JP2018518155A - Lnaベース突然変異体エンリッチメント次世代シーケンシングアッセイ - Google Patents
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Abstract
超高感度アッセイであって、例えば、腫瘍遺伝子材料の血液ベース資源(循環腫瘍細胞または血漿)、または限定量のDNA、例えば、腫瘍DNAが利用可能である他の環境からの突然変異の検出のための超高感度アッセイ。本アッセイはエストロゲン受容体において例示されるが、他の遺伝子中の突然変異を標的化するために広くカスタマイズ可能である。
Description
優先権の主張
本出願は、2015年4月15日に出願された米国仮特許出願第62/147,851号明細書、および2015年10月29日に出願された同第62/248,154号明細書の利益を主張する。上記の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2015年4月15日に出願された米国仮特許出願第62/147,851号明細書、および2015年10月29日に出願された同第62/248,154号明細書の利益を主張する。上記の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府により資金提供を受けた研究または開発
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金第CA129933号のもと政府支援により作製された。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金第CA129933号のもと政府支援により作製された。政府は本発明において一定の権利を有する。
超高感度PCRベースアッセイであって、例えば、腫瘍遺伝子材料の血液ベース資源(循環腫瘍細胞または血漿)、または限定量のDNA、例えば、腫瘍DNAが利用可能である他の環境からの突然変異の検出のための超高感度PCRベースアッセイが記載される。
非組織ベース資源からの腫瘍由来遺伝子材料の分析は、癌の管理を大幅に変化させつつある。血漿および尿中の循環腫瘍DNA(ctDNA)、循環腫瘍細胞(CTC)、およびエキソソームを含むがこれらに限定されない、腫瘍由来DNAの多数の資源が存在する。しかしながら、これらの資源の全てからの腫瘍特異的突然変異の検出は、正常細胞DNAのバックグラウンドにおけるそれらの例外的な希少性により、複雑化する。
腫瘍DNAの非侵襲的資源からの突然変異検出の従来の方法は、不十分な感度およびコストにより限定される。本明細書において、それらの欠点に対処するためのEnrich−Seqとして公知の新たなアプローチが記載される。本方法は、ロックド核酸クランプを、広範なインプットDNAに適合し得るライブラリー調製のための新規技術との組合せで使用して突然変異体エンリッチメントを得る。次いで、高度にストリンジェントな多面的生物情報学的アプローチを適用して突然変異コールの最適な特異度を確保する。
したがって、本明細書において、二本鎖DNA分子(dsDNA)の標的配列中の突然変異を検出する方法が提供される。本方法は、dsDNAを含む試料を提供すること;試料を、
第1の半機能的NGSアダプター配列を含むフォワード遺伝子特異的プライマー、および
場合により1つ以上のロックドヌクレオチドを含むクランピングオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーおよびクランピングオリゴヌクレオチドは、シスであり、クランピングオリゴは、1つ以上の突然変異を含むことが疑われる領域中の標的遺伝子の野生型配列にハイブリダイズするクランピングオリゴヌクレオチド
と接触させること;
第1の一本鎖プライマー伸長PCRラウンドを実施して第1のアンプリコンの集団を産生すること;
場合により、第1のアンプリコンの集団を精製すること;
第1のアンプリコンの集団を、
第1の半機能的NGSアダプター配列の一部に相補的な第1のユニバーサルプライマーであって、このプライマーによる増幅は、第1の完全機能的NGSアダプター配列を作出する第1のユニバーサルプライマー、
第2の半機能的NGSアダプター配列を含むリバース遺伝子特異的プライマーであって、リバースプライマーは、第1のNGSアダプター配列の一部に相補的なプライマーについてトランスであるリバース遺伝子特異的プライマーおよび;
リバースプライマー上の第2の半機能的NGSアダプター配列に相補的な第2のユニバーサルプライマーであって、第2のユニバーサルプライマーによる増幅は、第2の完全機能的NGSアダプター配列を作出する第2のユニバーサルプライマー
と接触させること;
第2のPCRラウンド(「PCR2」)を実施して第1および第2の完全機能的NGSアダプター配列の両方を含む第2のアンプリコンの集団の増幅を完了させること;
第2のアンプリコンの集団をシーケンシングすること;ならびに
第2のアンプリコンの集団の配列を、参照野生型標的配列と比較すること;
を含み、それにより標的配列中の突然変異(野生型配列からの差異)を検出する。
第1の半機能的NGSアダプター配列を含むフォワード遺伝子特異的プライマー、および
場合により1つ以上のロックドヌクレオチドを含むクランピングオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーおよびクランピングオリゴヌクレオチドは、シスであり、クランピングオリゴは、1つ以上の突然変異を含むことが疑われる領域中の標的遺伝子の野生型配列にハイブリダイズするクランピングオリゴヌクレオチド
と接触させること;
第1の一本鎖プライマー伸長PCRラウンドを実施して第1のアンプリコンの集団を産生すること;
場合により、第1のアンプリコンの集団を精製すること;
第1のアンプリコンの集団を、
第1の半機能的NGSアダプター配列の一部に相補的な第1のユニバーサルプライマーであって、このプライマーによる増幅は、第1の完全機能的NGSアダプター配列を作出する第1のユニバーサルプライマー、
第2の半機能的NGSアダプター配列を含むリバース遺伝子特異的プライマーであって、リバースプライマーは、第1のNGSアダプター配列の一部に相補的なプライマーについてトランスであるリバース遺伝子特異的プライマーおよび;
リバースプライマー上の第2の半機能的NGSアダプター配列に相補的な第2のユニバーサルプライマーであって、第2のユニバーサルプライマーによる増幅は、第2の完全機能的NGSアダプター配列を作出する第2のユニバーサルプライマー
と接触させること;
第2のPCRラウンド(「PCR2」)を実施して第1および第2の完全機能的NGSアダプター配列の両方を含む第2のアンプリコンの集団の増幅を完了させること;
第2のアンプリコンの集団をシーケンシングすること;ならびに
第2のアンプリコンの集団の配列を、参照野生型標的配列と比較すること;
を含み、それにより標的配列中の突然変異(野生型配列からの差異)を検出する。
一部の実施形態において、dsDNAは、ゲノムDNAであるか、またはそれを含む。一部の実施形態において、dsDNAは、例えば、血漿または尿中の循環腫瘍DNA(ctDNA)、循環腫瘍細胞(CTC)、またはエキソソームからのものである。
