CN112166199A - 用于对核酸分子进行计数的方法、系统和组合物 - Google Patents
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Abstract
用于在没有数字测序的情况下对分子数的变化,具体地例如由于基因重复或染色体的正常整倍体互补物,例如通常在二倍体对中发现的一个或多个染色体的三体的变化而引起的基因剂量的变化进行检测和定量的组合物以及方法、系统和试剂盒。
Description
本申请要求于2018年4月2日提交的美国临时申请序列号62/651,676和于2018年4月20日提交的美国临时申请序列号62/660,699的优先权,所述申请中的每一个均通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于在没有数字测序的情况下测定单独的分子如核酸分子的拷贝数的组合物和方法。本发明技术可用于例如分析可能由例如染色体数、基因拷贝数、表达水平等的变化引起的特定核酸序列的拷贝数的变化。本发明技术可具体应用于基因筛查,例如产前测试,具体地用于非侵入性产前测试(NIPT)。NIPT涉及分析在子宫内携带胎儿的女性的血液中循环的来自胎儿的游离DNA(cfDNA)。对母体血液中的游离DNA的分析可以用于评估胎儿的健康。本文中的本发明技术涉及用于对分子数的变化,具体地例如由于基因重复或染色体的正常整倍体互补物,例如通常在二倍体对中发现的一个或多个染色体的三体的变化而引起的基因剂量的变化进行检测和定量的方法、系统和试剂盒。
背景技术
检测样品中的分子的存在或分子数的变化是表征样品和样品的来源的有用方式。例如,基因剂量的变化是例如样品所采集自的受试者的疾病状态的临床上显著的指标。基因剂量的变化是由于DNA复制中的错误引起的并且可以在种系细胞中发生从而导致先天性缺陷以及甚至胚胎死亡或在体细胞中发生从而通常导致癌症。这些复制异常可以导致基因的各部分、全长基因和其周围的调节区域、染色体的兆碱基长部分或整个染色体的缺失或重复。对其它生物分子的分析在临床上也很重要。例如,RNA或蛋白质的量的变化可以指示与疾病状态相关联的基因的表达的变化。虽然关于特定应用例如测量DNA讨论了本文中所提供的本发明技术的实施例,但是应当理解,本发明技术不限于这些应用并且其容易地适用于分析能够以特异性方式与配偶体分子结合的许多不同类型的分子或部分,例如具有抗体的抗原、具有互补核酸的核酸、具有结合此类结构的蛋白质的核酸结构(例如,茎环、凸起的核苷酸、瓣、启动子序列)的核酸结构、具有碳水化合物的凝集素、具有蛋白结合配偶体的蛋白质、具有脂质的蛋白质(例如,具有脂质的SH2结构域)等。
染色体异常可以影响染色体的数量或结构。细胞、组织或个体不存在或除了染色体的正常整倍体互补物之外还具有一个或多个完整染色体或染色体片段的情况可以被称为非整倍性。由于染色体不分离而引起的种系复制错误会导致单体(常染色体而不是通常两个或仅一个性染色体的一个拷贝)或三体(三个拷贝)。当此类事件不会导致完全的胚胎死亡时,它们通常会导致各种各样的通常被认为是综合征的病症,例如21三体和唐氏综合征(Down′s syndrome)、18三体和爱德华综合征(Edward′s syndrome)和13三体和帕陶综合征(Patau′s syndrome)。影响染色体的各部分的结构性染色体异常是由于染色体断裂而引起的并且导致大块基因材料的缺失、倒置、易位或重复。这些事件通常与获得或损失整个染色体一样具有破坏性并且可以导致如普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)(del15q11-13)、视网膜母细胞瘤(del 13q14)、猫叫综合征(del 5p)等病症以及在通过全文引用的方式并入本文中的美国专利第5,888,740号中所列出的其它病症。
