WO2021162028A1 - バイオチップの製造方法 - Google Patents

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WO2021162028A1
WO2021162028A1 PCT/JP2021/004917 JP2021004917W WO2021162028A1 WO 2021162028 A1 WO2021162028 A1 WO 2021162028A1 JP 2021004917 W JP2021004917 W JP 2021004917W WO 2021162028 A1 WO2021162028 A1 WO 2021162028A1
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WO
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substrate
spot
binding substance
selective binding
humidity
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Application number
PCT/JP2021/004917
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English (en)
French (fr)
Inventor
薙野　邦久
有樹 瀧井
Original Assignee
東レ株式会社
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Publication date
Application filed by 東レ株式会社 filed Critical 東レ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a biochip in which a substance that selectively binds to a substance to be measured (referred to as “selectively binding substance” in the present specification) is immobilized on the surface of a substrate.
  • a biochip is a substance in which a selective binding substance such as a nucleic acid or a protein that selectively binds to a substance to be measured is immobilized on the surface of a substrate (hereinafter, also referred to as a "carrier") at a high density. Therefore, the substance to be measured can be detected by fluorescence or the like of the selectively bound substance, and molecular identification or diagnosis can be performed from the intensity change or pattern thereof.
  • an Affymetrix method for synthesizing an oligonucleotide which is a selective binding substance on a substrate surface using photolithography, or a solution containing a selective binding substance prepared in advance (hereinafter referred to as "spot solution").
  • the Stanford method is known in which.) Is applied onto a substrate to immobilize a selectively binding substance. Examples of the method of applying the spot solution in the Stanford method include a method of spotting the solution using a metal pin and a method of discharging the solution onto the substrate using a dispenser or an inkjet.
  • the immobilization of DNA which is a selective binding substance, on the substrate surface was made non-covalent by electrostatic interaction on a substrate coated with poly-L-lysine.
  • DNA which is a selective binding substance
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 describe a method of immobilizing a selectively binding substance on a substrate surface by covalent bonding. Specifically, a substrate in which a carboxyl group is previously generated on the surface thereof is used, and a spot solution containing an amination oligo DNA which is a selective binding substance and a condensing agent is spotted on the surface of the substrate and selected as a carboxyl group on the substrate. By forming an amide bond by condensation reaction with the amino group of the binding substance, the selective binding substance is fixed on the substrate by a covalent bond.
  • the method of using the spot solution containing the condensing agent as described above is selected by applying the spot solution containing no condensing agent to the substrate in which the carboxyl group is activated esterified in advance on the substrate described in Patent Document 3. Compared with the method of immobilizing a binding substance, there is an advantage that the substrate does not need to be activated in advance and is not affected by deterioration of the activated substrate during storage.
  • Patent Documents 4 and 5 it is disclosed in Patent Documents 4 and 5 that it is important to control the humidity to a constant level when immobilizing the selective binding substance.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-200812 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2011-200230 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-139532 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-17155 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-98172
  • the biochip must have excellent measurement reproducibility. In order to improve the measurement reproducibility, it is important to immobilize the selective binding substance at the maximum density that the substrate can support. Further, in the biochip manufacturing process, since the spot solution is applied to the substrate surface at high density, contamination (also referred to as contamination or contamination) by the spot solution applied to the adjacent immobilized region (spot) is caused. There is a risk of causing it. Biochips that have been contaminated are usually excluded in the inspection process, which contributes to a decrease in biochip production efficiency (yield).
  • the present inventors have simply determined the concentration of the condensing agent conventionally used in the production of a biochip for immobilizing a selective binding substance on the substrate surface using a spot solution containing the above condensing agent.
  • a spot solution containing the above condensing agent When applied, it was found that it is extremely difficult to achieve both the measurement reproducibility of the biochip and the suppression of contamination with adjacent spots, and mass production is impossible. Then, they found that these two problems could be solved by drastically changing the concentration of the condensing agent contained in the spot solution and appropriately setting the humidity at the time of applying the selective binding substance, and completed the present invention. I let you.
  • the present invention provides the following (1) to (6).
  • a method for producing a biochip in which a selective binding substance is immobilized on the surface of a substrate A step of applying a solution containing a selective binding substance and a condensing agent to the surface of the substrate, and a step B of binding the selective binding substance to the surface of the substrate are included.
  • the concentration of the condensing agent in the solution in the step A is 30 mM or more and 80 mM or less.
  • the humidity of the space where the substrate is installed is 60% RH or more.
  • Biochip manufacturing method (2) The method for producing a biochip according to (1), wherein in step A, the humidity of the space is 70% RH or less.
  • FIG. 1 It is a figure which shows one configuration example of the spot inspection apparatus which has a humidification unit. It is a figure which shows the substrate surface of the analysis chip substrate 10 used in an Example. It is sectional drawing of the analysis chip substrate 10 used in an Example at the position of line AA of FIG. It is a scatter diagram of the total spot signal intensity in the two chips after hybridization obtained in Example 2 (the left figure is the case of humidity 50% RH, and the right figure is the case of humidity 70% RH).
  • the present invention is a method for producing a biochip in which a selective binding substance is immobilized on a substrate surface, and includes the following steps A and B. Step A of applying a solution containing a selective binding substance and a condensing agent to the surface of the substrate. Step B of binding the selective binding substance to the surface of the substrate.
  • Step A of the present invention is a step of applying a solution (spot solution) containing a selective binding substance and a condensing agent to the substrate surface of the biochip.
  • the material of the biochip substrate used in the present invention is not particularly limited as long as the selective binding substance can be immobilized by a condensation reaction.
  • any of resin, glass, metal, and silicon wafer may be used, but resin is preferable from the viewpoint of ease of surface treatment and mass productivity.
  • Examples of the resin used as the material of the substrate include polyacrylic acid ester, polymethacrylic acid ester, polycarbonate, polystyrene, polyvinyl acetate, polyester and the like, and polyacrylic acid ester and polymethacrylic acid ester are preferable.
  • examples of the polymethacrylic acid ester include polymethylmethacrylate (PMMA), polyethylmethacrylate (PEMA), polypropylmethacrylate and other polyalkylmethacrylate (PAMA), and PMMA is preferable.
  • a known copolymer can also be used.
  • AS resin acrylonitrile / styrene copolymer
  • ABS resin acrylonitrile / butadiene / styrene copolymer
  • AES resin acrylonitrile / ethylene-propylene-diene / styrene copolymer
  • polymethacrylic acid ester polymethacrylic acid ester
  • polymer examples include methyl methacrylate / acrylonitrile / butadiene / styrene copolymer (MABS resin), methyl methacrylate / butadiene / styrene copolymer (MBS resin), and methyl methacrylate / styrene copolymer (MS resin). And so on.
  • MABS resin methyl methacrylate / acrylonitrile / butadiene / styrene copolymer
  • MMS resin methyl methacrylate / butadiene / styrene copolymer
  • MS resin methyl methacrylate / styrene copolymer
  • the shape of the substrate is not particularly limited, but a flat substrate having the same size as a commercially available slide glass is preferably used. Further, for the purpose of improving the detection sensitivity at the time of detection, it is preferable to use a substrate having an uneven structure on the surface of the substrate (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-264289). When a substrate having an uneven structure is used, it is necessary to accurately immobilize the selective binding substance on the upper surface of the convex portion on the substrate. Further, for the purpose of improving the detection sensitivity, in order to suppress the reflection of light from the substrate during observation, it is preferable that the surface of the substrate is a color or material that absorbs light such as black.
  • the spot solution after coating can be localized on the upper surface of the convex portion (reference number 13 in FIG. 3).