一部の実施形態において、第1のアンプリコンの集団を精製することは、固相可逆的固定化(SPRI)ビーズベースクリーンアップを使用することを含む。
一部の実施形態において、標的配列は、エストロゲン受容体1(ESR1)中、例えば、リガンド結合ドメイン中、例えば、ESR1野生型配列TGCCCCTCTATGACCTGCTG(配列番号1)に存在する。ESR1中の突然変異としては、例えば、V534E(1601T>A)、P535H(1604C>A)、L536R/P/Q(1607T>G/1607T>C/1607TC>AG)、Y537N/C/S(1609T>A/1610A>G/1610A>C)、またはD538G(1613A>G)を挙げることができる。一部の実施形態において、本方法は、ESR1中の突然変異を有する対象を、内分泌療法に耐性であるエストロゲン受容体(ER)陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ESR1中の突然変異を有する対象を、内分泌療法による治療に応答する可能性が低いと同定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、内分泌療法を含まない治療法を選択し、場合により、ESR1中の突然変異を有すると同定された対象に施与することを含み;治療オプションは、化学療法または内分泌療法と分子標的療法、例えば、エベロリムス(Afinitor)またはパルボシクリブ(Ibrance)により対象を治療することを含み得る。本方法は、内分泌療法、例として、治験薬、例えば、次世代エストロゲン受容体分解剤、内分泌療法とヒストンデアセチラーゼ阻害剤、PI3K経路阻害剤、またはアンドロゲン受容体遮断剤を使用する組合せ療法による治療に対する応答を予測することも含み得る。
一部の実施形態において、標的配列は、ホスファチジルイノシトール−4,5−二リン酸3−キナーゼ触媒サブユニットアルファ(PIK3CA)中、例えば、エキソン9および/または20中に存在し、例えば、PIK3CAエキソン9野生型配列:TCTCCTGCTCAGTGATTTCA(配列番号8)またはPIK3CAエキソン20野生型配列:TGCACATCATGGTGGCTGGA(配列番号9)を含む。PIK3CA中の突然変異としては、例えば、E542K(c.1624G→A)、E545K/Q/G/V(c.1633G→A/1633G>C/1634A>G/1634A>Tを挙げることができる。一部の実施形態において、本方法は、PIK3CA中の突然変異を有する対象を、トラスツズマブおよび/またはラパチニブによる治療に対して非応答性であるエストロゲン受容体(ER)陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、PIK3CA中の突然変異を有する対象を、トラスツズマブおよび/またはラパチニブによる治療に応答する可能性が低いと同定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、トラスツズマブおよび/またはラパチニブを含まない治療法を選択し、場合により、PIK3CA中の突然変異を有すると同定された対象に施与することを含む。本方法は、PI3K/AKT経路阻害剤による試験的治療法に対する応答を予測することも含み得る。
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本発明における使用のための方法および材料が本明細書に記載され;当技術分野において公知の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は、説明のためにすぎず、限定するものではない。本明細書において挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照文献は、全体として参照により組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が、定義を含め、優先する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
近年、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン(LBD)中の突然変異が、抗エストロゲン療法により治療された患者からの乳癌試料中に見出されている。前臨床試験において、それらの突然変異は、アロマターゼ阻害剤ならびに選択的エストロゲン受容体モジュレーターおよびエストロゲン受容体アンタゴニストに対する相対的耐性を付与することが観察された。これは、内分泌療法に対する獲得耐性のバイオマーカーとしてのそれらの突然変異における臨床的関心の増加をもたらした。
血液ベースサンプリングを介してエストロゲン受容体突然変異の存在を非侵襲的に検出する技能は、獲得耐性の出現についての連続的なモニタリングを可能とし、悪性腫瘍負荷全体の包括的サンプリングを提供する。循環腫瘍細胞(CTC)および血漿循環腫瘍DNA(ctDNA)は、患者から非侵襲的に得ることができるが、両方とも、正常細胞に由来する遺伝子材料の大きいバックグラウンドにより複雑化する腫瘍由来遺伝子材料を提供する。
本明細書において、CTCおよびctDNA中の両方の突然変異、例えば、エストロゲン受容体突然変異を検出する超高感度の方法が記載される。本技術は、単一アッセイにおいて複数のESRlリガンド結合突然変異を検出するように設計されたユニークロックド核酸配列による突然変異体エンリッチメントを利用する。これにより、大きい野生型バックグラウンドからの希少突然変異アレルを解析することができる。突然変異体エンリッチメントは、アッセイ感度を改善する一方、検出された突然変異の直接的な配列確認も可能として市販のアレル特異的アッセイまたは他の突然変異体エンリッチメントベース技術において見られるよりも高いアッセイ特異度を確保する革新的な次世代シーケンシングライブラリー調製法と組み合わせる。プロトコルの固有のフレキシビリティーは、代替遺伝子中の突然変異へのアッセイの直接的な適合も可能とする。
本技術は、患者、例えば、抗エストロゲン療法により治療されている患者における突然変異、例えば、エストロゲン受容体突然変異のリアルタイム非侵襲的検出を可能とし、治療耐性の出現を予測し、それにより将来的な治療法の選択をガイドし得る。さらに、ESRI突然変異の存在は、治療、例えば、内分泌療法による治療、例として、次世代エストロゲン受容体分解剤に対する応答を予測するための臨床的バイオマーカーとしての評価を保証し得る。
半機能的遺伝子特異的プライマー
