustotu do 10 vzoriek na mm2. V týchto spôsoboch sa DNA kovalentne naväzuje na membránu fýzikálno-chemickými prostriedkami (napr. UV žiarením) a je možné zoskupenie veľkých DNA molekúl (napr. molekúl dlhších ako 100 nukleotidov), ako aj malých molekúl, ako napríklad oligonukleotidových primerov.
Známe sú iné techniky, ktorými je možné získať zoskupenia oligonukleotidov s vyššou hustotou. Napríklad, prístupy založené na vopred zoskupených sklenených fólií, na ktorých sú zoskupenia reaktívnych oblastí získané atramentovou technológiou (Blanchard, A.P. a L. Hood, Microbial and Comparative Genomics, 1:225 (1996)) alebo založené na zoskupeniach reaktívnych polyakrylamidových gélov (Yershov, G. a ďalší, Proceedings of the National Academy of Science, USA, 93:4913-4918 (1996)), ktoré umožňujú teoreticky zoskupenie do 100 vzoriek na mm2.
Ešte vyššie hustoty zoskupenia vzoriek sa dajú dosiahnuť použitím DNA čipov (Fodor, S.P.A. a ďalší, Science 251: 767 (1991)). V súčasnosti techniky molekulárnej biológie využívajú čipy s 625 oligonukleotidovými sondami na mm2 (Lockhart, D.J. a ďalší, Náture Biotechnology 14: 1675 (1996)). Ako dosiahnuteľná bola opísaná hustota sond do 250 000 vzoriek na cm2 (2500/mm2) (Chee, M. a ďalší, Science 274: 610 (1996)). Avšak v súčasnosti sa môže na jednom čipe s veľkosťou približne 2,5 cm2 zoskupiť do 132000 odlišných nukleotidov. Dôležité je, že tieto čipy sú vyrábané takým spôsobom, že 3ΌΗ koniec oligonukleotidu je pripojený na tuhý podklad. To znamená, že oligonukleotidy pripojené na čipy týmto spôsobom nemôžu byť použité ako primery v PCR amplifikačnej reakcii.
Dôležité je, že keď sú PCR produkty pripojené na nádobu, v ktorej sa uskutočňuje PCR amplifikácia, hustota výsledného zoskupenia PCR produktov je obmedzená dostupnou nádobou. V súčasnosti sú dostupné nádoby majú formát len 96 jamkovej mikrotitračnej platne. To umožňuje získať len približne 0,02 vzorky PCR produktov na mm2 povrchu.
Napríklad, použitím komerčne dostupného Nucleolink™ systému (Nunc A/S, Roskilde, Dánsko) je možné dosiahnuť simultánnu amplifikáciu a zoskupenie ·· ·· • · · • · ···
-7• · · · · ·· vzoriek s hustotou 0,02 vzorky/mm2 v nádobkách, na ktorých povrchu sú prichytené oligonukleotidové primery. Avšak technické problémy spôsobujú, že je nepravdepodobné, že by sa týmto prístupom dosiahol významný nárast hustoty vzoriek.
Takže je zrejmé, že na zvýšenie výrobnej kapacity sú v oblasti techniky potrebné nové spôsoby amplifikácie nukleovej kyseliny, ktoré by umožnili simultánnu amplifikáciu a zoskupovanie vzoriek nukleových kyselín s vyššou hustotou, a navyše by umožnili rýchlejšie monitorovanie vzoriek, výhodne paralelne.
Okrem toho je zrejmé, že v oblasti techniky existuje potreba nových spôsobov sekvenovania, ktoré umožnia spracovávanie a sekvenovanie veľkého množstva vzoriek paralelne, tzn. existuje potreba spôsobov na sekvenovanie, ktoré umožnia významné zmnoženie procesu. Významné zmnoženie sekvenačného procesu by na druhej strane viedlo k vyššej výrobnej kapacite, ako je kapacita dosiahnuteľná spôsobmi sekvenovania známymi v oblasti techniky. Takéto nové spôsoby by mohli byť ešte viac želateľné, ak by dosiahli vysokú kapacitu sekvenovania za prijateľnú cenu a boli by menej náročné na prácnosť ako bežné sekvenačné techniky.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je spôsob amplifikácie nukleových kyselín na tuhej fáze, ktorý umožňuje simultánne zoskupovať a amplifikovať veľké množstvo odlišných nukleokyselinových sekvencií a to s vysokou hustotou. Vynález opisuje aj spôsoby, ktorými je možné rýchlo, a ak je to želateľné, paralelne monitorovať veľké množstvo odlišných amplifikovaných nukleokyselinových sekvencií. Vynález opisuje aj spôsoby, ktorými je možné simultánne a v krátkom čase determinovať sekvencie veľkého množstva odlišných nukleových kyselín. Tieto spôsoby sú užitočné najmä, ale bez obmedzenia, pri sekvenovaní celého genómu, alebo v situáciách, kedy sa musia simultánne sekvenovať mnohé gény (napr. 500) z mnohých jedincov (napr. 500), alebo v situáciách, kedy sa musia vyhodnocovať veľké množstvá (napr. milióny) polymorfizmov, alebo sa musí simultánne monitorovať expresia veľkého množstva génov (napr. 100000).
| • ·· | ·· | ·· | ·· | ||
| • · · | • | • | • | • | • · |
| • · | • | • | ··· | • | • |
| • · ······ | • | • ·· | • · ·· | • | • • · · |
Predložený vynález preto poskytuje spôsob amplifikácie najmenej jednej nukleovej kyseliny, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky:
(1) vytvorenie najmenej jedného nukleokyselinového templátu, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu (nukleové kyseliny), ktorá sa má amplifikovať, pričom uvedená nukleová kyselina (nukleové kyseliny) obsahuje na 5’ konci oligonukleotidovú sekvenciu Y a na 3' konci oligonukleotidovú sekvenciu Z, a okrem toho nesie nukleová kyselina (nukleové kyseliny) na 5’ konci prostriedok na pripojenie nukleovej kyseliny (nukleových kyselín) k tuhému podkladu;
(2) zmiešanie nukleokyselinového templátu (templátov) s jedným alebo viacerými kolóniovými primermi X, ktoré môžu hybridizovať s oligonukleotidovou sekvenciou Z a na 5’ konci nesú prostriedok na pripojenie kolóniových primerov k tuhému podkladu, v prítomnosti tuhého podkladu, aby sa 5’ konce tak nukleokyselinového templátu, ako aj kolóniových primerov, naviazali na tuhý podklad;
(3) uskutočňovanie jednej alebo viacerých nukleokyselinových amplifikačných reakcií na naviazanom templáte (templátoch), aby sa generovali kolónie nukleových kyselín.
V ďalšom uskutočnení vynálezu sa dva odlišné kolóniové primery X zmiešajú s nukleokyselinovým templátom (templátmi) v kroku (2) uvedeného spôsobu. Výhodné sekvencie kolóniových primerov X sú také, že oligonukleotidová sekvencia Z môže hybridizovať s jedným z kolóniových primerov X, a oligonukleotidová sekvencia Y je rovnaká ako sekvencia jedného z kolóniových primerov X.
V alternatívnom uskutočnení vynálezu je oligonukleotidová sekvencia Z komplementárna s oligonukleotidovou sekvenciou Y, označovanou ako Y’, a kolóniový primer X má rovnakú sekvenciu ako oligonukleotidová sekvencia Y.
V ešte inom uskutočnení vynálezu môže kolóniový primer X obsahovať degenerovanú primerovú sekvenciu a nukleokyselinový templát (templáty) obsahuje nukleovú kyselinu (kyseliny), ktorá sa má amplifikovať, a neobsahuje oligonukleotidové sekvencie Y alebo Z na 5’, respektíve 3’ konci.
V ďalšom uskutočnení vynálezu zahŕňa spôsob ďalší krok, v ktorom sa uskutočňuje najmenej jeden krok determinovania sekvencie jednej alebo viacerých nukleokyselinových kolónií generovaných v kroku (3).
| • ·· • · · • · | ·· | ·· • ··· | • · | ||
| • • | • • | • • | • · • | ||
| • · | • | • | • · | • | • |
| ······ | ·· | ·· | ·· · |
Takže vynález poskytuje aj spôsob na sekvenovanie najmenej jednej nukleovej kyseliny, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky:
(1) vytvorenie najmenej jedného nukleokyselinového templátu, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu (nukleové kyseliny), ktorá sa má sekvenovať, pričom uvedená nukleová kyselina (nukleové kyseliny) obsahuje na 5' konci oligonukleotidovú sekvenciu Y a na 3’ konci oligonukleotidovú sekvenciu Z, a okrem toho nesie nukleová kyselina (nukleové kyseliny) na 5’ konci prostriedok na pripojenie nukleovej kyseliny (nukleových kyselín) k tuhému podkladu;
(2) zmiešanie nukleokyselinového templátu (templátov) s jedným alebo viacerými kolóniovými primermi X, ktoré môžu hybridizovať s oligonukleotidovou sekvenciou Z a na 5’ konci nesú prostriedok na pripojenie kolóniových primérov k tuhému podkladu, v prítomnosti tuhého podkladu, aby sa 5’ konce tak nukleokyselinového templátu, ako aj kolóniových primérov, naviazali na tuhý podklad;
(3) uskutočňovanie jednej alebo viacerých nukleokyselinových amplifikačných reakcií na naviazanom templáte (templátoch), aby sa generovali kolónie nukleových kyselín; a (4) uskutočňovanie najmenej jedného kroku determinácie sekvencie najmenej jednej z generovaných nukleokyselinových kolónií.
V ďalšom uskutočnení vynálezu nesie 5' koniec tak nukleokyselinového templátu (templátov), ako aj kolóniových primérov, prostriedok na kovalentné pripojenie nukleokyselinových sekvencií na tuhý podklad. Výhodne je týmto prostriedkom na kovalentné pripojenie chemicky modifikovateľná funkčná skupina, ako napríklad fosfátová skupina, karboxylová alebo aldehydová skupina, tiolová, hydroxylová, dimetoxyltritylová (DMT) skupina alebo aminoskupina, výhodne aminoskupina.
Nukleové kyseliny, ktoré je možné amplifikovať spôsobom podľa vynálezu zahŕňajú DNA, napríklad, genomickú DNA, cDNA, rekombinantnú DNA alebo akúkoľvek formu syntetickej alebo modifikovanej DNA, RNA, mRNA alebo akúkoľvek formu syntetickej alebo modifikovanej RNA. Uvedené nukleové kyseliny môžu mať rôznu dĺžku a môžu byť fragmentmi alebo menšími časťami väčších nukleokyselinových molekúl. Výhodne je nukleová kyselina, ktoré sa má amplifikovať, dlhá najmenej 50 bázových párov a výhodnejšie od 150 do 4000 ·· ·· • · · • · ···
-10• ·· ·· · · • · ·· • · · • · • · ··· ···· • · · · ·· ·· • · ·· · bázových párov. Nukleová kyselina, ktorá sa môže amplifikovať, môže mať známu alebo neznámu sekvenciu a môže byť v jed no vlákno vej alebo v dvojvláknovej forme. Nukleová kyselina, ktorá sa má amplifikovať, môže byť odvodená od akéhokoľvek zdroja.
Tak ako je používanú tu znamená výraz nukleokyselinový templát entitu, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu, ktorá sa má amplifikovať alebo sekvenovať, v jednovláknovej forme. Ako bude zdôraznené nižšie, môže byť nukleová kyselina, ktorá sa má amplifikovať alebo sekvenovať, poskytnutá aj v dvojvláknovej forme. Takže nukleokyselinovými templátmi podl’a vynálezu môžu byť jedno alebo dvojvláknové nukleové kyseliny. Nukleokyselinové templáty na použitie v spôsobe podfa vynálezu môžu mať rôzne dĺžky. Výhodne sú dlhé najmenej 50 bázových párov a výhodnejšie sú dlhé 150 až 4000 bázových párov. Nukleotidy, ktoré vytvárajú nukleokyselinové templáty môžu byť prirodzene sa vyskytujúcimi nukleotidmi alebo inými ako prirodzene sa vyskytujúcimi nukleotidmi. Nukleokyselinové templáty podfa vynálezu neobsahujú len nukleovú kyselinu, ktorá sa má amplifikovať, ale aj 5’ a 3’ koncové krátke oligonukleotidové sekvencie. Oligonukleotidová sekvencia, ktorá sa nachádza na 5' konci, sa tu označuje ako Y. Oligonukleotidové sekvencia Y má známu sekvenciu a môže mať rôznu dĺžku. Oligonukleotidová sekvencia Y na použitie v spôsoboch podľa predloženého vynálezu je výhodne dlhá najmenej päť nukleotidov, výhodne 5 až 100 nukleotidov a najvýhodnejšie približne 20 nukleotidov. V oligonukleotidovej sekvencií Y sa môžu nachádzať prirodzene sa vyskytujúce nukleotidy alebo iné ako prirodzene sa vyskytujúce nukleotidy. Ako je uvedené vyššie, výhodnej je sekvencia oligonukleotidu Y rovnaká ako sekvencia kolóniového priméru X. Oligonukleotidové sekvencia nachádzajúca sa na 3’ konci nukleokyselinových templátov podľa vynálezu sa tu označuje ako Z. Oligonukleotidová sekvencia Z má známu sekvenciu a môže mať rôznu dĺžku. Oligonukleotidová sekvencia Z na použitie v spôsoboch podľa predloženého vynálezu je výhodne dlhá najmenej päť nukleotidov, výhodne 5 až 100 nukleotidov a najvýhodnejšie približne 20 nukleotidov. V oligonukleotidovej sekvencií Z sa môžu nachádzať prirodzene sa vyskytujúce nukleotidy alebo iné ako prirodzene sa vyskytujúce nukleotidy. Oligonukleotidová sekvencia Z je navrhovaná tak, aby hybridizovala s jedným z kolóniových primerov X, a výhodne je navrhovaná ··
-11 • ·· ·· · · • · ·· • · · • · ··· ·· • · · • · • · ··· ···· • · · · ·· ·· • · ·· · ta, aby bola komplementárna s oligonukleotidovou sekvenciou Y, tu označovanou ako Y’. Oligonukleotidové sekvencie Y a Z nachádzajúce sa na 5’, respektíve 3’ konci nukleokyseiinového templátu nemusia byť umiestnené na úplných koncoch templátu. Napríklad, hoci oligonukleotidové sekvencie Y a Z sú výhodne umiestnené na alebo neďaleko 5’, respektíve 3’ konca nukleokyselinových templátov (napríklad ako 0. až 100. nukleotidy na 5’ a 3’ konci) môžu byť umiestnené oveľa ďalej (napr. ďalej ako 100. nukleotidy) od 5’ alebo 3’ koncov nukleokyseiinového templátu. Takže oligonukleotidové sekvencie Y a Z môžu byť umiestnené v akejkoľvek polohe vo vnútri nukleokyseiinového templátu za predpokladu, že sekvencie Y a Z sú z oboch strán, tzn. že ohraničujú nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá sa má amplifikovať.
Tak ako sa používa tu, zahŕňa výraz nukleokyselinový templát aj entitu, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu, ktorá sa má amplifikovať alebo sekvenovať, v dvojvláknovej forme. Keď je nukleokyselinový templát v dvojvláknovej forme, sekvencie Y a Z nachádzajúce sa na 5’, respektíve na 3’ konci sú jednovláknové. Opačné vlákno je vďaka pravidlám bázového párovania DNA komplementárne k vláknu obsahujúcemu oligonukleotidové sekvencie Y a Z, a tak obsahuje oligonukleotidovú sekvenciu Z* na 5’ konci a oligonukleotidovú sekvenciu Y' na 3’ konci.
Tak ako je používaný tu, znamená výraz kolóniový primer entitu, ktorá obsahuje oligonukleotidovú sekvenciu, ktorá je schopná hybridizovať s komplementárnou sekvenciou a iniciovať špecifickú polymerázovú reakciu. Sekvencia kolóniového primeru je vybraná tak, aby mala maximálny hybridizačný účinok s jej komplementárnou sekvenciou a veľmi nízky nešpecifický hybridizačný účinok s akoukoľvek inou sekvenciou. Sekvencia používaná ako kolóniový primer môže zahŕňať akúkoľvek sekvenciu, ale výhodne zahŕňa 5-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG alebo 5’-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC. Kolóniový primer môže mať dĺžku 5 až 100 báz, ale výhodne 15 až 25 báz. V tomto primeri môžu byť prítomné tak prirodzene sa vyskytujúce nukleotidy, ako aj iné ako prirodzene sa vyskytujúce nukleotidy. V spôsoboch podľa predloženého vynálezu môžu byť na generovanej nukleokyselinových kolónií použité jeden alebo dva odlišné kolóniové primery. Kolóniové primery na použitie podľa predloženého vynálezu môžu zahŕňať aj degenerované primerové sekvencie.
| • ·· • · · • · | • e | ·· • ··· | ·· | • ·> | |
| • • | • • | ||||
| • · | • | • | • · | • · | • |
| ······ | ·· | ·· | • · | ·· |
Tak ako je používaný tu, znamená výraz degenerované primerové sekvencie krátke oligonukleotidové sekvencie, ktoré sú schopné hybridizovať s akýmkoľvek fragmentom nukleovej kyseliny nezávisle na sekvencii uvedeného nukleokyselinového fragmentu. Takže takéto degenerované primery nevyžadujú prítomnosť oligonukleotidových sekvencií Y alebo Z v nukleokyselinovom templáte (templátoch) na to, aby nastala ich hybridizácia s templátom, hoci nie je vylúčenie použitie degenerovaných primérov na hybridizáciu s templátom obsahujúcim oligonukleotidové sekvencie X alebo Y. Avšak je zrejmé, že na použitie pri amplifikačných spôsoboch podľa predloženého vynálezu musia degenerované primery hybridizovať s nukleokyselinovými sekvenciami v templáte v miestach na oboch stranách, alebo v miestach, ktoré ohraničujú nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá sa má amplifikovať.
Tak ako je používaný tu, znamená výraz tuhý podklad akýkoľvek tuhý povrch, na ktorý sa môžu kovalentne pripojiť nukleové kyseliny, napríklad, latexové guľôčky, dextránové guľôčky, polystyrén, polypropylénový povrch, polyakrylamidový gél, zlaté povrchy, sklenené povrchy a silikónové membrány. Výhodným tuhým podkladom je sklenený povrch.
Tak ako je používaný tu, znamená výraz prostriedok na pripájanie nukleových kyselín na tuhý povrch akúkoľvek chemickú alebo nechemickú pripájaciu metódu zahŕňajúcu chemicky modifikovateľné funkčné skupiny. Pripojenie sa týka imobilizácie nukleovej kyseliny na tuhých povrchoch buď kovalentným pripojením, alebo prostredníctvom ireverzibilnej pasívnej adsobcie, alebo prostredníctvom afinity medzi molekulami (napríklad imobilizáciou na avidínom obalenom povrchu biotinylovanými molekulami). Pripojenie musí byť dostatočne silné, aby sa nemohlo odstrániť premývaním s vodou alebo s vodnými tlmivými roztokmi pri DNA-denaturačných podmienkach.
Tak ako je používaný tu, znamená výraz chemicky modifikovateľná funkčná skupina napríklad fosfátovú skupinu, karboxylovú alebo aldehydovú skupinu, tiolovú skupinu alebo aminoskupinu.
Tak ako je používaný tu, znamená výraz nukleokyselinová kolónia oddelenú oblasť obsahujúcu viacero kópií nukleokyselinového reťazca. V rovnakej kolónií sa môže nachádzať aj viacero kópií reťazca komplementárneho k danému nukleo-13-
| • ·· | ·· | ·· | ·· | ||
| • · · | • | • | • | • | • · |
| • · | • | • | ··· | • | • |
| • · | • | • | • · | • | • |
| ······ | ·· | ·· | ·· · |
kyselinovému reťazcu. Viaceré kópie nukleokyselinových reťazcov, ktoré vytvárajú kolónie, sú vo všeobecnosti imobilizované na tuhom podklade a môžu byť v jednovláknovej alebo v dvojvláknovej forme. V závislosti na použitých podmienkach je možné generovať nukleokyselinové kolónie podľa vynálezu s rozličnou veľkosťou a hustotou. Veľkosť kolónií je výhodne od 0,2 μπι do 6 μπι, výhodnejšie od 0,3 μιτι do 4 μπι. Hustota nukleokyselinových kolónií na použitie v spôsobe podľa vynálezu je typicky 10000/mm2 až 100000/mm2. Verí sa, že je možné dosiahnuť vyššie hustoty, napríklad 100000/mm2 až 1000000/mm2 a 1000000/mm2 až 10000000/mm2.
Spôsoby podľa vynálezu môžu byť používané na generovanie nukleokyselinových kolónií. Takže ďalší predmet vynálezu poskytuje jednu alebo viac nukleokyselinových kolónií. Nukleokyselinová kolónia podľa vynálezu môže byť generovaná z jediného imobilizovaného nukleokyselinového templátu podľa vynálezu. Spôsob podľa vynálezu umožňuje simultánnu produkciu množstva takýchto nukleokyselinových kolónií, z ktorých každá môže obsahovať odlišné imobilizované nukleokyselinové vlákna.
Takže ešte ďalší predmet vynálezu poskytuje pluralitu nukleokyselinových templátov obsahujúcich nukleové kyseliny, ktoré sa majú amplifikovať, pričom uvedené nukleové kyseliny obsahujú na svojich 5’ koncoch oligonukleotidovú sekvenciu Y a na svojich 3’ koncoch oligonukleotidovú sekvenciu Z, a okrem toho tieto nukleové kyseliny nesú na svojom 5' konci prostriedok na pripojenie nukleovej kyseliny k tuhému podkladu. Výhodne sú tieto rôzne nukleokyselinové templáty zmiešané s rôznymi kolóniovými primérmi X, ktoré môžu hybridizovať soligonukleotidovou sekvenciou Z a nesú na svojom 5' konci prostriedok na pripojenie kolóniových primerov k tuhému podkladu. Výhodne sú tieto rôzne nukleokyselinové templáty a kovalentné primery naviazané na tuhý podklad kovalentne.
V ďalšom uskutočnení vynálezu sa zmieša množstvo dvoch odlišných kolóniových primerov X s množstvom nukleokyselinových templátov. Výhodne sú sekvencie kolóniových primerov také, aby oligonukleotidová sekvencia Z mohla hybridizovať s jedným z kolóniových primerov X, a aby oligonukleotidová sekvencia Y bola rovnaká ako sekvencia jedného z kolóniových primerov X.
| • ·· ·· · · • · | ·· • · • · | ·· • ··· | ·· | • ·· • | |
| • • | • • | ||||
| • · | • · | • · | • | • | • |
| ··· ···· | ·· | ·· | ·· | ··· |
V alternatívnom uskutočnení je oligonukleotidová sekvencia Z komplementárna s oligonukleotidovou sekvenciou Y (Y*) a kolóniové primery X majú rovnakú sekvenciu ako oligonukleotidová sekvencia Y.
V ešte ďalšom uskutočnení môžu kolóniové primery X obsahovať degeneratívnu primerovú sekvenciu a nukleokyselinové templáty obsahujú nukleové kyseliny, ktoré sa majú amplifikovať, a neobsahujú oligonukleotidové sekvencie Y alebo Z na 5', respektíve 3’ konci.
Nukleokyselinové templáty podľa vynálezu sa môžu pripraviť technikami, ktoré sú v oblasti techniky štandardné alebo bežné. Vo všeobecnosti budú založené na technikách genetického inžinierstva.
Nukleové kyseliny, ktoré sa majú amplifikovať, sa môžu získať spôsobmi, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe a dokumentované. Napríklad získaním vzorky nukleovej kyseliny, ako napríklad celkovej DNA, genomickej DNA, cDNA, celkovej RNA, mRNA atď. metódami, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe a dokumentované, a tým, že sa z nich generujú fragmenty, napríklad limitovaným štiepením reštrikčnými enzýmami alebo mechanickými prostriedkami.
Typicky sa nukleová kyselina, ktorá sa má amplifikovať, najprv získa v dvojvláknovej forme. Keď je nukleová kyselina poskytnutá v jednovláknovej forme, napríklad mRNA, je najprv prevedená na dvojvláknovú formu prostredníctvom v oblasti techniky dobre známych a dokumentovaných prostriedkov, ako napríklad použitím oligo-dT primerov a reverznej transkriptázy a DNA polymerázy. Keď už sa raz nukleová kyselina, ktorá sa má amplifikovať, získa v dvojvláknovej forme s príslušnou dĺžkou, pripoja sa na každý koniec oligonukleotidové sekvencie zodpovedajúce oligonukleotidovým sekvenciám Y a Z, tzn. tak na 5’, ako aj na 3' koniec nukleokyselinovej sekvencie, aby sa vytvoril nukleokyselinový templát. To je možné uskutočniť použitím metód, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe a dokumentované, napríklad ligáciou alebo zavedením nukleovej kyseliny, ktorá sa má amplifikovať, do biologického vektora v mieste, ktoré je ohraničené príslušnými oligonukleotidovými sekvenciami. Alternatívne, ak je známa aspoň čas sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá sa má amplifikovať, je možné generovať nukleokyselinový templát, obsahujúci oligonukleotidové sekvencie Y a Z na 5’, respektíve 3' konci, prostredníctvom PCR použitím príslušných PCR primerov, ktoré obsahujú
| • ·· • · · • · | ·· • · • · | ·· • ··· | • · • • | • · • |
| • · | • · | • · | • | • |
| ······ | ·· | ·· | • · | • |
sekvencie špecifické voči nukleovej kyseline, ktorá sa má amplifikovať. Pred pripojením nukleokyselinového templátu na tuhý podklad, môže sa tento previesť do jednovláknovej formy použitím spôsobov, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe a dokumentované, napríklad zahriatím na približne 94 °C a rýchlym ochladením na 0 °C na Tade.
Oligonukleotidová šekvencia nachádzajúca sa na 5’ konci nukleovej kyseliny môže byť akákoľvek šekvencia s akoukoľvek dĺžkou a tu je označovaná ako šekvencia Y. Vhodné dĺžky a sekvencie oligonukleotidu môžu byť vybrané použitím spôsobov, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe a dokumentované. Napríklad oligonukleotidové sekvencie pripojené na oba konce nukleovej kyseliny, ktorá sa má amplifikovať, sú normálne relatívne krátke nukleotidové sekvencie s dĺžkou medzi 5 a 100 nukleotidov. Oligonukleotidová šekvencia, ktorá sa nachádza na 3’ konci nukleovej kyseliny môže byť akákoľvek šekvencia s akoukoľvek dĺžkou a tu je označovaná ako šekvencia Z. Vhodné dĺžky a sekvencie oligonukleotidu môžu byť vybrané použitím spôsobov, ktoré sú v oblasti dobre známe a dokumentované. Napríklad oligonukleotidové sekvencie nachádzajúce sa na oboch koncoch nukleovej kyseliny, ktorá sa má amplifikovať, sú normálne relatívne krátke nukleotidové sekvencie s dĺžkou medzi 5 a 100 nukleotidov.
Šekvencia oligonukleotidovej sekvencie Z je taká, aby mohla hybridizovať s jedným z kolóniových primerov X. Výhodne je šekvencia oligonukleotidu Y taká, aby bola rovnaká ako jeden z kolóniových primerov X. Výhodnejšie je oligonukleotidová šekvencia Z komplementárna s oligonukleotidovou sekvenciou Y (Y’) a kolóniové primery X majú rovnakú sekvenciu ako oligonukleotidová šekvencia Y.
Oligonukleotidové sekvencie Y a Z podľa vynálezu sa môžu pripraviť použitím štandardných a bežných techník v oblasti techniky, alebo sa môžu kúpiť z komerčných zdrojov.
Keď sa vyrábajú nukleokyselinové templáty podľa vynálezu, je možné spôsobmi dobre známymi a dokumentovanými v oblasti techniky zaviesť ďalšie želateľné sekvencie. Takéto ďalšie sekvencie zahŕňajú napríklad miesta pre reštrikčné enzýmy alebo určité nukleokyselinové prívesky, ktoré umožňujú identifikovať amplifikačné produkty danej nukleokyselinovej templátovej sekvencie. Iné želateľné sekvencie zahŕňajú fold-back DNA sekvencie (ktoré vytvárajú
-16• ·· ·· ·· · ···· · · · · · · • · · · ··· · · ·· · · · · ·· ··· ···· ·· ·· ·· · vlásenkové slučky alebo iné sekundárne štruktúry, keď sa dostanú do jednovláknovej formy), riadiace DNA sekvencie, ktoré riadia proteín/DNA interakcie, ako napríklad promótorová DNA sekvencia, ktorá je rozoznávaná nukleokyselinovou polymerázou, alebo operátorová DNA sekvencia, ktorá je rozoznávaná DNA-viažucim proteínom.
Ak sa má uskutočňovať amplifikácia viacerých rôznych nukleokyselinových sekvencii, potom sa pripájanie oligonukleotidov Y a Z môže uskutočňovať v rovnakej alebo v rôznych reakčných zmesiach.
Keď sa už pripraví nukleokyselinový templát, môže sa pred tým, ako bude použitý v spôsoboch podľa predloženého vynálezu, amplifikovať. Takáto amplifikácia sa môže uskutočňovať použitím metód, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe a dokumentované, napríklad zavedením templátovej nukleovej kyseliny do expresného vektora a jeho amplifikáciou vo vhodnou biologickom hostiteľovi, alebo amplifikáciou prostredníctvom PCR. Avšak tento amplifikačný krok nie je nevyhnutný, keďže spôsob podľa vynálezu umožňuje produkciu multikópií nukleokyselinového templátu v nukleokyselinovej kolónii generovanej z jedinej kópie nukleokyselinového templátu.
Výhodne môže byť 5’ koniec nukleokyselinového templátu pripraveného ako bolo opísané vyššie modifikovaný tak, aby niesol prostriedok na kovalentné pripojenie templátov k tuhému podkladu. Takýmto prostriedkom môže byť napríklad chemicky modifikovateľná funkčná skupina, ako napríklad fosfátová skupina, karboxylová alebo aldehydová skupina, tiolová skupina alebo aminoskupina. Najvýhodnejšie je na ô’-modifikáciu nukleovej kyseliny používaná tiolová, fosfátová alebo aminoskupina.
Kolóniové primery podľa vynálezu môžu byť pripravené použitím štandardných alebo bežných techník v oblasti techniky. Vo všeobecnosti budú kolóniové primery podľa vynálezu syntetické oligonukleotidy generované spôsobmi, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe alebo dokumentované, alebo sa môžu nakúpiť z komerčných zdrojov.
V súlade so spôsobom podľa vynálezu je možné na amplifikáciu akejkoľvek nukleokyselinovej sekvencie použiť jeden alebo dva odlišné kolóniové primery X. To je rozdiel a výhoda oproti mnohým amplifikačným metódam známym v oblasti
-17• ·· ·· ·· ·· ···· · · ··· • · · · ··· · · • · · · · · · · ··· ···· ·· ·· ·· · techniky, ako napríklad oproti spôsobu opísanému vo WO 96/04404, podľa ktorého je potrebné navrhnúť odlišné špecifické primery pre každú konkrétnu nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá sa má amplifikovať.
Výhodne sú 5’ konce kolóniových primerov X podľa vynálezu modifikované tak, že nesú prostriedok na kovalentné pripojenie kolóniových primerov na tuhý podklad. Výhodne je týmto prostriedkom na kovalentné pripojenie chemicky modifikovateľná funkčná skupina, ako bola opísaná vyššie. Ak je to želateľné, môžu byť kolóniové primery navrhnuté tak, aby obsahovali ďalšie želateľné sekvencie ako napríklad miesta pre reštrikčné endonukleázy alebo iné typy štiepnych miest, ako napríklad ribozýmové štiepne miesta. Iné želateľné sekvencie zahŕňajú fold-back DNA sekvencie (ktoré tvoria vlásenkové slučky alebo iné sekundárne štruktúry, keď sa dostanú do jednovláknovej formy), riadiace DNA sekvencie, ktoré riadia proteín/DNA interakcie, ako napríklad promótorová DNA sekvencia, ktorá je rozoznávaná nukleokyselinovou polymerázou, alebo operátorová DNA sekvencia, ktorá je rozoznávaná DNA-viažucim proteinom.
Imobilizácia kolóniového primeru X na podklade prostredníctvom 5’ konca necháva 3’ koniec primeru mimo podkladu, takže kolóniový primer je dostupný na predlžovanie reťazca polymerázou, keď sa uskutoční hybridizácia s komplementárnou oligonukleotidovou sekvenciou nachádzajúcou sa na 3’ konci nukleokyselinového templátu.