在140例活产儿中的近1例中并且在更高比例的未足月或非活产的胎儿中检测到重大染色体异常。Hsu(1998)通过羊膜穿刺术对染色体异常进行产前诊断(Prenataldiagnosis of chromosomal abnormalities through amniocentesis)在以下文献中:Milunsky A编辑《遗传性病症与胎儿(Genetic Disorders and the Fetus)》第4版巴尔的摩:约翰霍普金斯大学出版社(The Johns Hopkins University Press.)179-180;Staebler等人(2005)“确定核型应当针对由产科超声检测到的所有畸形系统化?(Shoulddetermination of the karyotype be systematic for all malformations detectedby obstetrical ultrasound?)”《产前诊断(Prenat Diagn)》25:567-573。最常见的非整倍性是目前在730例产儿中有1例发生的21三体(唐氏综合征)。Hsu;Staebler等人。虽然与21三体相比较不普遍,但是18三体(爱德华综合征)和13三体(帕陶综合征)分别在5,500例活产儿中有1例和17,200例活产儿中有1例发生。Hsu。在有染色体非整倍性的儿童中发现了各种先天性缺陷、生长缺陷和智力障碍,并且这些对家庭和社会构成了终生挑战。Jones(2006)人畸形的史密斯可识别模式(Smith′s recognizable patterns of humanmalformation)费城:爱思维尔桑德斯公司(Elsevier Saunders)。有各种产前测试可以指示胎儿非整倍性的风险增加,包含侵入性诊断测试如羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样),所述侵入性诊断测试是当前的金标准,但是与不可忽略的胎儿丢失风险相关联。美国妇产科医师学会(American College of Obstetrics and Gynecology)(2007)《ACOG实践简报(ACOGPractice Bulletin)》第88期,2007年12月。对非整倍性的侵入性产前测试(Invasiveprenatal testing for aneuploidy)《妇产科学(Obstet Gynecol)》110:1459-1467。因此,长期寻求针对胎儿非整倍性的更可靠的非侵入性测试。这些中最有前途的是基于对母体血浆中的胎儿DNA的检测。已经证实,对从母体血浆生成的文库的大规模平行测序可以可靠地检测21号染色体异常。参见例如Chiu等人,通过对母体血浆中的DNA的大规模平行基因组测序对胎儿染色体非整倍性进行非侵入性产前诊断(Noninvasive prenatal diagnosis offetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNAin maternal plasma)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,105:20458-20463(2008);Fan等人,通过对来自母体血液的DNA进行鸟枪法测序对胎儿非整倍性进行非侵入性诊断(Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencingDNA from maternal blood)《美国国家科学院院刊》,105:16266-16271(2008)。还参见美国专利第7,888,017号。
依赖于下一代测序(NGS)的用于对分子数的变化进行定量例如从而进行非整倍性筛查的当前方法通常是耗时、昂贵的并且需要大量的生物信息学分析。
发明内容
本发明提供了用于通过对可以在样品中表示的特定分子(例如小分子、半抗原、蛋白质、抗体、脂质、碳水化合物和核酸,如基因或其它DNA分子或片段和/或RNA(例如,信使RNA、微RNA和其它非编码RNA))进行计数来检测和表征样品的组合物、方法和系统。本发明技术可应用于例如监测基因表达、测量非编码RNA丰度以及分析基因变异,包含但不限于基因剂量的改变,例如非整倍性。在优选实施例中,本发明技术提供了用于在不使用“下一代”测序(NGS)技术(如Chiu等人和Fan等人(同上)所描述的那些技术)或依赖于针对不同的物理离散元件(例如,微容器或乳剂液滴)中的单独靶分子(包含核酸)的分离扩增反应的单分子扩增技术的情况下检测靶分子并且由此对靶分子进行计数的单拷贝的方法。
通常,这些组合物、方法和系统提供了改进的方式来检测各种大小的基因组缺失和重复,包含完整的染色体、染色体臂、显微缺失和重复、亚显微缺失和缺失以及单核苷酸特征(包含单核苷酸多态性、缺失和插入)。在某些实施例中,本公开的方法可以用于检测亚染色体基因损伤,例如微缺失。所述方法的示例性应用包含非整倍性的小儿和产前诊断、对妊娠产物或过早流产的风险的检验、非侵入性产前测试(定性基因检验和定量基因检验两者,如检测孟德尔病症、插入/缺失和染色体失衡)、检验植入前基因学、肿瘤表征、产后检验(包含细胞基因学)和诱变效应监测。