本明細書に記載の方法は、半機能的遺伝子特異的プライマーおよび半機能的シーケンシングプライマーを使用して2つのPCRラウンドを実施する2ステップPCRの使用を含む。遺伝子特異的プライマーは、本明細書において「フォワード」および「リバース」と称され、それらは、それらが逆鎖に結合する事実を示すが、「フォワード」プライマーは、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかに結合し得る(「リバース」は、その逆鎖に結合する)。遺伝子特異的プライマーは、少なくとも1つの突然変異を含むことが既知であり、またはそれが疑われる特異的領域を増幅するように設計される。フォワードプライマーは、例えば、IlluminaまたはIonTorrentシーケンシングプラットフォームによる使用のためのNGSプライマーを付着させるために使用することができる半機能的次世代シーケンシング(NGS)アダプター「ペイロード」配列を含む。上記のとおりフォワードプライマーについてトランスであるリバースプライマーも、半機能的NGSアダプター「ペイロード」配列を含有する。半機能的遺伝子特異的プライマーは、任意の遺伝子標的のために、および任意のNGSプラットフォーム、例えば、MiSeq(Illumina)またはIon Torrent(Life Technologies)プラットフォームに適合するように設計することができる。ESR1またはホスファチジルイノシトール−4,5−二リン酸3−キナーゼ触媒サブユニットアルファ(PIK3CA)中の突然変異の増幅において使用される半機能的遺伝子特異的プライマーとしては、本明細書に記載のものを挙げることができる。
本明細書に記載の方法は、半機能的遺伝子特異的プライマーおよび半機能的シーケンシングプライマーを使用して2つのPCRラウンドを実施する2ステップPCRの使用を含む。遺伝子特異的プライマーは、本明細書において「フォワード」および「リバース」と称され、それらは、それらが逆鎖に結合する事実を示すが、「フォワード」プライマーは、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかに結合し得る(「リバース」は、その逆鎖に結合する)。遺伝子特異的プライマーは、少なくとも1つの突然変異を含むことが既知であり、またはそれが疑われる特異的領域を増幅するように設計される。フォワードプライマーは、例えば、IlluminaまたはIonTorrentシーケンシングプラットフォームによる使用のためのNGSプライマーを付着させるために使用することができる半機能的次世代シーケンシング(NGS)アダプター「ペイロード」配列を含む。上記のとおりフォワードプライマーについてトランスであるリバースプライマーも、半機能的NGSアダプター「ペイロード」配列を含有する。半機能的遺伝子特異的プライマーは、任意の遺伝子標的のために、および任意のNGSプラットフォーム、例えば、MiSeq(Illumina)またはIon Torrent(Life Technologies)プラットフォームに適合するように設計することができる。ESR1またはホスファチジルイノシトール−4,5−二リン酸3−キナーゼ触媒サブユニットアルファ(PIK3CA)中の突然変異の増幅において使用される半機能的遺伝子特異的プライマーとしては、本明細書に記載のものを挙げることができる。
ユニバーサル半機能的シーケンシングプライマーは、二等分の配列を含む可変配列を有し、一方の半等分は、半機能的GSP上の「ペイロード」配列に相補的な所与の遺伝子に使用されるプライマーの全てにわたり一致し、他方の半等分は、NGSアダプター配列を含む。数百個のこれらの後者の配列、例えば、単一反応における複数の試料のインデックス化を可能とするIlluminaにより公開されたMiSeq配列が存在する。
クランプオリゴヌクレオチド
クランピングオリゴは、任意の遺伝子中のホットスポット突然変異のために作製することができるが、示差的なハイブリダイゼーションおよび得られる相対的突然変異体エンリッチメントは、遺伝学的状況に基づき異なり得る。クランプの長さおよびアニーリング温度は、野生型および突然変異体アレルへのハイブリダイゼーション間の最大ミスマッチ区別を可能とするように、当技術分野において公知の方法(例えば、You et al.,Nucleic Acids Research,2006,Vol.34,No.8 e60参照)を使用して最適化すべきである。
クランピングオリゴは、任意の遺伝子中のホットスポット突然変異のために作製することができるが、示差的なハイブリダイゼーションおよび得られる相対的突然変異体エンリッチメントは、遺伝学的状況に基づき異なり得る。クランプの長さおよびアニーリング温度は、野生型および突然変異体アレルへのハイブリダイゼーション間の最大ミスマッチ区別を可能とするように、当技術分野において公知の方法(例えば、You et al.,Nucleic Acids Research,2006,Vol.34,No.8 e60参照)を使用して最適化すべきである。
一部の実施形態において、クランプオリゴは、ロックド核酸(LNA)分子、例えば、例として、[アルファ]−L−LNAを含む。LNAは、リボース環が2’−酸素および4’−炭素間のメチレン架橋により「ロック」されているリボ核酸アナログ、すなわち、少なくとも1つのLNAモノマー、すなわち、1つの2’−O,4’−C−メチレン−β−D−リボフラノシルヌクレオチドを含有する阻害核酸を含む。LNA塩基は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するが、ロックド構成は、塩基対形成反応の率および安定性を増加させる(Jepsen et al.,Oligonucleotides,14,130−146(2004))。これらの特性により、LNAが本明細書に記載の方法に特に有用となる。
LNAクランプオリゴは、それぞれの鎖中に10〜30、例えば、12〜24、例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドを含む分子を含み得、鎖の一方は、標的遺伝子中の領域と(例えば、野生型配列と)同一である。LNAクランプオリゴは、当技術分野において公知の方法を使用して化学合成することができる。
LNAクランプオリゴは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して設計することができ;多数のアルゴリズムが公知であり、市販されている(例えば、インターネット上、例えば、exiqon.com)。例えば、You et al.,Nuc.Acids.Res.34:e60(2006);McTigue et al.,Biochemistry 43:5388−405(2004);およびLevin et al.,Nuc.Acids.Res.34:e142(2006)参照。例えば、「遺伝子歩行」法は、アンチセンスオリゴを設計するために使用されるものと同様に、LNAクランプオリゴの配列を最適化するために使用することができ;例えば、標的配列の長さに及ぶ10〜30ヌクレオチドの一連の阻害核酸を調製することができ、次いで活性について試験する。場合により、例えば、5〜10ヌクレオチド以上のギャップをLNAクランプオリゴ間に残して合成および試験される阻害核酸の数を低減させることができる。GC含有率は、好ましくは、約30〜60%である。LNAクランプオリゴを設計するための一般的指針は当技術分野において公知であり;例えば、LNA配列は、他のLNA配列に極めてタイトに結合するため、それは、LNA内の顕著な相補性を回避することが好ましい。5つ以上のLNA残基の連続ランは、可能であれば回避すべきである(例えば、極めて短い(例えば、約9〜10nt)阻害核酸については可能でないことがある)。一部の実施形態において、LNAは、キシロ−LNAである(例えば、You et al.,Nucleic Acids Research,2006,Vol.34,No.8 e60参照)。