Keď sú nukleokyselinové templáty a kolóniové primery podľa vynálezu nasyntetizované, zmiešajú sa spolu v príslušných pomeroch tak, aby sa, keď sa pripoja na tuhý podklad, získali pripojené nukleokyselinové templáty a kolóniové primery s príslušnou hustotou. Výhodne je podiel kolóniových primerov v zmesi vyšší ako podiel nukleokyselinových templátov. Výhodne je pomer kolóniových primerov ku nukleokyselinovým templátom taký, že keď sa kolóniové primery a nukleokyselinové templáty imobilizujú na tuhý podklad, vytvorí sa súvislá vrstva kolóniových primerov, ktorá obsahuje množstvo rôznych kolóniových primerov, ktoré sú rozmiestnené s približne uniformnou hustotou na celom tuhom podklade alebo v ohraničenej oblasti tuhého podkladu, pričom jeden alebo viacero nukleokyselinových templátov je imobilizovaných jednotlivo s rozostupmi v súvislej vrstve kolóniových primerov.
| • | ·· | ·· | ·· | • · | |||
| ·· · · | • | • | • | • | • | ·· | |
| • | • | • | • | ··· | • | • | |
| • | • | • | • | • · | • | • | |
| ······· | ·· | · | • · | ·· |
Nukleokyselinové templáty môžu byť poskytnuté v jednovláknovej forme. Avšak môžu byť poskytnuté aj v úplne alebo v čiastočne dvojvláknovej forme, pričom môžu byť buď na jednom 5’ konci, alebo na oboch 5’ koncoch modifikované tak, aby bolo umožnené pripojenie na podklad. V takom prípade je po ukončení pripájaceho procesu možné chcieť rozdeliť vlákna prostriedkom známym v oblasti techniky, napr. zahriatím na 94 °C, pred tým, ako sa uvoľnené vlákna odmyjú. Bude zrejmé, že v prípade, kedy obe vlákna dvojvláknových molekúl zreagujú s povrchom a obe budú pripojené, bude výsledok rovnaký ako v prípade, keď je pripojené len jedno vlákno a uskutočnil sa jeden amplifikačný krok. Inými slovami, v prípade, keď sa pripoja obe vlákna dvojvláknovej templátovej nukleovej kyseliny, sú nevyhnutne obe vlákna pripojené tesne pri sebe a nie sú rozoznateľné od výsledku pripojenia len jedného vlákna a uskutočnenia jedného amplifikačného kroku. Takže na poskytnutie templátových nukleových kyselín pripojených k povrchu a vhodných na generovanie kolónií je možné použiť jednovláknové a dvojvláknové templátové nukleové kyseliny.
Vzdialenosť medzi jednotlivými kolóniovými primermi a jednotlivými nukleokyselinovými templátmi (a teda hustota kolóniových primerov a nukleokyselinových templátov) sa môže kontrolovať menením koncentrácie kolóniových primerov a nukleokyselinových templátov, ktoré sú imobilizované na podklade. Výhodná hustota kolóniových primerov je najmenej 1 fmol/mm2, výhodne najmenej 10 fmol/mm2, výhodnejšie medzi 30 a 60 fmol/mm2. Hustota nukleokyselinových templátov na použitie v spôsobe podľa vynálezu je typicky 10000/mm2 až 100000/mm2. Verí sa, že je možné dosiahnuť vyššie hustoty, napríklad 100000/ mm2 až 1000000/ mm2 a 1000000/ mm2 až 10000000/ mm2.
Kontrolovanie hustoty pripojených nukleokyselinových templátov a kolóniových primerov na druhej strane umožňuje kontrolovať konečnú hustotu nukleokyselinových kolónií na povrchu podkladu. To je možné vďaka skutočnosti, že v súlade so spôsobom podľa vynálezu môže byť jedna nukleokyselinová kolónia výsledkom pripojenia jedného nukleokyselinového templátu za predpokladu, že kolóniové primery podľa vynálezu sa nachádzajú na vhodnom mieste na tuhom podklade (podrobnejšie pozri nižšie). Možné je kontrolovať aj hustotu molekúl • ·· ·· · ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · ··· · · • · ·· ·· ··· · ·· ···· · · ··· ···· ·· ·· ·· ·
-19nukleových kyselín v jednej kolónii prostredníctvom kontrolovania hustoty pripojených kolóniových primérov.
Keď sú už kolóniové primery a nukleokyselinové templáty podľa vynálezu imobilizované na tuhom podklade s vhodnou hustotou, je možné generovať nukleokyselinové kolónie podľa vynálezu uskutočňovaním príslušného počtu cyklov amplifikácie kovalentne naviazanej templátovej nukleovej kyseliny, aby každá kolónia obsahovala množstvo kópií pôvodne imobilizovaného nukleokyselinového templátu a jeho komplementárnej sekvencie. Jeden cyklus amplifikácie pozostáva z hybridizačného, predlžovacieho a denaturačného kroku a tieto kroky sa vo všeobecnosti uskutočňujú použitím reakčných činidiel a podmienok, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe pre PCR.
Typická amplifikačná reakcia zahŕňa podrobenie sa tuhého podkladu a pripojeného nukleokyselinového templátu a kolóniových primérov podmienkam, ktoré indukujú hybridizáciu primérov, napríklad tým, že sa na nich pôsobí teplotou približne 65 °C. V týchto podmienkach bude oligonukleotidová sekvencia Z na 3' konci nukleokyselinového templátu hybridizovať s imobilizovaným kolóniovým primerom X a v podmienkach a s reakčnými činidlami, ktoré sú potrebné na predlžovanie priméru, napríklad teplota okolo 72 °C, prítomnosť nukleokyselinovej polymerázy, napríklad DNA závislej DNA polymerázy alebo reverznej transkriptázovej molekuly (tzn. RNA závislej DNA polymerázy) alebo RNA polymerázy, spolu s poskytnutím nukleozidtrifosfátových molekúl alebo akýchkoľvek iných nukleotidových prekurzorov, napríklad modifikovaných nukleozidtrifosfátových molekúl, sa bude kolóniový primér predlžovať pridávaním nukleotidov, ktoré sú komplementárne so sekvenciou templátovej nukleovej kyseliny.
Príkladmi nukleokyselinových polymeráz, ktoré môžu byť použité v predloženom vynáleze sú DNA polymeráza (Klenowov fragment, T4 DNA polymeráza), DNA polymerázy stabilné pri vysokých teplotách z rôznych termostabilných baktérií (ako napríklad Taq, VENT, Pfu, Tfl DNA polymerázy), ako aj ich geneticky modifikované deriváty (TaqGold, VENTexo, Pfu exo). Na generovanie amplifikácie DNA kolónie môže byť použitá aj kombinácia RNA polymerázy a reverznej transkriptázy. Výhodne je nukleokyselinová polymeráza používaná na predlžovanie kolóniového primera stabilná pri PCR reakčných • · ·
-20• · • · • ···· ·· ·· • · · • · ··· • · · • · · · ·· ·· • · ·· · podmienkach, tzn. opakovaných cykloch zahrievania a ochladzovania, a je stabilná pri používanej denaturačnej teplote, zvyčajne približne pri 94 °C. Výhodne používanou DNA polymerázou je Taq DNA polymeráza.
Výhodne sa ako nukleozidtrifosfátové molekuly používajú deoxyribonukleotidtrifosfáty, napríklad dATP, dTTP, dCTP, dGTP, alebo ribonukleozidtrifosfáty, napríklad dATP, dUTP, dCTP, dGTP. Nukleozidtrifosfátovými molekulami môžu byť prirodzene sa vyskytujúce molekuly alebo iné ako prirodzene sa vyskytujúce molekuly.
Po hybridizačnom a predlžovacom kroku a potom ako sa na podklad a pripojené nukleové kyseliny bude pôsobiť denaturačnými podmienkami, budú prítomné dve imobilizované nukleové kyseliny, prvou bude počiatočný imobilizovaný nukleovokyselinový templát a druhou bude k nemu komplementárna nukleová kyselina, ktorá vznikla predĺžením z jedného z imobilizovaných kolóniových primerov X. Tak pôvodný imobilizovaný nukleovokyselinový templát, ako aj vytvorený imobilizovaný predĺžený kolóniový primér, sú potom schopné Iniciovať ďalšie kolá amplifikácie, tým, že sa podklad podrobí ďalším cyklom hybridizácie, predlžovania a denaturácie. Výsledkom takýchto ďalších kôl amplifikácie bude nukleokyselinová kolónia obsahujúca množstvo imobilizovaných kópií templátovej nukleovej kyseliny a jej komplementárnej sekvencie.
Počiatočná imobilizácia templátovej nukleovej kyseliny znamená, že templátová nukleová kyselina môže hybridizovať len s kolóniovými primermi umiestnenými vo vzdialenosti, ktorá je menšia ako celková dĺžka templátovej nukleovej kyseliny. Takže hranica vytváranej nukleokyselinovej kolónie je obmedzená na relatívne lokálnu oblasť, na oblasť, v ktorej bola imobilizovaná počiatočná templátová nukleová kyselina. Je zrejmé, že keď sa už nasyntetizuje viac kópií templátovej molekuly a jej komplementu prostredníctvom uskutočnenia ďalších kôl amplifikácie, tzn. ďalších kôl hybridizácie, predlžovania a denaturácie, potom bude hranica generovanej nukleokyselinovej kolónie schopná ďalej sa predlžovať, hoci hranica vytvorenej kolónie bude stále obmedzená na relatívne lokálnu oblasť, na oblasť, v ktorej bol imobilizovaný počiatočný nukleokyselinový templát.
-21 ·· ·· • · · • · ··· • · · β • · · a ·· ··
Schematické znázornenie spôsobu generovania nukleokyselinovej kolónie podľa uskutočnenia predloženého vynálezu je znázornené na obrázku 1. Obrázok 1 (a) znázorňuje kolóniový primer X podľa vynálezu (tu znázornený ako primer so sekvenciou ATT) a nukleokyselinový templát podľa vynálezu obsahujúci na 5’ konci oligonukleotidovú sekvenciu Y, tu znázornenú ako ATT, a na 3’ konci oligonukleotidovú sekvenciu Z, tu znázornenú ako AAT, ktorá môže hybridizovať so sekvenciou kolóniového primera X. Na schematickom vyobrazení sú kolóniový primer X a oligonukleotidové sekvencie Y a Z znázornené s dĺžkou len tri nukleotidy. Avšak v praxi bude zrejmé, že je možné normálne používať dlhšie sekvencie. 5’ koniec tak kolóniového primeru, ako aj nukleokyselinového templát u, nesie prostriedok na pripojenie nukleovej kyseliny k tuhému podkladu. Tento prostriedok je na obrázku 1 vyznačený ako čierny štvorec. Tento prostriedok na pripojenie môže viesť ku kovalentnému alebo nekovalentnému pripojeniu.
Na obrázku 1 (a) je kvôli jednoduchosti znázornený len jeden kolóniový primer X a jedna templátová nukleová kyselina. Avšak v praxi bude prítomných množstvo kolóniových primerov X spolu s množstvom nukleokyselinových templátov. Množstvo kolóniových primerov X môže zahŕňať dva odlišné kolóniové primery X. Avšak kvôli jednoduchosti schematické vyobrazenie na obrázku 1 znázorňuje len jeden typ kolóniového primera X so sekvenciou ATT. Množstvo nukleokyselinových templátov môže obsahovať odlišné nukleokyselinové sekvencie v centrálnej časti medzi oligonukleotidmi Y a Z, ale obsahuje rovnaké oligonukleotidové sekvencie Y a Z na 5’, respektíve 3' koncoch. Kvôli jednoduchosti je na obrázku 1 znázornený len jeden druh nukleokyselinového templátu, v ktorom je sekvencia v centrálnej časti označená ako CGG.
V prítomnosti tuhého podkladu sa 5’ konce tak nukleokyselinového templátu, ako aj kolóniového primera, viažu na podklad. To je znázornené na obrázku 1(b). Na podklad a na pripojený nukleokyselinový templát a na kolóniové primery sa potom pôsobí podmienkami, ktoré indukujú hybridizáciu primeru. Obrázok 1(c) znázorňuje nukleokyselinový templát, ktorý hybridizoval s kolóniovým primérom. Takáto hybridizácia je umožnená skutočnosťou, že oligonukleotidová sekvencia Z na 3’ konci nukleokyselinového templátu môže hybridizovať s kolóniovým primérom. Na schematickom vyobrazení je oligonukleotidová sekvencia Z znázornená ako ·· • ·· ·· «· ·· · · · · · • · · · ··· • · ·· ·· · · ··· ···· *<β·
-22komplementárna s kolóniovým primerom, hoci v praxi nie je nevyhnutná presná komplementárna sekvencia, za predpokladu, že v podmienkach, ktorým sú vystavené nukleokyselinové templáty a kolóniové primery, hybridizácia môže nastať.
Obrázok 1(d) znázorňuje štádium predlžovania primeru. Tu, pri vhodných teplotných podmienkach a prítomnosti DNA polymerázy a po dodaní nukleotidových prekurzorov, napríklad dATP, dTTP, dCTP a dGTP, predlžuje DNA polymeráza kolóniový primer z jeho 3’ konca použitím nukleokyselinového templátu ako templátu. Keď sa ukončí predlžovanie primera, pozri 1(e), je zrejmé, že sa vygenerovalo druhé imobilizované nukleokyselinové vlákno, ktoré je komplementárne s počiatočným nukleokyselinovým templátom. Po oddelení dvoch nukleokyselinových vlákien, napríklad zahriatím, budú prítomné dve imobilizované nukleové kyseliny, prvou bude počiatočný imobilizovaný nukleokyselinový templát a druhou bude jeho komplementárna nukleová kyselina, ktorá vznikla predĺžením jedného z imobilizovaných kolóniových primerov X, pozri obrázok 1(f).
Tak pôvodný imobilizovaný nukleokyselinový templát, ako aj vytvorený imobilizovaný predĺžený kolóniový primer, sú potom schopné hybridizovať s inými prítomnými kolóniovými primermi (znázornené ako kolóniové primery 2 a 3 na obrázku 1(g)) a po ďalšom kole predlžovania primeru (obrázok 1(h)) a oddelenia vlákien (obrázok 1 (i)), vzniknú štyri jednovláknové imobilizované nukleové kyseliny. Dve z nich obsahujú sekvenciu zodpovedajúcu pôvodnému nukleokyselinovému templátu a dve obsahujú komplementárnu sekvenciu.
Môžu sa uskutočňovať ďalšie kolá amplifikácie po kolách znázornených na obrázku 1, ktorých výsledkom je nukleokyselinová kolónia obsahujúca množstvo imobilizovaných kópií templátovej nukleovej kyseliny a jej komplementárnej sekvencie.
Takže je zrejmé, že spôsob podľa predloženého vynálezu umožňuje generovanie nukleokyselinovej kolónie z jediného imobilizovaného nukleokyselinového templátu, a že veľkosť týchto kolónií sa môže kontrolovať menením počtu kôl amplifikácie, ktorým sa podrobí nukleokyselinový templát. Takže množstvo nukleokyselinových kolónií vytvorených na povrchu tuhého podkladu závisí na množstve nukleokyselinových templátov, ktoré sa na začiatku imobilizujú na
-23podklade za predpokladu, že je dostatočné množstvo imobilizovaných kolóniových primerov v lokalite každého imobilizovaného nukleokyselinového templátu. Z toho dôvodu je výhodný tuhý podklad, na ktorom sú imobilizované kolóniové primery a nukleokyselinové templáty tak, že zahŕňa súvislú vrstvu imobilizovaných kolóniových primerov s vhodnou hustotou a s nukleokyselinovými templátmi imobilizovaných s určitými rozostupmi v súvislej vrstve primerov.
Takéto takzvané autošablónovanie nukleokyselinových kolónií má výhodu oproti mnohým spôsobom doterajšieho stavu techniky v tom, že je možné získať vyššiu hustotu nukleokyselinových kolónií vďaka skutočnosti, že hustota môže byť kontrolovaná regulovaním hustoty pôvodne imobilizovaných nukleokyselinových templátov. Takže takýto spôsob nie je obmedzený napríklad tým, že má špecificky zoskupené primery v konkrétnych lokálnych oblastiach podkladu a potom sa iniciuje vytváranie kolónií presným umiestňovaním konkrétnej vzorky obsahujúcej nukleokyselinový templát do tej istej lokálnej oblasti primeru. Počet kolónií, ktoré je možné zoskupiť použitím spôsobov podía doterajšieho stavu techniky, napríklad spôsobu opísaného vo WO 96/04404 (Mosaic Technologies, Inc.), je tak obmedzený hustotou/rozmiestnením, s akou je možné zoskupiť špecifické primerové oblasti v počiatočnom kroku.
Tým, že je možné kontrolovať počiatočnú hustotu nukleokyselinových templátov a tým hustotu nukleokyselinových kolónií, ktoré sú výsledkom nukleokyselinových templátov, spolu s možnosťou kontrolovať veľkosť vytváraných nukleokyselinových kolónií a okrem toho tým, že je možné kontrolovať hustotu nukleokyselinových templátov v jednotlivých kolóniách, je možné dosiahnuť optimálnu situáciu, kedy je možné vyprodukovať vysokú hustotu jednotlivých nukleokyselinových kolónií na tuhom podklade s dostatočnou veľkosťou a obsahujúce dostatočne veľký počet amplifikovaných sekvencií, aby bolo možné uskutočňovanie následnej analýzy a monitoringu nukleokyselinových kolónií.
Keď sa už vygenerujú nukleokyselinové kolónie, môže byť želateľné uskutočniť ďalší krok, ako napríklad vizualizáciu kolónií alebo stanovenie sekvencie (pozri nižšie). Vizualizácia kolónií môže byť potrebná napríklad, ak je nevyhnutné skrínovať vygenerované kolónie z hľadiska prítomnosti alebo absencie napríklad celého alebo časti konkrétneho nukleokyselinového fragmentu. V takom prípade by
• ··· • · · • · · • · • ·
-24sa kolónia alebo kolónie, ktoré obsahujú konkrétny nukleokyselinový fragment mohli detegovať navrhnutím nukleokyselinovej sondy, ktorá špecificky hybridizuje s nukleokyselinovým fragmentom, o ktorý je záujem.
Takáto nukleokyselinová sonda je výhodne značená detegovatefnou entitou, ako napríklad fluorescenčnou skupinou, entitou obsahujúcou biotín (ktorá môže byť detegovaná napríklad inkubovaním so streptavidínom označeným s fluorescenčnou skupinou), rádioaktívnou značkou (ktorá môže byť začlenená do nukleokyselinovej sondy spôsobmi, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe a dokumentované, a môže byť detegovaná detegovaním rádioaktivity, napríklad inkubovaním so scintilačnou kvapalinou), alebo nukleokyselinová sonda môže byť farbená iným farbiacim činidlom.
Alternatívne môže byť takáto nukleokyselinová sonda neznačená a môže byť navrhnutá tak, aby slúžila ako primer na začlenenie určitého počtu značených nukleotidov nukleokyselinovou polymerázou. Potom sa môže uskutočniť detekcia zavedenej značky a tým aj nukleokyselinových kolónií.
Nukleokyselinové kolónie podľa vynálezu sa potom pripravia na hybridizáciu. Takáto príprava zahŕňa ošetrenie kolónií tak, aby sa všetky alebo časť nukleokyselinových templátov, ktoré tvoria kolónie nachádzali v jednovláknovej forme. To je možné dosiahnuť napríklad tepelnou denaturáciou akejkoľvek dvojvláknovej DNA v kolóniách. Alternatívne sa na kolónie môže pôsobiť reštrikčnou endonukleázou, ktorá je špecifická pre dvojvláknovú formu sekvencie v templátovej nukleovej kyseline. Takže endonukleáza môže byť špecifická buď pre sekvenciu nachádzajúcu sa v oligonukleotide Y alebo Z, alebo pre inú sekvenciu, ktorá sa nachádza v templátovej nukleovej kyseline. Po poštiepení sa kolónie zahrejú tak, aby sa oddelili dvojvlákové DNA molekúl, a kolónie sa premyjú, aby sa odstránili neimobilizované vlákna, a v kolóniách tak ostali len pripojené jednovláknové DNA.
Po pripravení kolónií na hybridizáciu sa k nim pridá značená alebo neznačená sonda v podmienkach, ktoré sú vhodné na hybridizáciu sondy s jej špecifickou DNA sekvenciou. Takéto podmienky je schopný priemerný odborník v oblasti stanoviť použitím známych metód a budú závisieť napríklad na sekvencii sondy.
-25··· ···· ·· ·* • · · • · ··· • · · · · • · · · ·· ··
Sonda sa potom môže odstrániť tepelnou denaturáciou, a ak je to želateľné, môže sa hybridizovať a detegovať sonda špecifická pre druhú nukleovú kyselinu. Tieto kroky sa môžu opakovať toľko krát, koľko krát je to želateľné.
Značené sondy, ktoré hybridizovali s nukleokyselinovými kolóniami, sa potom môžu detegovať použitím prístroja, ktorý obsahuje príslušné detekčné zariadenie. Výhodným detekčným systémom na fluorescenčné značenia je fotoaparát spojený s nábojovým zariadením (CCD), ktorý môže byť voliteľne spojený so zväčšovacím zariadením, napríklad mikroskopom. Použitím takejto technológie je možné simultánne paralelne monitorovať kolónie. Napríklad použitím mikroskopu s CCD fotoaparátom a 10x alebo 20x objektívom je možné pozorovať kolónie na povrchu s veľkosťou 1 mm2 a 4 mm2, čo zodpovedá paralelnému monitoringu 10000 až 200000 kolónií. Navyše je zrejmé, že tento počet sa bude zvyšovať so zlepšovaním optických prístrojov a so zväčšovaním čipov.
Alternatívnym spôsobom monitorovania vygenerovaných kolónií je skenovanie povrchu pokrytého kolóniami. Je napríklad možné použiť systém, v ktorom by bolo možné simultánne zoskupiť a monitorovať do 100 000 000 kolónií, tým, že by sa fotil CCD fotoaparátom celý povrch. Je možné vidieť, že týmto spôsobom by bolo možné v krátkom čase monitorovať do 100000000 kolónií.
Na monitorovanie nukleokyselinových kolónií podľa vynálezu môžu byť použité akékoľvek iné zariadenia umožňujúce detekciu a výhodne kvantifikáciu fluorescencie na povrchu. Použité by mohli byť napríklad prístroje vytvárajúce fluorescenčné obrazy alebo konfokálne mikroskopy.
Ak sú značky rádioaktívne, potom by bol potrebný systém na detekciu rádioaktivity.
V spôsoboch podľa predloženého vynálezu, v ktorých sa uskutočňuje ďalší krok, pričom ide o najmenej jeden krok stanovovania sekvencie najmenej jednej z vygenerovaných nukleokyselinových kolónií, môže sa stanovovanie sekvencie uskutočňovať použitím akejkoľvek vhodnej sekvenačnej techniky na tuhej fáze. Napríklad, jedna technika stanovovania sekvencie, ktorá môže byť používaná v predloženom vynáleze, zahŕňa hybridizáciu príslušného primera, tu niekedy označovaného ako sekvenačný primer, s nukleokyselinovým templátom, ktorý sa má sekvenovať, predlžovanie primeru a detekciu nukleozidov použitých na • · • ···
-26predĺženie primera. Výhodne sa nukleová kyselina používaná na predlžovanie priméru deteguje pred tým, ako sa pridá ďalší nukleotid do rastúceho nukleokyselinového reťazca, čo umožňuje in situ sekvenovanie nukleovej kyseliny po jednotlivých bázach.
Detekcia začlenených nukleotidov sa uľahčuje zavedením jedného alebo viacerých značených nukleotidov do primerovej predlžovacej reakcie. Použiť sa môže akákoľvek vhodná detekovateľná značka, napríklad, fluorofór, rádioaktívna značka atď.. Výhodne sa používa fluorescenčná značka. Pre každý odlišný typ nukleotidu môžu byť použité rovnaké alebo odlišné značky. Tam, kde je použitou značkou fluorofór, a kde sa používajú pre každý odlišný typ nukleotidu rovnaké značky, môže každé začlenenie nukleotidu poskytnúť kumulatívne zvýšenie detegovaného signálu pri konkrétnej vlnovej dĺžke. Ak sa použijú odlišné značky, potom sa tieto signály môžu detegovať pri odlišných príslušných vlnových dĺžkach. Ak je to želateľné, poskytne sa zmes značených a neznačených nukleotidov.
Aby sa umožnila hybridizácia príslušného sekvenačného primera s nukleokyselinovým templátom, ktorý sa má sekvenovať, mal by normálne byť nukleokyselinový templát v jednovláknovej forme. Ak sa nukleokyselinové templáty vytvárajúce nukleokyselinové kolónie nachádzajú v dvojvláknovej forme, môžu sa spracovať tak, aby poskytli jednovláknové nukleokyselinové templáty použitím metód, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe, napríklad denaturáciou, štiepením, atď..
Sekvenačné priméry, ktoré hybridizujú s nukleokyselinovým templátom, a ktoré sa používajú na predlžovanie primera, sú výhodne krátke oligonukleotidy, napríklad oligonukleotidy dlhé 15 až 25 nukleotidov. Sekvencia primérov je navrhnutá tak, aby hybridizovali s časťou nukleokyselinového templátu, ktorý sa má sekvenovať, výhodne v prísnych podmienkach. Sekvencia primérov používaných na sekvenovanie môže byť rovnaká alebo podobná ako sekvencia kolóniových primérov používaných na generovanie nukleokyselinových kolónií podľa vynálezu. Sekvenačné priméry môžu byť poskytnuté v roztoku alebo v imobilizovanej forme.
Keď sekvenačný primer naaneluje na nukleokyselinový templát, ktorý sa má sekvenovať, tým že sa nukleokyselinový templát a sekvenačný primer vystavia príslušným podmienkam stanoveným spôsobmi, ktoré sú v oblasti techniky dobre známe, uskutočňuje sa predlžovanie priméru, napríklad použitím nukleokyselinovej » · ··· » · · 4 · · 4 ·· ··
-27• ·· ·· · · • · • · • · ··· ···· polymerázy a dodaním nukleotidov, z ktorých aspoň niektoré sú poskytnuté v značenej forme, pričom ak je poskytnutý vhodný nukleotid, podmienky sú vhodné na predlžovanie priméru. Príklady nukleokyselinových polymeráz a nukleotidov, ktoré môžu byť použité, sú uvedené vyššie.
Výhodne sa po každom primerovom predlžovacom kroku uskutočňuje premývací krok, aby sa odstránili nezačlenené nukleotidy, ktoré môžu interferovať s následnými krokmi. Keď sa už uskutoční primerový predlžovací krok, monitoruje sa nukleokyselinová kolónia, aby sa stanovilo, či sa značený nukleotid začlenil do predlžovaného primera. Primerový predlžovací krok sa potom môže opakovať, aby sa stanovil ďalší a následné nukleotidy začleňované do predlžujúceho sa primera.
Na stanovenie sekvencie môže byť použité akékoľvek zariadenie umožňujúce detekciu a výhodne kvantifikáciu príslušnej značky, napríklad fluorescencie alebo rádioaktivity. Ak je značkou fluorescenčná látka, je možné použiť CCD fotoaparát voliteľne pripojený na zväčšovacie zariadenie (ako bolo opísané vyššie). V skutočnosti môžu byť zariadeniami používanými na stanovovanie sekvencií v uskutočneniach podľa predloženého vynálezu rovnaké zariadenia, ako boli opísané vyššie na monitorovanie amplifikovaných nukleokyselinových kolónií.
Detekčný systém je výhodne používaný v kombinácii s analytickým systémom, aby sa stanovil počet a povaha nukleotidov začleňovaných do každej kolónie po každom kroku predlžovania priméru. Táto analýza, ktorá sa môže uskutočňovať okamžite po každom primerovom predlžovacom kroku alebo neskoršie použitím zaznamenaných údajov, umožňuje stanoviť sekvenciu nukleokyselinového templátu v danej kolónii.
Ak je sekvencia, ktorá sa má stanoviť neznáma, nukleotidy aplikované na danú kolóniu sa zvyčajne aplikujú vo zvolenom poradí, ktoré sa potom opakuje počas celej analýzy, napríklad dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Ak je však sekvencia, ktorá sa má stanoviť, známa a presekvenúvava sa, napríklad, aby sa analyzovalo, či sú alebo nie sú prítomné malé odlišnosti v danej sekvencii oproti známej sekvencii, môže sa proces stanovovania sekvencie urýchliť pridávaním nukleotidov v každom kroku v príslušnom poradí, ktoré je zvolené na základe známej sekvencie. Rozdiely oproti známej sekvencii sa tak detegujú tým, že určité nukleotidy sa nezačlenia v konkrétnych štádiách primerového predlžovania.
··
-28Takže je možné vidieť, že použitím spôsobov podľa predloženého vynálezu je možné stanoviť celkové alebo čiastočné sekvencie amplifikovaných nukleokyselinových templátov tvoriacich konkrétne nukleokyselinové kolónie.
V ďalšom uskutočnení predloženého vynálezu je možné stanoviť celkovú alebo čiastočnú sekvenciu viac ako jednej nukleovej kyseliny stanovením celkovej alebo čiastočnej sekvencie amplifikovaných nukleokyselinových templátov nachádzajúcich sa vo viac ako jednej nukleokyselinovej kolónii. Výhodne sa stanovuje simultánne viacero sekvencií.
Uskutočňovanie stanovovania sekvencie nukleových kyselín použitím spôsobu podľa predloženého vynálezu má výhodu v tom, že je pravdepodobne veľmi spoľahlivé vďaka skutočnosti, že vo vnútri každej nukleokyselinovej kolónie podľa vynálezu je poskytnuté na sekvenovanie veľké množstvo z každej nukleovej kyseliny. Ak je to želateľné, je možné získať ďalšie zlepšenie spoľahlivosti poskytnutím viacerých nukleokyselinových kolónií, ktoré obsahujú rovnaké nukleokyselinové templáty na sekvenovanie, a potom stanovením sekvencie pre každú z viacerých kolónií a porovnaním takto stanovených sekvencií.
Výhodne je pripojenie kolóniového primera a nukleokyselinového templátu na tuhý podklad termostabilné pri teplote, ktorej môže byť podklad vystavený počas nukleokyselinovej amplifikačnej reakcie, napríklad pri teplotách do približne 100 °C, napríklad približne 94 °C. Výhodne má pripojenie kovalentnú povahu.
V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu je kovalentné pripájanie kolóniových primerov a nukleokyselinového templátu (templátov) na tuhý podklad indukované kroslinkerovým činidlom, napríklad hydrochloridom 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC), anhydridom kyseliny vínnej, fenyldiizotiokyanátom alebo anhydridom kyseliny maleínovej, alebo hetero-bifunkčnými kroslinkermi, ako napríklad esterom m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidu (MBS), Nsukcinimidyl-[4-jódacetyl]aminobenzoátom (SIAB), sukcinimidyl-4-[A/-maleimidometyl]cyklohexán-1-karboxylátom (SMCC), esterom /V-y-maleimidobutyryloxysukcinimidu (GMBS), sukcinimidyl-4-[p-maleimidofenyl]butyrátom (SMPB) a zodpovedajúcimi sulfónovými (vo vode rozpustnými) zlúčeninami. Výhodnými kroslinkermi na použitie v predloženom vynáleze sú s-SIAB, s-MBS a EDC.
·· ·· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··
-29• ·· ·· · · • · • · ·· ···· ·· ·
V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu sú na povrchu podkladu vytvorené deriváty. V ešte ďalšom uskutočnení sa deriváty na povrchu tuhého podkladu následne modifikujú bifunkčnými krížové väzby vytvárajúcimi skupinami, aby sa poskytol funkcionalizovaný povrch, výhodne s reaktívnymi skupinami vytvárajúcimi krížové väzby.
Tak ako je používaný tu, znamená výraz deriváty na povrchu, povrch, ktorý bol modifikovaný chemicky reaktívnymi skupinami, napríklad aminoskupinami, tiololovými alebo akrylátovými skupinami.
Tak ako je používaný tu, znamená výraz funkcionalizovaný povrch povrch s derivátmi, ktoré boli modifikované so špecifickými funkčnými skupinami, napríklad maleínovými alebo vínnymi funkčnými skupinami.
Na to, aby bol spôsob podľa predloženého vynálezu užitočný na určité aplikácie, musí pripojenie kolóniových primérov a nukleokyselinových templátov na tuhý podklad spĺňať niekoľko požiadaviek. Ideálne pripojenie by nemalo byť ovplyvňované ani vystavením vysokým teplotám, ani opakovaním cyklov zahrievania a ochladzovania používaných počas procedúry amplifikácie nukleových kyselín. Okrem toho by mal podklad umožniť získanie hustoty pripojených kolóniových primérov najmenej 1 fmol/mm2, výhodne najmenej 10 fmol/mm2, výhodnejšie medzi 30 a 60 fmol/mm2. Ideálny podklad by mal mať uniformné plochý povrch s nízkym fluorescenčným pozadím, a mal by byť aj stabilný pri vysokých teplotách (nedeformovateľný). Tuhé podklady, ktoré umožňujú pasívnu adsorpciu DNA, ako určité typy plastov a syntetických nitrocelulózových membrán, nie sú vhodné. Nakoniec, tuhý podklad by mal byť jednorazový, takže by nemal byť drahý.
Z týchto dôvodov, hoci tuhým podkladom môže byť akýkoľvek tuhý povrch, na ktorý je možné pripojiť nukleové kyseliny, ako napríklad latexové guľôčky, dextránové guľôčky, polystyrén, polypropylénový povrch, polyakrylamidový gél, zlaté povrchy, sklenené povrchy a silikónové membrány, výhodným tuhým podkladom je sklenený povrch a pripojenie nukleových kyselín na neho je kovalentné.