在一些实施例中,本文中的本发明技术提供了以序列特异性和定量方式表征核酸,优选地DNA,更优选地来自血液或血浆的循环游离DNA的方法。在优选实施例中,在没有聚合酶链反应或DNA测序的情况下对DNA的单拷贝进行检测和计数。本发明技术的实施例提供了使用用于扩增指示靶DNA在样品中的存在的信号的方法来检测靶DNA的方法、组合物和系统。在优选实施例中,以使得来源于单个靶分子的信号是可检测的和可鉴定的、与来自其它靶和来自靶分子的其它拷贝的信号隔离的程度和方式来扩增来自单个靶分子的可检测信号。
在一些实施例中,本发明技术提供了一种用于对固相载体上的靶分子进行计数的方法,所述方法包括:形成包括与经环化核酸探针杂交的寡核苷酸引物的至少一个复合物,其中所述引物与固相载体结合;以及在包括以下的过程中检测所述至少一个复合物的形成:i)在滚环扩增(RCA)反应中使所述复合物中的所述引物延伸以形成RCA产物;ii)使多个带标记探针与所述RCA产物杂交;以及iii)检测经过杂交的带标记探针,其中经过杂交的带标记探针指示所述靶分子在所述固相载体上的存在。在一些实施例中,所述固相载体包括硅烷化表面,优选地包括玻璃的表面。
在一些实施例中,本发明技术提供了一种对固相载体上的靶分子进行计数的方法,所述方法包括:a)提供包括以下中的至少一个的硅烷化表面:丙烯酸基和反应性胺基;b)在玻璃表面上形成多个复合物,所述多个复合物包括以下中的至少一个:RCA产物,所述RCA产物包括多个经过杂交的带标记探针;以及双链支架产物,所述双链支架产物包括多个连环化标记支架寡核苷酸,其中复合物的形成指示靶分子在所述玻璃表面上的存在,并且其中形成所述多个复合物包括使所述玻璃表面暴露于包括氧化石墨烯的溶液;以及c)对所述多个复合物进行计数。在一些实施例中,所述硅烷化表面是玻璃。在某些优选实施例中,所述硅烷化表面包括用3-氨基丙基三乙氧基硅烷或甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯处理的表面。
所述表面不限于任何特定格式。例如,在上文所描述的任何实施例中,所述固相载体可以包括测定板,优选地玻璃底测定板中的表面。在一些实施例中,所述测定板是多孔测定板,优选地微量滴定板。
在本发明技术的一些实施例中,上文所描述的任何实施例的所述引物与所述固相载体直接结合,优选地与所述固相载体共价连接。例如,在一些实施例中,所述引物包括生物素部分并且所述固相载体包括亲和素,优选地链霉亲和素。在某些实施例中,一个或多个复合物包括与抗原或半抗原结合的抗体,并且在一些实施例中,所述复合物包括与所述固相载体直接结合的抗原或半抗原。在某些实施例中,所述抗原或半抗原与所述固相载体共价连接。
在本文中所描述的任何实施例中,形成复合物或多个复合物可以包括使所述固相载体暴露于包括拥挤剂的溶液。在一些实施例中,所述拥挤剂包括聚乙二醇(PEG),优选至少2%到10%(w∶v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。在某些优选实施例中,所述PEG的平均分子量介于200与8000之间,优选地介于200与1000之间,优选地介于400与800之间,优选地为600。
在上文所描述的任何实施例中,形成复合物或多个复合物可以包括使所述固相载体暴露于包括氧化石墨烯的溶液的步骤。在优选实施例中,在检测经过杂交的带标记探针的步骤之前使所述固相载体暴露于氧化石墨烯。在特别优选的实施例中,所述固相载体暴露于包括带标记探针和氧化石墨烯的混合物的溶液。在一些实施例中,在所述检测或计数之前用包括去污剂的溶液来洗涤暴露于包括氧化石墨烯的溶液的所述固相载体或所述玻璃表面。在某些优选实施例中,所述去污剂包括吐温(Tween)20。
本发明技术可用于检测许多不同种类的分子,包含例如图38中示意性地描绘的分子。在一些实施例中,靶分子包括核酸,优选地来自受试者的样品,优选地血液或血液产物样品的DNA。在某些优选实施例中,所述DNA是来自血液或血液产物样品的游离DNA。在一些实施例中,所述游离DNA包括来自母体血液样品的母体和/或胎儿DNA。
本文中上文所描述的任何实施例可以包括在包括在反应混合物中使引物在经环化核酸探针上延伸的过程中形成RCA产物,所述反应混合物包括每μL Phi29 DNA聚合酶至少0.2个单位,优选地每μL至少0.8个单位以及至少400μM,优选地至少600μM,更优选地至少800μM总dNTP。在一些实施例中,形成包括多个经过杂交的带标记探针的RCA产物包括在进一步包括超过100nM分子信标探针的反应混合物中形成所述RCA产物,优选地所述反应混合物中有至少1000nM分子信标探针。