LNAに関する追加の情報については、米国特許第6,268,490号明細書;同第6,734,291号明細書;同第6,770,748号明細書;同第6,794,499号明細書;同第7,034,133号明細書;同第7,053,207号明細書;同第7,060,809号明細書;同第7,084,125号明細書;および同第7,572,582号明細書;ならびに米国特許出願公開第20100267018号明細書;同第20100261175号明細書;および同第20100035968号明細書;Koshkin et al.Tetrahedron 54,3607−3630(1998);Obika et al.Tetrahedron Lett.39,5401−5404(1998);Jepsen et al.,Oligonucleotides 14:130−146(2004);Kauppinen et al.,Drug Disc.Today 2(3):287−290(2005);You et al.,Nucleic Acids Research,2006,Vol.34,No.8 e60;Ponting et al.,Cell 136(4):629−641(2009)、ならびにそれらに引用される参照文献を参照。
2ステップクランプPCR
図2に示されるとおり、第1のPCRラウンド(「PCR1」)において、クランピングLNA配列についてシスであるフォワード遺伝子特異的プライマー(クランピングLNA配列と同一の鎖にハイブリダイズする)を、一本鎖プライマー伸長に使用する。遺伝子特異的プライマーは、半機能的NGSアダプターペイロードも含有する。例えば、固相可逆的固定化(SPRI)ビーズベースクリーンアップを使用するPCR1産物の精製後、アダプターペイロードの一部に相補的な第1のユニバーサルプライマーおよび別の半機能的NGSアダプターペイロードを含有する逆鎖上のペアをなす遺伝子特異的リバースプライマーを使用して第2のPCRラウンド(「PCR2」)を完了させる。リバースプライマー上のアダプターペイロードに相補的な第2のユニバーサルプライマーを使用して完全にインデックス化したアンプリコンの増幅を完了させる。第2のユニバーサルプライマーの使用は、同一の単一遺伝子特異的プライマーを用いる多くの異なるNS(例えば、Illumina)アダプター配列の使用を可能とする。あるいは、リバースプライマーは、完全機能的NGSプライマーを含み得;これは、異なるアダプター配列を有する多数の完全機能的リバース配列の合成を要求する。これは、よりコストを要し、任意の所与の時間においてランすることができる試料の数を限定し得る。
図2に示されるとおり、第1のPCRラウンド(「PCR1」)において、クランピングLNA配列についてシスであるフォワード遺伝子特異的プライマー(クランピングLNA配列と同一の鎖にハイブリダイズする)を、一本鎖プライマー伸長に使用する。遺伝子特異的プライマーは、半機能的NGSアダプターペイロードも含有する。例えば、固相可逆的固定化(SPRI)ビーズベースクリーンアップを使用するPCR1産物の精製後、アダプターペイロードの一部に相補的な第1のユニバーサルプライマーおよび別の半機能的NGSアダプターペイロードを含有する逆鎖上のペアをなす遺伝子特異的リバースプライマーを使用して第2のPCRラウンド(「PCR2」)を完了させる。リバースプライマー上のアダプターペイロードに相補的な第2のユニバーサルプライマーを使用して完全にインデックス化したアンプリコンの増幅を完了させる。第2のユニバーサルプライマーの使用は、同一の単一遺伝子特異的プライマーを用いる多くの異なるNS(例えば、Illumina)アダプター配列の使用を可能とする。あるいは、リバースプライマーは、完全機能的NGSプライマーを含み得;これは、異なるアダプター配列を有する多数の完全機能的リバース配列の合成を要求する。これは、よりコストを要し、任意の所与の時間においてランすることができる試料の数を限定し得る。
シーケンシング
本明細書において使用される「シーケンシング」は、核酸の配列を決定する任意の方法を含む。シーケンシングの任意の方法、例として、鎖ターミネーター(Sanger)シーケンシングおよびダイターミネーターシーケンシングを、本方法において使用することができる。好ましい実施形態において、次世代シーケンシング(NGS)、数千または数百万回のシーケンシング反応を並行して実施するハイスループットシーケンシング技術を使用する。異なるNGSプラットフォームは変動するアッセイ化学反応を使用するが、それらは全て、大量のテンプレート上の大量のシーケンシング反応ランからの配列データを同時に生成する。典型的には、配列データは、スキャナーを使用して回収し、次いで生物情報学的にアセンブルおよび分析する。したがって、シーケンシング反応は、並行して実施、リード、アセンブル、および分析する:例えば、米国特許出願公開第20140162897号明細書、ならびにVoelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641−658,2009;およびMacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287−296(2009)参照。NGS法は、テンプレート増幅を要求するものあり、要求しないものもある。増幅を要求する方法としては、パイロシーケンシング(例えば、米国特許第6,210,89号明細書および同第6,258,568号明細書参照;Rocheにより市販);Solexa/Illuminaプラットフォーム(例えば、米国特許第6,833,246号明細書、同第7,115,400号明細書、および同第6,969,488号明細書参照);およびSupported Oligonucleotide Ligation and Detection(SOLiD)プラットフォーム(Applied Biosystems;例えば、米国特許第5,912,148号明細書および同第6,130,073号明細書参照)が挙げられる。増幅を要求しない方法、例えば、単一分子シーケンシング法としては、ナノポアシーケンシング、HeliScope(米国特許第7,169,560号明細書;同第7,282,337号明細書;同第7,482,120号明細書;同第7,501,245号明細書;同第6,818,395号明細書;同第6,911,345号明細書;および同第7,501,245号明細書);合成によるリアルタイムシーケンシング(例えば、米国特許第7,329,492号明細書参照);ゼロモード導波路(ZMW)を使用する単分子リアルタイム(SMRT)DNAシーケンシング法;ならびに他の方法、例として、米国特許第7,170,050号明細書;同第7,302,146号明細書;同第7,313,308号明細書;および同第7,476,503号明細書に記載のもの)が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第20130274147号明細書;米国特許出願公開第20140038831号明細書;Metzker,Nat Rev Genet 11(1):31−46(2010)を参照。