  • the reason for this is that the spread of the spot solution can be limited at the edge portion of the convex portion (reference number 14 in FIG. 3).
  • the spot solution may spread on the substrate because there is no portion corresponding to the reference number 14 in FIG.
  • a functional group capable of a condensation reaction for example, an amino group, a hydroxy group, or a thiol group (sulfanyl group) is formed on the surface of the substrate.
  • a carboxyl group it is preferable to have a carboxyl group, and it is more preferable to have a carboxyl group.
  • a silane coupling agent having these functional groups for example, 3-aminopropyltriethoxysilane).
  • the carboxyl group can be introduced on the surface of the substrate by reacting with succinic anhydride or the like.
  • a resin substrate a polymer having these functional groups may be applied to the surface of the substrate, and when an acrylic resin substrate such as methyl polymethacrylate (PMMA) is used, alkali hydrolysis may be applied.
  • PMMA methyl polymethacrylate
  • a carboxyl group may be generated by hydrolyzing the ester group on the surface of the substrate by the reaction.
  • the selective binding substance immobilized on the substrate in the method of the present invention means a substance capable of selectively binding directly or indirectly to the substance to be measured, and typical examples thereof include nucleic acids, proteins, and sugars. And other antigenic compounds.
  • the nucleic acid may be PNA as well as DNA and RNA.
  • a single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof, and thus falls under a selective binding substance. ..
  • the protein include an antibody, an antigen-binding fragment of an antibody such as a Fab fragment and an F (ab') 2 fragment, and various antigens.
  • An antibody or an antigen-binding fragment thereof selectively binds to a corresponding antigen, and the antigen selectively binds to a corresponding antibody, and thus is therefore a selective binding substance.
  • the saccharide a polysaccharide is preferable, and various antigens can be mentioned. It is also possible to immobilize substances having antigenicity other than proteins and sugars.
  • the selective binding substance used in the present invention may be a commercially available substance, or may be obtained from a living cell or the like. Particularly preferred as the selective binding substance are nucleic acids.
  • nucleic acids with a length of 10 to 100 bases which are called oligonucleic acids
  • the amino group at the end of the nucleic acid can be easily modified. It is preferable because it can be easily fixed to the surface of the substrate. Further, from the viewpoint of hybridization stability, the length is more preferably 20 to 100 bases.
  • a functional group capable of a condensation reaction that is, an amino group, a hydroxy group, a thiol group, or a carboxyl group is present at the terminal of the nucleic acid, and an amino group is particularly preferable.
  • Methods for binding these functional groups to the ends of nucleic acids are well known. For example, binding an amino group to the end of a nucleic acid can be performed by binding an amidite reagent containing an amino group (references). : International Publication 2013/024694).
  • the selective binding substance is immobilized on the substrate surface by a condensation reaction using a condensing agent.
  • a condensing agent is a reagent that forms an amide bond or an ester bond by subjecting a selective binding substance to a condensation reaction with a functional group existing on a substrate. From the viewpoint of stability, the selective binding substance is preferably bonded to the substrate surface by an amide bond.
  • the condensing agent is used by adding it to the spot solution together with the selective binding substance. Therefore, the condensing agent is preferably water-soluble.
  • Water-soluble condensing agents include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-.
  • Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) and the like can be mentioned.
  • Examples of the condensing agent include a carbodiimide derivative, a uronium derivative, and a phosphonium derivative depending on the difference in the molecular structure, but a highly versatile carbodiimide derivative is preferable.
  • Examples of the carbodiimide derivative include EDC, N, and N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), and EDC is particularly preferable from the viewpoint of water solubility as described above.
  • the EDC may be hydrochloride or salt-free.
  • the concentration of the condensing agent in the spot solution used in step A of the present invention needs to be 30 mM or more, and preferably 40 mM or more in order to sufficiently proceed with the condensation reaction of the selective binding substance. .. Further, when the concentration of the condensing agent is high, contamination with the selective binding substance at adjacent spots on the substrate frequently occurs, and the yield is remarkably lowered in the production of the analysis chip. It needs to be 80 mM or less, preferably 60 mM or less. That is, the concentration of the condensing agent in the spot solution needs to be 30 mM or more and 80 mM or less. In particular, it is preferably 40 mM or more and 60 mM or less.
  • the spot solution used in step A of the present invention preferably contains a salt together with a selective binding substance and a condensing agent. This is based on whether or not the spot liquid could be applied to a predetermined position after the spot, and whether or not there is a defect such that the spot liquid is connected to the adjacent region to which the selective binding substance is applied at the spot position on the substrate. This is because the inspection can be performed by observing the precipitated crystals of the salt with a camera or the like.
  • the salt is a compound produced by the reaction of an acid and a base, and is composed of a positive component (cation) of the base and a negative component (anion) of the acid.
  • the cation constituting the salt include sodium ion, potassium ion, lithium ion, magnesium ion, calcium ion and the like.
  • the anion constituting the salt include chloride ion, bromide ion, fluoride ion, iodide ion, sulfate ion, nitrate ion, phosphite ion, acetate ion, phosphate ion, perchlorate ion and the like.
  • the salt used in the present invention is a combination of these cations and anions, specifically lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, magnesium bromide, magnesium perchlorate, magnesium nitrate, nitrite.
  • Magnesium, magnesium acetate, magnesium sulfate, sodium phosphate, potassium phosphate are preferable, and sodium chloride is more preferable.
  • the concentration of the salt contained in the spot solution is preferably 10 mM or more, more preferably 40 mM or more, and further preferably 80 mM or more. Further, if the concentration is too high, the immobilization reaction of the selective binding substance may be inhibited. Therefore, the concentration is preferably 500 mM or less, more preferably 120 mM or less.
  • the range of salt concentration in the spot solution is preferably 10 mM or more and 500 mM or less, more preferably 40 mM or more and 120 mM or less, and further preferably 80 mM or more and 120 mM or less.
  • the concentration of the selectively binding substance in the spot solution is not particularly limited as long as the amount of the substance to be measured can be detected, and can be appropriately set.
  • the selective binding substance is nucleic acid
  • the nucleic acid concentration in the spot solution is usually about 5 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably about 10 ⁇ M to 30 ⁇ M.
  • the spot solution containing the selective binding substance, condensing agent and salt is preferably an aqueous solution. Further, the spot solution may contain other substances such as an organic solvent, a surfactant, and a buffer for pH adjustment, in addition to the selective binding substance, the salt and the condensing agent.
  • the method of applying the spot solution to the surface of the substrate is not particularly limited, and for example, a method of instilling the spot solution using a pin and a method of discharging the spot solution onto the substrate using a dispenser or an inkjet are used. Can be used. Specifically, in the method of spotting using a pin, a spot liquid is adhered to the tip of the pin, and the adhered spot liquid is brought into contact with a substrate to be applied.
  • step A of applying the spot solution to the surface of the substrate the humidity of the space where the substrate is installed greatly affects the performance of the produced biochip.
  • the humidity of the space where the substrate is installed it is necessary to maintain the humidity of the space where the substrate is installed at 60% RH or more. If the humidity is lower than this, the measurement reproducibility of the produced biochip is lowered.
  • the upper limit of humidity is preferably 70% RH or less from the viewpoint of yield. If this humidity is exceeded, the frequency of contamination with the immobilized region (spot) of the adjacent selective binding substance increases, and the yield in production tends to decrease.