在本文中所提供的本发明技术的某些实施例中,与带标记探针杂交的多个RCA产物以分散的方式固定在所述固相载体上,其中所述多个RCA产物中的至少一部分能够通过检测标记来单独地检测。在一些实施例中,RCA产物的所述分散是不规则的,而在一些实施例中,RCA产物的所述分散呈可寻址阵列。
在本文中所描述的任何实施例中,固定在表面上的复合物可以包括至少一个多肽(例如,抗体)和/或所述复合物可以包括选自半抗原、凝集素和脂质的至少一个可特异性结合分子。
在一些实施例中,本文中所描述的本发明技术的至少一个带标记探针包括荧光标记,而在一些实施例中,至少一个带标记探针包括淬灭剂部分。在某些优选实施例中,至少一个带标记探针包括荧光团和淬灭剂部分。在优选实施例中,所述至少一个带标记探针是分子信标探针。
在本发明技术的一些实施例中,多个RCA产物与全部包括同一标记的带标记探针杂交,而在一些实施例中,多个RCA产物与包括两个或更多个不同标记,优选地两种或更多种不同荧光染料的带标记探针杂交。
本发明技术的实施例不限于对与表面结合的复合物进行检测或计数的任何特定方式。在一些实施例中,所述检测或计数包括检测荧光。在某些优选实施例中,所述检测或计数包括荧光显微术,而在一些实施例中,检测或计数包括流式细胞术。
在本发明技术的一些实施例中,形成RCA产物包括在至少37℃,优选地至少42℃,优选地至少45℃下温育所述反应混合物。在某些实施例中,所述反应混合物包括PEG,优选至少2%到10%(w∶v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。
本发明技术还提供了与实践所述方法有关的组合物。在一些实施例中,本发明技术提供了一种组合物,其包括硅烷化表面和反应混合物,所述硅烷化表面与各自包括与经环化核酸探针杂交的寡核苷酸引物的多个复合物结合,其中所述引物与固相载体结合,所述反应混合物包括:每μL Phi29 DNA聚合酶至少0.2个单位,优选地每μL至少0.8个单位;缓冲液;至少400μM,优选地至少600μM,更优选地至少800μM总dNTP;以及PEG,优选至少2%到10%(w∶v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。在一些实施例中,所述PEG的平均分子量介于200与8000之间,优选地介于200与1000之间,优选地介于400与800之间,优选地为600。在一些实施例中,所述反应混合物进一步包括至少100nM分子信标探针,优选地至少1000nM分子信标探针。
在所述组合物的一些实施例中,所述引物以不规则分散的方式与所述固相载体结合,而在一些实施例中,所述引物呈可寻址阵列与所述固相载体结合。在某些实施例中,所述引物与所述固相载体共价连接,而在一些实施例中,其中所述引物包括生物素部分并且所述固相载体包括亲和素,优选地链霉亲和素。在一些实施例中,所述复合物包括与抗原或半抗原结合的抗体,并且在一些实施例中,所述复合物包括与所述固相载体直接结合的抗原或半抗原。在一些实施例中,所述抗原或半抗原与所述固相载体共价连接。
在本文中的所述组合物的一些实施例中,复合物包括至少一个多肽。在一些优选实施例中,所述至少一个多肽包括抗体。在一些实施例中,所述复合物包括选自半抗原、凝集素和脂质的至少一个可特异性结合分子。
上文所描述的组合物的实施例可以包括硅烷化表面和溶液,所述硅烷化表面与各自包括RCA产物的多个复合物结合,所述RCA产物包括多个经过杂交的带标记探针,所述溶液包括氧化石墨烯。在一些实施例中,所述硅烷化表面是玻璃。在一些优选实施例中,所述硅烷化表面包括用3-氨基丙基三乙氧基硅烷或甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯处理的表面,优选地玻璃表面。
在一些实施例中,所述包括氧化石墨烯的溶液进一步包括分子信标探针,优选地超过100nM分子信标探针,优选地至少1000nM分子信标探针。
在所述组合物的一些实施例中,所述包括氧化石墨烯的溶液包括缓冲溶液,所述缓冲溶液包括MgCl2。在某些实施例中,包括MgCl2的缓冲液是Phi29 DNA聚合酶缓冲液。