Kovalentné pripojenie kolóniových primérov a nukleokyselinových templátov na tuhý podklad sa môže uskutočňovať použitím techník, ktoré sú v oblasti známe a dokumentované. Napríklad, epoxysilán-aminové kovalentné pripojenie oligo-nukleo• ·<
• ·
-30tidov na tuhé podklady, ako napríklad porézne sklenené guľôčky, sa vo veľkej miere používalo na in situ syntézu oligonukleotidov na tuhej fáze (prostredníctvom pripojenia 3’ konca) a adaptovalo sa aj na pripojenie oligonukleotidu 5’ koncom. Oligonukleotidy modifikované na 5’ konci karboxylovou alebo aldehydovou skupinou sa kovalentne pripájali na hydrazínom derivatizované latexové guľôčky (Kremsky a ďalší, 1987).
Iné prístupy na pripájanie oligonukleotidov na tuhé povrchy využívajú kroslinkery, ako napríklad anhydrid kyseliny vínnej, fenyldiizotiokyanát (Guo a ďalší, 1994) alebo anhydrid kyseliny maleínovej (Yang a ďalší, 1998). Iným široko používaným kroslinkerom je hydrochlorid 1-etyl-3-(3-dimetylamonipropyl)-karbodiimidu (EDC). Chemické použitie EDC prvý krát opísal Gilham a ďalší (1968), ktorý pripojil DNA templáty na papier (celulózu) prostredníctvom 5’ koncovej fosfátovej skupiny. S využitím EDC boli použité iné podklady, ako napríklad latexové guľôčky (Wolf a ďalší, 1987, Lund a ďalší, 1988), polystyrénové mikronádobky (Rasmussen a ďalší, 1991), sklo s kontrolovanou veľkosťou pórov (Ghosh a ďalší, 1987) a dextránové molekuly (Gingeras a ďalší, 1987). Kondenzácia 5’ amino-modifikovaných oligonukleotidov s karbodiimidovým sprostredkovacím činidlom bola opísaná v Chu a ďalší (1983) a v Egan a ďalší (1982) pre 5' koncovú fosfátovú modifikačnú skupinu.
Výťažok oligonukleotidového pripojenia prostredníctvom 5’ konca použitím karbodiimídov môže dosiahnuť 60 %, ale hlavnou brzdou je nešpecifické pripájanie prostredníctvom vnútorných nukleotidov oligonukleotidu. Rasmussen a ďalší (1991) zvýšili špecifické pripájanie cez 5’ koniec na 85 % prostredníctvom vytvorenia derivátov na povrchu použitím sekundárnych aminoskupín.
Novšie články publikovali výhody hetero-bifunkčných kroslinkerov. Heteroalebo mono-bifunkčné kroslinkery sa široko používali na prípravu peptidových nosičových konjugátových molekúl (peptid-proteín), aby sa zvýšila imunogénnosť v živočíchoch (Peeters a ďalší 1989). Publikovalo sa, že väčšina týchto zaštepovacích reakčných činidiel vytvára stabilné kovalentné väzby vo vodnom roztoku. Tieto kroslinkerové reakčné činidlá boli používané na pripájanie DNA na tuhý podklad len v jednom mieste molekuly.
• · ··· • · · · • · · 9 ·· ··
-31 • *· ·· · · ·· ·· ·· · t···
Chrisey a ďalší (1996) študovali účinnosť a stabilitu pripájania DNA v tuhej fáze použitím 6 odlišných hetero-bifunkčných kroslinkerov. V tomto príklade nastalo pripojenie len na 5’ konci DNA oligomérov modifikovaných tiolovou skupinou. Tento typ pripojenia bol opísaný aj v O’Donnell-Maloney a ďalší (1996) na pripojenie DNA cieľov v MALDI-TOF sekvenčnej analýze a Hamamatsu Photonics F.K. spoločnosťou (EP-A-665293) na stanovenie sekvencie báz nukleovej kyseliny na tuhom povrchu.
Uskutočnilo sa len veľmi málo štúdií týkajúcich sa tepelnej stability pripojenia oligonukleotidov na tuhý podklad. Chrisey a ďalší (1996) publikovali, že so sukcinimidyl-4-jp-maleimidofenyljbutyrátovým (SMPB) kroslinkerom sa počas zahrievania uvoľní takmer 60 % molekúl. Ale tepelná stabilita iných reakčných činidiel ešte nebola opísaná.
Aby sa generovali nukleokyselinové kolónie prostredníctvom amplifikačnej reakcie na tuhej fáze ako je opísaná v predloženej prihláške, musia byť kolóniové primery a nukleokyselinové templáty špecificky pripojené na svojich 5’ koncoch na tuhý povrch, výhodne sklo. V stručnosti, na sklenenom povrchu je možné vytvoriť deriváty s reaktívnymi aminoskupinami silanizáciou použitím amino-alkoxy silánov. Vhodné silánové reakčné činidlá zahŕňajú aminopropyltrimetoxysilán, aminopropyltrietoxysilán a 4-aminobutyltrietoxysilán. Na sklenených povrchoch sa môžu vytvoriť deriváty aj s inými reaktívnymi skupinami, ako napríklad akrylátom alebo epoxyskupinou použitím epoxysilánu, akrylátsilánu a akrylamidsilánu. Po kroku vytvorenia derivátov sa nukleokyselinové molekuly (kolóniové primery alebo nukleokyselinové templáty), ktoré majú chemicky modifikovateľnú funkčnú skupinu na svojom 5’ konci, napríklad fosfátovú, tiolovú alebo aminoskupinu, kovalentne pripoja na derivatizovaný povrch prostredníctvom kroslinkerového reakčného činidla, ako bolo opísané vyššie.
Alternatívne môže po derivatizačnom kroku nasledovať pripojenie bifunkčného kroslinkerového činidla na povrchové aminoskupiny, čím sa poskytne modifikovaný funkcionalizovaný povrch. Nukleokyselinové molekuly (kolóniové primery alebo nukleokyselinové templáty) majúce 5’-fosfátovú, tiolovú alebo aminoskupiny potom reagujú s funkcionalizovaným povrchom a vytvárajú kovalentnú väzbu medzi nukleovou kyselinou a sklom.
I
-32Potenciálne kroslinkerové a prichytávacie reakčné činidlá, ktoré môžu byť použité na kovalentné pripojenie DNA/oligonukleotidu na tuhý podklad zahŕňajú anhydrid kyseliny vínnej, hydrochlorid 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidu (EDC), ester m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidu (MBS), /V-sukcinimidyl[4jódacetyljaminobenzoát (SIAB), sukcinimidyl-4-[A/-maleimidometyl]cyklohexán-1 karboxylát (SMCC), ester /V-y-maleimidobutyryloxy-sukcinimidu (GMBS), sukcinimidyl-4-[p-maleimidofenyl]butyrát (SMPB) a zodpovedajúce sulfónové (vo vode rozpustné) zlúčeniny. Výhodnými kroslinkerovými reakčnými činidlami podľa predloženého vynálezu sú s-SIAB, s-MBS a EDC. s-MBS je maleimid-sukcinimidový hetero-bifunkčný kroslinker a s-SIAB je jódacetyl-sukcinimidový hetero-bifunkčný kroslinker. Oba sú schopné vytvoriť kovalentnú väzbu s SH skupinami, respektíve primárnymi aminoskupinami. EDC je karbodiimidové reakčné činidlo, ktoré sprostredkúva kovalentné pripojenie fosfátovej skupiny a aminoskupiny.
Kolóniové primery a nukleokyselinové templáty sú vo všeobecnosti modifikované na 5' konci fosfátovou skupinou alebo primárnou aminoskupinou (pre EDC pripájacie činidlo) alebo tiolovou skupinou (pre s-SIAB alebo s-MBS linkery).
Takže ďalší predmet vynálezu poskytuje tuhý podklad, na ktorý je pripojené množstvo kolóniových primerov X, ako boli opísané vyššie, a najmenej jeden nukleokyselinový templát, ako bol opísaný vyššie, pričom uvedené nukleokyselinové templáty obsahujú na svojom 5' konci oligonukleotidovú sekvenciu Y, ako bola opísaná vyššie, a na svojom 3' konci oligonukleotidovú sekvenciu Z, ako bola opísaná vyššie. Výhodne je na tuhý podklad, ktorý je výhodne sklom, pripojených viacero nukleokyselinových templátov. Výhodne je pripojenie nukleokyselinových templátov a kolóniových primerov na tuhý podklad kovalentné. Uskutočňovaním jedného alebo viacerých kôl nukleokyselinovej amplifikácie na imobilizovanom nukleokyselinovou templáte (templátoch), použitím vyššie opísaných spôsobov, je možné vytvoriť nukleokyselinové kolónie podľa vynálezu. Takže ešte ďalším predmetom vynálezu je podklad obsahujúci jednu alebo viaceré nukleokyselinové kolónie podľa vynálezu. Ešte ďalší predmet vynálezu poskytuje použitie tuhých podkladov podľa vynálezu v spôsoboch amplifikácie alebo sekvenovania nukleových kyselín. Takéto spôsoby amplifikácie alebo sekvenovania nukleových kyselín zahŕňajú spôsoby podľa predloženého vynálezu.
-33Ešte ďalší predmet vynálezu poskytuje použitie derivatizovaného alebo funkcionalizovaného podkladu pripraveného ako bolo opísané vyššie, v spôsoboch amplifikácie a sekvenovania nukleových kyselín. Takéto spôsoby amplifikácie alebo sekvenovania nukleových kyselín zahŕňajú spôsoby podľa predloženého vynálezu.
Ešte ďalší predmet predloženého vynálezu poskytuje zariadenie na uskutočňovanie spôsobov podľa vynálezu alebo zariadenie na výrobu tuhého podkladu obsahujúceho nukleokyselinové kolónie podľa vynálezu. Takéto zariadenie by mohlo obsahovať napríklad viacero nukleokyselinových templátov a kolóniových primerov podľa vynálezu naviazaných, výhodne kovalentne, na tuhý podklad, ako bolo uvedené vyššie, spolu s nukleokyselinovou polymerázou, viacerými nukleotidovými prekurzormi, ako napríklad tými, ktoré boli opísané vyššie, z ktorých časť môže byť značená, a prostriedkom na riadenie teploty. Alternatívne môže zariadenie obsahovať napríklad podklad zahŕňajúci jednu alebo viacero nukleokyselinových kolónií podľa vynálezu. Výhodne obsahuje zariadenie aj detekčný prostriedok na detekciu a rozlíšenie signálov z jednotlivých nukleokyselinových kolónií zoskupených na tuhom podklade spôsobmi podľa predloženého vynálezu. Takýto detekčný prostriedok by mohol napríklad obsahovať CCD zariadenie operačne spojené so zväčšovacím zariadením, ako napríklad mikroskopom, ako bolo opísané vyššie.
Výhodne sú akékoľvek zariadenia podľa vynálezu poskytnuté v automatizovanej forme.
Predložená prihláška poskytuje riešenie súčasných a objavujúcich sa potrieb, ktoré sa vedci a biotechnologický priemysel snažia riešiť v oblastiach genómov, pôsobenia farmaceutických prostriedkov na genetické ochorenia, objavovania liekov, charakterizácie potravy a genotypingu. Takže spôsob podľa predloženého vynálezu je možné potenciálne aplikovať napríklad na: sekvenovanie a opakované sekvenovanie nukleových kyselín, diagnostiku a skríning, monitorovanie génovej expresie, vytváranie profilov genetickej diverzity, objavovanie a vyhodnocovanie celogenómových polymorfizmov, vytváranie genómových rezov (celého genómu pacienta na mikroskopickom reze) a sekvenovanie celého genómu.
Takže predložený vynález môže byť použitý na sekvenovanie a opakované sekvenovanie nukleových kyselín, pričom sa napríklad vybraný počet génov • · • ··· • · · · • · · • · ··
-34·· ·· ···· ·· špecificky amplifikuje do kolónií na sekvenovanie kompletnej DNA. Opakované sekvenovanie génu umožňuje identifikáciu všetkých známych alebo nových genetických polymorfizmov skúmaných génov. Aplikácie sú v liečebnej diagnostike a pri identifikácii génov živých organizmov.
Na použitie predloženého vynálezu na diagnostiku a skríning sa môžu celé genómy alebo frakcie genómov amplifikovať do kolónií na DNA sekvenovanie známych jednonukleotidových polymorfizmov (SNP). Identifikácia SNP má aplikáciu v medicínskom genetickom výskume na identifikáciu genetických rizikových faktorov asociovaných s chorobami. SNP genotyping bude mať aj diagnostické aplikácie pri pôsobení farmaceutických prostriedkov na ochorenia na identifikáciu a liečbu pacientov špecifickými liečivami.
Na použitie predloženého vynálezu na vytváranie profilov genetickej diverzity sa môžu identifikovať napríklad organizmy alebo bunky alebo tkanivá amplifikáciou vzorkovej DNA do kolónií a následne DNA sekvenovaním špecifických príveskov pre každú jednotlivú entitu. Týmto spôsobom sa môže definovať genetická diverzita vzorky spočítaním počtu príveskov z každej jednotlivej entite.
Na použitie predloženého vynálezu na monitoring génovej expresie sa exprimované mRNA molekuly tkaniva alebo organizmu, ktoré sa skúmajú, konvertujú na cDNA molekuly, ktoré sa amplifikujú do sád kolónií na DNA sekvenovanie. Frekvencia kolónií kódujúcich danú mRNA je proporcionálna k frekvencii mRNA molekúl, ktoré sa nachádzajú vo východiskovom tkanive. Aplikácie monitoringu génovej expresie sú v bio-medicínskom výskume.
Celogenómový rez, na ktorom je reprezentovaný celý genóm živého organizmu v množstve DNA kolónií, ktorých je dostatok na to, aby obsahovali všetky sekvencie daného genómu, môže byť pripravený použitím spôsobov podl’a vynálezu. Genómový rez je genetická karta akéhokoľvek živého organizmu. Genetické karty majú využitie v medicínskom výskume a na genetickú identifikáciu živých organizmov s priemyselnou hodnotou.
Predložený vynález môže byť použitý aj na uskutočnenie sekvenovania celého genómu, kde sa celý genóm živého organizmu amplifikuje ako sada kolónií na extenzívne DNA sekvenovanie. Sekvenovanie celého genómu umožňuje napríklad: 1) presnú identifikáciu genetického kmeňa živého organizmu; 2) ·· *· • · · • · ··· • · · · · • · · · ·· ·· ··
-35• ·· ·· · · • · • · · • · ·· ···· ·· objavenie nových kódujúcich génov v genóme a 3) objavenie nových genetických polymorfizmov.
Aplikácie predloženého vynálezu nie sú obmedzené na analýzu nukleokyselinových vzoriek z jediného organizmu/pacienta. Je napríklad možné začleniť nukleokyselinové prívesky do nukleokyselinových templátov a amplifikovať ich a pre každý organizmu/pacienta sa môžu použiť odlišné nukleokyselinové prívesky. Takže, keď sa stanovuje sekvencia amplifikovanej nukleovej kyseliny, je možné stanoviť aj sekvenciu prívesku a tým identifikovať pôvod vzorky.
Takže ďalší predmet vynálezu poskytuje použitie spôsobov podľa vynálezu alebo nukleokyselinových kolónií podľa vynálezu alebo viacerých nukleokyselinových templátov podľa vynálezu alebo tuhých podkladov podľa vynálezu na poskytnutie nukleokyselinových molekúl na sekvenovanie a opakované sekvenovanie, monitoring génovej expresie, vytváranie profilu genetickej diverzity, diagnostiku, skríning, sekvenovanie celého genómu, objavovanie a vyhodnocovanie celogenómových polymorfizmov a na prípravu celogenómových rezov (tzn. celý genóm jedinca na jednom podklade) alebo na akékoľvek iné aplikácie zahŕňajúce amplifikáciu nukleových kyselín alebo ich sekvenovanie.
Ešte ďalší predmet vynálezu poskytuje kit na použitie na sekvenovanie, opakované sekvenovanie, monitoring génovej expresie, vytváranie profilu genetickej diverzity, diagnostiku, skríning, sekvenovanie celého genómu, objavovanie a vyhodnocovanie celogenómových polymorfizmov alebo na akékoľvek iné aplikácie zahŕňajúce amplifikáciu nukleových kyselín alebo ich sekvenovanie. Tento kit zahŕňa viacero nukleokyselinových templátov a kolóniových primerov podľa vynálezu naviazaných na tuhý podklad, ako bolo uvedené vyššie.
Vynález bude teraz podrobnejšie opísaný v nasledujúcich neobmedzujúcich príkladoch s odvolaním sa na nasledujúce výkresy, na ktorých:
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje schematické vyobrazenie spôsobu generovania nukleokyselinovej kolónia v súlade s uskutočnením podľa vynálezu.
Obrázok 2 znázorňuje schematické vyobrazenie prípravy templátu a následného pripojenia na tuhý povrch. Na obrázku 2a je znázornená príprava templátov A, B a B’ obsahujúcich kolóniové primerové sekvencie )umiestnenie primerov na RAGE). Z genomickej DNA sa použitím PCR primerov TP1 a TP2 generuje 3,2Kb templát. Templáty A (854 bp) a B (927 bp) sa generujú použitím PCR primerov TPA1/TPA2, respektíve TPB1/TPB2. TPA1 a TPB1 oiigonukleotidy sú modifikované na svojom 5' konci buď fosfátovou, alebo tiolovou skupinou, na následné chemické pripojenie (*). Treba poznamenať, že získané templáty obsahujú sekvencie zodpovedajúce kolóniovým primerom CP1 a/alebo CP2. 11 exónov génu sa označuje ako Έ1 až Ε1Γ. Na obrázku 2b je znázornené chemické pripojenie kolóniových primerov a templátov na sklenený povrch. Ako príklad je uvedené vytváranie derivátov prostredníctvom ATS (aminopropyltrietoxysilánu).
Obrázok 3: DNA kolónie generované z kolóniového primera. Znázorňuje počet kolónií pozorovaných na 20x oblasti, ako funkciu koncentrácie templátu naviazaného na nádobku. Najnižšia koncentrácia detekovateľného templátu zodpovedá 10'13 M.
Obrázok 4: Vyobrazenie rozlišovania medzi dvoma kolóniami pochádzajúcimi z dvoch odlišných templátov. Obrázok 4a znázorňuje obrázky kolónii vytvorených z oboch templátov a negatívne kontroly. Obrázok 4b znázorňuje kolónie z oboch templátov v rovnakej polohe v tej istej nádobke vizualizované s dvoma odlišnými farbami a negatívne kontroly. Obrázok 4c znázorňuje koordináty oboch kolóniových typov (červených a zelených) v subsekcii mikroskopického poľa. Obrázok 4c demonštruje, že kolónie z dvoch odlišných templátov nekoincidujú.
Obrázok 5: Reakčná schéma pripojenia templátu alebo oligonukleotidu na sklo. Krok A je vytváranie derivátov na povrchu: sklenená vrstva sa ošetrila s kyslým roztokom na posilnenie voľnej hydroxylovej skupiny na povrchu. Predošetrené rezy sa ponoria do roztoku aminosilánu. ATS: aminopropyltrietoxysilán. Krok B: B1 alebo B2 je funkcionalizácia skleneného povrchu s kroslinkermi, po ktorej nasleduje pripojenie oligonukleotidov. Aminoskupina reaguje s kroslinkerovým činidlom prostredníctvom amidovej väzby: krok B1; sMBS (ester sulfo m-maleimidobenzoyl/V-hydroxy-sukcinimidu) krok B2; s-SIAB (sulfo /V-sukcinimidyl [4-jódacetyl]aminobenzoát). Oiigonukleotidy (5’ koncový tiol modifikovaného oligonukleotidu) sa x
··
-37• ·· ·· · · • · • · • · ··· ···· ·· • · · • · · • · · • · · ·· ·· ·· pripájajú na povrch prostredníctvom vytvorenia kovalentnej väzby medzi tiolom a dvojitou väzbou maleimidu. Fyziologický fosfátový tlmivý roztok: (PBS, 0,1 M NaFhPCXi, pH 6,5, 0,15M NaCl). B3: Pripájanie oligonukleotidov použitím EDC a imidazolu. 5’ koncový fosfát modifikovaných oligonukleotidov reaguje s imidazolom v prítomnosti EDC, čím vznikajú 5’-fosforimidazolidové deriváty (nie je ukázané). Deriváty vytvárajú fosforamidovú väzbu s aminoskupinami derivátov na sklenenom povrchu. EDC: hydrochlorid 1-etyl-3-(3-dimetylaminipropyl)-karbodiimidu.
Obrázok 6 znázorňuje počet kolónií pozorovaných na 20x oblasť, ako funkciu koncentrácie templátu naviazaného na nádobku. DNA templát sa naväzoval v odlišných koncentráciách buď prostredníctvom sprostredkovacieho párovacieho reakčného činidla (EDC) na aminoderivatizovaný sklenený povrch (A), alebo na sMBS funkcionalizovaný sklenený povrch (B). Na dvojvláknové DNA kolónie sa pôsobilo reštrikčným enzýmom a izolované jednovláknové DNA hybridizovali s komplementárnym oligonukleotidom, cy5 fluorescenčné značeným.
Obrázok 7 znázorňuje príklad in situ sekvenovania z DNA kolónií generovaných na skle. Obrázok 7A znázorňuje výsledok po inkubovaní s Cy5™dCTP na vzorke, ktorá nebola inkubovaná s primerom p181. Je možné pozorovať len 5 škvrnitých bodov, z čo vyplýva, že nenastáva žiadny dramatický falošný účinok (ako napríklad precipitácia Cy5™-dCTP agregátov, adsorpcia alebo jednoducho nešpecifické začleňovanie do DNA v kolóniách alebo na povrchu). Obrázok 7B znázorňuje výsledok po inkubovaní s Cy5™-dUTP na vzorke, ktorá bola inkubovaná s primerom p181. Je zrejmé, že nie je možné pozorovať žiadny fluorescenčný bod, z čoho vyplýva, že sa nemohlo uskutočniť začlenenie fluorescenčnej bázy v detegovateľnom množstve, keď nukleotid navrhnutý na začlenenie nezodpovedal sekvencii templátu nasledujúcej po hybridizovanom primere. Obrázok 7C znázorňuje výsledok po inkubovaní s Cy5™-dCTP na vzorke, ktorá bola inkubovaná s primerom p 181. Je zrejmé, že je možné pozorovať mnoho fluorescenčných bodov, z čoho vyplýva, že v skutočnosti nastalo začlenenie fluorescenčnej bázy v detegovateľných množstvách, keď nukleotid navrhnutý na začlenenie zodpovedal sekvencii templátu nasledujúcej po hybridizovanom primere.
Obrázok 8 znázorňuje hybridizáciu sond s oligonukleotidmi pripojenými na Nucleolink, pred a po PCR cykloch. Obrázok znázorňuje R58 hybridizáciu s CP2 (5’-38• ·· ·· · · • « • · • · ······· ·· ·· • · · • · ··· • · · · · • · · · ·· ·· ·· • · · * · • · · • · ·· · (fosfát)-TTTTTmTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), plné krúžky, s CP8 (5’(aminohexametylén)-111111111 iagaaggagaaggaaa-gggaaaggg), plné trojuholníky, s CP9 (5XhydrOXyl)-TTTTTTTTTTAGAAGGAG-AAGGAAAGGGAAAGGG), kosoštvorce, S CP10 (5’(dimetoxytrityl)- 11111111 itagaaggagaaggaaagggaaaggg), prázdne krúžky a s CP11 (5’(biotín)- 111111111 iagaaggagaaggaaagggaaaggg), prázdne trojuholníky.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava DNA templátov vhodných na generovanie DNA kolónií
DNA kolónie sa generovali z DNA templátov a kolóniových primerov. Tak ako sa používa tu, znamená výraz kolóniová primerová sekvencia sekvenciu zodpovedajúcu sekvencii kolóniového primera a niekedy je tu označovaná ako oligonukleotidová sekvencia Y alebo oligonukleotidové sekvencia Z’.
Vlastnosti kolóniových primerov boli vybrané na základe selekcie oligonukleotidových primerov, ktoré vykazujú malé nešpecifické začleňovanie nukleotidov v prítomnosti tepelne stabilných DNA polymeráz. Kolóniové primery CPa (5’-p CACCAACCCAAACCAACCCAAACC) a ΟΡβ (5'-p AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) boli vybrané vďaka ich malému začleňovaniu rádioaktívne značeného [a32p-dCTP] v prítomnosti stabilnej DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) v štandardnom tlmivom roztoku a pri termocyklických podmienkach (94 °C 30 sekúnd, 65 °C 1 minútu, 72 °C 2 minúty, 50 cyklov).
3,2 kb DNA fragment sa zobral ako model systému na demonštrovanie uskutočniteľnosti generovania kolónií použitím kolóniových primerov a DNA templátov. Vybraný templát obsahuje ľudský gén pre receptor na pokročilú glykozyláciu koncových produktov (HUMOXRAGE, GenBank por. č. D28769). RAGE-špecifické primery sú zobrazené v tabuľke 1. 3,2kb templát sa generoval prostredníctvom PCR amplifikácie z 0,1 μg ľudskej genomickej DNA s 1μΜ primermi TP1 a TP2, s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA), v štandardom tlmivou roztoku pri termocyklických podmienkach (94 °C 30 ··
-39·· · · • « • · · • · ··· ···· ·· • · • ··· • · · • · · »· ·· • · · • · • · 9
9 • 9 9 sekúnd, 65 °C 1 minútu, 72 °C 5 minút, 40 cyklov). Tento 3,2kb DNA fragment sa použil ako templát pre sekundárnu PCR na generovanie dvoch kratších templátov na generovanie kolónií (templáty A a B). Primery použité na generovanie kratších templátov obsahujú tak sekvencie špecifické pre templát, ako aj sekvencie kolóniových primerov CP1 a CP2 na amplifikáciu DNA na tuhom povrchu. Vo všeobecnosti je PCR primer používaný na generovanie DNA templátu modifikovaný na 5’ konci buď fosfátovou, alebo tiolovou skupinou. Takže po PCR amplifikácii sú generované DNA fragmenty, ktoré obsahujú kolóniové primerové sekvencie na jednom alebo na oboch koncoch v susedstve RAGE DNA fragmentu, o ktorý je záujem (pozri obrázok 2a).
Templát A (dvojvláknový templát obsahujúci na oboch koncoch kolóniovú primerovú sekvenciu CPp) sa generoval s 0,1 ng 3,2kb templátu, s 1μΜ primermi TPA1 a 1μΜ TPA2, s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA), v štandardom tlmivou roztoku pri termocyklických podmienkach (94 °C 30 sekúnd, 65 °C 1 minútu, 72 °C 1 minútu, 30 cyklov). Produkty sa potom purifikovali na Qiagen Qia-quick kolónach (Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko).
Templát B (dvojvláknový templát, ktorý obsahuje kolóniové primerové sekvencie zodpovedajúce CPp) sa generoval s 0,1 ng 3,2kb templátu, s 1μΜ primermi TPB1 a 1μΜ TPB2, s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA), v štandardom tlmivou roztoku pri termocyklických podmienkach (94 °C 30 sekúnd, 65 °C 1 minútu, 72 °C 1 minútu, 30 cyklov). Produkty sa potom purifikovali na Qiagen Qia-quick kolónach (Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko).
Templát B* (dvojvláknový templát obsahujúci na oboch koncoch kolóniové primerové sekvencie zodpovedajúce CPa a CPp) sa generoval s 0,1 ng 3,2kb templátu, s 1μΜ primermi TPB3 a 1μΜ TPB4, s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA), v štandardom tlmivou roztoku pri termocyklických podmienkach (94 °C 30 sekúnd, 65 °C 1 minútu, 72 °C 1 minútu, 30 cyklov). Produkty sa potom purifikovali na Qiagen Qia-quick kolónach (Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko).
··
-40Všetky špecifické oligonukleotidy využívané na prípravu DNA templátov a na generovanie DNA kolónií sú uvedené v tabuľke 1 spolu s akoukoľvek chemickou modifikáciou.
Všeobecná schéma znázorňujúca chemické pripojenie kolóniových primerov a templátov na sklenený povrch je uvedená na obrázku 2b, kde sa ako neobmedzujúci príklad uvádza vytváranie derivátov prostredníctvom ATS (aminopropyltrietoxysilánu).
Tabuľka 1
Zoznam oligonukleotidov použitých na prípravu templátov a generovanie kolónií
| Meno | DNA sekvencia | Orientácia | Oligo. modif. | Použitie |
| TP1 | GAGGCCAGAACAGTTCAAGG | 9810 (R) | Templát 3,2 kb | |
| TP2 | CCTGTGACAAGACGACTGAA | 6550 (F) | Templát 3,2 kb | |
| CP1 | TTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCA AACC | žiadna | 5’P | Generovanie kolónií |
| CP2 | I I I I I I I I I IAGAAGUAUAAGGAAAGGGA AAGGG | žiadna | 5’P | Generovanie kolónií |
| CP3 | II I I I I I I IICACCAACCCAAACCAACCCA AACC | žiadna | 5’SH | Generovanie kolónií |
| CP4 | Γ TTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGA AAGGG | žiadna | 5’SH | Generovanie kolónií |
| CP5 | AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTT | žiadna | 5’P | Generovanie kolónii |
| CP6 | AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG | žiadna | 5’P | Generovanie kolónií |
| CP7 | II I I I I I I IIGAGGAAGGCAAACCAACCCA AACC | žiadna | 5’ (NH2) | Generovanie kolónií |
| CP8 | I I I I I I I I I ÍÄGÄAGGAGAAGGAAAGGGA AAGGG | žiadna | 5’ <NH2) | Generovanie kolónií |
| CP9 | I I I I I I I I I IAGAAGGAGAAGGAAAGGGA AAGGG | žiadna | 5' (OH) | Kontrolné oligo |
··
-41 ·· • · • · ···· • · · • · ··· • · · · • · · · ·» ··
| CP10 | I I I I I I I I I IAUAAGUAGAAGGAAAGGGA AAGGG | žiadna | 5’ (DMT) | Kontrolné oligo |
| CP11 | ľTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGA AAGGG | žiadna | 5' (biotín) | Kontrolné oligo |
| TPA1 | AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGCCTG TGACAAGACGACTGAA | 6550 (F) | 5’P | Templát A |
| TPA2 | I I I ľľTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGA AAGGGGCGGCCGCTGAGGCCAGTGGAA GTCAGA | 7403 (R) | 5' P | Templát A |
| TPB3 | III I I I I I I rACCAACCCAAACCAACCCAA ACCGAGCTCAGGCTGAGGCAGGAGAATT G | 9049 (F) | žiadna | Templát B’ |
| TPB1 | AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGAG CTGAGGAGGAAGAGAGG | 9265 (F) | žiadna | Templát B |
| TPB2 | AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGCG GCCGCTCGCCTGGTTCTGGAAGACA | 8411 (R) | 5’P | Templát B |
| TPB4 | AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGCG GCCGCTCGCCTGGTTCTGGAAGACA | 9265 (R) | 5’ SK | Templát B’ |
Časť z HUMOXRAGE génu por. č. D28768; (R) znamená reverzný a (F) znamená priamy
Príklad 1a
Príprava náhodného DNA templátu ohraničeného degeneračným primerom
3,2kb DNA fragment sa zobral ako modelový systém na demonštráciu uskutočniteľnosti generovania kolónií z náhodnej primerovej PCR amplifikácie. Táto stratégia sa môže aplikovať na sekvenovanie DNA fragmentov dlhých približne 100 kb a prostredníctvom kombinácie fragmentov na celé genómy. Fragment DNA s dĺžkou 3,2 kb sa generoval prostredníctvom PCR z ľudskej genomickej DNA použitím PCR primérov; TP1 5’-pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG a TP2 5’pCCTGTGACAAGACGACTGAA, ako bolo opísané v príklade 1. 3,2kb fragment sa poštiepil na menšie fragmenty kombináciou reštrikčných enzýmov (EcoRI a Hhaľ), čím vznikli 4 fragmenty s približnou dĺžkou 800 bp. Poštiepené alebo nepoštiepené fragmentové DNA sa potom zmiešali s degeneratívnym primerom, p252 (5- P ··
-42I I I I I I I I I IISISISISISIS, kde I znamená inozín (ktorý sa páruje s A, T a C) a S znamená G alebo C), a kovalentne sa naviazali na Nucleolink nádobky (Nunc, Dánsko). Skúmavky sa potom podrobili náhodnej PCR amplifikácii na tuhej fáze a vizualizovali sa hybridizáciou so značenými DNA sondami, ako bude opísané v príklade 2a.