  • the method of measuring the humidity near the surface of the substrate at the time of coating is not particularly limited, but it can be measured by arranging the sensor of the electric hygrometer near the substrate where the coating is performed. Specifically, a resistance change type humidity sensor and a capacitance change type humidity sensor can be used. As these sensors, small ones that can be connected to a data logger are commercially available.
  • Humidity adjustment in the installation space of the board can be realized by combining a known air conditioner and a humidifier.
  • a humidifying function for example, air passing through water as shown in FIG. 1 is blown onto the carrier.
  • Humidification unit 130 or a method of sending air with a humidity prepared and controlled by an air conditioner having a humidifying and dehumidifying function, and the like can be mentioned, but the method is not limited to these methods.
  • the humidity of the installation space and the humidity on the substrate surface are the same because the air flow is generated by adjusting the humidity.
  • the example of the humidification unit 130 shown in FIG. 1 includes a bottle 131, a water bath 132, an air pump 133, an air supply tube 134, a humidification tube 135, and a thermometer 136.
  • the bottle 131 contains the water 131a and the air stone 131b, and the temperature of the water 131a in the bottle 131 is adjusted by the water bath 132.
  • Air is sent from the air pump 133 through the air supply tube 134 into the water 131a, and the released air is taken into the air stone 131b, and minute bubbles are discharged.
  • the bubbles rise in the bottle 131 as humidified air, flow into the humidifying tube 135, and are supplied to each uneven portion 11 (convex portion 13) of the analysis chip 1.
  • thermometer 133a that measures the flow rate of the gas output from the air pump 133
  • flow rate adjusting valve 133b that adjusts the flow rate of the gas output from the air pump 133.
  • step B of binding the selective binding substance to the surface of the substrate is provided.
  • This step is carried out by subjecting the selective binding substance to a condensation reaction with a functional group present on the surface of the substrate using a condensing agent, and can be carried out under normal conditions under which the condensation reaction proceeds.
  • the temperature of the condensation reaction is preferably 30 ° C. or higher at which the condensation reaction is promoted
  • the humidity is preferably 80% RH or higher in order to prevent evaporation of the applied spot solution
  • the reaction time is preferably 1 hour or higher. ..
  • the temperature of the condensation reaction is too high, the selective binding substance may change or the condensation reaction may be hindered. Therefore, the temperature is preferably 60 ° C.
  • the selective binding substance can be bonded to the surface of the substrate by placing the substrate coated with the spot solution in a plastic container containing a small amount of water and allowing it to stand at 37 ° C. for 12 hours. In the conventional method, in this immobilization step, contamination with the immobilization region of the adjacent selective binding substance is likely to occur.
  • a step of detecting the precipitated salt using an image detection unit after the step B of binding the selective binding substance to the surface of the substrate.
  • a normal optical microscope or a digital microscope may be used for detecting the precipitated salt
  • a laser scanner used for analysis of a microarray, or a spot inspection device as shown in FIG. 1 may be used. ..
  • the spot inspection device 100 shown in FIG. 1 includes an image acquisition unit 110 that acquires an image of the biochip 1 and an analysis unit 120 that analyzes an image acquired by the image acquisition unit 110.
  • Each unit of the spot inspection device 100 is driven under the control of a control unit (not shown).
  • the spot solution is applied to the spot portion 11 on the substrate 10.
  • the image acquisition unit 110 includes a light source unit 111, a light source power supply 112, a lens barrel 113, and an image pickup unit 114.
  • the light source unit 111 is configured by using an LED, a laser light source, a halogen lamp, or the like.
  • the light source unit 111 emits illumination light by the electric power supplied from the light source power supply 112.
  • the illumination light emitted by the light source unit 111 is incident on the lens barrel 113.
  • the lens barrel 113 is provided with an objective lens, a relay lens, and the like, emits illumination light supplied from the light source unit 111 toward the analysis chip 1, takes in the light from the analysis chip 1, and guides the light to the image pickup unit 114. It glows.
  • the imaging unit 114 receives the light guided by the lens barrel 113 and converts it into an electric signal.
  • the imaging unit 114 outputs the converted electrical signal to the analysis unit 120.
  • the imaging unit 114 is configured by using a CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) image sensor, a CCD (Charge Coupled Device) image sensor, a photomultiplier tube (PMT), or the like.
  • CMOS Complementary Metal Oxide Semiconductor
  • CCD Charge Coupled Device
  • PMT photomultiplier tube
  • the analysis unit 120 generates an image of the analysis chip 1 based on the electric signal generated by the imaging unit 114, or binarizes this image to determine the application status of the spot liquid at the spot.
  • the analysis unit 120 includes a general-purpose processor such as a CPU (Central Processing Unit), a dedicated processor such as a GPU (Graphics Processing Unit), a programmable logic device such as an FPGA (field-programmable gate array), a display, and an input means (for example, a keyboard). Etc. are used.
  • the quality of the spot can be judged by analyzing the image data of the obtained substrate or visually, using the presence or absence of the precipitated salt at the spot as an index.
  • the image data can be analyzed by binarizing the board image. For example, a binarized image obtained by binarizing the brightness of the substrate image with a preset first threshold value as a boundary is generated. In this binarized image, white is assigned to the portion where salt is precipitated, and black is assigned to the portion where salt is not precipitated.
  • the spot is quantified based on the binarized image. The area of each spot is extracted, and the number of pixels to which white is assigned (the number of white pixels) in each spot is counted. After that, the quality of each spot is determined based on the counted number of white pixels and the second threshold value set in advance. For example, as shown in each example of FIG.
  • Whether or not a sufficient amount of selective binding substance was immobilized on the produced biochip may be inspected by a known method.
  • a nucleic acid for example, a method of evaluating the immobilized amount of the selective binding substance using terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) described in JP-A-2006-234712 can be mentioned. Be done.
  • TdT terminal deoxynucleotidyltransferase
  • a solution containing TdT and a nucleotide labeled with a fluorescent dye is dropped onto a biochip to introduce the fluorescent dye into the terminal of the immobilized nucleic acid, and after washing, a laser scanner is used. By measuring the fluorescence intensity, the amount of the selectively binding substance immobilized can be evaluated.
  • Example 1 Preparation of Substrate As shown in FIGS. 2 and 3, a substrate 10 (75 mm ⁇ 25 mm ⁇ 1 mm) made of polymethylmethacrylate (PMMA) was prepared. On the substrate surface of the substrate 10, a spot composed of 32 (4 ⁇ 8) convex portions 12 in which 100 (10 ⁇ 10) units of 100 (10 ⁇ 10) conical cone-shaped convex portions 13 having a pitch of 170 ⁇ m and a diameter of 100 ⁇ m are provided. The region 11 was divided into four sections (that is, a total of 12800 convex portions were provided on the substrate).
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • This substrate was immersed in a 10 N aqueous sodium hydroxide solution at 70 ° C. for 15 hours. Then, pure water, 0.1N HCl aqueous solution, and pure water were washed in this order. In this way, the side chain of PMMA on the surface of the substrate was hydrolyzed to generate a carboxyl group.
  • step A As a selective binding substance, 3000 kinds of human microRNA DNA probes corresponding to the public database "miRbase release 22" were synthesized and prepared. This probe has an aminated 5'end.
  • the spot solution uses the above 3000 kinds of DNA probes, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) as a condensing agent, and sodium chloride as a salt, and the concentration of EDC is as shown in Table 1. It was prepared as an aqueous solution having a composition of 1 to 5 in which the above was changed. In any of the spot solutions having compositions 1 to 5, the sodium chloride concentration was fixed at 100 mM and the DNA probe concentration was fixed at 20 ⁇ M.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the prepared spot solution was applied (spotted) to the surface of the convex portion on the substrate using a pin-type spotter.