本文中所提供的本发明技术不限于任何特定用途或应用。在一些实施例中,本发明技术可用于分析染色体畸变(例如,非整倍性),优选地在非侵入性产前测试的情况下。例如,本发明技术的应用的一些实施例包括获得包括母体基因材料和胎儿基因材料两者的母体样品以及测量多个靶核酸,其中所述靶核酸包括与第一染色体相关联的特异性序列,其中所述第一染色体被怀疑是所述胎儿材料的变体(例如,在基因剂量或染色体计数方面),并且其中所述靶核酸进一步包括与第二染色体相关联的特异性序列,所述第二染色体未被怀疑是所述胎儿材料的变体。所述方法包括分析样品中的与所述第一染色体相关联的所述靶核酸的量和与所述第二染色体相关联的所述靶核酸的量以确定与所述第一染色体相关联的所述靶核酸的所述量是否显著不同于与所述第二条染色体相关联的所述靶核酸的所述量以指示胎儿中的染色体或基因剂量变体。在优选实施例中,与第一染色体和第二染色体相关联的靶核酸存在于母体基因材料和胎儿基因材料两者中并且是母体核酸和胎儿核酸,测定针对所述靶核酸不是特异性的。在优选实施例中,所述母体样品是来自母体血液的游离DNA。基于测量样品中的DNA的量来分析染色体畸变的统计方法(包含在胎儿DNA是母体样品中的总DNA的一小部分时确定胎儿DNA中的畸变)是本领域已知的。参见例如,美国专利第6,100,029号,所述美国专利通过引用并入本文中。
定义
为了便于理解本发明,下文对多个术语和短语进行了定义:
贯穿本说明书和权利要求书,除非上下文另有明确指出,否则以下术语采用与本文明确相关的含义。尽管本文使用的短语“在一个实施例中”虽然可以,但是不一定指代相同的实施例。此外,本文使用的短语“在另一个实施例中”虽然可以,但是不一定指代不同的实施例。因此,如下文所描述的,在不脱离本发明的范围或精神的情况下,可以容易地组合本发明的各个实施例。
另外,除非上下文另外明确指出,否则如本文中所使用的,术语“或”是包含性的“或”运算符,并且等同于术语“和/或”。除非上下文另外明确指出,否则术语“基于”不是排他性的,并且允许基于未描述的其它因素。另外,在整个说明书中,“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”的含义包含复数指代物。“在......中”的含义包含“在......中”和“在......上”。
本申请中的权利要求中所使用的过渡性短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制为指定材料或步骤“以及对所要求保护的本发明的一个或多个基本和新颖特性不产生实质影响的材料或步骤”,如In re Herz,537F.2d 549,551-52,190 USPQ 461,463(CCPA 1976)中所讨论的。例如,“基本上由所叙述的要素组成”的组合物可以含有一定水平的未叙述的污染物,使得尽管污染物存在,其与纯组合物(即,“由所叙述的组分组成”的组合物)相比也不会改变所叙述的组合物的功能。
如本文中所使用的,术语“受试者”和“患者”是指任何生物体,包含植物、微生物和动物(例如,哺乳动物,如狗、猫、牲畜和人)。
本说明书和权利要求书中的术语“样品”以其最广泛的含义使用。一方面意味着包含标本或培养物(例如,微生物培养物)。另一方面意味着包含生物样品和环境样品两者。样品可以包含合成来源的标本。生物样品可以是动物,包含人、流体、固体(例如,粪便)或组织,以及液体和固体食品和饲料产品和成分,如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品以及废料。生物样品可以从所有不同家族的家养动物以及未驯服或野生动物(包含但不限于有蹄类动物、熊类动物、鱼类动物、兔类动物、啮齿动物等)中获得。
环境样品包含环境材料,如表面物质、土壤、水和工业样品,以及从食品和乳制品加工仪器、仪器、设备、器具、一次性和非一次性物品中获得的样品。这些实例不应解释为限制了适用于本发明的样品类型。
如本文中所使用的,术语“靶”是指寻求从其它分子中分选出用于评估、测量或其它表征的分子。例如,靶核酸可以例如通过探针结合、扩增、分离、捕获等从样品中的其它核酸中分选。当关于基于杂交的检测(例如,聚合酶链反应)使用时,“靶”是指由用于聚合酶链反应的引物界定的核酸的区域,而当在没有扩增靶DNA的测定中使用时(例如,在通过分子倒置探针(MIPS)捕获时),靶包括由MIP的靶特异性臂的杂交界定的位点,使得可以连接MIP并且可以检测到靶核酸的存在。
术语“靶核酸的来源”是指含有核酸(RNA或DNA)的任何样品。靶核酸的特别优选的来源是生物样品,包含但不限于血液、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、胃肠液、脑脊液、胸膜液、牛奶、淋巴液、唾液和精液。