Príklad 2
Kovalentné viazanie sa DNA templátov a kolóniových primerov na tuhý podklad (z plastu) a vytváranie kolónií s kolóniovým primerom
Kovalentné viazanie sa DNA templátu a kolóniového primeru na tuhý podklad (z plastu)
Kolóniový primer (CP2, 5’-ttttttttttagaaggagaaaggaaagggaaaggg), fosforylovaný na svojom 5’ konci (Microsynth GmbH, Švajčiarsko), sa pripojil na Nucleolink plastické mikrotitračné nádobky (Nunc, Dánsko) v prítomnosti rôznych dávok templátu A (pripraveného, ako bolo opísané v príklade 1). V 8 nádobkách sa uskutočnilo dvojmo sedem 1/10 riedení templátu s CP2, pričom sa vychádzalo z najvyššej koncentrácie 1 nM.
Mikrotitračné nádobky, na ktorých bol kovalentne naviazaný CP2 kolóniový primer a templát, sa pripravili nasledovne. Do každej Nucleolink nádobky sa dalo 30 μΙ 1μΜ roztoku kolóniového primeru s rôznymi koncentráciami templátu nariedeného od 1 nM v 10mM 1-metyl-imidazole (pH 7,0) (Sigma Chemicals). Do každej nádobky sa k roztoku kolóniového primeru a templátu pridalo 10 μΙ 40mM 1etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidu (pH 7,0) (Sigma Chemicals) v 10mM 1metyl-imidazole. Nádobky sa potom nepriepustné uzavreli a inkubovali sa cez noc pri 50 °C. Po inkubovaní sa nádobky dva krát vymyli s 200 μΙ RS (0,4N NaOH, 0,25% Tween 20), inkubovali sa 15 minút s 200 μΙ RS, dvakrát sa premyli s 200 μΙ RS a dva krát s 200 μΙ TNT (100mM TrisHCI pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20). Skúmavky sa vysušili pri 50 °C a uskladňovali sa v nepriepustné uzavretom plastovom vrecku pri 4 °C.
-43.··. ·· ·· ♦ · · · · • · · ·· • · · · · · * · · · • ···· ·· ee’ ·· • · • · • · • · ··
Generovanie kolónií
Rast kolónií sa inicioval v každej nádobke s 20 μΙ PCR zmesi; štyri dNTPs (0,2 mM), 0,1% BSA (hovädzí sérový albumín), 0,1% Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švajčiarsko), 1x PCR tlmivý roztok a 0,025 jednotiek/μΙ AmpliTaq DNA polymerázy (Perkin Elmer, Foster City, CA). Nádobky sa potom umiestnili do termocyklera a rast sa uskutočňoval inkubovaním nepriepustné uzavretých nádobiek 5 minút pri 94 °C a 50 krát s nasledujúcimi podmienkami: 94 °C 30 sekúnd, 65 °C 2 minúty, 72 °C 2 minúty. Po ukončení tohto programu sa nádobky nechali do ďalšieho použitia pri 8 °C. Pred hybridizáciou sa nádobky naplnili s 50 μΙ TE (10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7,4), zahrievali sa na 94 °C 5 minút a ochladili sa na ľade pred tým, ako sa pri 45 °C pridala sonda.
Vizualizácia kolónií
Sonda
Sondou bol DNA fragment s dĺžkou 1405 bázových párov obsahujúci sekvenciu templátu na jeho 3’ konci (nukleotidová poloha 8405 až 9259). DNA sonda sa syntetizovala prostredníctvom PCR použitím dvoch primérov: p47 (5’GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA) amplifikujúceho od bázy 8405, a TP2, biotinylovaného na 5’ konci a amplifikujúceho od bázy 9876 protismerného vlákna.
Hybridizácia a detekcia
Sonda sa nariedila na 1 nM v easyhyb (Boehringer-Manngeim, Nemecko) a do každej nádobky sa jej pridalo 20 μΙ. Sonda a kolónie sa denaturovali pri 94 °C 5 minút a potom sa inkubovali 6 hodín pri 50 °C. Nadbytok sond sa odmyl pri 50 °C v 2xSSC s 0,1% Tween. DNA sondy sa naväzovali na avidínom pokryté zelené fluorescenčné fluoroguľôčky s priemerom 0,04 μηι (Molecular Probes) v TNT 1 hodinu pri laboratórnej teplote. Nadbytok guľôčok sa odmyl s TNT. Kolónie sa vizualizovali mikroskopom a obrazovou analýzou, ako je opísané v príklade 2a. Obrázok 3 znázorňuje počet kolónií pozorovaných na 20x oblasť, ako funkciu
-44• »· ·· · · • · • · • · ··· ···· ·· ·· • · · • · ··· • · · • · · ·· ·· ·· koncentrácie templátu naviazaného na nádobku. Najnižšia koncentrácia detekovateľného templátu zodpovedá 10'13 M.
Príklad 2a
Kovalentné viazanie sa DNA templátov a kolóniových primérov na tuhý podklad (z plastu) a vytváranie kolónií s degeneratívnym primerom
Kovalentné viazanie sa DNA templátu a kolóniového priméru na tuhý podklad (z plastu)
Mikrotitračné nádobky s p252 a templátovými DNA fragmentmi sa pripravili nasledovne.
Do každej Nucleolink nádobky sa dalo 30 μΙ 1μΜ roztoku kolóniového priméru p252 s rôznymi koncentráciami templátu nariedeného od 0,5 nM v 10mM 1metyl-imidazole (pH 7,0) (Sigma Chemicals). Do každej nádobky sa k roztoku kolóniového priméru a templátu pridalo 10 μΙ 40mM 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (pH 7,0) (Sigma Chemicals) v 10mM 1-metyl-imidazole. Nádobky sa potom nepriepustné uzavreli a inkubovali sa cez noc pri 50 °C. Po inkubovaní sa nádobky dva krát vymyli s 200 μΙ RS (0,4N NaOH, 0,25% Tween 20), inkubovali sa 15 minút s 200 μΙ RS, dvakrát sa premyli s 200 μΙ RS a dva krát s 200 μΙ TNT (100mM TrisHCI pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20). Skúmavky sa vysušili pri 50 °C a uskladňovali sa v nepriepustné uzavretom plastovom vrecku pri 4 °C.
Generovanie kolónií
Generovanie DNA kolónií sa uskutočňovalo s modifikovaným protokolom, aby sa umožnilo primovanie v každej nádobke s 20 μΙ PCR zmesi; štyri dNTPs (0,2 mM každý), 0,1% BSA, 0,1% Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švajčiarsko), 1x PCR tlmivý roztok a 0,025 jednotiek/μΙ AmpliTaq DNA polymerázy (Perkin Elmer, Foster City, CA). Nádobky sa potom umiestnili do termocyklera a amplifikácia sa uskutočňovala inkubovaním nepriepustné uzavretých nádobiek 5 minút pri 94 °C a 50 krát s nasledujúcimi podmienkami: 94 °C 30 sekúnd, 65 °C 2 minúty, 72 °C 2 minúty. Po ukončení tohto programu sa nádobky udržiavali do • · · • · ··· • · · · • · · · ·· ·· • ·· ·· · · • · • · • · ··· ····
-45ďalšieho použitia pri 8 °C. Pred hybridizáciou sa nádobky naplnili s 50 μί TE (10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7,4), zahrievali sa na 94 °C 5 minút a ochladili sa na Tade pred tým, ako sa pri 45 °C pridala sonda.
Vizualizácia kolónií
Sondy
Prostredníctvom PCR sa amplifikovali dva DNA fragmenty s dĺžkou 546 a 1405 bázových párov, ktoré obsahujú sekvencie z oboch koncov pôvodného templátu. Antisense vlákno sondy sa označilo biotínom, prostredníctvom použitia 5’biotinylovaného PCR primeru. Poloha bázových párov sond bola 6550 až 7113 a 6734 až 9805.
Hybridizácia a detekcia
Sondy sa nariedili na 1 nM v easyhyb (Boehringer-Manngeim, Nemecko) a do každej nádobky sa jej pridalo 20 μί. Sonda a kolónie sa denaturovali pri 94 °C 5 minút a potom sa inkubovali 6 hodín pri 50 °C. Nadbytok sond sa odmyl pri 50 °C v 2xSSC s 0,1% Tween. DNA sondy sa naväzovali na avidínom pokryté zelené fluorescenčné fluoroguľôčky s priemerom 40 nm (Molecular Probes, Portland OR) v TNT 1 hodinu pri laboratórnej teplote. Nadbytok guľôčok sa odmyl s TNT. Fluorescencia sa detegovala použitím invertovaného mikroskopu (použitím 20x/0,400 LD Achroplan objektívu na Axiovert S100TV, s olovenou lampou HBO 100W/2, Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko), ktorý bol spojený s 768 (H)x512 (V) bodový-CCD fotoaparát (Princeton Instruments Inc. Trenton, N J, USA). Expozícia bola 20 sekúnd cez sadu filtrov XF22 (Ex: 485DF22, Dichroický: 505DRLPO2 Em: 530DF30) a XF47 (Ex: 640DF20, Dichroický: 670DRLPO2 Em: 682DF22) od Omega Optical (Brattleboro VT) pre FITC, respektíve Cy5. Údaje sa analyzovali použitím Winwiew softwaru (Princeton Instruments Inc., Trenton NJ, USA). Počet kolónií na oblasť sa počítal vždy v dvoch jamkách s obrazovým analyzačným softwarom vyvinutým v laboratóriu.
| • ·· | ·· | • · | • · | |
| ·· · · | • | • | • | • · · |
| • · | • | • | ··· | • · |
| • · | • | • | • · | • · |
| ······· | ·· | ·· | • · · |
Príklad 3
Rozlišovanie sekvencie v rôznych kolóniách pochádzajúcich z rôznych pomerov 2 odlišných kovalentne naviazaných templátov a kolóniových primerov
Kovalentné viazanie sa templátov a kolóniové ho primeru na tuhý podklad (z plastu)
Kolóniový primer (CP2: 5’ pTT i hihi iagaaggagaaggaaagggaaaggg), fosforylovaný na svojom 5’ konci (Microsynth GmbH, Švajčiarsko), sa prichytil na Nucleolink plastové mikrotitračné nádobky (Nunc, Dánsko) v prítomnosti rôznych dávok dvoch templátov A a B (pripravených ako bolo opísané v príklade 1). Série 8 nádobiek sa pripravili trojmo so siedmymi 1/10 riedeniami oboch templátov vychádzajúc z najvyššej koncentrácie 1nM. Templátové riedenia sa pripravovali protismeme tak, aby najvyššia koncentrácia jedného templátu korešpondovala s najnižšou koncentráciou druhého.
Mikrotitračné nádobky, na ktoré sa kovalentne naviazal CP2 primer a oba templáty, sa pripravili nasledovne.
Do každej Nucleolink nádobky sa dalo 30 μΙ 1μΜ roztoku CP2 primeru s rôznymi koncentráciami oboch templátov nariedených od 1 nM v 10mM 1-metylimidazole (pH 7,0) (Sigma Chemicals). Do každej nádobky sa k roztoku kolóniového primeru a templátov pridalo 10 μΙ 40mM 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (pH 7,0) (Sigma Chemicals) v 10mM 1-metyl-imidazole (pH 7,0). Nádobky sa potom nepriepustné uzavreli a inkubovali sa 4 hodiny pri 50 °C. Po inkubovaní sa nádobky trikrát vymyli s 50 μΙ RS (0,4N NaOH, 0,25% Tween 20), inkubovali sa 15 minút s 50 μΙ RS, trikrát sa premyli s 50 μΙ RS a trikrát s 50 μΙ TNT (100mM TrisHCI pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20). Skúmavky sa uskladňovali v TNT pri 4 °C.
Generovanie kolónií
Rast kolónií sa inicioval v každej jamke s 20 μΙ PCR zmesi; štyri dNTPs (0,2 mM), 0,1% BSA, 0,1% Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švajčiarsko), 1x PCR tlmivý roztok a 0,025 jednotiek/μΙ AmpliTaq DNA polymerázy (Perkin Elmer, Foster City, CA).
| • · · • · · • · | • · | • · • • ee | ·· • • | • · • | |
| • • | • • | ||||
| • · | • | • | • · | • | • |
| • · ···· | ·· | • · | ·· | • |
Nádobky sa potom umiestnili do termocyklera a rast sa uskutočňoval inkubovaním nepriepustné uzavretých nádobiek 5 minút pri 94 °C a 50 krát s nasledujúcimi podmienkami: 94 °C 30 sekúnd, 65 °C 5 minút, 72 °C 5 minút. Po ukončení tohto programu sa nádobky udržiavali do ďalšieho použitia pri 8 °C. Pred hybridizáciou sa nádobky naplnili s 50 μΙ TE (10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7,4), zahrievali sa na 94 °C 5 minút a ochladili sa na ľade pred tým, ako sa pri 50 °C pridala sonda.
Vizualizácia kolónií
Sonda
Dva DNA fragmenty s dĺžkou 546 a 1405 bázových párov zodpovedajúce sekvenciám 3,2kb DNA fragmentu na 5’, respektíve 3' konci, sa amplifikovali prostredníctvom PCR použitím biotinylovaného primera (pozri príklad 2). Dve sondy sa denaturovali zahrievaním na 94 °C 5 minút, rýchlo sa zamrazili do 1M NaCl, 10mM Tris pH 7,4 a nechali sa viazať sa na streptavidínom obalené fluoroguľôčky s priemerom 0,04 μιτι označené rôznymi farbami 2 hodiny pri 4 °C. Sondy naviazané na guľôčky sa nariedili 20x v easyhyb roztoku, ktorý bol predhriaty na 50 °C. Do každej nádobky obsahujúcej denaturované kolónie sa pridalo 20 μΙ sond.
Hybridizácia a detekcia
Hybridizácia sa uskutočňovala pri 50 °C 5 hodín. Nadbytok sond sa odmyl pri 50 °C v 2xSSC s 0,1% SDS. Kolónie boli vizualizované mikroskopom s 20x objektívom, 20 sekundovou expozíciou a obrazovou analýzou, ako bola opísaná v príklade 2a. Obrázok 4a znázorňuje obrazy kolónií vytvorených z oboch templátov a negatívne kontroly. Obrázok 4b znázorňuje kolónie z oboch templátov v rovnakej polohe v rovnakej nádobke vizualizované dvoma odlišnými farbami a negatívne kontroly. Obrázok 4c znázorňuje polohy oboch typov kolónií v subsekcii mikroskopického poľa. Obrázok 4c demonštruje, že kolónie z odlišných templátov nekoincidujú.
-48• ·· ·· ·· ·· ···· ··· ··· • · · · ··· · · • · · · · · ·· ··· ···· ·· ·· · ·
Príklad 4
Kovalentné naviazanie DNA templátov a oligonukleotidov na sklenené tuhé podklady
Aminosilánom derivatizované sklenené rezy sa použili ako tuhý podklad na kovalentné pripojenie tiolom modifikovaných oligonukleotidových sond použitím hetero-bifunkčných kroslinkerov. Vybrané reakčné činidlá mali tiol-reaktívne (maleimid) a amino-reaktívne skupiny (sukcinimidyl ester). Účinnosť oligonukleotidového pripojenia a stabilita imobilizovaných molekúl bude značne závisieť na stabilite kroslinkerov vo vzťahu k podmienkam rozličných použitých pôsobení. Reakčné schémy pripájania DNA templátov alebo oligonukleotidov na sklo sú opísané na obrázku 5.
Zhodnotila sa skladovacia stabilita sklenených rezov pripravených s kroslinkermi s-MBS a s-SIAB a ich tepelná stabilita. Dôležitým faktorom ovplyvňujúcim rozsah hybridizácie imobilizovaných oligonukleotidových sond je hustota pripojených sond (Beattie a ďalší, 1995; Joss a ďalší, 1997). Študovali sme tento účinok menením koncentrácie oligonukleotidov počas imobilizácie a testovaním hustoty oligonukleotidov pripojených hybridizáciou.
Materiál a metódy
Predošetrenie mikroskopických sklenených rezov kyselinou - Mikroskopické sklenené rezy (Knittel, Merck ABS) sa namočili do zásaditého Helmanex roztoku na 1 hodinu (HelmanexllR 0,25%, 1N NaOH). Rezy sa premyli s vodou, cez noc sa ponorili do 1N HCI, znovu sa premyli vo vode a jednu hodinu sa na nich pôsobilo roztokom kyseliny sírovej (H2SO4/H2O, 1/1, v/v, s malým množstvom pridaného čerstvého persulfátu amónneho). Rezy sa umyli vo vode, etanole a nakoniec v čistom acetóne. Do ďalšieho použitia sa sklenené rezy vysušili a uskladnili vo vákuu.
Silanizácia povrchu - Predošetrené rezy sa ponorili do 5% roztoku ATS (aminopropyltrietoxysilán, Aldrich) v acetóne. Silanizácia sa uskutočňovala pri laboratórnej teplote 2 hodiny. Po troch premývaniach v acetóne (5 min/premývanie) sa rezy raz premyli s etanolom, vysušili sa a uskladnili sa vo vákuu.
| • · · • · · • · | • · | • · • ··· | ·· • • | • · • | |
| • • | • • | ||||
| • · | • | • | • · | • | • |
| • · ···· | ·· | ·· | • · | • |
Kroslinkerové pripojenie - Kroslinkery, s-MBS a s-SIAB (ester sulfo m-maleimidobenzoyl-/V-hydroxysukcinimidu, respektíve sulfo /V-sukcinimidyl [4-jódacetyl]aminobenzoát, Peirce, Rockford IL), sa pripravili ako 20mM roztoky v PBS (fyziologický fosfátový tlmivý roztok, 0,1 M NaH2PO4, pH 7,2, 0,15M NaCl). Silanizované sklenené rezy, na ktoré sa nanieslo 80 μΙ kroslinkerového roztoku, sa prikryli vyčisteným mikroskopickým krycím sklíčkom, a nechali sa reagovať 5 hodín pri 20 °C. Sklenené rezy sa premyli v PBS, narýchlo sa ponorili do vody a premyli sa v etanole. Rezy sa potom vysušili a pred ďalším použitím sa uskladnili vo vákuu, v tme.
Pripájanie oligonukleotidov - Oligonukleotidy sa syntetizovali modifikované na 5’ konci tiolovou (CP3 a VP4, Eurogentec, Brusel) alebo fosfátovou (CP1 a CP2, Eurogentec, Brusel) skupinou použitím štandardných fosforamiditových chemických prostriedkov.
5*-tiolové oligonukleotidové primery (CP3 a CP4) sa pripravili ako 100μΜ roztoky vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku (NaPi: 0,1 M NaH2PO4 pH 6,6, 0,15M NaCl) a 1μΙ kvapky sa naniesli na funkcionalizovaný sklenený rez (funkcionalizovaný s kroslinkerom) na 5 hodín pri laboratórnej teplote. Sklenené rezy sa udržiavali v nasýtenej vlhkej atmosfére, aby sa zabránilo evaporácii. Sklenené rezy sa premývali na miešadle v NaPi tlmivom roztoku. Na zistenie tepelnej stability sa sklenené rezy ponorili 2 krát do Tris tlmivého roztoku (10mM, pH 8) na 5 minút pri 100 °C a priamo sa ponorili do 5xSSC (0,75M NaCl, 0.075M citrát sodný pH 7) pri 4 °C na 5 minút. Rezy sa do ďalšieho použitia uskladňovali v 5xSSC pri 4 °C.
5’-fosfátové oligonukleotidové primery (CP1 a CP2) sa naniesli (1 μΙ kvapky) na 5 hodín pri laboratórnej teplote na amino-derivatizované sklo vo forme 1μΜ roztoku v 10mM 1-metyl-imidazole (pH 7,0) (Sigma Chemicals) obsahujúcom 40mM 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC, Peirce, Rockford IL). Rezy sa premyli dvakrát pri 100 °C v Tris tlmivom roztoku (10 mM, pH 8) a priamo sa ponorili do 5xSSC pri 4 °C na 5 minút. Rezy sa do ďalšieho použitia uskladňovali v 5xSSC pri 4 °C.
-50• ·· ·· ·· ·· ···· · · · ··· • · · · ··· · · • · ···· ·· ······· ·· ·· ·· ·
Pripájanie oligonukleotidov a DNA templátu
5-tiolové oligonukleotidové primery (CP3 a CP4) a 5-tiolový templát B’ sa zmiešali vo fosfátom tlmenom fyziologickom tlmivom roztoku (NaPi: 0,1 M NaH2PO4 pH: 6,6, 0,15M NaCl). Koncentrácia DNA templátu sa menila od 0,001 do 1 μΜ a koncentrácia primerov sa menila od 0,1 do 100 μΜ, ale boli optimalizované na koncentráciu templátu 1 μΜ a primerov 100 μΜ. Potom nasledoval postup opísaný vyššie na pripojenie CP3 a CP4 na funkcionalizovaný sklenený povrch.
5’-fosfátové oligonukleotidové primery (CP1 a CP2) a 5-fosfátový templát B sa zmiešali v 10mM 1-metyl-imidazolovom (pH 7,0) (Sigma Chemicals) roztoku obsahujúcom 40mM 1-etyl-3-(3-dimetylamino-propyl)karbodiimid (EDC, Pierce, Rockford IL). Koncentrácia DNA templátu sa menila od 0,001 do 10 nM a koncentrácia primerov sa menila od 0,1 do 1 μΜ, ale boli eventuálne optimalizované na koncentráciu templátu 10 nM a primerov 1 μΜ. Potom nasledoval postup opísaný vyššie na pripojenie CP1 a CP2 na aminoderivatizovaný sklenený povrch.
Hybridizácia s fluorescenčnými sondami - Oligonukleotidové sondy, fluorescenčné značené na svojom 5’ konci s Cy5 alebo FITC, sa syntetizovali firmou Eurogentec (Brusel). Aby sa zabránilo nešpecifickej hybridizácii, inkubovali sa sklenené rezy s blokovacím roztokom (5xSSC, Tween 0,1%, BSA 0,1%) 1 hodinu a premývali sa na trepačke v 5xSSC (2 krát, 5 minút). Oligonukleotidové sondy sa nariedili na 0,5 μΜ v 5xSSC, Tween 0,1% a naniesli sa na 2 hodiny na sklenený povrch pri laboratórnej teplote. Sklenené rezy sa vymývali na trepačke pri 37 °C, jedenkrát v 5xSSC 5 minút a dvakrát v 2xSSC obsahujúcom 0,1% SDS 5 minút.
Hybridizácia s rádioaktívne značenými sondami - Rádioaktívne značené oligonukleotidy komplementárne s kovalentne naviazanými oligonukleotidmi boli použité ako hybridizačné sondy, aby sa kvantifikovali výťažky hybridizácie. Oligonukleotidy sa enzymaticky označili na ich 5’ konci s [y-32P]dATP (Amersham, UK) použitím bakteriofágovej T4 polynukleotidkinázy (New England Biolabs, Beverly, MA). Nadbytok [y-32P]dATP sa odstránil s Chromá Spin kolónou TE-10 (Clontech, Palo Alto CA). Rádioaktívne oligonukleotidy (0,5 μΜ v 5xSSC, Tween 0,1%) sa potom naniesli na derivatizované rezy na 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Sklenené rezy sa vymývali na trepačke jedenkrát v 5xSSC 5 minút a dvakrát v
| • ·· | • · • • | • • | ·· • ··· | ·· • • | • • | |
| • · | • • | |||||
| • · | • | • | • · | • | • | |
| • · ··· | • | • · | ·· | ·· |
2xSSC, SDS 0,1% 5 minút pri 37 °C. Po hybridizácii sa špecifická aktivita stanovila scintilačným odčítavaním.
Mikroskopické pozorovanie - Sklenené rezy sa prekryli s 5xSSC roztokom a krycím mikroskopickým sklíčkom. Fluorescencia sa detegovala použitím invertovaného mikroskopu model Axiovert S100TV, s olovenou lampou HBO 100W/2 (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko), ktorý bol spojený s CCD fotoaparátom vybaveným s CCD radou Kodak s formátom 768 (H)x512 (V) bodov; 6,91x4,6 mm celkovo, veľkosť bodu 9x9 μΐη2 (Princeton Instruments Inc. Trenton, NJ, USA). Expozičný čas bol medzi 1 a 50 sekundami použitím objektívu LD Achroplan 20x/0,400 (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko) a sady filtrov XF22 (Ex: 485DF22, Dichroický: 505DRLPO2 Em: 530DF30) a XF47 (Ex: 640DF20, Dichroický: 670DRLPO2 Em: 682DF22) od Omega Optical (Brattleboro VT) pre FITC, respektíve Cy5. Údaje sa analyzovali použitím Winwiew softwaru (Princeton Instruments Inc., Trenton NJ, USA).
Výsledky
Zhodnotenie skladovacej stability pripojenia a tepelnej stability
Hodnotili sme skladovaciu stabilitu sklenených platní pripravených s s-MBS a s-SIAB. Keďže tieto reakčné činidlá sú citlivé na hydrolýzu, bude výťažok oligonukleotidového pripojenia závisieť na ich stabilite. Amino-derivatizované sklenené platne sa funkcionalizovali s čerstvo pripravenými kroslinkerovými činidlami, s-MBS a s-SIAB. Funkcionalizované rezy sa uskladňovali po kroslinkerovom pripojení 10 dní v desikátore vo vákuu v tme pri laboratórnej teplote. Po uplynutí tohto času sa testovali uskladnené rezy (t = 10 dní) a čerstvo zreagované rezy s kroslinkerovými reakčnými činidlami (t = 0). Pri oboch chemických postupoch boli porovnané výsledky získané po reakcii tiololigonukleotidu a hybridizácii komplementárnej fluorescenčnej sondy v čase t = 0 a v čase t = 10 dní.
Po imobilizácii sú s-SIAB-funkcionalizované rezy úplne stabilné po 10 dňoch skladovania, čo je dokázané rovnakými výťažkami hybridizácie získanými pri t = 0 a t = 10 dní. Na rozdiel od toho, sa zistilo, že pripojenie s-MBS na sklo je menej ···· ··· · · · • · · · ··· · · • · ·· ·· · · · · • · · · · · · ··· ···· ·· ·· ·· ·
-52stabilné s 30% stratou výťažku oligonukleotidového pripojenia a hybridizácie po 10 dňoch skladovania. Na základe toho sú s-SIAB funkcionalizované rezy výhodné, keď je ich možné pripraviť vopred a skladovať suché vo vákuu v tme najmenej desať dní bez toho, aby sa znížil výťažok pripojenia sondy.
Na zhodnotenie tepelnej stability pripojenia oligonukleotidov na sklo sa na rezy pôsobilo 5 minút pri teplote 100 °C 10mM Tris-HCI, pH 8. Oligonukleotidy, ktoré ostali ešte imobilizované po premývaní, sa testovali hybridizáciou s fluorescenčné značeným komplementárnym oligonukleotidom. Približne 14 % pripojených molekúl sa uvoľnilo z s-SIAB sklenených rezov a 17 % z s-MBS sklenených rezov po prvých 5 minútach premývania, ale nebolo detegované žiadne ďalšie uvoľňovania pri druhom premývaní pri oboch chemických postupoch (tabuľka 1A). Tieto výsledky sú povzbudzujúce v porovnaní s výsledkami získanými Chriseyom a ďalšími, 1996, kde sa uvoľnilo viac ako 62 % oligonukleotidov pripojených na fúzované kremičité rezy prostredníctvom kroslinkera SMPB (sukcinimidyl 4-[p-maleimidofenyl]butyrát), po 10 minútovom pôsobení v PBS pri 80 °C.
Tabuľka 1
Štúdia tepelnej stability
| Výsledky hybridizácie (zvolené jednotky, normalizované na 100 %) | |||
| Čerstvo pripojené | Po 5 min. premývania pri 100 °C | Po 2x5 min. premývania pri 100 °C | |
| s-MBS | 80 ±6 | 69 ±4 | 73 ±4 |
| s-SIAB | 100 ±9 | 84 ±8 | 87 ±3 |
Oligonukleotidy sa pripájali na sklenené rezy funkcionalizované buď s s-MBS, alebo s-SIAB. Pripojené oligonukleotidy sa testovali hybridizáciou s fluorescenčné značeným komplementárnym oligonukleotidom. Fluorescenčný signál sa normalizoval ako 100 pre najvyšší získaný signál. Uvedené sú priemerné hodnoty trojitej analýzy.
-53• · · · · · ·· ·· ··· ··· • · · ··· · · • · · · · · · · ······· · ·· ··
Hybridizácia ako funkcia pripojenia sondy
Študovali sme rozsah hybridizácie kovalentne naviazaných oligonukleotidových sond ako funkciu povrchového pokrytia oligonukleotidov pripojených použitím s-MBS, s-SIAB kroslinkerov a EDC-sprostredkovanými reakciami. Koncentrácia oligonukleotidov aplikovaných na imobilizáciu bola 1 μΜ pre EDC a v rozsahu od 1 do 800 μΜ pre kroslinkery, pričom povrchová hustota bola testovaná hybridizáciou s 32P-značenými sondami. Optimálna koncentrácia na pripojenie primerov použitím hetero-bifunkčných kroslinkerov bola 500 μΜ, čo sa rovnalo povrchovej hustote hybridizovaných molekúl 60 fmol/mm2 pre s-MBS a 270 fmol/mm2 pre s-SIAB. Podobná pokrývacia hustota ako pre s-MBS sa získala použitím EDC/imidazolom sprostredkovaného pripojenia 5'-fosfátových oligonukleotidov na aminosilanizované sklo. Avšak len 1μΜ roztoky oligonukleotidov boli nevyhnutné na dosiahnutie rovnakého výťažku pripojenia, čo predstavuje 500-násobný nadbytok oligonukleotidov, ktoré je možné pripojiť prostredníctvom s-MBS chemického postupu, v porovnaní s EDC/imidazol párovacou stratégiou (tabuľka 1B).
Tabuľka 1B
Hybridizácia ako funkcia pripojenia sond
| Oligonukleot. hybridizácia (fmol/mm^) | |||
| Kone. oligonukleotid. použitého na pripojenie (μΜ) | s-MBS | s-SIAB | EDC |
| 1 | NT | NT | 50 |
| 100 | 10 | 100 | NT |
| 500 | 60 | 270 | NT |
Oligonukleotidy sa pripájali na sklenené rezy funkcionalizované buď s s-MBS, alebo s s-SIAB, alebo cez sprostredkovacie aktivačné reakčné činidlo EDC. Pripojené oligonukleotidy sa testovali hybridizáciou s rádioaktívne značeným
| • ·· • · · • · | ·· | ·· • ··· | ·· • · • · | ·· | |
| • • | • • | ||||
| • · | • | • | • · | • · | |
| • · · · · | ·· | ·· | ·· | ·· |
komplementárnym oligonukleotidom. Špecifická aktivita a tým hustota hybridizovaných molekúl sa stanovovala scintilačnou kvapalinou. NT - netestované.
fmol/mm2 povrchovej hustoty zodpovedá priemernej vzdialenosti molekúl medzi naviazanými oligonukleotidmi 8 nm. Podľa našich výsledkov je na získanie DNA kolónií dostatočná hustota 30 fmol/mm2 (vzdialenosť 20 nm). Tento výťažok je možné získať imobilizáciou primerov v koncentrácii 100 μΜ použitím heterobifunkčného kroslinkera s-SIAB alebo s 1μΜ sondami použitím EDC-sprostredkovacieho prístupu. Hybridizačné hustoty, ktoré sme dosiahli, sú v rozsahu najvyšších hustôt získaných na sklenených rezoch podľa iných, pred tým publikovaných, protokolov (Guo a ďalší, 1994; Joss a ďalší, 1997; Beattie a ďalší, 1995).
Generovanie DNA kolónií na skle: vytváranie kolónií je závislé na dĺžke, koncentrácii templátu a na koncentrácii primerov
Teoreticky vyžaduje vytváranie DNA kolónií príslušnú hustotu primerov pripojených na povrch, ktorá zodpovedá dĺžke DNA templátu. Pre optimálne generovanie DNA kolónií je dôležité definovať rozsah hustôt naviazaných primerov a templátov, ako aj stechiometrický pomer medzi templátom a primérom.
Materiál a metódy
Príprava sklenených rezov
Sklenené rezy sa derivatizovali a funkcionalizovali ako bolo opísané vyššie (Materiál a metódy). DNA kolóniovými primermi boli CP1 a CP2. Kolóniové templáty sa pripravili ako bolo opísané v príklade 1 pre templát B', ale s použitím primerov TPB3 a TPB2. Na sklenený povrch sa naniesli rôzne koncentrácie tak modifikovaných kolóniových primerov, ako aj kolóniového templátu.
Generovanie kolónií
Sklenené rezy uskladňované v 5xSSC sa premyli v mikrofiltrovanej vode, aby sa odstránili soli. Rast kolónií sa inicioval na sklenenom povrchu s PCR zmesou; štyri dNTP (0,2 mM), 0,1% BSA, 0,1% Tween 20, 1x PCR tlmivý roztok a 0,05 U/μΙ AmpliTaq DNA polymerázy (Perkin Elmer, Foster City, CA). PCR zmes sa
| • ·· | ·· | • · | ·· | ||
| • · · | • | • | • | • | • |
| • · | • | • | ··· | • | • |
| • · ·· ···· | • ·· | • | • · ·· | • ·· | • |
umiestnila do komory s utesneným rámom (MJ Research, Watertown, MA). Rezy sa umiestnili do termocyklera (The DNA Engine, MJ Research Watertown, MA) a uskutočňovala sa termická cyklická reakcie a to nasledovne: krok 1 pri 94 °C 1 minútu, krok 2 pri 65 °C 3 minúty, krok 3 pri 74 °C 6 minút a tento program sa opakoval 50 krát. Po ukončení tohto programu sa rezy do ďalšieho použitia udržiavali pri 6 °C.