  • the temperature of the space where the substrate was placed was maintained at 18 ° C. and the humidity was maintained at 70% RH.
  • a precision air conditioner (Apiste Co., Ltd., PAU-A1400S-HC) with a temperature of 18 ° C and a humidity of 70% RH, and blow air from the precision air conditioner into the space where the spotter solution is applied. This was done by guiding the air to be made.
  • a temperature / humidity sensor Hioki Electric Co., Ltd. Z2000 was placed near the place where the spot liquid was applied in the spotter (within 5 cm as a distance), and the temperature / humidity was monitored during the application process.
  • the probe solution was applied to 20 substrates.
  • step B The substrate on which the probe solution was spotted in (2) above was placed in a closed plastic container and incubated for 20 hours under the conditions of a temperature of 37 ° C. and a humidity of 100% to carry out a condensation reaction, and the probe DNA was immobilized on the substrate surface. ..
  • probe immobilization is good (condition that a sufficient amount of probe DNA is immobilized), and when the signal intensity is less than 15,000, “probe immobilization is good”. It was determined as “poor probe immobilization” (condition in which the amount of probe DNA immobilized was insufficient).
  • RNA was fluorescently labeled with a fluorescent dye according to the instruction manual of "3D-Gene miRNA Labeling kit” (Toray Co., Ltd.).
  • the labeled product was applied to one spot region 11 on each "hybridization chip”. Then, the hybridization reaction was carried out at 32 ° C. for 16 hours while shaking the “hybridization chip” and stirring the labeled product with beads.
  • the squared value (R 2 ) of the correlation coefficient exceeded 0.994 when the spot solution having any of the compositions 2 to 4 was used, and no particular problem was observed in the reproducibility of the two measurements. rice field.
  • Example 2 In step A of Example 1 (2), the composition of the spot solution is composition 3 (EDC concentration 60 mM), and the humidity when the spot solution is applied to the substrate is 50% RH, 60% RH, 70% RH (implementation). (Same as in Example 1), except that the four conditions of 72.5% RH were set, the probe DNA was immobilized on each substrate to prepare a chip (step B) in the same manner as in Example 1, and after the hybridization reaction. Detect spots, calculate non-contamination rate (%), determine good / bad probe immobilization, and calculate the squared value (R 2 ) of the correlation coefficient, which indicates the reproducibility of two measurements. went. The results are shown in Table 2.
  • FIG. 4 shows a scatter plot when the humidity at the time of application is 50% RH (left figure) and when the humidity is 70% RH (right figure).
  • the scatter plot was distorted, the square value (R 2 ) of the correlation coefficient was lowered, and the reproducibility was lowered. That is, when the humidity is less than 60% RH, there is no difference in the average value of the signal intensities of the spots, but it shows that the amount of probe DNA immobilized in each spot varies.
  • Example 3 A substrate having no uneven structure shown in FIG. 2 (however, the material of the substrate was the same as in Example 1) was produced.
  • the composition of the spot solution is the composition 3 of Table 1, and during the coating process, the temperature of the space where the substrate is placed is maintained at 18 ° C. and the humidity is maintained at 70% RH, and the probe DNA is applied to each substrate in the same manner as in Example 1.
  • the squared value (R 2 ) of the correlation coefficient showing the above was calculated.
  • the intensity average value was 16000, and the squared value of the correlation coefficient was 0.9941, which was equivalent to the result of the same conditions in Examples 1 and 2.
  • the non-occurrence rate of contamination was 80%.

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Abstract