如本文中所使用的,术语“基因剂量”是指基因、基因区域、染色体或其片段或部分的拷贝数。正常个体携带大多数基因或基因区域的两个拷贝,两个染色体中的每个染色体上有一个拷贝。然而,例如,当基因或基因区域位于X或Y染色体上时,或当基因序列存在于假基因中时,存在某些例外。
如本文中所使用的,术语“非整倍性”是指细胞、组织或个体具有一个或多个完整染色体或染色体片段不存在或除染色体的正常的整倍体互补物之外的情况。
如本文中所使用的,给定测定(或一起使用的一组测定)的“灵敏度”是指报告高于在表现出变体表型的样品(例如,癌细胞、非整倍性)与表现出正常或野生型表型的样品(例如,非癌细胞、整倍性)之间进行区分的阈值的特定形式或变体例如突变、基因重复、染色体重复的样品的百分比。在一些实施例中,“阳性”被定义为报告与待检测疾病或病状的存在相关联的测定结果的临床上确认的变体,并且假阴性被定义为报告与疾病或病状的不存在相关联的测定结果的临床上确认的变体。因此,灵敏度的值反映对已知变体或患病样品进行的给定诊断测定将产生指示变异或疾病的存在的结果的概率。如此处所定义的,计算出的灵敏度值的临床相关性表示对给定测定在应用于患有临床病状的受试者时将会检测到所述病状的存在的概率的估计。使用本文中所描述的本发明技术,可以在不需要生成序列读段的情况下实现一定水平的准确度。准确度可以指灵敏度,准确度可以指特异性,或准确度可以指其某种组合。期望的准确度水平可以介于90%与95%之间;期望的准确度水平可以介于95%与98%之间;期望的准确度水平可以介于98%与99%之间;期望的准确度水平可以介于99%与99.5%之间;期望的准确度水平可以介于99.5%与99.9%之间;期望的准确度水平可以介于99.9%与99.99%之间;期望的准确度水平可以介于99.99%与99.999%之间;期望的准确度水平可以介于99.999%与100%之间。高于95%的准确度水平可以被称为高准确度。
如本文中所使用的,给定测定(或一起使用的一组测定)的“特异度”是指报告与待检测疾病或病状的存在相关联的测定结果的正常样品的百分比,并且假阳性被定义为报告与疾病或病状的存在相关联的测定结果的临床上确认的正常样品。因此,特异度的值反映对已知正常样品进行的给定诊断测定将产生指示变异或疾病的存在的结果的概率。如此处所定义的,计算出的特异度值的临床相关性表示对给定标志物在应用于未患有临床病状的受试者时将会检测到所述病状的不存在的概率的估计。
术语“基因”是指包括产生具有非编码功能的RNA(例如,核糖体RNA或转移RNA)、多肽或前体所必需的对照和编码序列的DNA序列。RNA或多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码,只要保留期望的活性或功能即可。
如本文中所使用的,术语“基因区域”是指基因、其外显子、其内含子和其侧接在其上游和下游的区域,例如,分别在转录起始位点和转录终止位点的5′和3′的5到10千碱基。
如本文中所使用的,术语“基因序列”是指基因、其内含子和其侧接在其上游和下游的区域例如分别在转录起始位点和转录终止位点的5′和3′的5到10千碱基的序列。
如本文中所使用的,术语“染色体特异性”是指仅在所述特定类型的染色体中发现的序列。
如本文中所使用的,术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即,核酸之间的缔合的强度)受到如核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性和形成的杂交体的Tm等因素的影响。“杂交”方法涉及将一种核酸退火到另一种互补核酸,即,具有互补核苷酸序列的核酸。含有互补序列的两种核酸聚合物发现彼此并且通过碱基配对相互作用退火的能力是公认的现象。在由Marmur和Lane,《美国国家科学院院刊》46:453(1960)和Doty等人,《美国国家科学院院刊》46:461(1960)对“杂交”过程的初始观察之后,将此过程改进为现代生物学的重要工具。
如本文中所使用的,术语“寡核苷酸”被定义为包括两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,优选地至少5个核苷酸,更优选地至少约10-15个核苷酸以及更优选地至少约15到30个核苷酸的分子。确切大小将取决于许多因素,所述许多因素进而取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以以任何方式产生,包含化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或其组合。