本明細書において使用される「シーケンシング」は、核酸の配列を決定する任意の方法を含む。シーケンシングの任意の方法、例として、鎖ターミネーター(Sanger)シーケンシングおよびダイターミネーターシーケンシングを、本方法において使用することができる。好ましい実施形態において、次世代シーケンシング(NGS)、数千または数百万回のシーケンシング反応を並行して実施するハイスループットシーケンシング技術を使用する。異なるNGSプラットフォームは変動するアッセイ化学反応を使用するが、それらは全て、大量のテンプレート上の大量のシーケンシング反応ランからの配列データを同時に生成する。典型的には、配列データは、スキャナーを使用して回収し、次いで生物情報学的にアセンブルおよび分析する。したがって、シーケンシング反応は、並行して実施、リード、アセンブル、および分析する:例えば、米国特許出願公開第20140162897号明細書、ならびにVoelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641−658,2009;およびMacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287−296(2009)参照。NGS法は、テンプレート増幅を要求するものあり、要求しないものもある。増幅を要求する方法としては、パイロシーケンシング(例えば、米国特許第6,210,89号明細書および同第6,258,568号明細書参照;Rocheにより市販);Solexa/Illuminaプラットフォーム(例えば、米国特許第6,833,246号明細書、同第7,115,400号明細書、および同第6,969,488号明細書参照);およびSupported Oligonucleotide Ligation and Detection(SOLiD)プラットフォーム(Applied Biosystems;例えば、米国特許第5,912,148号明細書および同第6,130,073号明細書参照)が挙げられる。増幅を要求しない方法、例えば、単一分子シーケンシング法としては、ナノポアシーケンシング、HeliScope(米国特許第7,169,560号明細書;同第7,282,337号明細書;同第7,482,120号明細書;同第7,501,245号明細書;同第6,818,395号明細書;同第6,911,345号明細書;および同第7,501,245号明細書);合成によるリアルタイムシーケンシング(例えば、米国特許第7,329,492号明細書参照);ゼロモード導波路(ZMW)を使用する単分子リアルタイム(SMRT)DNAシーケンシング法;ならびに他の方法、例として、米国特許第7,170,050号明細書;同第7,302,146号明細書;同第7,313,308号明細書;および同第7,476,503号明細書に記載のもの)が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第20130274147号明細書;米国特許出願公開第20140038831号明細書;Metzker,Nat Rev Genet 11(1):31−46(2010)を参照。
あるいは、ハイブリダイゼーションベース配列法または他のハイスループット法、例えば、マイクロアレイ分析、NANOSTRING、ILLUMINA、または他のシーケンシングプラットフォームを使用することもできる。
Enrich−Seqを使用するESR1およびPIK3CA突然変異分析
乳癌の約70%が、エストロゲン受容体α(ER)陽性であり、内分泌療法により治療される。ESR1のLBD中の突然変異は、内分泌療法に対する耐性の発生に関連することが示されている。例えば、Jeselsohn et al.,Nat Rev Clin Oncol.2015 Oct;12(10):573−83;Li et al.,Cell Rep.2013 Sep 26;4(6):10.1016参照。PIK3CA中の突然変異は、トラスツズマブおよび/またはラパチニブに対する非応答性に関連している(例えば、Majewski et al.,J Clin Oncol 2015;33(12):1334−1339参照。本方法は、癌、例えば、乳癌を有するか、または有すると疑われると診断された対象(例えば、ヒト対象)からの、例えば、循環腫瘍細胞(CTC)、循環腫瘍DNA(ctDNA)、またはエキソソームからの二本鎖DNA中の、例えば、乳癌関連突然変異を検出するために使用することができる。例えば、本方法は、乳癌を有するか、または有すると疑われる対象におけるESR1のリガンド結合ドメイン(LBD)、またはPIK3CAのエキソン9もしくは20中の突然変異を検出するために使用することができる。
乳癌の約70%が、エストロゲン受容体α(ER)陽性であり、内分泌療法により治療される。ESR1のLBD中の突然変異は、内分泌療法に対する耐性の発生に関連することが示されている。例えば、Jeselsohn et al.,Nat Rev Clin Oncol.2015 Oct;12(10):573−83;Li et al.,Cell Rep.2013 Sep 26;4(6):10.1016参照。PIK3CA中の突然変異は、トラスツズマブおよび/またはラパチニブに対する非応答性に関連している(例えば、Majewski et al.,J Clin Oncol 2015;33(12):1334−1339参照。本方法は、癌、例えば、乳癌を有するか、または有すると疑われると診断された対象(例えば、ヒト対象)からの、例えば、循環腫瘍細胞(CTC)、循環腫瘍DNA(ctDNA)、またはエキソソームからの二本鎖DNA中の、例えば、乳癌関連突然変異を検出するために使用することができる。例えば、本方法は、乳癌を有するか、または有すると疑われる対象におけるESR1のリガンド結合ドメイン(LBD)、またはPIK3CAのエキソン9もしくは20中の突然変異を検出するために使用することができる。
PIK3CAエキソン9野生型配列:TCTCCTGCTCAGTGATTTCA(配列番号8);PIK3CAエキソン20野生型配列:TGCACATCATGGTGGCTGGA(配列番号9);またはESR1野生型配列TGCCCCTCTATGACCTGCTG(配列番号1)中の突然変異を検出するための、これらの方法において有用な例示的な遺伝子特異的プライマーおよびLNAクランプが、本明細書において示される。本方法は、対象からのCTCまたはctDNAを含む試料を得ること、および本明細書に記載の2ステップクランプPCR法を使用して突然変異を検出することを含み得る。好ましくは、本方法は、ESR1および/またはPIK3CA中の突然変異を検出することを含み、単一非分割反応において、すなわち、単一チューブ中で実施する。