要約　縮合反応を利用して選択結合性物質を基板に結合させるバイオチップの製造方法であって、バイオチップの再現性と歩留まりの両立が可能な製造方法が開示されている。バイオチップの製造方法は、選択結合性物質および縮合剤を含む溶液を基板表面へ塗布する工程Ａ、および選択結合性物質を基板表面に結合させる工程Ｂ、を含み、工程Ａにおける前記溶液中の縮合剤の濃度が３０ｍＭ以上８０ｍＭ以下であり、工程Ａ中、基板が設置された空間の湿度が６０％ＲＨ以上である。

Description

バイオチップの製造方法
　本発明は、測定対象物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）が基板表面に固定化されたバイオチップの製造方法に関する。
　バイオチップは、測定対象物質と選択的な結合をする核酸、タンパク質などの選択結合性物質を基板（以下「担体」と言う場合もある。）の表面に高密度に固定化させたものであって、当該選択的結合されたものを蛍光などにより測定対象物質を検出し、また、その強度変化やパターンから分子識別や診断を行うことができるものである。多種類の選択結合性物質を高密度（通常30個以上／平方ミリメーター）に固定化させることで、微量な検体でも、一度に多くの情報を得られることが最大の利点である。
　バイオチップを製造する方法としては、フォトリソグラフィを用いて基板表面上で選択結合性物質であるオリゴヌクレオチドを合成するAffymetrix法や、予め準備した選択結合性物質を含む溶液（以下「スポット溶液」という。）を基板上に塗布して選択結合性物質を固定化するStanford法が知られている。Stanford法においてスポット溶液を塗布する方法としては、金属製のピンを用いて溶液を点着（スポット）する方法、ディスペンサやインクジェットを用いて基板上に溶液を吐出する方法が挙げられる。
　検体に含まれるタンパク質や核酸の量を測定する場合において、その測定再現性はバイオチップにとって重要な性能である。即ち、同一の検体を複数のバイオチップに反応させた場合は、同一の選択結合性物質が固定化された領域からは、バイオチップの個体が異なったとしても、同一の検出強度（通常は蛍光強度）が得られることが必要である。
　バイオチップが開発された当初、選択結合性物質であるＤＮＡの基板表面への固定化は、ポリ-Ｌ-リジンでコートされた基板上に静電相互作用により非共有結合的にされていたが、現在は、測定再現性の観点から、より安定な共有結合による固定化が一般的である。
　特許文献１および特許文献２には、共有結合により選択結合性物質を基板表面に固定化する方法が記載されている。具体的には、その表面にあらかじめカルボキシル基を生成させた基板を用い、選択結合性物質であるアミノ化オリゴＤＮＡおよび縮合剤を含むスポット溶液を基板表面にスポットし、基板上のカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基とを縮合反応させてアミド結合を形成することにより、選択結合性物質が基板上に共有結合により固定化される。このように縮合剤を含むスポット溶液を用いる方法は、特許文献３に記載された、あらかじめ基板上においてカルボキシル基を活性エステル化させた基板を用い、縮合剤を含まないスポット溶液を塗布して選択結合性物質を固定化する方法と比較して、あらかじめ基板を活性化させる必要がなく、活性化させた基板の保存中の劣化の影響も受けないというメリットが存在する。
　また、選択結合性物質の固定化時に、一定の湿度にコントロールすることが重要であることは、特許文献４、５に開示がある。
特開２００６－２０８０１２号公報 特開２０１１－２００２３０号公報 特開２００１－１３９５３２号公報 特開２００５－１７１５５号公報 特開２００３－９８１７２号公報
　先に述べたとおり、バイオチップは、その測定再現性が優れたものでなければならない。測定再現性を上げるためには、基板が担持できる最大密度で選択結合性物質を固定化することが重要である。また、バイオチップの製造工程において、スポット溶液は高密度に基板表面に塗布されるために、隣接する固定化領域（スポット）に塗布されたスポット溶液による汚染（混入、コンタミネーションともいう。）をおこすおそれがある。コンタミネーションが生じたバイオチップは、通常、検査工程で除外されるので、バイオチップの製造効率（歩留まり）を低下させる一因となる。
　先に述べた測定再現性の性能を維持しつつ、コンタミネーションの抑制した歩留まりが良い製造方法を確立することは二律背反の関係であることが多く、その技術の確立が求められている。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、上記の縮合剤を含むスポット溶液を用いて選択結合性物質を基板表面に固定化するバイオチップの製造において、従来用いられている縮合剤の濃度を単に適用した場合は、バイオチップの測定再現性と隣接スポットとのコンタミネーションの抑制の両立が極めて困難であり、量産化は不可能であることを見いだした。そして、スポット溶液に含まれる縮合剤の濃度を大幅に変更し、かつ、選択結合性物質の塗布時の湿度を適切に設定することで、これら２つの課題が解決できることを見いだし、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下（１）～（６）を提供する。
（１）選択結合性物質が基板表面に固定化されたバイオチップの製造方法であって、
選択結合性物質および縮合剤を含む溶液を基板表面へ塗布する工程Ａ、および
選択結合性物質を基板表面に結合させる工程Ｂ、を含み、
前記工程Ａにおける前記溶液中の縮合剤の濃度が３０ｍＭ以上８０ｍＭ以下であり、
当該工程Ａ中、基板が設置された空間の湿度が６０％ＲＨ以上である、
バイオチップの製造方法。
（２）工程Ａにおいて、前記空間の湿度が７０％ＲＨ以下である、（１）に記載のバイオチップの製造方法。
（３）縮合剤が水溶性である、（１）または（２）に記載のバイオチップの製造方法。
（４）縮合剤がカルボジイミドの誘導体である、（１）から（３）のいずれかに記載のバイオチップの製造方法。
（５）カルボジイミドの誘導体が１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、（４）に記載のバイオチップの製造方法。
（６）選択結合性物質が核酸である、（１）から（５）のいずれかに記載のバイオチップの製造方法。
　縮合剤を含むスポット溶液を用いて縮合反応により選択結合性物質を基板表面に固定化するバイオチップの製造において、本発明の方法を用いれば、測定再現性に優れたバイオチップを隣接スポットとのコンタミネーションを抑制して、歩留まり良く高い生産性で製造可能となる。
加湿ユニットを有するスポット検査装置の一構成例を示す図である。 実施例で使用した分析チップ基板１０の基板表面を示す図である。 実施例で使用した分析チップ基板１０の、図２のＡ－Ａ線位置における断面図である。 実施例２で得られた、ハイブリダイゼーション後の２枚のチップにおける全スポットシグナル強度の散布図（左図は湿度５０％ＲＨの場合、右図は湿度７０％ＲＨの場合）である。
　本発明は、選択結合性物質が基板表面に固定化されたバイオチップの製造方法であって、次の工程Ａおよび工程Ｂを含む。
選択結合性物質、縮合剤を含む溶液を基板表面へ塗布する工程Ａ。
選択結合性物質を基板表面に結合させる工程Ｂ。
　以下、上記工程ごとに、本発明の製造方法を説明する。
　本発明の工程Ａは、選択結合性物質、縮合剤を含む溶液（スポット溶液）をバイオチップの基板表面へ塗布する工程である。
　本発明で使用するバイオチップの基板の材質は、選択結合性物質を縮合反応によって固定化可能なものであれば特に限定されない。例えば、樹脂、ガラス、金属、シリコンウェハのいずれであってもよいが、表面処理の容易性、量産性の観点から樹脂が好ましい。
　基板の材質となる樹脂としては、例えば、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリエステル等が挙げられ、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステルが好ましい。このうち、ポリメタクリル酸エステルとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）またはポリプロピルメタクリレート等のポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）が挙げられるが、好ましくはＰＭＭＡである。
　また、樹脂としては、公知の共重合体も用いることができる。例えば、アクリロニトリル・スチレン共重合体（ＡＳ樹脂）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体（ＡＢＳ樹脂）、アクリロニトリル・エチレン-プロピレン-ジエン・スチレン共重合体（ＡＥＳ樹脂）、ポリメタクリル酸エステルを含む共重合体としては、メタクリル酸メチル・アクリルニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体（ＭＡＢＳ樹脂）、メタクリル酸メチル・ブタジエン・スチレン共重合体（ＭＢＳ樹脂）、メタクリル酸メチル・スチレン共重合体（ＭＳ樹脂）等が挙げられる。