因为以使得一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸通过磷酸二酯键在一个方向上与其相邻的单核苷酸戊糖环的3′氧连接的方式使单核苷酸反应以形成寡核苷酸,所以如果寡核苷酸的5′磷酸没有连接到单核苷酸戊糖环的3′氧,则其的末端被称为“5′端”,并且如果寡核苷酸的3′氧没有连接到随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸,则其的末端被称为“3′端”。如本文中所使用的,即使处于更大的寡核苷酸的内部,核酸序列也可以被称为具有5′端和3′端。如果第一区域的3′端在5′到3′方向上沿核酸链移动时在第二区域的5′端之前,则沿核酸链的第一区域被称为另一个区域的上游。
当两种不同的非重叠寡核苷酸退火到同一直链互补核酸序列的不同区域并且一种寡核苷酸的3′端指向另一种寡核苷酸的5′端时,前者可以被称为“上游”寡核苷酸,而后者被称为“下游”寡核苷酸。类似地,当两个重叠寡核苷酸与同一直链互补核酸序列杂交并且第一个寡核苷酸被定位成使得其5′端是第二个寡核苷酸的5′端的上游并且第一个寡核苷酸的3′端是第二个寡核苷酸的3′端的上游时,第一个寡核苷酸可以被称为“上游”寡核苷酸并且第二个寡核苷酸可以被称为“下游”寡核苷酸。
术语“引物”是指当置于例如在存在核苷酸和适合的核酸聚合酶的情况下启动引物延伸的条件下时能够充当合成的起始点的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以天然存在,可以使用分子生物学方法(例如,限制性消化的纯化)来制成,或可以合成产生。在优选实施例中,引物由DNA构成或包括DNA。
引物被选择为与模板的特异性序列链“基本上”互补。引物必须具有足够的互补性才能与模板链杂交以使引物延伸发生。引物序列不需要反映模板的确切序列。例如,非互补核苷酸片段可以与引物的5′端连接,并且引物序列的剩余部分与链基本上互补。非互补碱基或较长序列可以散布于引物中,条件是引物序列与模板的序列具有足够的互补性以杂交并且由此形成用于合成引物的延伸产物的模板引物复合物。
如本文所使用的,术语“序列变异”是指两个核酸之间的核酸序列的差异。例如,野生型结构基因和这个野生型结构基因的突变形式可以通过单个碱基取代的存在和/或一个或多个核苷酸的缺失或插入而在序列上有所不同。结构基因的这两种形式被称为在序列上彼此不同。结构基因的第二突变形式可以存在。这个第二突变形式可以被称为与野生型基因和基因的第一突变形式两者在序列上有所不同。
如本文中所使用的,术语“核苷酸类似物”是指经修饰的或非天然存在的核苷酸,包含但不限于具有改变的堆积相互作用的类似物,如7-脱氮嘌呤(即,7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP);具有替代性氢键构型的碱基类似物(例如,如Iso-C和Iso-G以及S.Benner的美国专利第6,001,983号中所描述的其它非标准碱基对);非氢键类似物(例如,非极性芳香族核苷类似物,如2,4-二氟甲苯,由B.A.Schweitzer和E.T.Kool,《有机化学(J.Org.Chem.)》,1994,59,7238-7242,B.A.Schweitzer和E.T.Kool,《美国化学会会志(J.Am.Chem.Soc.)》,1995,117,1863-1872所描述的);“通用”碱基,如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯;和通用嘌吟和嘧啶(如分别为“K”核苷酸和“P”核苷酸;P.Kong等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,1989,17,10373-10383、P.Kong等人,《核酸研究》,1992,20,5149-5152)。核苷酸类似物包含碱基类似物,并且包括脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的经修饰的形式,并且包含但不限于在以下美国专利中所描述的经修饰的碱基和核苷酸:美国专利第5,432,272号;第6,001,983号;第6,037,120号;第6,140,496号;第5,912,340号;第6,127,121号和第6,143,877号,所述美国专利中的每一个通过全文引用的方式并入本文中;基于嘌呤或嘧啶环系统的杂环碱基类似物和其它杂环碱基。