ESR1中の1つ以上の突然変異(例えば、V534E(1601T>A)、P535H(1604C>A)、L536R/P/Q(1607T>G/1607T>C/1607TC>AG)、Y537N/C/S(1609T>A/1610A>G/1610A>C)、またはD538G(1613A>G))の検出時、本方法は、対象を、内分泌療法に対して耐性であるエストロゲン受容体(ER)陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することを含み得る。内分泌療法としては、エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、例えば、タモキシフェンおよびラロキシフェン;LH遮断剤、例えば、ゴセレリン(Zoladex);アロマターゼ阻害剤(例えば、アナストロゾール(Arimidex)、エキセメスタン(Aromasin)、またはレトロゾール(Femara));GnRHアゴニスト;およびER分解剤(例えば、フルベストラント(Faslodex))が挙げられ、例えば、Lumachi et al.,Curr Med Chem.2011;18(4):513−22;Burstein et al.,J Clin Oncol 2014;32(21):2255−2269参照。ESR1突然変異の検出により内分泌耐性が同定されたら、治療オプションは、化学療法または内分泌療法と、分子標的療法、例えば、エベロリムス(Afinitor)またはパルボシクリブ(Ibrance)により対象を治療することを含み得る。本方法は、内分泌療法、例として、治験薬、例えば、次世代エストロゲン受容体分解剤、内分泌療法とヒストンデアセチラーゼ阻害剤、PI3K経路阻害剤、またはアンドロゲン受容体遮断剤を使用する組合せ療法による治療に対する応答を予測することも含み得る。
PIK3CA中の1つ以上の突然変異(例えば、エキソン9中のE542K(c.1624G→A)、E545K/Q/G/V(c.1633G→A/1633G>C/1634A>G/1634A>T)および/またはH1047R(c.3140A→G)、H1047L(c.3140A→T))の検出時、本方法は、対象を、トラスツズマブおよび/またはラパチニブに応答しないエストロゲン受容体(ER)陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することを含み得る。本方法は、トラスツズマブおよび/またはラパチニブを含まない治療法により対象を治療することを含み得る。本方法は、PI3K/AKT経路阻害剤による試験的治療法に対する応答を予測することも含み得る。
本発明は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。
方法
以下の方法を以下に記載の実施例において使用した。
以下の方法を以下に記載の実施例において使用した。
Qiagen AllPrep DNA/RNA Micro KitまたはQiagen Circulating Nucleic Acid Kitを、それぞれ製造業者のプロトコルに従って使用して循環腫瘍細胞(CTC)または循環腫瘍DNA(ctDNA)からのゲノムDNA(gDNA)を抽出した。DNAテンプレートを新たな半機能的遺伝子特異的プライマーと組み合わせ、遺伝子特異的LNAクランプおよびKAPA HiFi Hot Start PCR Kit(Kapa Biosystems)をマッチングさせ、突然変異体エンリッチメントのための重要なステップを表す25回のプライマー伸長ラウンドを実施することにより、半機能的シーケンシングライブラリーを調製した。
次に、Agencourt Ampure XPビーズ(Beckman Coulter)を製造業者のプロトコルに従って用いて、20分間のインキュベーションに改変し、31.5uLのヌクレアーゼフリー水により溶出させ、0.4×固相可逆的固定化(SPRI)ビーズベースクリーンアップを実施した。次いで、相補的半機能的遺伝子特異的プライマー、シーケンシングアダプター、およびKAPA HiFi Hot Start PCR Kit(Kapa Biosystems)を用いるPCR増幅の追加の30サイクルを実施することにより、ライブラリーをシーケンシングのために完全にコンピテントにした。次に、Agencourt Ampure XPビーズ(Beckman Coulter)を製造業者のプロトコルに従って用いて0.6×SPRIビーズクリーンアップを実施した。KAPA Library Quantification Kit(Kapa Biosystems)を使用して、得られた完全機能化ライブラリーを定量し、Illuminaペアドエンドシーケンシング法を使用してIlluminaシーケンシングのために処理した。未加工FASTAシーケンシングデータを脱多重化して試料データを分離した。個々の試料データを処理してペアドエンドコンセンサスリードを生成した。FLASHオープンソースツールを使用するペアドエンドリードの完全なマッチングが要求された。次いで、BWA−MEMオープンソースツールを使用してペアドコンセンサスリードをヒト参照ゲノムに対してアラインした。得られたアラインメントを、Integrated Genomics Viewer(IGV)においてレビューし、および/またはSAMtoolsおよびVarScanツールを使用して分散を求めた。
半機能的遺伝子特異的プライマー
本実施例における半機能的遺伝子特異的プライマーは、Illuminaプラットフォーム上でのシーケンシングに適合するように設計した。以下の融合プライマーを使用し、Illuminaアダプター配列をイタリックで示し、「ヒンジ」相配列(それがIlluminaアダプターペイロードおよびプライマーの遺伝子特異的部分間に存在するため、そう呼ばれる)を太字のNとして示し、プライマーの遺伝子特異的部分を普通文字で示す。
本実施例における半機能的遺伝子特異的プライマーは、Illuminaプラットフォーム上でのシーケンシングに適合するように設計した。以下の融合プライマーを使用し、Illuminaアダプター配列をイタリックで示し、「ヒンジ」相配列(それがIlluminaアダプターペイロードおよびプライマーの遺伝子特異的部分間に存在するため、そう呼ばれる)を太字のNとして示し、プライマーの遺伝子特異的部分を普通文字で示す。
LNAクランププライマー
本実施例において、以下のLNAを使用した:
本実施例において、以下のLNAを使用した:
実施例1
Enrich−Seqを使用するESR1およびPIK3CA突然変異分析
本実施例は、ロックド核酸クランプを、広範なインプットDNAに適合し得るライブラリー調製のための新規技術との組合せで使用する突然変異体エンリッチメントを得るEnrich−Seqとして本明細書に記載のアプローチの開発および例示的実行を記載する。次いで、高度にストリンジェントな多面的生物情報学的アプローチを適用して突然変異コールの最適な特異度を確保する。
Enrich−Seqを使用するESR1およびPIK3CA突然変異分析
本実施例は、ロックド核酸クランプを、広範なインプットDNAに適合し得るライブラリー調製のための新規技術との組合せで使用する突然変異体エンリッチメントを得るEnrich−Seqとして本明細書に記載のアプローチの開発および例示的実行を記載する。次いで、高度にストリンジェントな多面的生物情報学的アプローチを適用して突然変異コールの最適な特異度を確保する。