Štiepenie dvojvláknových DNA kolónií
Sklenený povrch obsahujúci DNA sa štiepil reštrikčnou nukleázou preliatím s reštrikčným enzýmom v štiepiacom 1x tlmivom roztoku. Reakcia bežala dva krát 1,5 hodiny pri 37 °C. Dvojvláknové DNA kolónie sa denaturovali ponorením rezov 2 krát do tris tlmivého roztoku (10mM, pH 8) pri 100 °C na 5 minút a nasledovalo premývanie v 5xSSC pri 4 °C. Na ďalšie použitie sa rezy uskladňovali v 5xSSC.
Hybridizácia jednovláknových DNA kolónií
Aby sa zabránilo nešpecifickej hybridizácii, inkubovali sa sklenené rezy s blokovacím roztokom (5xSSC, 0,1% Tween, 0,1% BSA) 1 hodinu a rezy sa premyli v 5xSSC (2 krát po 5 minút). Oligonukleotid fluorescenčné s Cy5 značený na 5’ konci (Eurogentec, Brusel) sa nariedil na 0,5 μΜ v 5xSSC, Tween 0,1% a naniesol sa na sklenený povrch na najmenej 2 hodiny. Sklenené rezy sa premývali na trepačke raz v 5xSSC 5 minút a dvakrát v 5xSSC, SDS 0,1% 5 minút pri 37 °C.
Sklenené rezy sa vizualizovali ako bolo opísané vyššie.
Predtým sme pozorovali, že rozsah hybridizácie je funkciou hustoty pripojenia oligonukleotidov. Podobná štúdia s naviazanými DNA templátmi ukázala, že vytváranie kolónií je aj funkciou koncentrácie templátu pripojeného na sklenený rez. V závislosti na chemickom postupe použitom na pripojenie oligonukleotidov a templátu je optimálna koncentrácia templátu 1 μΜ pre bi-funkčné kroslinkery, s-MBS (obrázok 6B), a 1 nM pre EDC karbodiimid (obrázok 6A). Je zaujímavé, že vyššia koncentrácia templátu nezvyšuje počet kolónií pri EDC chemickom postupe a zdá sa, že sa dosiahne piateau zodpovedajúce maximálnemu počtu kolónií.
| • ·· | ·· | ·· | ·· | ||
| • · · | • | • | • | • | • « |
| • · | • | • | ··· | • | • |
| • · | • | • | • · | • | • |
| ······ | ·· | ·· | ·· | • |
Študovali sme vytváranie kolónií (počet) ako funkciu koncentrácie primérov, koncentrácie DNA templátu naneseného na povrch, a dĺžky DNA templátu.
Tiež sme zhodnocovali počet kópií templátu v každej kolónii. Kvantifikácia bola založená na fluorescenčnej detekcii s Cy5-, Cy3- alebo fluoresceínomznačených fluorofóroch, ktoré boli doplnené anti-bieliacim reakčným činidlom (Prolong, Molecular Probes, Portland OR). Kalibrácia sa uskutočnila hybridizačnými experimentmi s primerami pripojenými na povrch, ktorých zodpovedajúca presná hustota bola stanovená prostredníctvom rádioaktivity.
Príklad 5
In situ sekvenovanie kolóniovej DNA
Sklenené rezy (priemer 5 mm, Verrerie de Carouge, Švajčiarsko) sa najprv umiestnili do Helmanex 0,2 % (v H2O), NaOH 1N kúpeľa na hodinu pri laboratórnej teplote, dvakrát sa premyli s destilovanou vodou, premyli sa v čistom hexáne, znovu sa dvakrát premyli s destilovanou vodou a cez noc sa na nich pôsobilo 1M HCI pri laboratórnej teplote. Potom sa dvakrát premyli v destilovanej vode a hodinu sa na nich pôsobilo s H2SO4 (50 %) + K2S2O8 pri laboratórnej teplote. Premyli sa v destilovanej vode a potom dvakrát v etanole. Na sklenených rezoch sa prostredníctvom ATS (ako je opísané v príklade 4) vytvorili deriváty.
Kolóniové primery cpi (5-p111111111 icaccaacccaaaccaacccaaacc) a CP2 (5’-p I I I I I I I I I IAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), ktoré boli 5’ fosforylované (Microsynth GmbH, Švajčiarsko) a DNA templát B (pripravený ako bolo opísané v príklade 1) sa 5* koncom kovalentne pripojili na sklenené rezy s priemerom 5 mm (Verrerie de Carouge, Švajčiarsko) do finálnej koncentrácie 1 μΜ, respektíve 10 nM, nasledovne: 2 nmoly každého primera sa pridali k 0,2 nmolom templátu v 1 ml roztoku A (41 μΙ metylimidazolu (Sigma, č. M-8878) v 50 ml H2O, pH nastavené na 7 s HCI) a potom sa zmiešali v pomere 1:1 s roztokom D (0,2mM EDC v 10 ml roztoku A). Na obe strany sklenených rezov sa nanieslo 3,5 μΙ zmesi a inkubovali sa cez noc pri laboratórnej teplote. Sklenené rezy sa potom rýchlo premyli s 5xSSC tlmivým roztokom a umiestnili sa pri 100 °C do 10mM Tris tlmivého roztoku pH 8,0 na dvakrát 5 minút.
| • ·· | ·· | ·· | ·· · | |||
| ·· · · | • | • | • | • | • | • · |
| • · | • | • | ··· | • | • | • |
| • · ··· ···· | • ·· | • | • · ·· | • ·· | e | • ··· |
Nešpecifické miesta na skle sa blokovali s hovädzím sérovým albumínom (BSA, Boehringer Mannheim GmbH, Nemecko, č. 238040) v koncentrácii 1 mg/ml v 5xSSC tlmivom roztoku jednu hodinu pri laboratórnej teplote a potom sa premyli s destilovanou vodou.
Sklenené rezy sa potom jednotlivo umiestnili do Miroamp™ reakčnej skúmavky (Perkin Elmer) obsahujúcej 170 μΙ PCR zmesi, a DNA kolónie sa potom generovali použitím Taq polymerázy (AmpliTaq, Pe-Applied biosystems Inc., Foster City CA) s 50 cyklami (94C/60, 60C/3’, 72C/6’) v MTC 200 termocykleri (MJ Research, Watertown, MA). Každý rez sa dvakrát štiepil použitím 1,3 jednotky Pvull (Stratagene) v NEB 2 tlmivom roztoku (New England Biolabs) 45 minút pri 37 °C. Po poštiepení sa skúmavky umiestnili pri 100 °C do 10mM Tris tlmivého roztoku pH 8,0 na dvakrát 5 minút, potom sa blokovali s filtrovaným (Millex GV4, Millipore) 1 mg/ml BSA v 2xSSC tlmivom roztoku 30 minút pri laboratórnej teplote a najprv sa premyli v 2xSSC 0,1% SDS tlmivom roztoku a potom v 5xSSC tlmivom roztoku. Každý rez sa cez noc inkuboval pri laboratórnej teplote s 5xSSC/0,1% Tween 20 tlmivým roztokom obsahujúcim 1 μΜ sekvenačného primera p181 (CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC). Kontroly bez primera sa udržiavali v 5xSSC 0,1% Tween 20 tlmivom roztoku. Sklenené rezy sa dvakrát premyli v 5xSSC 0,1% SDS pri 37 °C po 5 minút a premyli sa v 5xSSC. Primer p181 môže hybridizovať s templátom B’ a sekvencia nasledujúca po p181 je CAGCT.... Aby sa uľahčilo zaostrovanie, adsorbovali sa na dno každej nádobky zelené fluorescenčné guľôčky inkubovaním každej nádobky s 20 μΙ 1/2000 zriedených 200 nm žltých/zelených fluorescenčných streptavidínom obalených FluoSpheres(R) (Molecular Probes, Eugene, OR) v 5xSSC 20 sekúnd pri laboratórnej teplote.
Po hybridizácii s primérom sa na každý rez pridali 2 μΙ roztoku obsahujúceho 0,1% BSA, 6mM ditiotreitol (Sigma Chemicals), 5μΜ Cy5™-dCTP alebo 5μΜ Cy5™-dUTP (Amersham, UK) a 1x sekvenázový reakčný tlmivý roztok. Pridanie Cy5™-nukleotidu bolo iniciované pridaním 1,3 jednotky T7 Sekvenázy™ DNA polymerázy (Amersham, UK) na dve minúty pri laboratórnej teplote. Nádobky sa dvakrát premývali v 5xSSC/0,1% SDS kúpeli 15 minút a premyli sa s 5xSSC tlmivým roztokom.
-58• ·· ·· ·· ·· ···· ··· ··· • · · · ··· · · ·· ···· · · ··· ···· ·· ·· ·· ·
Vzorky sa pozorovali použitím invertovaného mikroskopu (Axiovert S100TV, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Nemecko) vybaveného s Micromax 512x768 CCD fotoaparátom a Winview softwarom (Princeton Instruments, Trenton, NJ). Na zaostrenie sa použil 20x objektív a XF 22 filtrová sada (Omega Optical, Brattleboro, VT), a na pozorovanie začlenenia Cy5™ do vzorky sa použil 20x objektív a XF47 filtrová sada (Omega Optical) s 50 sekundami expozície použitím 2x2 bodových priehradok. Žlto/zelené FluoSpheres(R) (približne 100/oblasť pozorovania) nedávajú žiadny detegovateľný signál použitím XF47 filtrovej sady a 50 sekundovej expozície (údaje nie sú uvedené). Fotografie sú generované programom Winview (Princeton Instruments).
Obrázok 7A znázorňuje výsledok po inkubovaní s Cy5™-dCTP na vzorke, ktorá nebola inkubovaná s primerom p181. Je možné pozorovať len 5 škvrnitých bodov, z čo vyplýva, že nenastáva žiadny dramatický falošný účinok (ako napríklad precipitácia Cy5™-dCTP agregátov, adsorpcia alebo jednoducho nešpecifické začleňovanie do DNA v kolóniách alebo na povrchu). Obrázok 7B znázorňuje výsledok po inkubovaní s Cy5™-dUTP na vzorke, ktorá bola inkubovaná s primerom p181. Je zrejmé, že nie je možné pozorovať žiadny fluorescenčný bod, z čoho vyplýva, že sa nemohlo uskutočniť začlenenie fluorescenčnej bázy v detegovateľnom množstve, keď nukleotid navrhnutý na začlenenie nezodpovedal sekvencii templátu nasledujúcej po hybridizovanom primere. Obrázok 7C znázorňuje výsledok po inkubovaní s Cy5™-dCTP na vzorke, ktorá bola inkubovaná s primerom p181. Je zrejmé, že je možné pozorovať mnoho fluorescenčných bodov, z čoho vyplýva, že v skutočnosti nastalo začlenenie fluorescenčnej bázy v detegovateľných množstvách, keď nukleotid navrhnutý na začlenenie zodpovedal sekvencii templátu nasledujúcej po hybridizovanom primere. Možno zhrnúť, že sme ukázali, že je možné začleňovanie fluorescenčných nukleotidov do DNA nachádzajúcej sa v kolóniách sekvenčne špecifickým spôsobom a monitorovanie tohto začleňovania s opísaným zariadením a opísaným spôsobom. Avšak to je len príklad. Bude zrejmé, že ak je to želateľné, začleňovanie fluorescenčnej bázy sa môže opakovať niekoľko krát. Keďže sa toto uskutočňuje sekvenčne špecifickým spôsobom, je tak možné vydedukovať časť sekvencie DNA nachádzajúcej sa v kolóniách.
| • ·· • · · • · | ·· • • | • • | • t • ··· | • · | • | |
| • • | • • | |||||
| • · | • | • | • · | • | • | |
| ······ | ·· | ·· | ·· | • |
Príklad 6
Analýza 5’ mRNA sekvenčného prívesku
Najpresnejším spôsobom na monitorovanie génovej expresie v bunkách alebo tkanivách je redukcia počtu krokov medzi odobratím vzorky a analyzovaním mRNA. Nové spôsoby na rýchlu izoláciu mRNA sú komerčne dostupné. Najúčinnejšie spôsoby zahŕňajú rýchlu izoláciu vzorky a okamžité rozrušenie buniek v roztoku guanidínium hydrochloridu, ktorý úplne rozruší proteíny a inaktivuje RNAázy. Potom nasleduje purifikácia mRNA zo supernatantu rozrušených buniek oligo-dT afinitnou chromatografiou. Nakoniec je možné použitím jednoduchej stratégie (SMART cDNA synthesis, Clontech, Palo Alto) mRNA s 5’ sekvenciou špecificky nasmerovať a transformovať na cDNA.
Tento spôsob umožňuje syntézu cDNA kópií len translačne aktívnej mRNA s 5’ ukončovacou sekvenciou. Kombináciou vyššie opísaných rýchlych spôsobov izolácie mRNA a prípravy cDNA so spôsobom pripájania templátu na generovanie DNA kolónií, ktorý je opísaný v predloženej prihláške, máme prístup na vysokoproduktívnu identifikáciu veľkého počtu 5’ mRNA sekvenčných príveskov. Výhodou nášho vynálezu je možnosť sekvenovať veľké množstvo cDNA priamym pripojením produktu cDNA syntetickej reakcie, amplifikáciou cDNA do tisícok kópií a následne simultánnym in situ sekvenovaním cDNAs.
Materiál a metódy
Syntetické oligonukleotidy a plazmidy - Oligonukleotidy sa syntetizovali s 5’fosfátmi firmou Eurogentec alebo Microsynth. Plazmidy obsahujúce čiastočne kódujúcu sekvenciu a 3' netranslatovanú sekvenciu hlodavčieho génu pre draselný kanál, mSlo, za ktorou nasleduje T3 RNA polymerázový promótor, sa generovali štandardnými spôsobmi.
mRNA syntéza - mSlo plazmidy sa linearizovali v jedinom Sail alebo Sad reštrikčnom nukleoázovom mieste za polyA+ sekvenciou v plazmide. Po ošetrení poštiepeného plazmidu s proteinázou K, sa lineárna plazmidová DNA raz extrahovala zo zmesou fenol/CHsCI/izoamylalkohol a precipitovala sa s etanolom. DNA precipitát sa znovu rozpustil v H2O do koncentrácie 10 pg/pl. Syntetická mRNA
| • ·· • · · | ·· • | • | ·· • | ·· • | • · |
| • · | • | • | ··· | • | • |
| • · | • | • | • · | • | • |
| ·· ···· | ·· | ·· | ·· | • |
ukončená na 5’ konci metylguanozínom sa syntetizovala mMessage mMachine in vitro mRNA syntetizujúcim kitom podľa inštrukcií výrobcu (Ambion Austin TX). Syntetická mRNA sa uskladňovala pri 80 °C.
Enzýmy - Reštrikčné enzýmy sa získali od New England Biolabs (Beverly,
MA).
Syntéza cDNA - Syntetické mRNA sa zmiešali s myšacou pečeňovou polyA+ mRNA v rôznych molárnych pomeroch (1:1, 1:10, 1:100) a cDNA syntéza zmesi syntetických a myších pečeňových mRNA sa uskutočňovala použitím SMART PCR cDNA syntetického kitu (Clontech, Palo Alto CA) s určitými minimálnymi modifikáciami. V cDNA reakcii sa zmiešal približne 1 pg mRNA zmesi s primerom CP5, ktorý má 5’ koncovú sekvenciu CPp, (5’ p-AGGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG11 i 111111 1111111NN). Tento primer bol použitý na syntézu 1. vlákna cDNA. Na výrobu 2. vlákna bola použitá technika SMART*. Základom SMART syntézy je vlastníctvo Moloney hlodavčej vírusovej reverznej transkriptázy, ktorá sa pridáva do troch až piatich deoxycytozínových zvyškov na 3’ konci prvého vlákna cDNA, keď mRNA obsahuje 5*-metylguanozínové ukončenie (SMART manuál, Clontech, Palo Alto CA). CP6 primer, ktorý obsahuje sekvenciu CPp plus AAAGGGGG na 3’ konci, (5’p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG) sa použil na syntézu 2. cDNA vlákna. Tlmivý roztok a SUPERSCRIPT™ II RNáza H reverzná transkriptáza z Moloney hlodavčieho leukemického vírusu (Life Technológie, Ltd.) boli použité podľa inštrukcií a reakcia sa uskutočňovala pri 42 °C hodinu. cDNA sa testovala prostredníctvom PCR použitím primeru p251, ktorý obsahuje fragment CPp sekvencie (5’-GAGAAGGAAAGGGGAAAGG) s Taq DNA polymerázou (Platinum Taq, Life Technologies, Ltd.).
Príprava DNA kolónií - 5’p-cDNA sa zmiešala s rôznymi koncentráciami kolóniového primera na tuhej fáze, CP2 (5’p-l I I I ι ι ι ι ι l AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) a chemicky sa naviazala na Nucleolink PCR skúmavky (NUNC) podľa inštrukcií výrobcu. Potom sa použitím Taq polymerázy (AmpliTaq Gold, PeApplied Biosystems Inc., Foster City CA) generovali DNA kolónie 30 cyklami (94C/30, 65C/1’, 72C/1.5’) v MTC 200 termocykleri (MJ Research, Watertown, MA).
| • · • · · | ·· • | e | ·· • | ·· • · | ·· | |
| • · | • | • | ··· | • | • | |
| • · | • | • | • · | • | • | |
| ······ | ·· | ·· | ·· | • · |
DNA sondy a hybridizácia - 32Biotinylované a 32P-rádioaktívne značené DNA sondy špecifické pre mSlo DNA sekvenciu sa syntetizovali s 5'-biotinylovaným primerom a normálnym downstream primerom prostredníctvom PCR na templáte (mSlo plazmidovej DNA). Do sondy sa zaviedol a[32P]-dCTP (Amersham, Amersham UK) v pomere 300:1 (a[32P]-dCTP ku dCTP) v PCR reakcii s finálnou koncentráciou štyroch deoxynukleozidtrífosfátov 50 μΜ. Výsledná biotinylovaná a rádioaktívne značená DNA sonda sa odsolila na Chromaspin-1000 kolóne (Clontech, Palo Alto CA). DNA sondy sa hybridizovali so vzorkami v easyhyb tlmivom roztoku (Boehringer-Mannheim, Nemecko) použitím nasledujúcej teplotnej schémy (v MTC200 termocykleri): 94 °C 5 minút, následne 68 krokov poklesu teploty o 0,5 °C každých 30 sekúnd (inými slovami teplota sa znížila na 60 °C počas 34 minút), použitím nepriepustné uzavretých nádobiek. Vzorky sa potom trikrát premyli s 200 μΙ TNT pri laboratórnej teplote. Nádobky sa potom inkubovali 30 minút s 50 μΙ TNT obsahujúcim 0,1 mg/ml BSA (New England Biolabs, Beverly, MA). Potom sa nádobky inkubovali 5 minút s 15 μΙ roztoku červených, fluorescenčných, streptavidínom obalených, 40nm mikroguľôčok (Molecular Probes, Portland, OR). Roztok mikrogurôčok sa pripravil z 2 μΙ zásobného roztoku mikroguľôčok, ktorý sa sonifikoval 5 minút v 50W ultrazvukovom vodnom kúpeli (Elgasonic, Bienne, Švajčiarsko), nariedil sa v 1 ml TNT roztoku obsahujúceho 0,1 mg/ml BSA a prefiltroval sa cez Millex GV4 filter s veľkosťou pórov 0,22 μιη (Millipore, Bedford, MA).
Vizualizácia DNA kolónií - Farbené vzorky sa pozorovali použitím invertovaného Axiovert 10 mikroskopu použitím 20x objektívu (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Nemecko) vybaveným s Micromax 512x768 CCD fotoaparátom (Princeton Instruments, Trenton, N J), použitím PB546/FT580/LP590 filtrovej sady a 10 sekundového osvetlenia. Súbory sa konvertovali na TIFF formát a spracovali sa vhodným softwarom (PhotoPaint, Corel Corp. Ltd, Dublin, Írsko). Spracovanie pozostávalo z inverzie a zo zosilnenia lineárneho kontrastu, aby sa poskytol obrázok vhodný na vytlačenie čiernobielou laserovou tlačiarňou.
Výsledky
Syntéza syntetickej mRNA a cDNA
| • ·· • · · • · | ·· • • | • • | ·· • ··* | • · | ·· | |
| • • | • • | |||||
| • · | • | • | • e | • | • | |
| ······ | ·· | ·· | • · |
Po syntéze cDNA sa táto skontrolovala v PCR použitím p251 primeru (generovaný na každom konci prvého vlákna cDNA), aby sa overili správne dĺžky produktov testovaním prostredníctvom agarózovej gélovej elektroforézy. Syntetická mSlo mRNA sa nariedila do pečeňovej mRNA, čo bolo dokázané znížením intenzity mSlo-špecifického pásu a zosilnením nešpecifického rozmazaného pruhu pečeňovej cDNA.
Detekcia a kvantifikácia DNA kolónií
DNA kolónie sa testovali použitím fluorescenčnej zobrazovacej CCD mikroskopie alebo scintilačným odčítaním. Počet fluorescenčné detegovateľných kolónií sa zvyšoval ako funkcia množstva pripojeného templátu, ako je znázornené na obrázku 6. Toto zvýšenie sa odzrkadľuje množstvom detegovanej 32Prádioaktivity. S rádioaktívne značenými sondami je možné detegovat mRNA kópie v pomere približne 1:100. Ale s fluorescenčnou mikroskopickou CCD zobrazovacou technológiou je možné detegovat mRNA v riedení 1:10000.
Príklad 7
Kovalentné naviazanie sa primeru na tuhý podklad (z plastu)
Oligonukleotidové primery sa pripájali na Nucleolink plastické mikrotitračné nádobky (Nunc, Dánsko), aby sa stanovil optimálny čas pripájania a chemický postup. Oligonukleotidy; CP2 (5’-(fosfát)-i 11111111 iagaaggagaaggaaagggaaaGGG), CP8 (S'-íaminohexametylénJ-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), CP9 (5’-(hydrOXyl)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), CP10 (5’ (dimetoxytrityl)-i 11111111 iagaaggagaaggaaagggaaaggg) a CP11 (5’ (biotín)Tl 1111111 iagaaggagaaggaaagggaaaggg), (Microsynth GmbH, Švajčiarsko), sa pripájali na Nucleolink mikrotitračné nádobky nasledovne (8 nádobiek pre každý); do každej nádobky sa dalo 20 μΙ roztoku obsahujúceho 0,1 μΜ oligonukleotidu, 10 mM 1-metyl-imidazolu (pH 7,0) (Sigma Chemicals) a 10 mM 1-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimidu (pH 7,0) (Sigma Chemicals) v 10mM 1-metylimidazole. Nádobky sa potom nepriepustné uzavreli a inkubovali sa pri 50 °C rôzne dlho. Pripájacia reakcia sa ukončila v konkrétnom čase dvakrát premytím s 200 μΙ
| • | • e | ·· | ·· | ·· | |||
| ·· · · | • | • | • | • | • | ·· | |
| 4 | • | • | • | ··· | * | * | |
| • | e | • | • | • · | • | • | |
| ··· ···· | ·· | ·· | • e | ·· |
RS (0,4N NaOH, 0,25% Tween 20) a dvakrát s 200 μΙ TNT (100mM TrisHCI pH 7,5, 150mM NaCI, 0,1% Tween 20). Skúmavky sa sušili pri 50 °C 30 minút a uskladňovali sa v nepriepustné uzavretých plastických vreckách pri 4 °C.
Stabilita naviazaných oligonukleotidov v PCR podmienkach generovania kolónií
Stabilita sa testovala v podmienkach rastu kolónií pridaním PCR zmesi (20 μΙ, štyri dNTP (0,2 mM), 0,1% BSA, 0,1% Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka Švajčiarsko), 1x PCR tlmivý roztok). Nádobky sa potom umiestnili do termocyklera a uskutočňovalo sa 33 cyklov nasledujúcich podmienok: 94 °C 45 sekúnd, 60 °C 4 minúty, 72 °C 4 minúty. Po ukončení tohto programu sa nádobky vymyli s 5xSSC, 0,1% Tween 20 a do ďalšieho používania sa udržiavali pri 8 °C. Pred hybridizáciou sa nádobky naplnili s 50 μΙ 5xSSC, 0,1% Tween 20, zahrievali sa 5 minút na 94 °C a uskladnili sa pri laboratórnej teplote.
Sonda: Oligonukleotidové sondy, R57 (5’ (fosfát)-GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG, kontrolná sonda) a R58 (5 - (fosfát)- CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT, ktorá je komplementárna s CP2, CP8, CP9, CP10 a CP11) sa enzymaticky označili na ich 5’ koncoch s [y-32P]dATP (Amersham, UK) použitím bakteriofágovej T4 polynukleotidkinázy (New England Biolabs, Beverly, MA). Nadbytok 32PdATP sa odstránil s Chromá Spin kolónou TE-10 (Clontech, Palo Alto CA). Rádioaktívne oligonukleotidy (0,5 μΜ v 5xSSC, 0,1% Tween 20) sa potom hybridizovali s oligonukleotidovými derivatizovanými Nucleolink nádobkami pri 37 °C dve hodiny. Nádobky sa štyrikrát vymyli s 5xSSC, 0,1% Tween 20 pri laboratórnej teplote a nasledovalo premývanie s 0,5xSSC, 0,1% Tween 20 15’ pri 37 °C. Naviazanie sondy na nádobky sa potom testovalo scintilačným odčítavaním.
Výsledky
Je značný rozdiel v rýchlosti a špecificite oligonukleotidového pripájania v závislosti na povahe 5’-funkčnej skupiny oligonukleotidu. Oligonukleotidy nesúce 5’aminoskupinu sa pripájali približne dvakrát rýchlejšie ako oligonukleotidy funkcionalizované s 5’-fosfátovou skupinou (pozri tabuľku 2 a obrázok 8). Okrem toho sa kontrolné oligonukleotidy funkcionalizované s 5’hydroxylom, 5’-DMT alebo
| • ·· | ·· | ·· | |||
| • · · | • · | • | • · | ·· | |
| • · | • · | ··· | • | • | |
| • · | • · | • · | • | • | |
| ·· ···· | ·· | ·· | ·· | ·· |
5’-biotínom všetky pripájali podobnými rýchlosťami ako oligonukleotidy funkcionalizované 5-fosfátom, čo spochybňuje 5’ špecifickú povahu chemického pripojenia použitím 5-fosfátovej skupiny.
Tabuľka 2
| 5’-fosfát | 5’-amino | 5’-hydroxyl | 5-DMT | 5’-biotín | |
| Ka (min'1) | 0,0068 | 0,0135 | 0,0063 | 0,0070 | 0,0068 |
| Pripojené oligonukl. (fmol/nádobku) | 608 | 1344 | 542 | 602 | 650 |
| PCR stabilita (% ostávajúcich) | 56 | 69 | 66 | 66 | 62 |
• · • · e · • ··· • · · ·· ·· ·· ·
-65Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:
(i) Prihlasovateľ:
(A) Meno: Applied Research Systems ARS Holding N.V.
(B) Ulica: 14 John B. Gorsiraweg (C) Mesto: Curacao (E) Krajina: Holandské Antily (F) Poštové smerovacie číslo (ZIP): žiadne (ii) Názov vynálezu: Spôsoby amplifikácie a sekvenovania nukleových kyselín (iii) Počet sekvencii: 19 (iv) Počítačom čitateľná forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release č. 1.0, verzia č. 1.30 (EPO) (2) Informácie o sekv. č. 1:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 24 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primér • ·
-66• ···· • · · · · · ·· · · · · (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 1:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG 24 (2) Informácie o sekv. č. 2:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 24 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 2:
CACCAACCCA AACCAACCCA AACC 24 (2) Informácie o sekv. č. 3:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 20 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 3:
GAGGCCAGAA CAGTTCAAGG 20 (2) Informácie o sekv. č. 4:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 20 bázových párov • · • · • ··· • · ···· ·· ··· ···· ·· ·· ··
-67(B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 4:
CCTGTGACAA GACGACTGAA 20 (2) Informácie o sekv. č. 5:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 34 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 5:
TTTTTTTTTT CACCAACCCA AACCAACCCA AACC 34 (2) Informácie o sekv. č. 6:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 34 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer • · ·· • · · · · · ··· ···· ·· ··
-68(xi) Opis sekvencie: sekv. č. 6:
TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG 34 (2) Informácie o sekv. č. 7:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 34 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový prímer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 7:
TTTTTTTTTT CACCAACCCA AACCAACCCA AACC 34 (2) Informácie o sekv. č. 8:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 34 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový prímer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 8:
TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG 34 (2) Informácie o sekv. č. 9:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 42 bázových párov • · • ··· • ·
-69(B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 9:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGTTTTTT TTTTTTTTTT NN 42 (2) Informácie o sekv. č. 10:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 26 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 10:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGG 26 (2) Informácie o sekv. č. 11:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 52 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer • ·
-70(xi) Opis sekvencie: sekv. č. 11:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTCGCCTGG TTCTGGAAGA CA 52 (2) Informácie o sekv. č. 12:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 44 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primér (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 12:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGCCTGTG ACAAGACGAC TGAA 44 (2) Informácie o sekv. č. 13:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 62 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primér (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 13:
TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTGAGGCCA GTGGAAGTCA 60
GA 62 (2) Informácie o sekv. č. 14:
(i) Charakteristiky sekvencie:
• · ··· ···· ·· ·· • · · • · ··· • · · • · · · ·· ·· ·· ·
-71 (A) Dĺžka: 60 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 14:
ττττψτψψττ CACCAACCCA AACCAACCCA AACCGAGCTC AGGCTGAGGC AGGAGAATTG 60 (2) Informácie o sekv. č. 15:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 44 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 15:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGAGCTG AGGAGGAAGA GAGG 44 (2) Informácie o sekv. č. 16:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 52 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina ··
-72(A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 16:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTCGCCTGG TTCTGGAAGA CA 52 (2) Informácie o sekv. č. 17:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 22 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (ix) Znak:
(A) Meno/Kľúč: modifikovaná báza (B) Lokalizácia: 11 (D) Iné informácie: mod. báza = i (ix) Znak:
(A) Meno/Kľúč: modifikovaná báza (B) Lokalizácia: 13 (D) Iné informácie: mod. báza = i (ix) Znak:
(A) Meno/Kľúč: modifikovaná báza (B) Lokalizácia: 15 (D) Iné informácie: mod. báza = i (ix) Znak:
(A) Meno/Kľúč: modifikovaná báza ·· ·· ·· • ·
-73·· · ···· • · · • · ··· • · · · · · ·· ·· ·· (B) Lokalizácia: 17 (D) Iné informácie: mod. báza = i (ix) Znak:
(A) Meno/Kľúč: modifikovaná báza (B) Lokalizácia: 19 (D) Iné informácie: mod. báza = i (ix) Znak:
(A) Meno/Kľúč: modifikovaná báza (B) Lokalizácia: 21 (D) Iné informácie: mod. báza = i (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 17:
TTTTTTTTTT NSNSNSNSNS ns (2) Informácie o sekv. č. 18:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 24 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 18:
CGACAGCCGG AAGGAAGAGG GAGC (2) Informácie o sekv. č. 19:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 18 bázových párov ·· • · · · ··· · · • · ·· ·· ··· · • ···· ·· ··· ···· ·· ·· ··
-74(B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: oligonukleotidový primer (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 19:
GAGAAGGAAA GGGAAAGG ·· • · • ··· • · · · • · · ··
Claims (34)
- (1) vytvorenie najmenej jedného nukleokyselinového templátu, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu (nukleové kyseliny), ktorá sa má amplifikovať, pričom nukleová kyselina (nukleové kyseliny) obsahuje na 5' konci oligonukleotidovú sekvenciu Y a na 3’ konci oligonukleotidovú sekvenciu Z, a okrem toho nesie nukleová kyselina (nukleové kyseliny) na 5’ konci prostriedok na pripojenie nukleovej kyseliny (nukleových kyselín) k tuhému podkladu;1. Spôsob amplifikácie najmenej jednej nukleovej kyseliny, vyznačujúci s a t ý m , že zahŕňa nasledujúce kroky:
- (2) zmiešanie nukleokyselinových templátov s jedným alebo viacerými kolóniovými primermi X, ktoré môžu hybridizovať s oligonukleotidovou sekvenciou v uvedenom templáte (templátoch) na mieste ohraničujúcom nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá sa má amplifikovať, a ktoré na 5’ konci nesú prostriedok na pripojenie kolóniových primerov k tuhému podkladu, v prítomnosti tuhého podkladu, na pripojenie 5' koncov tak nukleokyselinového templátu, ako aj kolóniových primerov, na tuhý podklad;2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotidová sekvencia Z je komplementárna s oligonukleotidovou sekvenciou Y a kolóniový primér X má rovnakú sekvenciu ako oligonukleotidová sekvencia Y.(2) zmiešanie nukleokyselinového templátu (templátov) s jedným alebo viacerými kolóniovými primermi X, ktoré môžu hybridizovať s oligonukleotidovou sekvenciou Z a na 5’ konci nesú prostriedok na pripojenie kolóniových primérov k tuhému podkladu, v prítomnosti tuhého podkladu, na pripojenie 5' koncov tak nukleokyselinového templátu, ako aj kolóniových primérov, na tuhý podklad;
- (3) uskutočňovanie jednej alebo viacerých nukleokyselinových amplifikačných reakcií na naviazanom templáte (templátoch) na generovanie kolónií nukleových kyselín.3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa dva odlišné kolóniové primery X zmiešajú s nukleokyselinovým templátom (templátmi) v kroku (2) a sekvencie kolóniových primérov X sú také, že oligonukleotidová sekvencia Z môže hybridizovať s jedným z kolóniových primérov X, a oligonukleotidová sekvencia Y je rovnaká ako sekvencia jedného z kolóniových primérov X.(3) uskutočňovanie jednej alebo viacerých nukleokyselinových amplifikačných reakcií na naviazanom templáte (templátoch) na generovanie kolónií nukleových kyselín.