　基板の形状は、特に限定されないが、市販のスライドガラスと同等の大きさの平坦な基板が好ましく用いられる。また、検出時の検出感度を向上させる目的で、基板の表面上に凹凸構造を有する基板（例えば特開２００４－２６４２８９号公報参照）を用いることが好ましい。凹凸構造を有する基板を用いる場合には、選択結合性物質を基板上の凸部上面に正確に固定化する必要がある。また、検出感度を向上させる目的で、観察時において基板からの光の反射を抑制するために、基板の表面が、黒色等、光を吸収する色や素材であることが好ましい。
　基板を凹凸構造として、凸部上面に選択結合性物質を固定化する場合は、塗布後のスポット溶液を凸部（図３中の参照番号１３）上面に局在化させることが可能である。この理由は凸部のエッジ部分（図３中の参照番号１４）で、スポット溶液の広がりを制限できるためである。他方、一般的な平坦な基板では、図３中の参照番号１４に相当する部分が無いのでスポット溶液が基板上で広がる場合がある。このため、凹凸構造を持つ基板の凸部上面に固定化する場合は、平坦な基板にスポットする場合と比較して、隣接するスポットとの選択結合性物質のコンタミネーションを低減、即ち歩留まりを増加できることがあり、より好ましく用いることができる。
　本発明の方法では、選択結合性物質を基板の表面に縮合反応により固定化することから、基板表面には縮合反応が可能な官能基、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基（スルファニル基）、カルボキシル基を有することが好ましく、なかでもカルボキシル基を有することがより好ましい。基板表面に官能基を導入する方法としては、ガラス製基板を用いる場合には、これらの官能基を有するシランカップリング剤（例えば、３－アミノプロピルトリエトキシシラン）を用いてシランカップリングにより導入する方法を用いることができる。このようにアミノ基を導入した場合は、無水コハク酸などを反応させることにより、カルボキシル基を基板表面上に導入することが可能である。樹脂製基板を用いる場合には、これらの官能基を有する高分子を基板表面に塗布しても良いし、ポリメタクリ酸メチル（ＰＭＭＡ）などのアクリル樹脂製の基板を用いる場合には、アルカリ加水分解反応により基板表面のエステル基を加水分解することでカルボキシル基を生成してもよい。
　本発明の方法において基板に固定化する選択結合性物質は、測定対象物質と直接的または間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、その代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類および他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡのほか、ＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、当該塩基配列またはその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、選択結合性物質に該当する。また、タンパク質としては、抗体、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体の抗原結合性断片、種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、選択結合性物質に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞等から得られたものでもよい。選択結合性物質として、特に好ましいものは、核酸である。核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、基板表面への固定化が容易となることから好ましい。また、ハイブリダイゼーションの安定性という観点から２０～１００塩基長であることがより好ましい。核酸の末端には縮合反応が可能な官能基、すなわちアミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシル基が存在することが好ましいが、特にアミノ基が好ましい。核酸の末端にこれらの官能基を結合する方法は周知であり、例えば、核酸の末端にアミノ基を結合することは、アミノ基を含有するアミダイト試薬を結合することにより行うことができる（参考文献：国際公開２０１３／０２４６９４号）。
　本発明の方法において、選択結合物質は縮合剤を用いた縮合反応により基板表面に固定化される。縮合剤は、選択結合性物質を、基板上に存在する官能基と縮合反応させることによりアミド結合またはエステル結合を形成する試薬である。安定性の面から、選択結合性物質は、アミド結合により基板表面に結合されることが好ましい。
　本発明の方法では、縮合剤は、選択結合性物質と共に、スポット溶液中に添加して用いられる。そのため、縮合剤は水溶性であることが好ましい。水溶性の縮合剤としては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）や４－（４，６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）などが挙げられる。
　縮合剤は、その分子構造の違いにより、カルボジイミド誘導体、ウロニウム誘導体、ホスホニウム誘導体などが挙げられるが、汎用性の高いカルボジイミド誘導体が好ましい。カルボジイミド誘導体体としては、ＥＤＣやＮ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）が挙げられるが、前述の水溶性の観点からＥＤＣが特に好ましい。ＥＤＣは、塩酸塩であってもよいし、塩フリー体であってもよい。
　本発明の工程Ａで使用するスポット溶液中の縮合剤の濃度は、選択結合性物質の縮合反応を十分に進行させるために、３０ｍＭ以上であることが必要であり、４０ｍＭ以上であることが好ましい。また、縮合剤の濃度は、高濃度であると、基板上で隣接するスポットにおける選択結合性物質とのコンタミネーションが頻発し、分析チップの製造において歩留まりが低下することが顕著であるために、８０ｍＭ以下であることが必要であり、６０ｍＭ以下であることが好ましい。すなわち、スポット溶液中の縮合剤の濃度は、３０ｍＭ以上８０ｍＭ以下であることが必要である。特に、４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下であることが好ましい。
　本発明の工程Ａで使用されるスポット溶液には、選択結合性物質および縮合剤と共に塩が含まれていることが好ましい。これは、スポット後にスポット液が所定の位置に塗布できたか否か、さらには隣の選択結合性物質を塗布した領域とつながってしまうような不良が生じていないかを、基板上のスポット位置で析出した当該塩の結晶をカメラなどで観察することにより検査が可能になるためである。
　ここで、塩とは、酸と塩基との反応によって生じる化合物であり，塩基の陽性成分（カチオン）と酸の陰性成分（アニオン）とからなるものである。塩を構成するカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。塩を構成するアニオンとしては、塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、亜酸イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸イオンなどが挙げられる。本発明で使用される塩は、これらのカチオンおよびアニオンの組み合わせであり、具体的には、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、亜硝酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムが好ましく、塩化ナトリウムがより好ましい。
　スポット溶液に含まれる塩の濃度は、低すぎる場合には十分量の塩が析出しないため、１０ｍＭ以上であることが好ましく、４０ｍＭ以上であることがより好ましく、８０ｍＭ以上であることがさらに好ましい。また、濃度が高すぎる場合には選択結合性物質の固定化反応を阻害する可能性があるので、５００ｍＭ以下であることが好ましく、１２０ｍＭ以下であることがより好ましい。スポット溶液中の塩の濃度の範囲は、１０ｍＭ以上５００ｍＭ以下が好ましく、４0ｍＭ以上１２０ｍＭ以下がより好ましく、８０ｍＭ以上１２０ｍＭ以下がさらに好ましい。
　スポット溶液中の選択結合性物質の濃度は、測定対象物質の検出が可能となる量であれば特に限定されず、適宜設定することが可能である。例えば、選択結合性物質が核酸の場合、スポット溶液中の核酸濃度は、通常、５μＭ～１００μＭ程度、好ましくは、１０μＭ～３０μＭ程度である。
　選択結合性物質、縮合剤および塩を含むスポット溶液は、水溶液であることが好ましい。また、スポット溶液には、選択結合性物質、塩および縮合剤以外に、有機溶剤や界面活性剤、ｐＨ調製用の緩衝剤など他の物質を含んでいてもよい。
　工程Ａにおいて、スポット溶液を基板表面への塗布する方法は特に限定されないが、例えば、ピンを用いてスポット溶液を点着する方法、ディスペンサやインクジェットを用いて基板上にスポット溶液を吐出する方法を用いることができる。具体的には、ピンを用いて点着する方法は、ピンの先端にスポット液を付着させ、付着したスポット液を基板に接触させて塗布する。