この技術の開発のため、本発明者らは最初に、エストロゲン受容体アルファ遺伝子ESR1中の反復突然変異が近年検出され、内分泌療法に対する耐性を付与すると考えられるエストロゲン受容体(ER)陽性乳癌にフォーカスした(1〜5)。内分泌療法を受けている転移性乳癌を有する女性の非侵襲的モニタリングを介するESR1突然変異の同定は、治療耐性の早期同定を可能とし得、タイムリーな治療法の変更を可能とする。ESR1中の突然変異は、リガンド結合ドメイン(LBD)中でクラスター化すると考えられるため、本発明者らは、ESR1 LBD中のほとんどの突然変異部位に及ぶ野生型ESR1配列に強固にハイブリダイズするロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドを設計した(図1)。このLNAクランプは、完全にマッチした野生型ESR1配列およびミスマッチ突然変異配列への示差的なハイブリダイゼーションを利用して突然変異アレルの区別およびしたがって突然変異体DNAテンプレートのエンリッチ増幅を可能とする。本発明者らは、野生型および9つの異なるESR1突然変異体アレルへのハイブリダイゼーション間の最大ミスマッチ区別を許容するようにこのESR1クランプのアニーリング温度を最適化し、高度に効率的な多重化アッセイ設計フレームワークを作製した。
ESR1 LNA設計の最適化後、本発明者らは、LNAベースエンリッチメント化学反応を、次世代シーケンシング(NGS)ライブラリー調製法と組み合わせてアッセイの特異度および感度をさらに改善することを進めた。アッセイを超低感度に最適化するため、本発明者らは、突然変異体テンプレート希釈系列または統計的方法の技術的不確実性を回避して感度を推定し、試験の間にバリアントアレル率を確実に確認することができる方法を用いた。本発明者らは、ユニーク実験用資源、ESR1 LBD突然変異、Y537Sを保有するCTC由来細胞系を利用した(5)。マイクロマニピュレーションを使用してこの細胞系からの個々の細胞を単離し、続いて正常白血球のバックグラウンド中に配置して技術的最適化のための目的アレル率を確実に反映させた。例えば、単一突然変異ESR1 Y537Sアレル(ヘテロ接合性)を有するこの細胞系からの単一細胞は、15,000個の白血球のバックグラウンド中に配置されると、0.01%の突然変異体アレル率を反映する。
NGSライブラリー調製への本発明者らのアプローチの適合の第1の構成要素は、LNAクランプ配列をフランキングするESR1増幅プライマーの設計であった。改良型Primer3アルゴリズムを使用して最適なプライマーを選択した。多ステップPCRアプローチの一部としての半機能的シーケンシングアダプターペイロードを有する遺伝子特異的プライマーを設計した(図2)。本発明者らのアレル特異的増幅プールの低い複雑性を考慮して、最初に、遺伝子特異的プライマーを位相3ヌクレオチドランダムオリゴマー(図3)について試験した。LNAクランプを用いるエンリッチメントの状況において、これは、非特異的増幅の増加および無差別のアダプター組換えをもたらし、したがって、3つの位相ヌクレオチドを有するオリゴマーを廃棄し、単一の位相ヌクレオチドを有するオリゴマーを選択した。増幅プライマー設計の仕上げ後、特異的PCR条件に留意を向けた。アニーリングおよび伸長温度を最適化し、その後、PCR1において導入LNAクランプアニーリングステップを追加した。PCR1および2についての複数のサイクル数を次に試験した。最も確率の低いPCRエラー導入とバランスの取れた最良の突然変異体エンリッチメントを有するサイクリング条件を、PCR1および2について選択した。PCR1および2後の固相可逆的固定化(SPRI)ビーズクリーンアップ条件は、PCR1からのアダプターキャリーオーバーおよびPCR2後の最終ライブラリープールへの流入からの非特異的アンプリコンを低減させるための多数のSPRI比ならびにインキュベーション時間を試験することにより調整した。PCR2における第2のLNAクランプの使用は、追加の突然変異体エンリッチメントについて評価した。突然変異体テンプレートエンリッチメントが顕著に増加したが、それはアッセイ特異度を代償として生じ、プロトコルから排除した。仕上げ済みライブラリー調製PCR条件を図4にまとめる。
LNAエンリッチライブラリーは、Illuminaペアドエンドシーケンシング法を使用してシーケンシングした。未加工FASTAシーケンシングデータを脱多重化して試料データを分離した。個々の試料データを処理してペアドエンドコンセンサスリードを生成した。ペアドエンドリードの完全なマッチングは、FLASHオープンソースツールを使用して実施した。次いで、BWA−MEMオープンソースツールを使用してペアドコンセンサスリードをヒト参照ゲノムに対してアラインした。得られたアラインメントを、Integrated Genomics Viewer(IGV)においてレビューし、および/またはSAMtoolsおよびVarScanツールを使用して分散を求めた。
上記の大規模な最適化後、上記のとおり正常白血球のバックグラウンド中に配置された関連ESR1突然変異を保有する個々の細胞を使用してアッセイバリデーションを実施した。検出限界を超える0.01%のアレル率において、アッセイ感度は40%であると決定された。同一のアレル率における特異度は、100%である(図5)。
上記の最適化およびアッセイバリデーション後、MGH Cancer Centerにおいて少なくとも2つの内分泌療法の過程を受けた後に疾患進行を有したER陽性転移性乳癌を有する25人の女性のパイロットコホートから単離されたCTCに対してEnrich−Seqを使用するESR1ゲノタイピングを行った。ESR1突然変異は、8/25人(32%)の患者において検出され、2人の患者においては、同期するESR1突然変異が検出された(図6)。同一の患者における複数のESR1突然変異の検出は、標準的な組織ベースESR1ゲノタイピングのいかなる刊行物においても報告されてこなかった血液ベースゲノタイピングのユニークな利点であり、依然として探索すべき内分泌耐性の程度についての臨床上の意義を有し得る。
上記のとおり、Enrich−Seqは、依然として、LNAベース突然変異体エンリッチメントおよび次世代ライブラリー調製化学反応を組み合わせることにより、10,000個の野生型アレルのバックグラウンド中の単一バリアントアレルを検出することがバリデードされた唯一の多重化ESR1ゲノタイピングアッセイである。さらに、これは、本発明者らの見識では、CTCゲノタイピングにおける使用についてバリデードされた唯一のESR1ゲノタイピングアッセイであり;それは、CellSearchプラットフォームを使用するCTC計数と特に関連し、例えば、転移性乳を有する女性における予後診断のためのFDA承認診断試験である。
参照文献:
1.Toy W,Shen Y,Won H,Green B,Sakr RA,Will M,et al.ESR1 ligand−binding domain mutations in hormone−resistant breast cancer.Nature genetics 2013;45:1439−45.