- 4. Spôsob amplifikácie najmenej jednej nukleovej kyseliny, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa nasledujúce kroky:·· ···· ··· · · t * · · · ··· · · • · ·· ·· ··· · • · ···· · · ··· ···· ·· ·· ,, ,-76(1) vytvorenie najmenej jedného nukleokyselinového templátu, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu (nukleové kyseliny), ktorá sa má amplifikovať, pričom nukleová kyselina (nukleové kyseliny) nesie na 5’ konci prostriedok na pripojenie nukleovej kyseliny (nukleových kyselín) k tuhému podkladu;
- 5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ďalší krok uskutočňovania najmenej jedného kroku stanovovania sekvencie jednej alebo viacerých vygenerovaných nukleokyselinových kolónií.
- 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že krok stanovovania sekvencie (5) zahŕňa začleňovanie a detekciu značených oligonukleotidov.
- 7. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že sa simultánne stanovujú celkové alebo čiastočné sekvencie amplifikovaných nukleokyselinových templátov, ktoré sú prítomné vo viac ako jednej nukleokyselinovej kolónii.
- 8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa ďalší krok vizualizácie vygenerovaných kolónií.·· • · · • · ··· • · · · • · · · ·· »·-779. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že vizualizačný krok zahŕňa použitie značenej alebo neznačenej nukleokyselinovej sondy.• ·· ·· · ·
- 9 · • · · • · ······· ··
- 10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že prostriedok na pripojenie nukleokyselinového templátu (templátov) a kolóniových primerov k tuhému podkladu zahŕňa prostriedok na kovalentné pripojenie nukleokyselinových sekvencii s tuhému podkladu.
- 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že prostriedkom na kovalentné pripojenie nukleokyselinových sekvencii k tuhému podkladu je chemicky modifikovateľná funkčná skupina.
- 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že chemicky modifikovateľnou funkčnou skupinou je fosfátová skupina, karboxylová alebo aldehydová skupina, tiolová skupina, hydroxylová skupina, dimetoxytrityl (DMT) alebo aminoskupina.
- 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že chemicky modifikovateľnou funkčnou skupinou je aminoskupina.
- 14. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že tuhý podklad je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje latexové guľôčky, dextránové guľôčky, polystyrén, polypropylénový povrch, polyakrylamidový gél, zlaté povrchy, sklenené povrchy a silikónové fólie.
- 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že tuhým podkladom je sklo.
- 16. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že hustota vygenerovaných nukleokyselinových kolónií je 10000/mm2 až 100000/mm2.-78• ·· ·· · · • · • · · • · ······· ·· ·· • · 9 • · ··· • · · * • · · · ·· ·· ·· • · · • e • · · * · ·· ·
- 17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa t ý m, že hustota kolóniových primerov X pripojených na tuhý podklad je najmenej 1 fmol/mm2.
- 18. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 17, vyznačujúci sa t ý m , že hustota nukleokyselinových templátov je 10000/mm2 až 100000/mm2.
- 19. Viacero odlišných nukleokyselinových templátov obsahujúcich nukleové kyseliny, ktoré sa majú amplifikovať, pričom každá z uvedených nukleových kyselín obsahuje na 5’ konci známu oligonukleotidovú sekvenciu Y a na 3' konci známu oligonukleotidovú sekvenciu Z, a okrem toho nesie nukleová kyselina (nukleové kyseliny) na 5’ konci prostriedok na pripojenie nukleovej kyseliny (nukleových kyselín) na tuhý podklad.
- 20. Viacero nukleokyselinových templátov podľa nároku 19, pričom oligonukleotidová sekvencia Zje komplementárna s oligonukleotidovou sekvenciou Y.
- 21. Viacero nukleokyselinových templátov podľa nároku 19, keď sú zmiešané s viacerými kolóniovými primermi X, ktoré môžu hybridizovať s oligonukleotidovou sekvenciou Z a na svojich 5’ koncoch nesú prostriedok na pripojenie kolóniových primerov na tuhý podklad.
- 22. Viacero nukleokyselinových templátov podľa nároku 21, pričom oligonukleotidová sekvencia Z je komplementárna so oligonukleotidovou sekvenciou Y a kolóniový primer X má rovnakú sekvenciu ako oligonukleotidová sekvencia Y.
- 23. Viacero nukleokyselinových templátov podľa nároku 19, keď sú zmiešané s dvoma odlišnými kolóniovými primermi X, pričom sekvencie kolóniových primerov X sú také, že oligonukleotidová sekvencia Z môže hybridizovať s jedným z kolóniových primerov X a oligonukleotidová sekvencia Y je rovnaká ako sekvencia jedného z kolóniových primerov X.·· • · • · · · • · ··· · • · · · · · • · · · · ·· ·· ·· ·· ··
- 24. Viacero nukleokyselinových templátov podľa nároku 21, pričom kolóniové primery X obsahujú degenerovanú primerovú sekvenciu a nukleokyselinové templáty neobsahujú oligonukleotidové sekvencie Y alebo Z.
- 25. Tuhý podklad, vyznačujúci sa tým, že je naňho pripojených viacero kolóniových primerov X, ako boli určené v ktoromkoľvek z predchádzajúcich nárokov, a viacero nukleokyselinových templátov, ako boli definované v ktoromkoľvek z nárokov 19 až 24.
- 26. Tuhý podklad podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že je určený v nárokoch 14 a 15.
- 27. Tuhý podklad podľa nároku 25 alebo 26, vyznačujúci sa tým, že pripojenie nukleokyselinových templátov a kolóniových primerov na tuhý podklad je kovalentné.
- 28. Tuhý podklad, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jednu alebo viacero nukleokyselinových kolónií generovaných spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18.
- 29. Použitie tuhého podkladu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 28 v spôsoboch na amplifikáciu alebo sekvenovanie nukleových kyselín.
- 30. Použitie podľa nároku 29, pričom spôsobom je spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18.
- 31. Použitie spôsobu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18 na amplifikáciu alebo sekvenovanie nukleových kyselín.
- 32. Použitie spôsobu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18, alebo nukleokyselinových kolónií generovaných uvedenými spôsobmi alebo viacerých nukleokyselinových templátov podľa nárokov 19 až 25 alebo tuhých podkladov • ···-80B · · I ·· ·· podľa nárokov 25 až 28 na poskytnutie nukleokyselinových kolónií na sekvenovanie, opätovné sekvenovanie, monitorovanie génovej expresie, vytváranie profilov genetickej diverzity, diagnostiku, skríning, sekvenovanie celého genómu, objavovanie polymorfizmov v celom genóme a na vyhodnocovanie a prípravu celogenómových rezov alebo na akékoľvek iné aplikácie zahŕňajúce amplifikáciu alebo sekvenovanie nukleových kyselín.
- 33. Kit na použitie na amplifikáciu alebo sekvenovanie nukleových kyselín, vyznačujúci sa tým, že obsahuje viacero nukleokyselinových templátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 24 a kolóniové primery podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov naviazané na tuhý podklad.
- 34. Kit podľa nároku 33 na použitie na sekvenovanie, opätovné sekvenovanie, monitorovanie génovej expresie, vytváranie profilov genetickej diverzity, diagnostiku, skríning, sekvenovanie celého genómu, objavovanie polymorfizmov v celom genóme a na vyhodnocovanie alebo na akékoľvek iné aplikácie zahŕňajúce amplifikáciu alebo sekvenovanie nukleových kyselín.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98307985 | 1998-09-30 | ||
| PCT/GB1999/003248 WO2000018957A1 (en) | 1998-09-30 | 1999-09-30 | Methods of nucleic acid amplification and sequencing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK4292001A3 true SK4292001A3 (en) | 2001-12-03 |
Family
ID=8235083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK429-2001A SK4292001A3 (en) | 1998-09-30 | 1999-09-30 | Methods of nucleic acid amplification and sequencing |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7115400B1 (sk) |
| EP (2) | EP1634963B1 (sk) |
| JP (1) | JP2002525125A (sk) |
| KR (1) | KR20010085860A (sk) |
| CN (1) | CN1325458A (sk) |
| AR (1) | AR021833A1 (sk) |
| AT (1) | ATE311474T1 (sk) |
| AU (1) | AU771073B2 (sk) |
| BG (1) | BG105363A (sk) |
| BR (1) | BR9914159A (sk) |
| CA (1) | CA2344575A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ20011183A3 (sk) |
| DE (1) | DE69928683T2 (sk) |
| EA (1) | EA004271B1 (sk) |
| EE (1) | EE200100195A (sk) |
| HK (1) | HK1042525A1 (sk) |
| HU (1) | HUP0105052A3 (sk) |
| IL (1) | IL142178A0 (sk) |
| NO (1) | NO20011303L (sk) |
| NZ (1) | NZ510599A (sk) |
| PL (1) | PL347125A1 (sk) |
| SK (1) | SK4292001A3 (sk) |
| TR (1) | TR200100911T2 (sk) |
| WO (1) | WO2000018957A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA200102420B (sk) |
Families Citing this family (766)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002503954A (ja) * | 1997-04-01 | 2002-02-05 | グラクソ、グループ、リミテッド | 核酸増幅法 |
| US20100130368A1 (en) * | 1998-07-30 | 2010-05-27 | Shankar Balasubramanian | Method and system for sequencing polynucleotides |
| AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| DE10027040A1 (de) * | 2000-06-02 | 2001-12-06 | Basf Lynx Bioscience Ag | Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| ATE397095T1 (de) | 2001-04-20 | 2008-06-15 | Penn State Res Found | Verfahren zur manipulation von nukleinsäuren |
| US7195908B2 (en) * | 2002-10-31 | 2007-03-27 | Corning Incorporated | Supports treated with triamine for immobilizing biomolecules |
| AU2003302770B2 (en) | 2002-12-20 | 2007-07-12 | Caliper Life Sciences, Inc. | Single molecule amplification and detection of DNA |
| CA2513889A1 (en) | 2003-01-29 | 2004-08-19 | 454 Corporation | Double ended sequencing |
| JP2007525571A (ja) | 2004-01-07 | 2007-09-06 | ソレクサ リミテッド | 修飾分子アレイ |
| US7833709B2 (en) | 2004-05-28 | 2010-11-16 | Wafergen, Inc. | Thermo-controllable chips for multiplex analyses |
| WO2006064199A1 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | Solexa Limited | Improved method of nucleotide detection |
| GB0427236D0 (en) | 2004-12-13 | 2005-01-12 | Solexa Ltd | Improved method of nucleotide detection |
| EP1844162B1 (en) | 2005-02-01 | 2014-10-15 | Applied Biosystems, LLC | Method for identifying a sequence in a polynucleotide |
| EP2236628A3 (en) | 2005-02-01 | 2010-10-13 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing |
| GB0514936D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Preparation of templates for nucleic acid sequencing |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| GB0524069D0 (en) * | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| AU2006331512B2 (en) | 2005-12-22 | 2012-02-23 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Active surface coupled polymerases |
| US8192930B2 (en) | 2006-02-08 | 2012-06-05 | Illumina Cambridge Limited | Method for sequencing a polynucleotide template |
| WO2007107710A1 (en) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Solexa Limited | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| US20070231823A1 (en) | 2006-03-23 | 2007-10-04 | Mckernan Kevin J | Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing |
| WO2008002502A2 (en) | 2006-06-23 | 2008-01-03 | Illumina, Inc. | Devices and systems for creation of dna cluster arrays |
| BRPI0715427B1 (pt) * | 2006-07-31 | 2016-04-12 | Wanli Bi | método para amplificação de sequência ou sinal de ácidos nucleicos alvo, oligonucleotideo modificado reversível, mistura e conjunto de reação de amplificação de ácido nucleico |
| US9328378B2 (en) * | 2006-07-31 | 2016-05-03 | Illumina Cambridge Limited | Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers |
| JPWO2008018355A1 (ja) * | 2006-08-08 | 2009-12-24 | シャープ株式会社 | バイオセンサ及びその製造方法並びに当該バイオセンサを用いた検出方法 |
| WO2008021290A2 (en) | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| EP2076609A1 (en) | 2006-10-10 | 2009-07-08 | Illumina Inc. | Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization |
| WO2008069906A2 (en) * | 2006-11-14 | 2008-06-12 | The Regents Of The University Of California | Digital expression of gene analysis |
| EP2126765B1 (en) | 2007-01-26 | 2011-08-24 | Illumina Inc. | Nucleic acid sequencing system and method |
| US8315817B2 (en) | 2007-01-26 | 2012-11-20 | Illumina, Inc. | Independently removable nucleic acid sequencing system and method |
| WO2008093098A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| WO2008096146A1 (en) | 2007-02-07 | 2008-08-14 | Solexa Limited | Preparation of templates for methylation analysis |
| WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| US20100304445A1 (en) * | 2007-06-16 | 2010-12-02 | Waclaw Szybalski | Nucleic acid packaging system |
| WO2008157640A2 (en) | 2007-06-18 | 2008-12-24 | Illumina, Inc. | Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates |
| JP2009000070A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Hitachi Ltd | 大規模並列核酸分析方法 |
| US8759077B2 (en) | 2007-08-28 | 2014-06-24 | Lightspeed Genomics, Inc. | Apparatus for selective excitation of microparticles |
| US8222040B2 (en) * | 2007-08-28 | 2012-07-17 | Lightspeed Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles |
| JP2010537643A (ja) | 2007-08-29 | 2010-12-09 | アプライド バイオシステムズ， エルエルシー | 代替的な核酸配列決定法 |
| WO2009032167A1 (en) * | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Illumina Cambridge | Method for sequencing a polynucleotide template |
| US9388457B2 (en) | 2007-09-14 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Locus specific amplification using array probes |
| US8716190B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-05-06 | Affymetrix, Inc. | Amplification and analysis of selected targets on solid supports |
| US7767441B2 (en) * | 2007-10-25 | 2010-08-03 | Industrial Technology Research Institute | Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules |
| US7811810B2 (en) | 2007-10-25 | 2010-10-12 | Industrial Technology Research Institute | Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules |
| JP2009178159A (ja) | 2007-11-05 | 2009-08-13 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板 |
| US8202691B2 (en) * | 2008-01-25 | 2012-06-19 | Illumina, Inc. | Uniform fragmentation of DNA using binding proteins |
| US8039817B2 (en) | 2008-05-05 | 2011-10-18 | Illumina, Inc. | Compensator for multiple surface imaging |
| US20110105356A1 (en) * | 2008-05-07 | 2011-05-05 | Derosier Chad F | Compositions and methods for providing substances to and from an array |
| US8407012B2 (en) * | 2008-07-03 | 2013-03-26 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods and systems of DNA sequencing |
| WO2010004695A1 (ja) | 2008-07-09 | 2010-01-14 | パナソニック株式会社 | シークエンサー |
| US20100069250A1 (en) * | 2008-08-16 | 2010-03-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Digital PCR Calibration for High Throughput Sequencing |
| GB2467691A (en) | 2008-09-05 | 2010-08-11 | Aueon Inc | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
| US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
| WO2010038042A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Illumina Cambridge Ltd. | Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications |
| US20100087325A1 (en) * | 2008-10-07 | 2010-04-08 | Illumina, Inc. | Biological sample temperature control system and method |
| AU2009319907B2 (en) | 2008-11-03 | 2015-10-01 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting modification resistant nucleic acids |
| US8748103B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-06-10 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US9394567B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis |
| US9365901B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-06-14 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia |
| US8628927B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-01-14 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| EP4335932A2 (en) | 2008-11-07 | 2024-03-13 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of monitoring conditions by sequence analysis |
| US9506119B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-11-29 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of sequence determination using sequence tags |
| US9528160B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-12-27 | Adaptive Biotechnolgies Corp. | Rare clonotypes and uses thereof |
| WO2010068702A2 (en) * | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for hybridizing nucleic acids |
| EP2379748A4 (en) | 2008-12-23 | 2012-08-29 | Illumina Inc | MULTIBASE RELEASE FOR LONG READINGS IN SEQUENCING BY SYNTHESIS PROTOCOLS |
| EP2387627B1 (en) | 2009-01-15 | 2016-03-30 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
| US20100216648A1 (en) | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Febit Holding Gmbh | Synthesis of sequence-verified nucleic acids |
| JP5600880B2 (ja) * | 2009-03-03 | 2014-10-08 | 東洋紡株式会社 | 改良された増幅試薬 |
| JP5239978B2 (ja) * | 2009-03-23 | 2013-07-17 | パナソニック株式会社 | センサおよびシーケンサー |
| US20100285970A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-11-11 | Rose Floyd D | Methods of sequencing nucleic acids |
| WO2010115100A1 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-07 | L&C Diagment, Inc. | Multiplex nucleic acid detection methods and systems |
| AU2010242073C1 (en) | 2009-04-30 | 2015-12-24 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
| US9085798B2 (en) | 2009-04-30 | 2015-07-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
| EP2248914A1 (en) | 2009-05-05 | 2010-11-10 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications |
| US9309566B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification |
| US9309557B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
| US9334531B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-05-10 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
| EP3409792B1 (en) | 2009-06-25 | 2023-09-20 | Fred Hutchinson Cancer Center | Method of measuring adaptive immunity |
| WO2011011175A2 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Illumina, Inc. | Method for sequencing a polynucleotide template |
| WO2011014811A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
| ES2573277T3 (es) | 2009-08-14 | 2016-06-07 | Epicentre Technologies Corporation | Métodos, composiciones y kits de generación de muestras empobrecidas en ARNr o de aislamiento del ARNr de las muestras |
| PT2669387T (pt) | 2009-08-25 | 2016-09-20 | Illumina Inc | Métodos para selecção e amplificação de polinucleótidos |
| US8182994B2 (en) * | 2009-09-15 | 2012-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing |
| US10385391B2 (en) * | 2009-09-22 | 2019-08-20 | President And Fellows Of Harvard College | Entangled mate sequencing |
| ES2628739T3 (es) | 2009-10-15 | 2017-08-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplificación por desplazamiento múltiple |
| US8524450B2 (en) | 2009-10-30 | 2013-09-03 | Illumina, Inc. | Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same |
| EP2510126B1 (en) | 2009-12-07 | 2017-08-09 | Illumina, Inc. | Multi-sample indexing for multiplex genotyping |
| US9323888B2 (en) | 2010-01-19 | 2016-04-26 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| AU2011207561B2 (en) | 2010-01-19 | 2014-02-20 | Verinata Health, Inc. | Partition defined detection methods |
| US20120010085A1 (en) | 2010-01-19 | 2012-01-12 | Rava Richard P | Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples |
| EP2848703A1 (en) | 2010-01-19 | 2015-03-18 | Verinata Health, Inc | Simultaneous determination of aneuploidy and fetal fraction |
| US10388403B2 (en) | 2010-01-19 | 2019-08-20 | Verinata Health, Inc. | Analyzing copy number variation in the detection of cancer |
| AU2011207544A1 (en) | 2010-01-19 | 2012-09-06 | Verinata Health, Inc. | Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic DNA by whole genome sequencing |
| US20120100548A1 (en) | 2010-10-26 | 2012-04-26 | Verinata Health, Inc. | Method for determining copy number variations |
| US9260745B2 (en) | 2010-01-19 | 2016-02-16 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| WO2011091106A2 (en) * | 2010-01-22 | 2011-07-28 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for gene signature - based chemical screening |
| US20110312503A1 (en) | 2010-01-23 | 2011-12-22 | Artemis Health, Inc. | Methods of fetal abnormality detection |
| WO2011106368A2 (en) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Illumina, Inc. | Amplification methods to minimise sequence specific bias |
| DE202011003570U1 (de) | 2010-03-06 | 2012-01-30 | Illumina, Inc. | Systeme und Vorrichtungen zum Detektieren optischer Signale aus einer Probe |
| US9465228B2 (en) | 2010-03-19 | 2016-10-11 | Optical Biosystems, Inc. | Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns |
| US8502867B2 (en) | 2010-03-19 | 2013-08-06 | Lightspeed Genomics, Inc. | Synthetic aperture optics imaging method using minimum selective excitation patterns |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| SI2556171T1 (sl) | 2010-04-05 | 2016-03-31 | Prognosys Biosciences, Inc. | Prostorsko kodirane biološke analize |
| SG185128A1 (en) | 2010-05-06 | 2012-12-28 | Sequenta Inc | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| CA2798635A1 (en) * | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Integrated sample preparation systems and stabilized enzyme mixtures |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| EP2572003A4 (en) | 2010-05-18 | 2016-01-13 | Natera Inc | METHOD FOR NONINVASIVE PRANATAL PLOIDIE ASSIGNMENT |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| CA2801039A1 (en) | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Enumeration of nucleic acids |
| WO2011159942A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Illumina, Inc. | Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids |
| EP2596127A2 (en) | 2010-07-23 | 2013-05-29 | Esoterix Genetic Laboratories, LLC | Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof |
| US9029103B2 (en) | 2010-08-27 | 2015-05-12 | Illumina Cambridge Limited | Methods for sequencing polynucleotides |
| EP2426214A1 (en) | 2010-09-01 | 2012-03-07 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Method for amplifying nucleic acids |
| US20120070830A1 (en) | 2010-09-16 | 2012-03-22 | lbis Biosciences, Inc. | Stabilization of ozone-labile fluorescent dyes by thiourea |
| WO2012040387A1 (en) | 2010-09-24 | 2012-03-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers |
| US8759038B2 (en) | 2010-09-29 | 2014-06-24 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
| US10093981B2 (en) | 2010-10-19 | 2018-10-09 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
| EA022475B1 (ru) * | 2010-10-19 | 2016-01-29 | Ооо "Центр Инновационных Технологий-Нано" | Способ секвенирования днк |
| US20150225792A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-13 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
| US10233501B2 (en) | 2010-10-19 | 2019-03-19 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
| US20150218639A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-06 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
| EP2633069B1 (en) | 2010-10-26 | 2015-07-01 | Illumina, Inc. | Sequencing methods |
| WO2012058096A1 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Illumina, Inc. | Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same |
| US8575071B2 (en) | 2010-11-03 | 2013-11-05 | Illumina, Inc. | Reducing adapter dimer formation |
| US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| EP2643484A4 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-16 | Univ California | METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN |
| US20120152743A1 (en) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | General Electric Company | Method for electroeluting genetic material from dried samples |
| CN110079588B (zh) | 2010-12-17 | 2024-03-15 | 生命技术公司 | 用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒 |
| JP5616773B2 (ja) | 2010-12-21 | 2014-10-29 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置 |
| US9163281B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-20 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
| CN103502463B (zh) | 2010-12-27 | 2016-03-16 | 艾比斯生物科学公司 | 核酸样品的制备方法及组合物 |
| US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
| WO2012100194A1 (en) | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Microfluidic transducer |
| JP6017458B2 (ja) | 2011-02-02 | 2016-11-02 | ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン・スルー・イッツ・センター・フォー・コマーシャリゼーション | 大量並列連続性マッピング |
| WO2012106072A2 (en) * | 2011-02-03 | 2012-08-09 | Illumina, Inc. | Methods for minimizing sequence specific bias |
| WO2012122484A1 (en) | 2011-03-09 | 2012-09-13 | Roberto Polakiewicz | Methods and reagents for creating monoclonal antibodies |
| CN103797129B (zh) | 2011-04-12 | 2016-08-17 | 维里纳塔健康公司 | 使用多态计数来解析基因组分数 |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| GB2484764B (en) | 2011-04-14 | 2012-09-05 | Verinata Health Inc | Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies |
| US9411937B2 (en) | 2011-04-15 | 2016-08-09 | Verinata Health, Inc. | Detecting and classifying copy number variation |
| PL2697397T3 (pl) | 2011-04-15 | 2017-08-31 | The Johns Hopkins University | System bezpiecznego sekwencjonowania |
| EP2718465B1 (en) | 2011-06-09 | 2022-04-13 | Illumina, Inc. | Method of making an analyte array |
| EP2732423A4 (en) | 2011-07-13 | 2014-11-26 | Multiple Myeloma Res Foundation Inc | METHOD FOR DETECTING AND DISTRIBUTING DATA |
| WO2013022778A1 (en) | 2011-08-05 | 2013-02-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing by electrochemical detection |
| US10385475B2 (en) | 2011-09-12 | 2019-08-20 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Random array sequencing of low-complexity libraries |
| EP3290528B1 (en) | 2011-09-23 | 2019-08-14 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| AU2012316218B2 (en) | 2011-09-26 | 2016-03-17 | Gen-Probe Incorporated | Algorithms for sequence determinations |
| CA2852665A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Good Start Genetics, Inc. | Analysis methods |
| WO2013059746A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing |
| US9279159B2 (en) | 2011-10-21 | 2016-03-08 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| WO2013063308A1 (en) | 2011-10-25 | 2013-05-02 | University Of Massachusetts | An enzymatic method to enrich for capped rna, kits for performing same, and compositions derived therefrom |
| EP3305400A3 (en) | 2011-10-28 | 2018-06-06 | Illumina, Inc. | Microarray fabrication system and method |
| EP2774978B1 (en) | 2011-10-31 | 2019-05-15 | Hitachi High-Technologies Corporation | Nucleic acid amplification method |
| CA2858070C (en) | 2011-12-09 | 2018-07-10 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection |
| US9499865B2 (en) | 2011-12-13 | 2016-11-22 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| EP2795333A4 (en) | 2011-12-20 | 2016-02-17 | Univ Michigan | PSEUDOGENS AND USES THEREOF |
| WO2013096838A2 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids |
| EP2794927B1 (en) | 2011-12-22 | 2017-04-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplification primers and methods |
| WO2013096799A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples |
| WO2013096819A2 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Macromolecule positioning by electrical potential |
| ES2645418T3 (es) | 2011-12-22 | 2017-12-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplificación de una secuencia de un ácido ribonucleico |
| US9823246B2 (en) | 2011-12-28 | 2017-11-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon |
| US9506113B2 (en) | 2011-12-28 | 2016-11-29 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid ligation systems and methods |
| US9803231B2 (en) | 2011-12-29 | 2017-10-31 | Ibis Biosciences, Inc. | Macromolecule delivery to nanowells |
| WO2013101743A2 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbott Molecular, Inc. | Microorganism nucelic acid purification from host samples |
| CA2860594A1 (en) | 2012-01-09 | 2013-07-18 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| EP2802666B1 (en) | 2012-01-13 | 2018-09-19 | Data2Bio | Genotyping by next-generation sequencing |
| EP3578697B1 (en) | 2012-01-26 | 2024-03-06 | Tecan Genomics, Inc. | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
| WO2013117595A2 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Illumina Cambridge Limited | Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support |
| US10011871B2 (en) | 2012-02-17 | 2018-07-03 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for accurately identifying mutations |
| EP2817627A2 (en) | 2012-02-21 | 2014-12-31 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| WO2013134162A2 (en) | 2012-03-05 | 2013-09-12 | Sequenta, Inc. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| CA2866254A1 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Oslo Universitetssykehus Hf | Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer |
| NO2694769T3 (sk) | 2012-03-06 | 2018-03-03 | ||
| US9803239B2 (en) | 2012-03-29 | 2017-10-31 | Complete Genomics, Inc. | Flow cells for high density array chips |
| US20130261984A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Illumina, Inc. | Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities |
| BR112014024789B1 (pt) | 2012-04-03 | 2021-05-25 | Illumina, Inc | aparelho de detecção e método para formação de imagem de um substrato |
| EP2834370B1 (en) | 2012-04-03 | 2019-01-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Biomarker associated with irritable bowel syndrome and crohn's disease |
| US8209130B1 (en) | 2012-04-04 | 2012-06-26 | Good Start Genetics, Inc. | Sequence assembly |
| US8812422B2 (en) | 2012-04-09 | 2014-08-19 | Good Start Genetics, Inc. | Variant database |
| US20130274148A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Illumina, Inc. | Portable genetic detection and analysis system and method |
| US10227635B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-03-12 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Capture reactions |
| WO2013166305A1 (en) | 2012-05-02 | 2013-11-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Dna sequencing |
| US10202642B2 (en) | 2012-05-02 | 2019-02-12 | Ibis Biosciences, Inc. | DNA sequencing |
| WO2013166304A1 (en) | 2012-05-02 | 2013-11-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Dna sequencing |
| WO2013166302A1 (en) | 2012-05-02 | 2013-11-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing systems and methods |
| CN104520440B (zh) | 2012-05-08 | 2017-10-03 | 适应生物技术公司 | 用于测量和校准多重pcr反应中的扩增偏倚的组合物和方法 |
| US9012022B2 (en) | 2012-06-08 | 2015-04-21 | Illumina, Inc. | Polymer coatings |
| US8895249B2 (en) | 2012-06-15 | 2014-11-25 | Illumina, Inc. | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| WO2013191775A2 (en) | 2012-06-18 | 2013-12-27 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
| WO2014005076A2 (en) | 2012-06-29 | 2014-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and biomarkers for detection of kidney disorders |
| WO2014008448A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Quantitative assessment of human t-cell repertoire recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation |
| US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
| AU2013292610B2 (en) | 2012-07-17 | 2018-05-17 | Myriad Women's Health, Inc. | System and methods for detecting genetic variation |
| US9092401B2 (en) | 2012-10-31 | 2015-07-28 | Counsyl, Inc. | System and methods for detecting genetic variation |
| US9977861B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes |
| US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US10584381B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| CA2881685C (en) | 2012-08-14 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Microcapsule compositions and methods |
| US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9422602B2 (en) | 2012-08-15 | 2016-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for determining nucleic acid degradation |
| NL2017959B1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-19 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| CA3178340A1 (en) | 2012-08-20 | 2014-02-27 | Illumina, Inc. | Method and system for fluorescence lifetime based sequencing |
| PL2897978T3 (pl) | 2012-09-19 | 2017-08-31 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Sposoby identyfikacji przeciwciał o obniżonej immunogenności |
| JP6449160B2 (ja) | 2012-10-01 | 2019-01-09 | アダプティブ バイオテクノロジーズ コーポレイション | 適応免疫受容体多様性およびクローン性特性決定による免疫能力評価関連出願の相互参照 |
| EP3447150A1 (en) | 2012-10-16 | 2019-02-27 | Abbott Molecular Inc. | Methods and apparatus to sequence a nucleic acid |
| US9365896B2 (en) | 2012-10-19 | 2016-06-14 | Agilent Technologies, Inc. | Addition of an adaptor by invasive cleavage |
| EP2912197B1 (en) | 2012-10-24 | 2019-08-07 | Takara Bio USA, Inc. | Template switch-based methods for producing a product nucleic acid |
| US11525163B2 (en) | 2012-10-29 | 2022-12-13 | The Johns Hopkins University | Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers |
| CA3140836A1 (en) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Courtagen Life Sciences Inc. | A method of removing amplicons of a non-target nucleic acid having one or more methylated cytosines from a sample |
| US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| WO2014093676A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | 10X Technologies, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
| WO2014113204A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
| KR102190198B1 (ko) | 2013-02-08 | 2020-12-14 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 폴리뉴클레오티드 바코드 생성 |
| US9512422B2 (en) | 2013-02-26 | 2016-12-06 | Illumina, Inc. | Gel patterned surfaces |
| DK2964624T3 (en) | 2013-03-08 | 2017-04-03 | Illumina Cambridge Ltd | RHODAMINE COMPOUNDS AND USE AS FLUORESCING LABELS |
| CA2902982C (en) | 2013-03-08 | 2020-08-04 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| DK3553175T3 (da) | 2013-03-13 | 2021-08-23 | Illumina Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af et nukleinsyresekvenseringsbibliotek |
| AU2013382089B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-05-10 | Illumina, Inc. | Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication |
| EP2971169A4 (en) | 2013-03-13 | 2016-10-26 | Abbott Molecular Inc | SYSTEMS AND METHODS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS |
| EP2971175B1 (en) | 2013-03-14 | 2019-04-17 | Abbott Molecular Inc. | Minimizing errors using uracil-dna-n-glycosylase |
| EP2971154A4 (en) | 2013-03-14 | 2017-03-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid control panels |
| WO2014160117A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbott Molecular Inc. | Multiplex methylation-specific amplification systems and methods |
| EP2971159B1 (en) | 2013-03-14 | 2019-05-08 | Molecular Loop Biosolutions, LLC | Methods for analyzing nucleic acids |
| US10767221B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-08 | Illumina, Inc. | Enzyme-linked nucleotides |