　スポット溶液を基板表面に塗布する工程Ａにおいて、基板が設置された空間の湿度は、作製されたバイオチップの性能を大きく左右する。この工程Ａ中、基板が設置された空間の湿度は６０％ＲＨ以上に維持することが必要である。これより湿度が低い場合、作製されたバイオチップの測定再現性が低下する。湿度の上限については、歩留まりの観点から７０％ＲＨ以下であることが好ましい。この湿度を超えると、隣接する選択性結合物質の固定化領域（スポット）とのコンタミネーションが生じる頻度が高まり、製造における歩留まりが下がる傾向がある。
　塗布時の基板表面付近の湿度を測定する方法は、特に限定されるものではないが、塗布が行われる基板付近に電気式湿度計のセンサーを配置することで測定可能である。具体的には、抵抗変化型湿度センサーや静電容量変化型湿度センサーを用いることができる。これらのセンサーとしては、データロガーへの接続が可能で小型のものが市販されている。
　基板の設置空間における湿度の調整は、公知のエアコンディショナーや、加湿器を組み合わせることにより実現可能である。基板表面付近を効率的に湿度調整するためには、基板を設置する装置全体をカバーで覆い、その中に加湿機能（例えば、図１に示すような、水をくぐらせた空気を担体に吹き付ける加湿ユニット１３０）、または、加湿および除湿機能があるエアコンディショナーにて調製、管理された湿度の空気を送り込む方法、等が挙げられるが、これらの方法に限定されない。通常、湿度の調整に伴い空気の流れが生じるために、設置空間の湿度と基板表面における湿度は同一となる。
　ここで、図１に示す加湿ユニット１３０の例は、ボトル１３１と、ウォーターバス１３２と、エアーポンプ１３３と、送気チューブ１３４と、加湿チューブ１３５と、温度計１３６とを有する。ボトル１３１は、水１３１ａと、エアーストーン１３１ｂとを収容し、ウォーターバス１３２によってボトル１３１内の水１３１ａの温度が調整される。エアーポンプ１３３から送気チューブ１３４を経て水１３１ａ内に空気が送り込まれ、放出される空気はエアーストーン１３１ｂに取り込まれ、微小な泡が排出される。この泡が加湿された空気としてボトル１３１内を上昇し、加湿チューブ１３５に流れ込み、分析チップ１の各凹凸部１１（凸部１３）に供給される。
　エアーポンプ１３３と送気チューブ１３４との間には、エアーポンプ１３３から出力される気体の流量を計測する流量計１３３ａと、エアーポンプ１３３から出力される気体の流量を調整する流量調整弁１３３ｂとが設けられる。また、温度計１３６によって水１３１ａの温度を確認できる。
　本発明の工程Ａの後に、選択結合性物質を基板表面に結合させる工程Ｂが設けられる。この工程は、縮合剤を用いて、選択結合性物質を、基板表面に存在する官能基と縮合反応することにより行われ、縮合反応が進行する通常の条件で行うことができる。例えば、縮合反応の温度は、縮合反応が促進される３０℃以上が好ましく、湿度は、塗布したスポット溶液の蒸発を防ぐために８０％ＲＨ以上であることが好ましく、反応時間は１時間以上が好ましい。一方、縮合反応の温度は、高すぎると、選択結合性物質が変化したり、縮合反応に支障がでる場合があるので、６０℃以下が好ましい。また、縮合反応時間の上限は特にないが、長すぎても意味がないので、通常は４８時間以下、好ましくは２４時間以下である。具体的には、スポット溶液を塗布した基板を少量の水を入れたプラスチック容器に入れ、３７℃で、１２時間静置することで、選択結合性物質を基板表面へ結合することができる。従来の方法では、この固定化工程で、隣の選択性結合物質の固定化領域とのコンタミネーションが生じ易かった。
　本発明の製造方法においては、選択結合性物質を基板表面に結合させる工程Ｂの後に、析出した塩を、画像検出ユニットを用いて検出する工程を設けることが好ましい。本工程において、析出した塩の検出には、通常の光学顕微鏡やデジタル顕微鏡を用いてもよいし、マイクロアレイの分析に使用するレーザースキャナや、図１に示すようなスポット検査装置を用いてもよい。
　図１に示すスポット検査装置１００は、バイオチップ１の画像を取得する画像取得ユニット１１０と、画像取得ユニット１１０が取得した画像を解析する解析ユニット１２０とを備える。スポット検査装置１００は、図示しない制御部の制御のもとで各部が駆動する。
　バイオチップ１は、基板１０上のスポット箇所１１にスポット溶液が塗布されている。
　画像取得ユニット１１０は、光源部１１１と、光源用電源１１２と、鏡筒１１３と、撮像部１１４とを有する。
　光源部１１１は、ＬＥＤや、レーザー光源、ハロゲンランプ等を用いて構成される。光源部１１１は、光源用電源１１２から供給される電力によって照明光を発する。光源部１１１が出射した照明光は、鏡筒１１３に入射する。
　鏡筒１１３は、対物レンズ、リレーレンズ等が設けられ、光源部１１１から供給される照明光を分析チップ１に向けて出射するとともに、分析チップ１からの光を取り込んで、撮像部１１４に導光する。
　撮像部１１４は、鏡筒１１３に導光された光を受光して、電気信号に変換する。撮像部１１４は、変換した電気信号を、解析ユニット１２０に出力する。撮像部１１４は、ＣＭＯＳ（Complementary　Metal　Oxide　Semiconductor）イメージセンサ、ＣＣＤ（Charge　Coupled　Device）イメージセンサ、光電子増倍管（photomultiplier　tube：ＰＭＴ）等を用いて構成される。
　解析ユニット１２０は、撮像部１１４が生成した電気信号に基づいて、分析チップ１の画像を生成したり、この画像を二値化して、スポットにおけるスポット液の塗布状況を判定したりする。解析ユニット１２０は、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）等の汎用プロセッサ、ＧＰＵ（Graphics　Processing　Unit）等の専用プロセッサ、ＦＰＧＡ（field-programmable　gate　array）等のプログラマブルロジックデバイスや、ディスプレイ、入力手段（例えばキーボード）等を用いて構成される。
　スポットの良否は、得られた基板の画像データの解析または目視により、スポット箇所における析出した塩の有無を指標に判定することができる。
　画像データの解析は、基板画像を二値化することにより行うことができる。例えば、基板画像の輝度に対し、予め設定されている第１の閾値を境界として二値化した二値化画像を生成する。この二値化画像には、塩が析出している箇所に白色、塩が析出してない箇所に黒色が割り当てられる。二値化画像をもとに、スポットを数値化する。各スポットの領域をそれぞれ抽出し、各スポットにおける白色が割り当てられた画素の数（白ピクセル数）をそれぞれ計数する。その後、計数された白ピクセル数と、予め設定されている第２の閾値とに基づいて、各スポットの良否判定を行う。例えば、図２の各例に示すように、白ピクセル数が閾値以上であれば、スポット液が適切に塗布された良スポット（ＯＫ）であると判定する。一方、図３の各例に示すように、白ピクセル数が閾値未満であれば、スポット液が適切に塗布されていない不良スポット（ＮＧ）であると判定する。
　作製したバイオチップ上に十分量の選択結合物質が固定化されたか否かについては、既知の方法で検査すればよい。選択結合性物質として核酸を用いた場合には、例えば、特開２００６－２３４７１２号公報に記載のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて選択結合性物質の固定化量を評価する方法が挙げられる。ＴｄＴを用いた方法では、ＴｄＴと蛍光色素を標識したヌクレオチドを含む溶液を、バイオチップ上に滴下することで、固定化された核酸の末端に蛍光色素が導入され、洗浄後、レーザースキャナを用いて蛍光強度を測定することで、選択結合性物質の固定化量を評価することができる。
実施例１
（１）基板の作製
　図２、図３に示すような、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板１０（７５ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍ）を作製した。基板１０の基板表面には、１７０μｍのピッチで直径１００μｍの円錐台形状の凸部１３を１００個（１０×１０）単位で設けた３２個（４×８）の凸部群１２によって構成するスポット領域１１を４区分設けた（すなわち、基板上に合計１２８００個の凸部を設けた。）。
　この基板を、１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１５時間浸漬した。次いで、純水、０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、基板表面のＰＭＭＡの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。
（２）スポット溶液の塗布（工程Ａ）
　選択結合物質として、公的なデータベースである「ｍｉＲｂａｓｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　２２」に対応したヒトマイクロＲＮＡのＤＮＡプローブ３０００種を合成して用意した。本プローブは、５’末端がアミノ化されている。
　スポット溶液は、上記３０００種のＤＮＡプローブ、縮合剤として１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および塩として塩化ナトリウムを用いて、表１に示すように、ＥＤＣの濃度を変えた組成１～５の水溶液として調製した。なお、組成１～５のいずれのスポット溶液においても、塩化ナトリウム濃度：１００ｍＭ、ＤＮＡプローブ濃度：２０μＭと固定した。