2.Robinson DR,Wu YM,Vats P,Su F,Lonigro RJ,Cao X,et al.Activating ESR1 mutations in hormone−resistant metastatic breast cancer.Nature genetics 2013;45:1446−51.
3.Li S,Shen D,Shao J,Crowder R,Liu W,Prat A,et al.Endocrine−therapy−resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast−cancer−derived xenografts.Cell reports 2013;4:1116−30.
4.Jeselsohn R,Yelensky R,Buchwalter G,Frampton G,Meric−Bernstam F,Gonzalez−Angulo AM,et al.Emergence of constitutively active estrogen receptor−alpha mutations in pretreated advanced estrogen receptor−positive breast cancer.Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research 2014;20:1757−67.
5.Yu M,Bardia A,Aceto N,Bersani F,Madden MW,Donaldson MC,et al.Cancer therapy.Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.Science 2014;345:216−20.
1.Toy W,Shen Y,Won H,Green B,Sakr RA,Will M,et al.ESR1 ligand−binding domain mutations in hormone−resistant breast cancer.Nature genetics 2013;45:1439−45.
2.Robinson DR,Wu YM,Vats P,Su F,Lonigro RJ,Cao X,et al.Activating ESR1 mutations in hormone−resistant metastatic breast cancer.Nature genetics 2013;45:1446−51.
3.Li S,Shen D,Shao J,Crowder R,Liu W,Prat A,et al.Endocrine−therapy−resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast−cancer−derived xenografts.Cell reports 2013;4:1116−30.
4.Jeselsohn R,Yelensky R,Buchwalter G,Frampton G,Meric−Bernstam F,Gonzalez−Angulo AM,et al.Emergence of constitutively active estrogen receptor−alpha mutations in pretreated advanced estrogen receptor−positive breast cancer.Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research 2014;20:1757−67.
5.Yu M,Bardia A,Aceto N,Bersani F,Madden MW,Donaldson MC,et al.Cancer therapy.Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.Science 2014;345:216−20.
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (14)
- 二本鎖DNA分子(dsDNA)の標的配列中の突然変異を検出する方法であって、
前記dsDNAを含む試料を提供すること;
前記試料を、
第1の半機能的NGSアダプター配列を含むフォワード遺伝子特異的プライマー、および
場合により1つ以上のロックドヌクレオチドを含むクランピングオリゴヌクレオチドであって、前記フォワードプライマーおよびクランピングオリゴヌクレオチドは、シスであり、前記クランピングオリゴは、1つ以上の突然変異を含むことが疑われる領域中の前記標的遺伝子の野生型配列にハイブリダイズするクランピングオリゴヌクレオチド
と接触させること;
第1の一本鎖プライマー伸長PCRラウンドを実施して第1のアンプリコンの集団を産生すること;
場合により、前記第1のアンプリコンの集団を精製すること;
前記第1のアンプリコンの集団を、
前記第1の半機能的NGSアダプター配列の一部に相補的な第1のユニバーサルプライマーであって、前記プライマーによる増幅は、第1の完全機能的NGSアダプター配列を作出する第1のユニバーサルプライマー、
第2の半機能的NGSアダプター配列を含むリバース遺伝子特異的プライマーであって、前記リバースプライマーは、前記第1のNGSアダプター配列の一部に相補的な前記プライマーについてトランスであるリバース遺伝子特異的プライマーおよび;
前記リバースプライマー上の前記第2の半機能的NGSアダプター配列に相補的な第2のユニバーサルプライマーであって、前記第2のユニバーサルプライマーによる増幅は、第2の完全機能的NGSアダプター配列を作出する第2のユニバーサルプライマー
と接触させること;
第2のPCRラウンド(「PCR2」)を実施して第1および第2の完全機能的NGSアダプター配列の両方を含む第2のアンプリコンの集団の増幅を完了させること;
前記第2のアンプリコンの集団をシーケンシングすること;ならびに
前記第2のアンプリコンの集団の配列を、参照野生型標的配列と比較すること;
を含み、それにより前記標的配列中の突然変異を検出する方法。 - 前記dsDNAが、ゲノムDNAであるか、またはゲノムDNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記dsDNAが、好ましくは、血漿または尿中の循環腫瘍DNA(ctDNA)、循環腫瘍細胞(CTC)、またはエキソソームからのものである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のアンプリコンの集団を精製することが、固相可逆的固定化(SPRI)ビーズベースクリーンアップを使用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的配列が、エストロゲン受容体1(ESR1)中、好ましくは、リガンド結合ドメイン中に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記標的配列が、ESR1野生型配列TGCCCCTCTATGACCTGCTG(配列番号1)を含む、請求項5に記載の方法。
- ESR1中の突然変異を有する対象を、内分泌療法に対して耐性であるエストロゲン受容体(ER)陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- ESR1中の突然変異を有する対象を、内分泌療法による治療に応答する可能性が低いと同定することをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- 内分泌療法を含まない治療法を選択し、場合により、ESR1中の突然変異を有すると同定された対象に施与することをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- 前記標的配列が、ホスファチジルイノシトール−4,5−二リン酸3−キナーゼ触媒サブユニットアルファ(PIK3CA)中、場合により、エキソン9および/または20中に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記標的配列が、PIK3CAエキソン9野生型配列:TCTCCTGCTCAGTGATTTCA(配列番号8)またはPIK3CAエキソン20野生型配列:TGCACATCATGGTGGCTGGA(配列番号9)を含む、請求項10に記載の方法。
- PIK3CA中の突然変異を有する対象を、トラスツズマブおよび/またはラパチニブによる治療に対して非応答性であるエストロゲン受容体(ER)陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することをさらに含む、請求項10または11に記載の方法。
- PIK3CA中の突然変異を有する対象を、トラスツズマブおよび/またはラパチニブによる治療に応答する可能性が低いと同定することをさらに含む、請求項10または11に記載の方法。
- トラスツズマブおよび/またはラパチニブを含まない治療法を選択し、および場合により、PIK3CA中の突然変異を有すると同定された対象に施与することをさらに含む、請求項10または11に記載の方法。
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