| EP2971140B1 (en) | 2013-03-15 | 2019-01-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods to assess contamination in dna sequencing |
| US9255265B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-09 | Illumina, Inc. | Methods for producing stranded cDNA libraries |
| WO2014144092A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Nugen Technologies, Inc. | Sequential sequencing |
| WO2014150851A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleotide analogs for sequencing |
| CA2905410A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Abbott Molecular Inc. | Systems and methods for detection of genomic copy number changes |
| EP2986741B1 (en) | 2013-04-17 | 2019-07-24 | Agency For Science, Technology And Research | Method for generating extended sequence reads |
| WO2014172288A2 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| WO2014197377A2 (en) | 2013-06-03 | 2014-12-11 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and systems for storing sequence read data |
| DK3013983T3 (da) | 2013-06-25 | 2023-03-06 | Prognosys Biosciences Inc | Spatialt kodede biologiske assays ved brug af en mikrofluidisk anordning |
| DK3431614T3 (da) | 2013-07-01 | 2021-12-06 | Illumina Inc | Katalysator fri overfladefunktionalisering og polymerpodning |
| US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
| ES2719579T3 (es) | 2013-07-03 | 2019-07-11 | Illumina Inc | Sistema para secuenciación por síntesis ortogonal |
| SG11201600550WA (en) | 2013-07-25 | 2016-02-26 | Dch Molecular Diagnostics Inc | Methods and compositions for detecting bacterial contamination |
| KR102423377B1 (ko) | 2013-08-05 | 2022-07-25 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 드 노보 합성된 유전자 라이브러리 |
| BR112016000456B1 (pt) | 2013-08-08 | 2021-06-01 | Illumina, Inc | Sistema e método de reutilização de reagentes |
| EP3036359B1 (en) | 2013-08-19 | 2019-10-23 | Abbott Molecular Inc. | Next-generation sequencing libraries |
| JP2016539343A (ja) | 2013-08-30 | 2016-12-15 | イルミナ インコーポレイテッド | 親水性または斑状親水性表面上の液滴の操作 |
| EP3965111A1 (en) | 2013-08-30 | 2022-03-09 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genomic analysis |
| US10395758B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Sequencing methods |
| US9352315B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-05-31 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure |
| GB2535066A (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Personalis Inc | Methods for analyzing genotypes |
| US10941397B2 (en) | 2013-10-17 | 2021-03-09 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same |
| WO2015057985A1 (en) | 2013-10-17 | 2015-04-23 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries |
| US11041203B2 (en) | 2013-10-18 | 2021-06-22 | Molecular Loop Biosolutions, Inc. | Methods for assessing a genomic region of a subject |
| US10851414B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-12-01 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for determining carrier status |
| US10415083B2 (en) | 2013-10-28 | 2019-09-17 | The Translational Genomics Research Institute | Long insert-based whole genome sequencing |
| EP3068883B1 (en) | 2013-11-13 | 2020-04-29 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
| AU2014364180B2 (en) | 2013-12-09 | 2021-03-04 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
| MX360883B (es) | 2013-12-10 | 2018-11-21 | Illumina Inc | Biosensores para análisis biológico o químico y métodos para fabricarlos. |
| US9909181B2 (en) | 2013-12-13 | 2018-03-06 | Northwestern University | Biomarkers for post-traumatic stress states |
| US9719136B2 (en) | 2013-12-17 | 2017-08-01 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same |
| US10768181B2 (en) | 2013-12-17 | 2020-09-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Detection of an antibody against a pathogen |
| EP3572875A1 (en) | 2013-12-19 | 2019-11-27 | Illumina, Inc. | Roll-to-roll process of preparing a patterned substrate and patterned substrate prepared by the same process |
| DK3083994T3 (da) | 2013-12-20 | 2021-09-13 | Illumina Inc | Bevarelse af genomisk konnektivitetsinformation i fragmenterede genomiske DNA-prøver |
| WO2015103225A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Illumina, Inc. | Addressable flow cell using patterned electrodes |
| US9677132B2 (en) | 2014-01-16 | 2017-06-13 | Illumina, Inc. | Polynucleotide modification on solid support |
| WO2015108663A1 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Illumina, Inc. | Amplicon preparation and sequencing on solid supports |
| WO2015107430A2 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| SI3108009T1 (sl) | 2014-02-18 | 2021-09-30 | Illumina, Inc. | Postopki in sestavki za profiliranje DNK |
| WO2015131107A1 (en) | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
| CA2941612A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods using randomer-containing synthetic molecules |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| US11390921B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs) |
| BR112016023625A2 (pt) | 2014-04-10 | 2018-06-26 | 10X Genomics, Inc. | dispositivos fluídicos, sistemas e métodos para encapsular e particionar reagentes, e aplicações dos mesmos |
| EP3132059B1 (en) | 2014-04-17 | 2020-01-08 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| CN106460070B (zh) | 2014-04-21 | 2021-10-08 | 纳特拉公司 | 检测染色体片段中的突变和倍性 |
| US11053548B2 (en) | 2014-05-12 | 2021-07-06 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for detecting aneuploidy |
| SG10201809312QA (en) | 2014-05-16 | 2018-11-29 | Illumina Inc | Nucleic acid synthesis techniques |
| CA3127071A1 (en) | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Alex Aravanis | Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge |
| GB201410022D0 (en) | 2014-06-05 | 2014-07-16 | Orion Diagnostica Oy | Method |
| US10596569B2 (en) | 2014-06-05 | 2020-03-24 | Illumina, Inc. | Systems and methods including a rotary valve for at least one of sample preparation or sample analysis |
| EP3151733B1 (en) | 2014-06-06 | 2020-04-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease |
| US20150353989A1 (en) | 2014-06-09 | 2015-12-10 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation for nucleic acid amplification |
| GB201410420D0 (en) | 2014-06-11 | 2014-07-23 | Illumina Cambridge Ltd | Methods for estimating cluster numbers |
| AU2015273232B2 (en) | 2014-06-13 | 2021-09-16 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for preparing sequencing libraries |
| GB201410646D0 (en) | 2014-06-14 | 2014-07-30 | Illumina Cambridge Ltd | Methods of increasing sequencing accuracy |
| KR102598819B1 (ko) | 2014-06-23 | 2023-11-03 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인 (GUIDE-Seq) |
| WO2015200541A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-12-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital pcr barcoding |
| US10017759B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-07-10 | Illumina, Inc. | Library preparation of tagged nucleic acid |
| CN110211637B (zh) | 2014-06-26 | 2023-10-27 | 10X基因组学有限公司 | 核酸序列装配的方法和系统 |
| JP6838969B2 (ja) | 2014-06-26 | 2021-03-03 | １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド | 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法 |
| JP2017521654A (ja) | 2014-06-27 | 2017-08-03 | アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ | ヒトペギウイルス２（ＨＰｇＶ−２）を検出するための組成物および方法 |
| SG11201610910QA (en) | 2014-06-30 | 2017-01-27 | Illumina Inc | Methods and compositions using one-sided transposition |
| ES2864855T3 (es) | 2014-07-24 | 2021-10-14 | Abbott Molecular Inc | Métodos para la detección y análisis de mycobacterium tuberculosis |
| CA2956925C (en) | 2014-08-01 | 2024-02-13 | Dovetail Genomics, Llc | Tagging nucleic acids for sequence assembly |
| SG11201700891SA (en) | 2014-08-06 | 2017-03-30 | Nugen Technologies Inc | Digital measurements from targeted sequencing |
| WO2016025332A1 (en) | 2014-08-12 | 2016-02-18 | President And Fellows Of Harvard College | System and method for monitoring health based on collected bodily fluid |
| US10174383B2 (en) | 2014-08-13 | 2019-01-08 | Vanadis Diagnostics | Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample |
| EP3183577B1 (en) | 2014-08-21 | 2020-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Reversible surface functionalization |
| WO2016040446A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for selectively suppressing non-target sequences |
| WO2016040602A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Epicentre Technologies Corporation | Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv |
| CN107002293B (zh) | 2014-09-17 | 2020-12-08 | 艾比斯生物科学公司 | 使用脉冲读数光学的通过合成测序 |
| CN107002121B (zh) | 2014-09-18 | 2020-11-13 | 亿明达股份有限公司 | 用于分析核酸测序数据的方法和系统 |
| US10429399B2 (en) | 2014-09-24 | 2019-10-01 | Good Start Genetics, Inc. | Process control for increased robustness of genetic assays |
| US10040048B1 (en) | 2014-09-25 | 2018-08-07 | Synthego Corporation | Automated modular system and method for production of biopolymers |
| WO2016057950A1 (en) | 2014-10-09 | 2016-04-14 | Illumina, Inc. | Method and device for separating immiscible liquids to effectively isolate at least one of the liquids |
| CA2964799A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Illumina Cambridge Limited | Contiguity preserving transposition |
| US20160122817A1 (en) | 2014-10-29 | 2016-05-05 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
| AU2015339191A1 (en) | 2014-10-29 | 2017-05-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples |
| US10125399B2 (en) | 2014-10-30 | 2018-11-13 | Personalis, Inc. | Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin |
| JP6759197B2 (ja) | 2014-10-31 | 2020-09-23 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 新規のポリマーおよびｄｎａコポリマーコーティング |
| GB201419731D0 (en) | 2014-11-05 | 2014-12-17 | Illumina Cambridge Ltd | Sequencing from multiple primers to increase data rate and density |
| EP3215846B1 (en) | 2014-11-05 | 2020-03-11 | Nirmidas Biotech, Inc. | Metal composites for enhanced imaging |
| US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
| CN114438174A (zh) | 2014-11-11 | 2022-05-06 | 伊鲁米那股份有限公司 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
| EP3218482A4 (en) | 2014-11-11 | 2018-05-09 | Abbott Molecular Inc. | Hybridization probes and methods |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| WO2016081712A1 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Bigdatabio, Llc | Systems and methods for genomic manipulations and analysis |
| US10233490B2 (en) | 2014-11-21 | 2019-03-19 | Metabiotech Corporation | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
| WO2016086029A1 (en) | 2014-11-25 | 2016-06-02 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing |
| WO2016090266A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Amyris, Inc. | High-throughput sequencing of polynucleotides |
| EP4095261A1 (en) | 2015-01-06 | 2022-11-30 | Molecular Loop Biosciences, Inc. | Screening for structural variants |
| WO2016114970A1 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | 10X Genomics, Inc. | Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same |
| AU2016206706B2 (en) | 2015-01-13 | 2021-10-07 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information |
| CA2975852A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
| WO2016126987A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Compositions and methods for synthetic gene assembly |
| MX2017010142A (es) | 2015-02-09 | 2017-12-11 | 10X Genomics Inc | Sistemas y metodos para determinar variacion estructural y ajuste de fases con datos de recuperacion de variantes. |
| EP3259372B1 (en) | 2015-02-17 | 2020-11-18 | MGI Tech Co., Ltd. | Dna sequencing using controlled strand displacement |
| US10208339B2 (en) | 2015-02-19 | 2019-02-19 | Takara Bio Usa, Inc. | Systems and methods for whole genome amplification |
| CN107407685B (zh) | 2015-02-20 | 2021-08-03 | 宝生物工程（美国)有限公司 | 快速精确分配、可视化和分析单个细胞的方法 |
| WO2016138122A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Methods for diagnosing infectious disease and determining hla status using immune repertoire sequencing |
| EP4286516A3 (en) | 2015-02-24 | 2024-03-06 | 10X Genomics, Inc. | Partition processing methods and systems |
| JP2018505688A (ja) | 2015-02-24 | 2018-03-01 | １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド | 標的化核酸配列包括度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）のための方法 |
| AU2016235288B2 (en) | 2015-03-24 | 2019-02-28 | Illumina Cambridge Limited | Methods, carrier assemblies, and systems for imaging samples for biological or chemical analysis |
| CN107532205B (zh) | 2015-03-31 | 2021-06-08 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 模板的表面连环化 |
| EP3277294B1 (en) | 2015-04-01 | 2024-05-15 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
| CN107532207B (zh) | 2015-04-10 | 2021-05-07 | 空间转录公司 | 生物样本的空间区别、多重核酸分析 |
| JP2018518155A (ja) | 2015-04-15 | 2018-07-12 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | Ｌｎａベース突然変異体エンリッチメント次世代シーケンシングアッセイ |
| WO2016172377A1 (en) | 2015-04-21 | 2016-10-27 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
| US11085073B2 (en) | 2015-04-24 | 2021-08-10 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support |
| EP3286338B1 (en) | 2015-04-24 | 2023-11-01 | Atila Biosystems Incorporated | Amplification with primers of limited nucleotide composition |
| WO2016170179A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on solid support |
| US10844428B2 (en) | 2015-04-28 | 2020-11-24 | Illumina, Inc. | Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS) |
| WO2016183106A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| CN107810415B (zh) | 2015-05-11 | 2021-06-22 | 亿明达股份有限公司 | 用于发现和分析治疗剂的平台 |
| US10395759B2 (en) * | 2015-05-18 | 2019-08-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for copy number variant detection |
| WO2016187179A1 (en) * | 2015-05-18 | 2016-11-24 | 10X Genomics, Inc. | Stabilized reducing agents and methods using same |
| GB201508858D0 (en) | 2015-05-22 | 2015-07-01 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels |
| EP3302804B1 (en) | 2015-05-29 | 2022-07-13 | Illumina, Inc. | Sample carrier and assay system for conducting designated reactions |
| US11274333B2 (en) | 2015-05-29 | 2022-03-15 | Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) LLC | Compositions and methods for preparing sequencing libraries |
| DK3303614T3 (da) | 2015-05-29 | 2020-05-18 | Illumina Cambridge Ltd | Forbedret anvendelse af overfladeprimere i klynger |
| CN107924121B (zh) | 2015-07-07 | 2021-06-08 | 亿明达股份有限公司 | 经由纳米压印的选择性表面图案化 |
| US10526664B2 (en) | 2015-07-14 | 2020-01-07 | Abbott Molecular Inc. | Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis |
| EP3322805B1 (en) | 2015-07-14 | 2021-10-20 | Abbott Molecular Inc. | Purification of nucleic acids using copper-titanium oxides or magnesium-titanium oxides |
| EP3325648B1 (en) | 2015-07-17 | 2023-03-29 | Illumina, Inc. | Polymer sheets for sequencing applications |
| WO2017015543A1 (en) | 2015-07-23 | 2017-01-26 | Asuragen, Inc. | Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating a/t-rich segments |
| JP6712606B2 (ja) | 2015-07-30 | 2020-06-24 | イラミーナ インコーポレーテッド | ヌクレオチドのオルトゴナルな脱ブロッキング |
| JP6946292B2 (ja) | 2015-08-06 | 2021-10-06 | エイアールシー バイオ リミテッド ライアビリティ カンパニー | ゲノム分析のためのシステムおよび方法 |
| WO2017027653A1 (en) | 2015-08-11 | 2017-02-16 | The Johns Hopkins University | Assaying ovarian cyst fluid |
| US10976334B2 (en) | 2015-08-24 | 2021-04-13 | Illumina, Inc. | In-line pressure accumulator and flow-control system for biological or chemical assays |
| WO2017037078A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Illumina Cambridge Limited | Systems and methods of improving droplet operations in fluidic systems |
| EP4006150A1 (en) | 2015-09-09 | 2022-06-01 | QIAGEN GmbH | Polymerase enzyme |
| EP3347467B1 (en) | 2015-09-11 | 2021-06-23 | The General Hospital Corporation | Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq) |
| CN108368482A (zh) | 2015-09-18 | 2018-08-03 | 特韦斯特生物科学公司 | 寡核酸变体文库及其合成 |
| KR20180058772A (ko) | 2015-09-22 | 2018-06-01 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 합성을 위한 가요성 기판 |
| GB201516987D0 (en) | 2015-09-25 | 2015-11-11 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| AU2016331185A1 (en) | 2015-09-30 | 2018-04-26 | The General Hospital Corporation | Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (CIRCLE-seq) |
| WO2017087724A1 (en) | 2015-11-17 | 2017-05-26 | Omniome, Inc. | Methods for determining sequence profiles |
| US11371094B2 (en) | 2015-11-19 | 2022-06-28 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides |
| CN108603307A (zh) | 2015-12-01 | 2018-09-28 | 特韦斯特生物科学公司 | 功能化表面及其制备 |
| CN115369161A (zh) | 2015-12-04 | 2022-11-22 | 10X 基因组学有限公司 | 用于核酸分析的方法和组合物 |
| ES2928728T3 (es) | 2015-12-07 | 2022-11-22 | Zymergen Inc | Mejora de cepas microbianas mediante una plataforma de ingeniería genómica HTP |
| US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
| US11208649B2 (en) | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
| US11293029B2 (en) | 2015-12-07 | 2022-04-05 | Zymergen Inc. | Promoters from Corynebacterium glutamicum |
| EP3400298B1 (en) | 2016-01-08 | 2024-03-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiple beads per droplet resolution |
| KR20180108578A (ko) | 2016-01-11 | 2018-10-04 | 일루미나, 인코포레이티드 | 마이크로 형광 측정기, 유체 시스템, 및 플로우 셀 래치 클램프 모듈을 구비하는 검출 장치 |
| JP6902052B2 (ja) | 2016-02-08 | 2021-07-14 | アールジーン・インコーポレイテッドＲｇｅｎｅ， Ｉｎｃ． | 複数のリガーゼ組成物、システム、および方法 |
| US11081208B2 (en) | 2016-02-11 | 2021-08-03 | 10X Genomics, Inc. | Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data |
| WO2017160788A2 (en) | 2016-03-14 | 2017-09-21 | RGENE, Inc. | HYPER-THERMOSTABLE LYSINE-MUTANT ssDNA/RNA LIGASES |
| EP3433373B1 (en) | 2016-03-22 | 2022-01-12 | Myriad Women's Health, Inc. | Combinatorial dna screening |
| EP3377226B1 (en) | 2016-03-28 | 2021-02-17 | Illumina, Inc. | Multi-plane microarrays |
| EP3442706A4 (en) | 2016-04-13 | 2020-02-19 | NextGen Jane, Inc. | SAMPLE COLLECTION AND PRESERVATION DEVICES, SYSTEMS AND METHODS |
| EP4269611A3 (en) | 2016-05-11 | 2024-01-17 | Illumina, Inc. | Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems |
| WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
| ES2861478T3 (es) | 2016-05-18 | 2021-10-06 | Illumina Inc | Estampación de autoensamblado que utiliza superficies hidrófobas estampadas |
| US11118233B2 (en) | 2016-05-18 | 2021-09-14 | The University Of Chicago | BTK mutation and ibrutinib resistance |
| US11299783B2 (en) | 2016-05-27 | 2022-04-12 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
| AU2017278350B2 (en) | 2016-06-06 | 2023-10-19 | Redvault Biosciences, Lp | Target reporter constructs and uses thereof |
| US11708574B2 (en) | 2016-06-10 | 2023-07-25 | Myriad Women's Health, Inc. | Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof |
| CN109642252A (zh) | 2016-06-17 | 2019-04-16 | 加州理工学院 | 核酸反应及相关方法和组合物 |
| KR102345898B1 (ko) | 2016-06-30 | 2022-01-03 | 지머젠 인코포레이티드 | 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 |
| KR102345899B1 (ko) | 2016-06-30 | 2021-12-31 | 지머젠 인코포레이티드 | 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 |
| US11091795B2 (en) | 2016-07-11 | 2021-08-17 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias |
| WO2018013558A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-18 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for detecting nucleic acid regions |
| CN106086203A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-11-09 | 深圳绿倍生态科技有限公司 | 一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用 |
| CN109070044B (zh) | 2016-07-21 | 2021-07-30 | 宝生物工程（美国)有限公司 | 使用多孔装置进行的多z平面成像和分配 |
| KR102475710B1 (ko) | 2016-07-22 | 2022-12-08 | 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 | 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 및 이의 제조를 위한 조합 인덱싱 방법 |
| CN109890198A (zh) | 2016-08-22 | 2019-06-14 | 拜欧卢米克有限公司 | 种子处理系统、装置和方法 |
| JP6854340B2 (ja) | 2016-08-22 | 2021-04-07 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | デノボ合成された核酸ライブラリ |
| WO2018042251A1 (en) | 2016-08-29 | 2018-03-08 | Oslo Universitetssykehus Hf | Chip-seq assays |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| KR102217487B1 (ko) | 2016-09-21 | 2021-02-23 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 기반 데이터 저장 |
| WO2018064116A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems for data compression |
| US10385214B2 (en) | 2016-09-30 | 2019-08-20 | Illumina Cambridge Limited | Fluorescent dyes and their uses as biomarkers |
| US11530352B2 (en) | 2016-10-03 | 2022-12-20 | Illumina, Inc. | Fluorescent detection of amines and hydrazines and assaying methods thereof |
| US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| IL290157B2 (en) | 2016-10-14 | 2023-09-01 | Illumina Inc | cartridge kit |
| US20190348149A1 (en) | 2016-11-16 | 2019-11-14 | Illumina, Inc. | Validation methods and systems for sequence variant calls |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| EA201991262A1 (ru) | 2016-12-16 | 2020-04-07 | Твист Байосайенс Корпорейшн | Библиотеки вариантов иммунологического синапса и их синтез |
| US11021738B2 (en) | 2016-12-19 | 2021-06-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet tagging contiguity preserved tagmented DNA |
| US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| EP3559004B1 (en) | 2016-12-22 | 2023-07-05 | Illumina Cambridge Limited | Coumarin compounds and their uses as fluorescent labels |
| US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| ES2924223T3 (es) | 2017-01-04 | 2022-10-05 | Mgi Tech Co Ltd | Secuenciación de ácidos nucleicos mediante reactivos de afinidad |
| GB201704754D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| BR112019014651A2 (pt) | 2017-01-18 | 2020-07-21 | Illumina, Inc. | métodos para sequenciar moléculas de ácido nucleico e para preparar adaptadores de sequenciamento, produto de programa de computador, e, sistema de computador. |
| EP3354746B1 (en) | 2017-01-30 | 2019-05-29 | Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology GmbH | Novel spike-in oligonucleotides for normalization of sequence data |
| WO2018140966A1 (en) | 2017-01-30 | 2018-08-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for droplet-based single cell barcoding |
| US10968447B2 (en) | 2017-01-31 | 2021-04-06 | Myriad Women's Health, Inc. | Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides |
| WO2018144217A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Counsyl, Inc. | Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides |
| US10995333B2 (en) | 2017-02-06 | 2021-05-04 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid preparation |
| WO2018148724A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus |
| WO2018148727A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from 9°n |
| EP3580351A1 (en) | 2017-02-13 | 2019-12-18 | Qiagen Sciences, LLC | Polymerase enzyme from 9°n |
| WO2018148723A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from pyrococcus abyssi |
| WO2018148726A1 (en) | 2017-02-13 | 2018-08-16 | Qiagen Waltham Inc. | Polymerase enzyme from phage t4 |
| WO2018152162A1 (en) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | Omniome, Inc. | Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation |
| EP3586255A4 (en) | 2017-02-22 | 2021-03-31 | Twist Bioscience Corporation | NUCLEIC ACID-BASED DATA STORAGE |
| WO2018170169A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
| US10941445B2 (en) | 2017-03-24 | 2021-03-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Universal hairpin primers |
| WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
| WO2018187013A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Omniome, Inc. | Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions |
| CA3059839C (en) | 2017-04-23 | 2023-01-03 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| SG11201909916YA (en) | 2017-04-23 | 2019-11-28 | Illumina Cambridge Ltd | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| SG11201909394PA (en) | 2017-04-23 | 2019-11-28 | Illumina Inc | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| EP3872187B1 (en) | 2017-04-23 | 2022-09-21 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| US10161003B2 (en) | 2017-04-25 | 2018-12-25 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
| US11028435B2 (en) | 2017-05-01 | 2021-06-08 | Illumina, Inc. | Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing |
| AU2018266377A1 (en) | 2017-05-08 | 2019-11-14 | Illumina, Inc. | Universal short adapters for indexing of polynucleotide samples |
| WO2018213803A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Neon Therapeutics, Inc. | Immunogenic neoantigen identification |
| EP3625715A4 (en) | 2017-05-19 | 2021-03-17 | 10X Genomics, Inc. | DATA SET ANALYSIS SYSTEMS AND METHODS |
| JP2020520645A (ja) | 2017-05-19 | 2020-07-16 | ザイマージェン インコーポレイテッド | Ｎａｄｐｈの増大を導く生合成経路のゲノム工学 |
| US10844372B2 (en) | 2017-05-26 | 2020-11-24 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
| CN116064732A (zh) | 2017-05-26 | 2023-05-05 | 10X基因组学有限公司 | 转座酶可接近性染色质的单细胞分析 |
| CA3064619A1 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Zymergen Inc. | A high-throughput (htp) genomic engineering platform for improving saccharopolyspora spinosa |
| ES2875579T3 (es) | 2017-06-06 | 2021-11-10 | Zymergen Inc | Plataforma de ingeniería genómica de HTP para mejorar Escherichia coli |
| JP2020524494A (ja) | 2017-06-06 | 2020-08-20 | ザイマージェン インコーポレイテッド | ハイスループットトランスポゾン変異誘発 |
| EP3635112A2 (en) | 2017-06-06 | 2020-04-15 | Zymergen, Inc. | A htp genomic engineering platform for improving fungal strains |
| AU2018280131A1 (en) | 2017-06-07 | 2020-01-02 | Illumina, Inc. | Single cell whole genome libraries for methylation sequencing |
| EP3634992B1 (en) | 2017-06-08 | 2024-03-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for identifying epitopes |
| WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| CA3066744A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| US11186862B2 (en) | 2017-06-20 | 2021-11-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | MDA using bead oligonucleotide |
| WO2019002265A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Universität Für Bodenkultur Wien | NOVEL BIOMARKERS FOR THE DETECTION OF SENESCENT CELLS |
| GB201711219D0 (en) | 2017-07-12 | 2017-08-23 | Illumina Cambridge Ltd | Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications |
| EP3655153B1 (en) | 2017-07-18 | 2020-09-16 | Omniome, Inc. | Method of chemically modifying plastic surfaces |
| EP3662482A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-06-10 | Illumina Inc. | Sequencing system with multiplexed biological sample aggregation |
| KR20230004943A (ko) | 2017-08-01 | 2023-01-06 | 일루미나, 인코포레이티드 | 뉴클레오티드 서열분석용 하이드로겔 비드 |
| EP3662083A4 (en) | 2017-08-01 | 2021-03-03 | Illumina, Inc. | SPATIAL INDEXING OF GENETIC MATERIAL AND LIBRARY MANUFACTURING USING HYDROGEL BEADS AND FLOW CELLS |
| EP4209597A1 (en) | 2017-08-01 | 2023-07-12 | MGI Tech Co., Ltd. | Nucleic acid sequencing method |
| WO2019033065A1 (en) | 2017-08-11 | 2019-02-14 | Atila Biosystems, Inc. | DIGITAL AMPLIFICATION WITH LIMITED NUCLEOTIDE COMPOSITION PRIMERS |
| CA3072136A1 (en) | 2017-08-15 | 2019-02-21 | Omniome, Inc. | Scanning apparatus and methods useful for detection of chemical and biological analytes |
| WO2019038594A2 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Biolumic Limited | TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY |
| CA3075505A1 (en) | 2017-09-11 | 2019-03-14 | Twist Bioscience Corporation | Gpcr binding proteins and synthesis thereof |
| US11447818B2 (en) | 2017-09-15 | 2022-09-20 | Illumina, Inc. | Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers |
| AU2018335405A1 (en) | 2017-09-20 | 2020-04-09 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for differentiating somatic and germline variants |
| US10837047B2 (en) | 2017-10-04 | 2020-11-17 | 10X Genomics, Inc. | Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers |
| CN111787930A (zh) | 2017-10-06 | 2020-10-16 | 芝加哥大学 | 针对癌症特异性抗原对t淋巴细胞的筛选 |
| GB201716931D0 (en) | 2017-10-16 | 2017-11-29 | Illumina Cambridge Ltd | New fluorescent compounds and their use as biomarkers |
| SG11201912745WA (en) | 2017-10-16 | 2020-01-30 | Illumina Inc | Deep learning-based splice site classification |
| KR102416048B1 (ko) | 2017-10-16 | 2022-07-04 | 일루미나, 인코포레이티드 | 변이체 분류를 위한 심층 컨볼루션 신경망 |
| AU2018353136B2 (en) | 2017-10-19 | 2022-05-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows |
| US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
| GB2583590A (en) | 2017-10-20 | 2020-11-04 | Twist Bioscience Corp | Heated nanowells for polynucleotide synthesis |
| WO2019084043A1 (en) | 2017-10-26 | 2019-05-02 | 10X Genomics, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS |
| WO2019084165A1 (en) | 2017-10-27 | 2019-05-02 | 10X Genomics, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PREPARATION AND ANALYSIS |
| EP3704247B1 (en) | 2017-11-02 | 2023-01-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Transposase-based genomic analysis |
| MX2019003148A (es) | 2017-11-13 | 2019-05-27 | The Multiple Myeloma Res Foundation Inc | Base de datos, de datos moleculares, omicos, de inmunoterapia, metabolicos, epigeneticos y clinicos, integrados. |
| WO2019099751A1 (en) | 2017-11-15 | 2019-05-23 | 10X Genomics, Inc. | Functionalized gel beads |
| US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
| WO2019103967A1 (en) | 2017-11-22 | 2019-05-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating cancer |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
| WO2019108851A1 (en) | 2017-11-30 | 2019-06-06 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis |
| US11701656B2 (en) | 2018-01-02 | 2023-07-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Multi-droplet capture |
| JP7191448B2 (ja) | 2018-01-04 | 2022-12-19 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | Ｄｎａベースのデジタル情報ストレージ |
| WO2019136376A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Illumina, Inc. | High-throughput sequencing with semiconductor-based detection |
| KR102239487B1 (ko) | 2018-01-08 | 2021-04-14 | 일루미나, 인코포레이티드 | 반도체-기반 검출을 사용한 고-처리율 서열분석 |
| AU2019206709B2 (en) | 2018-01-15 | 2021-09-09 | Illumina Cambridge Limited | Deep learning-based variant classifier |
| WO2019152539A1 (en) | 2018-01-30 | 2019-08-08 | Optical Biosystems, Inc. | Method for detecting particles using structured illumination |
| CN111699253A (zh) | 2018-01-31 | 2020-09-22 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 用于解卷积分区条码的方法和组合物 |
| US20200370096A1 (en) | 2018-01-31 | 2020-11-26 | Dovetail Genomics, Llc | Sample prep for dna linkage recovery |
| CN112005115A (zh) | 2018-02-12 | 2020-11-27 | 10X基因组学有限公司 | 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法 |
| US11180752B2 (en) | 2018-02-13 | 2021-11-23 | Illumina, Inc. | DNA sequencing using hydrogel beads |
| US11639928B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-05-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations |
| CN111902540A (zh) | 2018-03-20 | 2020-11-06 | 齐默尔根公司 | 用于中国仓鼠卵巢细胞基因工程改造的htp平台 |
| WO2019183188A1 (en) | 2018-03-22 | 2019-09-26 | Illumina, Inc. | Preparation of nucleic acid libraries from rna and dna |
| AU2019248635B2 (en) | 2018-04-02 | 2022-01-27 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing |
| AU2019247652A1 (en) | 2018-04-02 | 2020-10-15 | Enumera Molecular, Inc. | Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules |
| CN112262218A (zh) | 2018-04-06 | 2021-01-22 | 10X基因组学有限公司 | 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法 |
| EP3553182A1 (en) | 2018-04-11 | 2019-10-16 | Université de Bourgogne | Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection |
| WO2019200338A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-17 | Illumina, Inc. | Variant classifier based on deep neural networks |
| US11512002B2 (en) | 2018-04-18 | 2022-11-29 | University Of Virginia Patent Foundation | Silica materials and methods of making thereof |
| CA3097583A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Omniome, Inc. | Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods |
| CN111051525A (zh) | 2018-04-20 | 2020-04-21 | 伊鲁米纳公司 | 包封单细胞的方法、包封的单细胞及其用途 |
| EP4234718A3 (en) | 2018-04-26 | 2023-11-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes |
| WO2019213619A1 (en) | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Abbott Laboratories | Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products |
| RU2766688C2 (ru) | 2018-05-15 | 2022-03-15 | Иллумина, Инк. | Композиции и способы химического расщепления и снятия защиты для связанных с поверхностью олигонуклеотидов |
| KR102447811B1 (ko) | 2018-05-17 | 2022-09-27 | 일루미나, 인코포레이티드 | 감소된 증폭 편향을 갖는 고속대량 단일 세포 서열분석 |
| AU2019270243A1 (en) | 2018-05-18 | 2021-01-07 | Twist Bioscience Corporation | Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization |
| US10801064B2 (en) | 2018-05-31 | 2020-10-13 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
| US11814750B2 (en) | 2018-05-31 | 2023-11-14 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
| EP3802874A1 (en) | 2018-05-31 | 2021-04-14 | Omniome, Inc. | Increased signal to noise in nucleic acid sequencing |
| EP4269618A3 (en) | 2018-06-04 | 2024-01-10 | Illumina, Inc. | Methods of making high-throughput single-cell transcriptome libraries |
| US20190385700A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-19 | Guardant Health, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR DETERMINING The CELLULAR ORIGIN OF CELL-FREE NUCLEIC ACIDS |
| US11932899B2 (en) | 2018-06-07 | 2024-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules |
| US11703427B2 (en) | 2018-06-25 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for cell and bead processing |
| US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| CN110684829A (zh) * | 2018-07-05 | 2020-01-14 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒 |
| US20200251183A1 (en) | 2018-07-11 | 2020-08-06 | Illumina, Inc. | Deep Learning-Based Framework for Identifying Sequence Patterns that Cause Sequence-Specific Errors (SSEs) |
| CA3107983A1 (en) | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for adjusting tumor mutational burden by tumor fraction and coverage |
| EP3827097A1 (en) | 2018-07-24 | 2021-06-02 | Omniome, Inc. | Serial formation of ternary complex species |
| US20200032335A1 (en) | 2018-07-27 | 2020-01-30 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for metabolome analysis |
| KR20210043634A (ko) | 2018-08-15 | 2021-04-21 | 일루미나, 인코포레이티드 | 라이브러리 인리치먼트를 개선하기 위한 조성물 및 방법 |
| EP4249651A3 (en) | 2018-08-20 | 2023-10-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions |
| US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| SG11202102019UA (en) | 2018-08-28 | 2021-03-30 | 10X Genomics Inc | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample |
| CA3109646A1 (en) | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for detecting contamination between samples |
| JP2021535489A (ja) | 2018-08-31 | 2021-12-16 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 無細胞ｄｎａにおけるマイクロサテライト不安定性の検出 |
| WO2020096691A2 (en) | 2018-09-04 | 2020-05-14 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for detecting allelic imbalance in cell-free nucleic acid samples |
| US11339440B2 (en) | 2018-09-20 | 2022-05-24 | Tamirna Gmbh | Micro-RNA signatures for the prediction of liver dysfunction |
| NZ759665A (en) | 2018-10-15 | 2022-07-01 | Illumina Inc | Deep learning-based techniques for pre-training deep convolutional neural networks |
| JP2022503873A (ja) | 2018-10-25 | 2022-01-12 | イルミナ インコーポレイテッド | インデックス及びバーコードを使用してアレイ上のリガンドを識別するための方法及び組成物 |
| MX2021003772A (es) | 2018-10-26 | 2021-05-27 | Illumina Inc | Modulacion de globulos de polimero para procesamiento de adn. |
| EP3874060A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-09-08 | Guardant Health, Inc. | Methods, compositions and systems for calibrating epigenetic partitioning assays |
| US10704094B1 (en) | 2018-11-14 | 2020-07-07 | Element Biosciences, Inc. | Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding |
| US10768173B1 (en) * | 2019-09-06 | 2020-09-08 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US10876148B2 (en) | 2018-11-14 | 2020-12-29 | Element Biosciences, Inc. | De novo surface preparation and uses thereof |
| US20240011086A1 (en) | 2018-11-15 | 2024-01-11 | Omniome, Inc. | Electronic detection of nucleic acid structure |
| EP3887540B1 (en) | 2018-11-30 | 2023-08-23 | Illumina, Inc. | Analysis of multiple analytes using a single assay |
| CN113166805A (zh) | 2018-12-04 | 2021-07-23 | 欧姆尼欧美公司 | 用于核酸测序和其他分析测定的混合相流体 |
| AU2019391274A1 (en) | 2018-12-05 | 2021-01-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification |
| CN113366120B (zh) * | 2018-12-07 | 2024-05-14 | 深圳华大生命科学研究院 | 纳米孔测序方法 |
| US11459607B1 (en) | 2018-12-10 | 2022-10-04 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes |
| KR20210103931A (ko) | 2018-12-14 | 2021-08-24 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 서열분석 동안 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 페이싱 감소 |
| KR102594019B1 (ko) | 2018-12-17 | 2023-10-26 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 폴리뉴클레오타이드 서열분석에 사용하기 위한 조성물 |
| WO2020126595A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | Illumina Cambridge Limited | Primer oligonucleotide for sequencing |
| WO2020126602A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-25 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for paired end sequencing using a single surface primer |
| SG11202012558VA (en) | 2018-12-19 | 2021-01-28 | Illumina Inc | Methods for improving polynucleotide cluster clonality priority |
| WO2020132350A2 (en) | 2018-12-20 | 2020-06-25 | Omniome, Inc. | Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes |
| EP3898969A1 (en) | 2018-12-20 | 2021-10-27 | Guardant Health, Inc. | Methods, compositions, and systems for improving recovery of nucleic acid molecules |
| US11293061B2 (en) | 2018-12-26 | 2022-04-05 | Illumina Cambridge Limited | Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group |
| WO2020142768A1 (en) | 2019-01-04 | 2020-07-09 | Northwestern University | Storing temporal data into dna |
| US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11845983B1 (en) | 2019-01-09 | 2023-12-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for multiplexing of droplet based assays |
| EP3908678A1 (en) | 2019-01-10 | 2021-11-17 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence |
| AU2020216438A1 (en) | 2019-01-31 | 2021-07-29 | Guardant Health, Inc. | Compositions and methods for isolating cell-free DNA |
| US11467153B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-10-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
| US11851683B1 (en) | 2019-02-12 | 2023-12-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for selective analysis of cellular samples |
| US11584953B2 (en) | 2019-02-12 | 2023-02-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
| WO2020167574A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-08-20 | Omniome, Inc. | Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes |
| WO2020172444A1 (en) | 2019-02-20 | 2020-08-27 | Omniome, Inc. | Scanning apparatus and methods for detecting chemical and biological analytes |
| US11655499B1 (en) | 2019-02-25 | 2023-05-23 | 10X Genomics, Inc. | Detection of sequence elements in nucleic acid molecules |
| WO2020176678A1 (en) | 2019-02-26 | 2020-09-03 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor |
| SG11202109283UA (en) | 2019-02-26 | 2021-09-29 | Twist Bioscience Corp | Variant nucleic acid libraries for antibody optimization |
| WO2020176659A1 (en) | 2019-02-27 | 2020-09-03 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free dna |
| EP3837365A1 (en) | 2019-03-01 | 2021-06-23 | Illumina, Inc. | High-throughput single-nuclei and single-cell libraries and methods of making and of using |
| NL2023327B1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-17 | Illumina Inc | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| SG11202012554QA (en) | 2019-03-01 | 2021-01-28 | Illumina Cambridge Ltd | Tertiary amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels |
| AU2020230955A1 (en) | 2019-03-01 | 2021-01-07 | Illumina Cambridge Limited | Exocyclic amine-substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels |
| WO2020178231A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Illumina, Inc. | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| EP3938537A1 (en) | 2019-03-11 | 2022-01-19 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing optically tagged beads |
| WO2020191390A2 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based quality scoring |
| NL2023311B9 (en) | 2019-03-21 | 2021-03-12 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| US11347965B2 (en) | 2019-03-21 | 2022-05-31 | Illumina, Inc. | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| US11210554B2 (en) | 2019-03-21 | 2021-12-28 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| NL2023316B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based sequencing |
| NL2023310B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| US11421271B2 (en) | 2019-03-28 | 2022-08-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels |
| WO2020206170A1 (en) | 2019-04-02 | 2020-10-08 | Progenity, Inc. | Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules |
| US11738336B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-08-29 | Western Digital Technologies, Inc. | Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing |
| US11609208B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-03-21 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles |
| US11112468B2 (en) | 2019-04-12 | 2021-09-07 | Western Digital Technologies, Inc. | Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes |
| US11327073B2 (en) | 2019-04-12 | 2022-05-10 | Western Digital Technologies, Inc. | Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes |
| US11579217B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-02-14 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors |
| US11423306B2 (en) | 2019-05-16 | 2022-08-23 | Illumina, Inc. | Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing |
| US11593649B2 (en) | 2019-05-16 | 2023-02-28 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
| WO2020243579A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| WO2020243722A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for improving patient monitoring after surgery |
| US11644406B2 (en) | 2019-06-11 | 2023-05-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Calibrated focus sensing |
| CN114729342A (zh) | 2019-06-21 | 2022-07-08 | 特韦斯特生物科学公司 | 基于条形码的核酸序列装配 |
| US20220154173A1 (en) | 2019-07-12 | 2022-05-19 | Iiiumina Cambridge Limited | Compositions and Methods for Preparing Nucleic Acid Sequencing Libraries Using CRISPR/CAS9 Immobilized on a Solid Support |
| WO2021011803A1 (en) | 2019-07-16 | 2021-01-21 | Omniome, Inc. | Synthetic nucleic acids having non-natural structures |
| US10656368B1 (en) | 2019-07-24 | 2020-05-19 | Omniome, Inc. | Method and system for biological imaging using a wide field objective lens |
| EP4028407B1 (en) | 2019-09-10 | 2023-08-16 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Reversible modification of nucleotides |
| US11208682B2 (en) | 2019-09-13 | 2021-12-28 | Western Digital Technologies, Inc. | Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags |
| BR112021026562A2 (pt) | 2019-09-20 | 2022-11-29 | Illumina Inc | Métodos e composições para identificar ligantes em arranjos com o uso de índices e códigos de barras |
| US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| WO2021061694A1 (en) | 2019-09-23 | 2021-04-01 | Zymergen Inc. | Method for counterselection in microorganisms |
| US11788137B2 (en) | 2019-09-30 | 2023-10-17 | Diagenode S.A. | Diagnostic and/or sequencing method and kit |
| WO2021076152A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for capping nucleic acids |
| DK3812472T3 (da) | 2019-10-21 | 2023-02-20 | Univ Freiburg Albert Ludwigs | Virkelig uvildig in vitro-undersøgelse til profilering af off-target-aktivitet af en eller flere målspecifikke programmerbare nukleaser i celler (abnoba-seq) |
| WO2021092433A2 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| EP4055185A1 (en) | 2019-11-08 | 2022-09-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
| US11747329B2 (en) | 2019-11-22 | 2023-09-05 | Western Digital Technologies, Inc. | Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection |
| US20210214800A1 (en) | 2019-11-26 | 2021-07-15 | Guardant Health, Inc. | Methods, compositions and systems for improving the binding of methylated polynucleotides |
| KR20220107231A (ko) | 2019-11-27 | 2022-08-02 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 사이클로옥타테트라엔 함유 염료 및 조성물 |
| SG11202109486QA (en) | 2019-12-19 | 2021-09-29 | Illumina Inc | High-throughput single-cell libraries and methods of making and of using |
| US11498078B2 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell receiver and methods of use |
| US11747262B2 (en) | 2019-12-23 | 2023-09-05 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell carrier and methods of use |
| EP4219754B1 (en) | 2019-12-23 | 2024-05-15 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rna-templated ligation |
| US20210189483A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-24 | Mgi Tech Co. Ltd. | Controlled strand-displacement for paired end sequencing |
| EP4085135A4 (en) | 2019-12-31 | 2023-08-02 | Singular Genomics Systems, Inc. | POLYNUCLEOTIDE BARCODES FOR LONG READ SEQUENCING |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US11821035B1 (en) | 2020-01-29 | 2023-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods of making gene expression libraries |
| WO2021152586A1 (en) | 2020-01-30 | 2021-08-05 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| WO2021158511A1 (en) | 2020-02-04 | 2021-08-12 | Omniome, Inc. | Flow cells and methods for their manufacture and use |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| US11835462B2 (en) | 2020-02-11 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for partitioning a biological sample |
| IL294909A (en) | 2020-02-13 | 2022-09-01 | Zymergen Inc | A metagenomic library and natural product discovery platform |
| WO2021162028A1 (ja) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | 東レ株式会社 | バイオチップの製造方法 |
| WO2021168353A2 (en) | 2020-02-20 | 2021-08-26 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based many-to-many base calling |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| US11926863B1 (en) | 2020-02-27 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells |
| US11768175B1 (en) | 2020-03-04 | 2023-09-26 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic methods for spatial analysis |
| WO2021180724A1 (en) | 2020-03-09 | 2021-09-16 | Illumina, Inc. | Improvements in nucleic acid sequencing |
| CN114040985A (zh) | 2020-03-09 | 2022-02-11 | 因美纳有限公司 | 用于对多核苷酸进行测序的方法 |
| EP4121554A4 (en) | 2020-03-18 | 2024-03-06 | Mgi Tech Co Ltd | PHASE RESTORATION IN MASSIVELY PARALLEL SEQUENCING |
| WO2021214766A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto |
| ES2965354T3 (es) | 2020-04-22 | 2024-04-12 | 10X Genomics Inc | Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana |
| EP4143338A1 (en) | 2020-04-30 | 2023-03-08 | Guardant Health, Inc. | Methods for sequence determination using partitioned nucleic acids |
| US11188778B1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-30 | Illumina, Inc. | Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator |
| CN115836135A (zh) | 2020-05-05 | 2023-03-21 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法 |
| WO2021224677A1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-11 | Akershus Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing bowel cancer |
| CA3177286A1 (en) | 2020-05-12 | 2021-11-18 | Illumina Inc. | Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase |
| US11851700B1 (en) | 2020-05-13 | 2023-12-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules |
| JP2023526252A (ja) | 2020-05-14 | 2023-06-21 | ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド | 相同組換え修復欠損の検出 |
| WO2021236929A1 (en) | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| WO2021237087A1 (en) | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| WO2021242834A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | 10X Genomics, Inc. | Method for resetting an array |
| EP4025692A2 (en) | 2020-06-02 | 2022-07-13 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid library methods |
| WO2021247568A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | 10X Genomics, Inc. | Spatial trancriptomics for antigen-receptors |
| EP4162074B1 (en) | 2020-06-08 | 2024-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| WO2021252617A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Illumina, Inc. | Methods for increasing yield of sequencing libraries |
| WO2021252591A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
| US11787831B2 (en) | 2020-06-22 | 2023-10-17 | Illumina Cambridge Limited | Nucleosides and nucleotides with 3′ acetal blocking group |
| AU2021294334A1 (en) | 2020-06-25 | 2023-02-02 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of DNA methylation |
| KR20230037503A (ko) | 2020-06-30 | 2023-03-16 | 일루미나, 인코포레이티드 | 무흔적 dna를 생성하기 위한 촉매적으로 제어된 합성에 의한 서열분석 |
| US20230242967A1 (en) | 2020-07-02 | 2023-08-03 | Illumina, Inc. | A method to calibrate nucleic acid library seeding efficiency in flowcells |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| KR20230038145A (ko) | 2020-07-08 | 2023-03-17 | 일루미나, 인코포레이티드 | 트랜스포좀 담체로서의 비드 |
| WO2023282916A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Guardant Health, Inc. | Methods of detecting genomic rearrangements using cell free nucleic acids |
| WO2022015600A2 (en) | 2020-07-13 | 2022-01-20 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods of sequencing complementary polynucleotides |
| US11981964B2 (en) | 2020-07-28 | 2024-05-14 | Illumina Cambridge Limited | Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels |
| WO2022026761A1 (en) | 2020-07-30 | 2022-02-03 | Guardant Health, Inc. | Methods for isolating cell-free dna |
| AU2021320307A1 (en) | 2020-08-06 | 2023-02-16 | Illumina Cambridge Limited | Preparation of RNA and DNA sequencing libraries using bead-linked transposomes |
| EP4193363A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-06-14 | Oxford Nanopore Technologies plc | Methods of identifying nucleic acid barcodes |
| KR20230051508A (ko) | 2020-08-18 | 2023-04-18 | 일루미나, 인코포레이티드 | 핵산의 서열-특이적 표적화된 전위 및 선택과 분류 |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| EP4205126A1 (en) | 2020-08-25 | 2023-07-05 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for predicting an origin of a variant |
| AU2021339945A1 (en) | 2020-09-11 | 2023-03-02 | Illumina Cambridge Limited | Methods of enriching a target sequence from a sequencing library using hairpin adaptors |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| US20220154285A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-05-19 | Guardant Health, Inc. | Analysis of methylated dna comprising methylation-sensitive or methylation-dependent restrictions |
| WO2022087150A2 (en) | 2020-10-21 | 2022-04-28 | Illumina, Inc. | Sequencing templates comprising multiple inserts and compositions and methods for improving sequencing throughput |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| US20220195516A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing |
| AU2021409136A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-06-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| US20220195518A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| WO2022140629A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Guardant Health, Inc. | Methods and systems for analyzing methylated polynucleotides |
| WO2022165188A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | Illumina, Inc. | Methods, compositions and kits to improve seeding efficiency of flow cells with polynucleotides |
| JP2024506304A (ja) | 2021-02-04 | 2024-02-13 | イルミナ インコーポレイテッド | トランスポソーム結合ビーズ上でのロングインデックス付き連結リード生成 |
| US11486001B2 (en) | 2021-02-08 | 2022-11-01 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides |
| US20240043915A1 (en) | 2021-02-13 | 2024-02-08 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof |
| WO2022182682A1 (en) | 2021-02-23 | 2022-09-01 | 10X Genomics, Inc. | Probe-based analysis of nucleic acids and proteins |
| KR20230156364A (ko) | 2021-03-05 | 2023-11-14 | 가던트 헬쓰, 인크. | 분자 반응을 분석하기 위한 방법 및 관련 측면 |
| EP4305200A1 (en) | 2021-03-09 | 2024-01-17 | Guardant Health, Inc. | Detecting the presence of a tumor based on off-target polynucleotide sequencing data |
| WO2022197752A1 (en) | 2021-03-16 | 2022-09-22 | Illumina, Inc. | Tile location and/or cycle based weight set selection for base calling |
| WO2022198068A1 (en) | 2021-03-18 | 2022-09-22 | 10X Genomics, Inc. | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample |
| AU2022245985A1 (en) | 2021-03-22 | 2023-09-21 | Illumina Cambridge Limited | Methods for improving nucleic acid cluster clonality |
| BR112023019894A2 (pt) | 2021-03-29 | 2023-11-14 | Illumina Inc | Composições e métodos para avaliar os danos ao dna em uma biblioteca e normalizar a distorção do tamanho do amplicon |
| KR20230161979A (ko) | 2021-03-29 | 2023-11-28 | 일루미나, 인코포레이티드 | 개선된 라이브러리 제조 방법 |
| WO2022212330A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Improved methods of isothermal complementary dna and library preparation |
| EP4314283A1 (en) | 2021-03-31 | 2024-02-07 | Illumina, Inc. | Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction |
| US20220336054A1 (en) | 2021-04-15 | 2022-10-20 | Illumina, Inc. | Deep Convolutional Neural Networks to Predict Variant Pathogenicity using Three-Dimensional (3D) Protein Structures |
| BR112023024130A2 (pt) | 2021-05-20 | 2024-01-30 | Illumina Cambridge Ltd | Composições e métodos para sequenciamento por síntese |
| CN117677435A (zh) | 2021-06-15 | 2024-03-08 | 伊鲁米纳公司 | 用于测序的不含水凝胶的表面官能化 |
| US11859241B2 (en) | 2021-06-17 | 2024-01-02 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
| US11535892B1 (en) | 2021-06-17 | 2022-12-27 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
| US20220411864A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Illumina, Inc. | Compositions, methods, kits, cartridges, and systems for sequencing reagents |
| WO2023278184A1 (en) | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| AU2022300970A1 (en) | 2021-06-29 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Self-learned base caller, trained using oligo sequences |
| WO2023287617A1 (en) | 2021-07-13 | 2023-01-19 | Illumina, Inc. | Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| EP4374343A1 (en) | 2021-07-19 | 2024-05-29 | Illumina, Inc. | Intensity extraction with interpolation and adaptation for base calling |
| US11455487B1 (en) | 2021-10-26 | 2022-09-27 | Illumina Software, Inc. | Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling |
| EP4373965A1 (en) | 2021-07-21 | 2024-05-29 | DNAe Diagnostics Limited | Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides |
| GB202110479D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
| GB202110485D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
| CN117813391A (zh) | 2021-07-23 | 2024-04-02 | 因美纳有限公司 | 制备用于dna测序的基底表面的方法 |
| IL309786A (en) | 2021-07-28 | 2024-02-01 | Illumina Inc | Quality score calibration of BASECALLING systems |
| KR20240035413A (ko) | 2021-08-03 | 2024-03-15 | 일루미나, 인코포레이티드 | 다중 염기 호출자 모델을 사용한 염기 호출 |
| WO2023034489A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| WO2023035003A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Elegen Corp. | Multi-way bead-sorting devices, systems, and methods of use thereof using pressure sources |
| US20230096386A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-03-30 | Illumina Cambridge Limited | Polynucleotide sequencing |
| WO2023056328A2 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Illumina, Inc. | Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples |
| CA3234961A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Illumina, Inc. | Methods for capturing library dna for sequencing |
| WO2023086847A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | Encodia, Inc. | Methods for barcoding macromolecules in individual cells |
| WO2023086635A1 (en) | 2021-11-15 | 2023-05-19 | Vir Biotechnology, Inc. | Virological and molecular surrogates of response to sars-cov-2 neutralizing antibody sotrovimab |
| CN117813390A (zh) | 2021-12-16 | 2024-04-02 | 因美纳有限公司 | 用于表面结合的多核苷酸的金属定向裂解的方法 |
| AU2022409487A1 (en) | 2021-12-16 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Hybrid clustering |
| AU2022413263A1 (en) | 2021-12-17 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Orthogonal hybridization |
| WO2023122491A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Illumina Cambridge Limited | Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| WO2023122499A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Illumina Cambridge Limited | Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| US20230212667A1 (en) | 2021-12-29 | 2023-07-06 | Illumina Cambridge Limited | Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers |
| WO2023135485A1 (en) | 2022-01-13 | 2023-07-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Prostate cancer markers and uses thereof |
| WO2023141154A1 (en) | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Illumina Cambridge Limited | Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing |
| WO2023152568A2 (en) | 2022-02-10 | 2023-08-17 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing lung cancer |
| CA3223669A1 (en) | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Niall Gormley | Concurrent sequencing of forward and reverse complement strands on concatenated polynucleotides for methylation detection |
| WO2023175013A1 (en) | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Illumina, Inc. | Methods for preparing signals for concurrent sequencing |
| CA3223115A1 (en) | 2022-03-28 | 2023-10-05 | Xiaolin Wu | Labeled avidin and methods for sequencing |
| US20230314322A1 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-05 | Illumina, Inc. | Systems and methods of sequencing polynucleotides |
| CA3223037A1 (en) | 2022-03-30 | 2023-10-05 | Oliver MILLER | Methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides |
| CA3222797A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Ramesh NEELAKANDAN | Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group |
| CA3223128A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for improving sequencing signals |
| US20230348973A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-11-02 | Illumina Cambridge Limited | Paired-end re-synthesis using blocked p5 primers |
| WO2023196572A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-12 | Illumina Singapore Pte. Ltd. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2023209606A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres |
| WO2023220602A1 (en) | 2022-05-09 | 2023-11-16 | Guardant Health, Inc. | Detecting degradation based on strand bias |
| US20230383342A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-11-30 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| US20230392201A1 (en) | 2022-06-06 | 2023-12-07 | Element Biosciences, Inc. | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
| WO2024003087A1 (en) | 2022-06-28 | 2024-01-04 | Illumina, Inc. | Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing |
| WO2024039516A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Illumina, Inc. | Third dna base pair site-specific dna detection |
| US20240124916A1 (en) | 2022-09-16 | 2024-04-18 | Illumina Cambridge Limited | Nanoparticle with polynucleotide binding site and method of making thereof |
| WO2024061799A1 (en) | 2022-09-19 | 2024-03-28 | Illumina, Inc. | Deformable polymers comprising immobilised primers |
| US20240102067A1 (en) | 2022-09-26 | 2024-03-28 | Illumina, Inc. | Resynthesis Kits and Methods |
| US20240124929A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-18 | Illumina, Inc. | Mesophilic compositions for nucleic acid amplification |
| US20240110234A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Amplification Compositions and Methods |
| WO2024073047A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides |
| US20240110221A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Methods of modulating clustering kinetics |
| US20240140939A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-05-02 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing |
| WO2024073043A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides |
| US20240124914A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-18 | Illumina, Inc. | Thermophilic compositions for nucleic acid amplification |
| WO2024069581A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina Singapore Pte. Ltd. | Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use |
| GB202215624D0 (en) | 2022-10-21 | 2022-12-07 | Dnae Diagnostics Ltd | Clonal amplification |
Family Cites Families (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4957858A (en) | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| EP0224126A3 (en) | 1985-11-25 | 1989-02-01 | The University of Calgary | Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| CA1340843C (en) | 1987-07-31 | 1999-12-07 | J. Lawrence Burg | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| SE8801070D0 (sv) | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
| US6107023A (en) * | 1988-06-17 | 2000-08-22 | Genelabs Technologies, Inc. | DNA amplification and subtraction techniques |
| GB8818020D0 (en) | 1988-07-28 | 1988-09-01 | Ici Plc | Method for amplification of nucleotide sequences |
| CA2004326A1 (en) | 1988-12-23 | 1990-06-23 | Nanibushan Dattagupta | Assay of sequences using amplified genes |
| US5629158A (en) * | 1989-03-22 | 1997-05-13 | Cemu Bitecknik Ab | Solid phase diagnosis of medical conditions |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| US5800992A (en) * | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| CA2044616A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-04-27 | Roger Y. Tsien | Dna sequencing |
| CA2036946C (en) * | 1990-04-06 | 2001-10-16 | Kenneth V. Deugau | Indexing linkers |
| US5326692B1 (en) * | 1992-05-13 | 1996-04-30 | Molecular Probes Inc | Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift |
| US5645994A (en) * | 1990-07-05 | 1997-07-08 | University Of Utah Research Foundation | Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences |
| ES2130177T3 (es) | 1991-08-10 | 1999-07-01 | Medical Res Council | Tratamiento de poblaciones de celulas. |
| WO1993004199A2 (en) | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Scientific Generics Limited | Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids |
| CA2077135A1 (en) * | 1991-08-30 | 1993-03-01 | Joh-E Ikeda | A method of dna amplification |
| DE69333650T2 (de) * | 1992-02-19 | 2006-01-12 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Neue anordnungn von oligonukleotiden und ihr nutzen zum sortieren, isolieren, sequenzieren und manipulieren von nukleinsäuren |
| WO1994002634A1 (en) * | 1992-07-24 | 1994-02-03 | University Of South Australia | Amplification and detection process |
| RU2048522C1 (ru) * | 1992-10-14 | 1995-11-20 | Институт белка РАН | Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления |
| US5436142A (en) * | 1992-11-12 | 1995-07-25 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences |
| US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| JPH07203998A (ja) | 1994-01-26 | 1995-08-08 | Hamamatsu Photonics Kk | 核酸塩基配列決定方法 |
| ATE220424T1 (de) | 1994-05-28 | 2002-07-15 | Tepnel Medical Ltd | Herstellung von nukleinsaeurekopien |
| US5641658A (en) | 1994-08-03 | 1997-06-24 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support |
| US6060288A (en) * | 1994-08-03 | 2000-05-09 | Mosaic Technologies | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
| CA2218188A1 (en) | 1995-04-11 | 1996-10-17 | Trustees Of Boston University | Solid phase sequencing of biopolymers |
| US5753439A (en) * | 1995-05-19 | 1998-05-19 | Trustees Of Boston University | Nucleic acid detection methods |
| JP3974941B2 (ja) | 1995-11-21 | 2007-09-12 | イェール ユニバーシティ | 単分子セグメントの増幅および検出 |
| US5939291A (en) * | 1996-06-14 | 1999-08-17 | Sarnoff Corporation | Microfluidic method for nucleic acid amplification |
| US6218142B1 (en) * | 1997-03-05 | 2001-04-17 | Michael Wassenegger | Nucleic acid molecules encoding polypeptides having the enzymatic activity of an RNA-directed RNA polymerase (RDRP) |
| JP2002503954A (ja) | 1997-04-01 | 2002-02-05 | グラクソ、グループ、リミテッド | 核酸増幅法 |
| WO1998044152A1 (en) * | 1997-04-01 | 1998-10-08 | Glaxo Group Limited | Method of nucleic acid sequencing |
| CA2256563A1 (en) | 1997-04-04 | 1998-10-15 | Innogenetics N.V. | Isothermal polymerase chain reaction by cycling the concentration of divalent metal ions |
| US6235471B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Caliper Technologies Corp. | Closed-loop biochemical analyzers |
| EP1801214B1 (en) | 1997-07-07 | 2010-11-10 | Medical Research Council | In vitro sorting method |
| US6326489B1 (en) * | 1997-08-05 | 2001-12-04 | Howard Hughes Medical Institute | Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays |
| US6124120A (en) * | 1997-10-08 | 2000-09-26 | Yale University | Multiple displacement amplification |
| US6511803B1 (en) * | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6248558B1 (en) * | 1998-03-31 | 2001-06-19 | Vanderbilt University | Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity |
| US6316229B1 (en) * | 1998-07-20 | 2001-11-13 | Yale University | Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers |
| AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| EP1149175A2 (en) | 1999-01-11 | 2001-10-31 | President And Fellows Of Harvard College | Isothermal amplification of dna |
| US6300070B1 (en) * | 1999-06-04 | 2001-10-09 | Mosaic Technologies, Inc. | Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids |
| JP6049051B2 (ja) | 2011-07-29 | 2016-12-21 | 日東電工株式会社 | 両面真空成膜方法 |
-
1999
- 1999-09-28 AR ARP990104889A patent/AR021833A1/es not_active Application Discontinuation
- 1999-09-30 CA CA002344575A patent/CA2344575A1/en not_active Abandoned
- 1999-09-30 NZ NZ510599A patent/NZ510599A/xx unknown
- 1999-09-30 EE EEP200100195A patent/EE200100195A/xx unknown
- 1999-09-30 IL IL14217899A patent/IL142178A0/xx unknown
- 1999-09-30 AU AU61088/99A patent/AU771073B2/en not_active Ceased
- 1999-09-30 ZA ZA200102420A patent/ZA200102420B/en unknown
- 1999-09-30 EP EP05016082.9A patent/EP1634963B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 AT AT99947713T patent/ATE311474T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 CZ CZ20011183A patent/CZ20011183A3/cs unknown
- 1999-09-30 BR BR9914159-0A patent/BR9914159A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 WO PCT/GB1999/003248 patent/WO2000018957A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-09-30 KR KR1020017003997A patent/KR20010085860A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-09-30 EP EP99947713A patent/EP1117827B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 HU HU0105052A patent/HUP0105052A3/hu unknown
- 1999-09-30 SK SK429-2001A patent/SK4292001A3/sk unknown
- 1999-09-30 DE DE69928683T patent/DE69928683T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 PL PL99347125A patent/PL347125A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-09-30 US US09/806,531 patent/US7115400B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-30 TR TR2001/00911T patent/TR200100911T2/xx unknown
- 1999-09-30 CN CN99813058A patent/CN1325458A/zh active Pending
- 1999-09-30 EA EA200100402A patent/EA004271B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-09-30 JP JP2000572404A patent/JP2002525125A/ja active Pending
-
2001
- 2001-03-14 NO NO20011303A patent/NO20011303L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-03-20 BG BG105363A patent/BG105363A/bg unknown
-
2002
- 2002-06-05 HK HK02104254.1A patent/HK1042525A1/zh unknown
-
2006
- 2006-08-17 US US11/506,146 patent/US8652810B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-01-08 US US14/150,607 patent/US9297006B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-02-22 US US15/050,345 patent/US10370652B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK4292001A3 (en) | Methods of nucleic acid amplification and sequencing | |
| ES2380923T3 (es) | Procedimientos de cuantificación de microARN y ARN interferentes pequeños | |
| US8795971B2 (en) | Centroid markers for image analysis of high density clusters in complex polynucleotide sequencing | |
| KR20030055343A (ko) | 고체 서포트에서 핵산의 등온 증폭 | |
| WO2015085274A1 (en) | Methods for sequencing nucleic acids | |
| CA2803693A1 (en) | Methods for nucleic acid capture and sequencing | |
| WO2016201111A1 (en) | Methods for sequencing nucleic acids | |
| WO2007106802A2 (en) | Method for linear amplification of bisulfite converted dna | |
| CN106244578A (zh) | 用于对核酸进行测序的方法 | |
| CN109689883B (zh) | 用于连接细胞组成物和基质的方法 | |
| US20100285970A1 (en) | Methods of sequencing nucleic acids | |
| MXPA01003266A (en) | Methods of nucleic acid amplification and sequencing | |
| US20060003360A1 (en) | Method for analyzing variation of nucleic acid and method for analyzing gene expression | |
| WO2006003638A2 (en) | Novel method for labeling nucleic acid in a sequence-specific manner, and method for detecting nucleic acid using the same |