　調製したスポット溶液を、基板上の凸部表面にピン方式のスポッターを用いて塗布（スポット）した。この塗布工程中、基板を設置した空間の温度は１８℃、湿度は７０％ＲＨに維持した。温湿度の調整は、精密空調機（株式会社アピステ、PAU－A1400S-HC）を温度１８℃、湿度７０％ＲＨに設定して用い、スポッター溶液の塗布が行われる空間に精密空調機から送風される空気を導くことにより行った。さらに、スポッター内のスポット液の塗布が実施される場所の近傍（距離として５ｃｍ以内）に温湿度センサー（日置電気株式会社　Ｚ２０００）を配置し、塗布工程中の温湿度のモニターを実施した。
　以上のようにして、２０枚の基板にプローブ溶液を塗布した。
（３）プローブＤＮＡの固定化（工程Ｂ）
　上記（２）でプローブ溶液がスポットされた基板を、密閉したプラスチック容器入れて、温度３７℃、湿度１００％の条件で２０時間インキュベートして縮合反応を行い、プローブＤＮＡを基板表面に固定化した。
（４）スポット溶液の乾燥、塩の析出
　上記（３）の固定化後、密閉したプラスチック容器から基板をとりだし、温度２１℃、湿度４５％の雰囲気下で３０分間静置し、基板表面上のスポット溶液を乾燥させ、塩を析出させた。
（５）スポットの検出、スポットの良否判定
　上記（４）でスポット溶液を乾燥させた基板に青色ＬＥＤ照明を照射し、テレセントリックレンズ（光学倍率２倍、WD66.7）を装着したＣＭＯＳカメラ（解像度２Ｍ、２０４８×１０８８pixel）にて基板表面の画像を取得した。この画像を用いて、目視で、隣接するスポットとのコンタミネーションが生じていないかの判定を実施した。全基板２０枚のうちのコンタミネーションが発生なかった基板の枚数の割合を「コンタミネーション非発生率」（％）として算出し、その結果を表２に示した。
（６）プローブＤＮＡ固定化量の評価
　（５）のスポット良否判定で合格となったチップの内、１枚を使用して、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ,タカラバイオ社製）１０Ｕを、Ｃｙ３標識ｄＵＴＰヌクレオチド（ＧＥヘルスケア社製）を１μＭとなるように溶解した添付のバッファー（TdT Buffer）２５０μＬに添加し、反応溶液とした。反応溶液５０μＬを基板へ滴下し、その上にカバーガラスをかぶせ、プラスチック容器の中に入れ、温度３５℃、湿度１００％の条件で１時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。「“３Ｄ　Ｇｅｎｅ”（登録商標）Ｓｃａｎａｒ」（東レ株式会社）に反応した基板をセットし、励起光５３２ｎｍ、レーザー出力１００％、ＰＭＴ３０に設定した状態で測定を行い、すべてのスポットのシグナル強度を求めた。そのシグナル強度の平均値を表１に示した。
　ここで、すべてのスポットでシグナル強度が１５,０００以上の場合を「プローブ固定化良」（十分量のプローブＤＮＡが固定化されている条件）と、シグナル強度が１５,０００を下回る場合を「プローブ固定化不良」（プローブＤＮＡの固定化量が不十分な条件）と、それぞれ判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１のとおり、ＥＤＣ濃度が１０ｍＭの場合（組成１）、「固定化不良」であったのに対し、ＥＤＣ濃度が３０ｍＭ以上（組成２～５）の場合、「プローブ固定化良」であった。一方で、ＥＤＣ濃度が８０ｍＭを超えると「コンタミネーション非発生率」が極端に下がり（即ち、歩留まりが極端に下がり）、量産には適していないことが分かった。
（７）ハイブリダイゼーションでの再現性評価
　組成２～４のスポット溶液を用いて作製した各基板に、そのスポット領域１１を覆うように、ビーズを挿入するための挿入孔を設けたカバーを貼り付け、カバーの挿入孔から攪拌用のセラミック製ビーズをチップ内に封入し、「ハイブリダイゼーション用チップ」をそれぞれ２枚得た。
　市販のヒトＰｒｏｓｔａｔｅ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いて、「３Ｄ－Ｇｅｎｅ　ｍｉＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ」（東レ株式会社）の取扱説明書に準じて、蛍光色素でＲＮＡを蛍光標識した。この標識産物を、各「ハイブリダイゼーション用チップ」上の１つのスポット領域１１にアプライした。その後、「ハイブリダイゼーション用チップ」を振盪してビーズによって標識産物を攪拌しながら、３２℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を実施した。
　ハイブリダイゼーション反応後に、カバーを剥奪し、チップを洗浄した。「“３Ｄ　Ｇｅｎｅ”（登録商標）Ｓｃａｎａｒ」（東レ株式会社）に反応した基板をセットし、励起光６３５ｎｍ、レーザー出力１００％、ＰＭＴ３５に設定した状態で蛍光強度の測定を行い、すべてのスポットのシグナル強度を求めた。２枚のチップの測定結果について散布図を描画し、その相関係数（Ｒ）の２乗値（Ｒ２）を求めた（表１）。
　組成２～４のいずれの組成のスポット溶液を用いた場合でも相関係数の２乗値（Ｒ２）は０．９９４を超えており、２回の測定の再現性に特に問題は認められなかった。
実施例２
　実施例１（２）の工程Ａにおいて、スポット液の組成を組成３（ＥＤＣ濃度６０ｍＭ）とし、スポット溶液を基板に塗布する際の湿度を、５０％ＲＨ、６０％ＲＨ、７０％ＲＨ（実施例１と同じ）、７２．５％ＲＨの４条件としたこと以外は、実施例１と同様にして、各基板にプローブＤＮＡを固定化して（工程Ｂ）チップを作製し、ハイブリダイゼーション反応後にスポットの検出を行い、コンタミネーション非発生率（％）の算出、プローブ固定化の良／不良の判定、２回の測定の再現性を示す相関係数の２乗値（Ｒ２）の算出を行った。その結果を、表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図４に、塗布時湿度が５０％ＲＨの場合（左図）および７０％ＲＨの場合（右図）の散布図を示した。塗布時湿度が７０％ＲＨの場合と比較し、５０％ＲＨの場合、散布図が乱れており、相関係数の２乗値（Ｒ２）が低下し、再現性が低下していた。すなわち、湿度が６０％ＲＨ未満の場合、スポットのシグナル強度の平均値では差がないが、個別のスポットにおいて固定化されたプローブＤＮＡ量がばらついていることを示している。このような結果が生じる理由は、湿度条件の違いにより、スポット溶液を塗布する工程Ａの間において、基板上にスポットされた溶液の蒸発（乾燥）の程度に差異が生じること（工程Ａの終了時、湿度が５０％ＲＨの場合は溶液が蒸発して乾燥していたのに対し、湿度７０％ＲＨの場合は溶液状態で残存していた。）に起因するものと推察された。
実施例３
　図２の凹凸構造がない基板（ただし基板の材料は実施例1と同様）を作製した。スポット溶液の組成は表１の組成３として、塗布工程中、基板を設置した空間の温度は１８℃、湿度は７０％ＲＨに維持し、実施例１と同様にして、各基板にプローブＤＮＡを固定化して（工程Ｂ）チップを作製し、ハイブリダイゼーション反応後にスポットの検出を行い、コンタミネーション非発生率（％）の算出、プローブ固定化の良／不良の判定、２回の測定の再現性を示す相関係数の２乗値（Ｒ２）の算出を行った。
プローブＤＮＡ固定化量の評価では、１６０００の強度平均値であり、相関係数の２乗値は０．９９４１と実施例１、２の同条件の結果と同等であった。コンタミネーションの非発生率は８０％であった。
　１　バイオチップ
　１０　基板
　１１　スポット領域
　１２　凸部群
　１３　凸部
　１００　スポット検査装置
　１１０　画像取得ユニット
　１１１　光源部
　１１２　光源用電源
　１１３　鏡筒
　１１４　撮像部
　１２０　解析ユニット
　１３０　加湿ユニット
　１３１　ボトル
　１３１ａ　水
　１３１ｂ　エアーストーン
　１３２　ウォーターバス
　１３３　エアーポンプ
　１３４　送気チューブ
　１３５　加湿チューブ
　１３６　温度計

Claims (6)

  1. 　選択結合性物質が基板表面に固定化されたバイオチップの製造方法であって、
    選択結合性物質および縮合剤を含む溶液を基板表面へ塗布する工程Ａ、および
    選択結合性物質を基板表面に結合させる工程Ｂ、を含み、
    前記工程Ａにおける前記溶液中の縮合剤の濃度が３０ｍＭ以上８０ｍＭ以下であり、
    当該工程Ａ中、基板が設置された空間の湿度が６０％ＲＨ以上である、
    バイオチップの製造方法。
  2. 　工程Ａにおいて、前記空間の湿度が７０％ＲＨ以下である、請求項１に記載のバイオチップの製造方法。
  3. 　縮合剤が水溶性である、請求項１または２に記載のバイオチップの製造方法。
  4. 　縮合剤がカルボジイミドの誘導体である、請求項１～３のいずれかに記載のバイオチップの製造方法。
  5. 　カルボジイミドの誘導体が１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、請求項４に記載のバイオチップの製造方法。
  6. 　選択結合性物質が核酸である、請求項１～５のいずれかに記載のバイオチップの製造方法。
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