如本文中所使用的,术语“连续的核酸链”是意味着具有连续的、共价连接的主链结构而没有切口或其它破坏的核酸链。每个核苷酸的碱基部分(无论是碱基-配对的、单-链的或不匹配的)的处置都不是连续链的定义中的要素。连续链的主链不限于在天然存在的、未经修饰的核酸中发现的核糖-磷酸组合物或脱氧核糖-磷酸组合物。本发明的核酸可以包括主链的结构中的修饰,包含但不限于硫代磷酸酯残基、膦酸酯残基、2′取代的核糖残基(例如,2′-O-甲基核糖)和含有残基的替代性糖(例如,阿拉伯糖)。
如本文中所使用的,术语“连续双链体”是指其中不存在对双链体内的碱基对的进展的破坏(即,沿双链体的碱基对不会扭曲以适应与连续双链体的区域的范围的空位、凸起或不匹配)的双链核酸的区域。如本文中所使用的,所述术语仅是指双链体内的碱基对的布置,而没有暗示核酸链的主链部分中的连续性。具有不间断的碱基配对但在一条或两条链中具有切口的双链核酸在连续双链体的定义之内。
术语“双链体”是指核酸的状态,在所述状态中,一条链上的核苷酸的碱基部分通过对排列在第二条链上的其互补碱基进行氢键结合而结合。处于双链体形式的条件体现于核酸的碱基的状态。借助于碱基配对,核酸链通常也采取双螺旋的三级结构,具有大沟和小沟。采取螺旋形式在成为双链体的行为中是隐含的。
术语“模板”是指在其上通过模板依赖性核酸聚合酶的活性从核苷三磷酸构建互补拷贝的核酸链。按照惯例,在双链体内,模板链被描绘和描述为“底部”链。类似地,非-模板链通常被描绘和描述为“顶部”链。
如适用于多核苷酸的,术语“基本上同一性”表示多核苷酸序列的特性,其中多核苷酸包括在至少20个核苷酸位置的比较窗口上(通常在至少25-50个核苷酸的窗口上)与参考序列相比具有至少85%序列同一性,优选地至少90%到95%序列同一性,更通常地至少99%序列同一性的序列,其中序列同一性的百分比通过将参考序列与多核苷酸序列进行比较来计算,所述多核苷酸序列可以包含在比较窗口上总共占参考序列的20%或更少的缺失或添加。参考序列可以是较大序列的子集,例如作为全长序列的剪接变体。
如适用于多肽的,术语“基本上同一性”意指两个多肽序列在如使用默认空位权重通过程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时共享至少80%序列同一性,优选地至少90%序列同一性,更优选地至少95%序列同一性或更多(例如,99%序列同一性)。优选地,不相同的残基位置因保守性氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如,具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸;具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺;具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;具有碱基侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸;并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文中所使用的,术语“标记”是指可以用于提供可检测的(优选地,可定量的)效应并且可以与核酸或蛋白质的任何原子或分子连接。标记包含但不限于染料:放射性标记,如32P;结合部分,如生物素;半抗原,如地高辛(digoxgenin);发光、磷光或荧光部分;质量标签;和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或偏移发射光谱的部分组合的荧光染料。FRET是两个分子(例如,两个染料分子或一个染料分子和一个非荧光淬灭剂分子)的电子激发态之间的距离依赖性相互作用,其中激发在没有发射光子的情况下从供体分子转移到受体分子。(Stryer等人,1978,《生物化学年度评论(Ann.Rev.Biochem.)》,47:819;Selvin,1995,《酶学方法(Methods Enzymol.)》246:300,每个文献通过引用并入本文中)。如本文中所使用的,术语“供体”是指在第一波长处吸收并且在第二较长波长处发射的荧光团。术语“受体”是指其吸收光谱与供体的发射光谱重叠并且能够在供体基团附近(通常介于1-100nm之间)时吸收来自供体的一些或大部分的所发射能量的部分,如荧光团、发色团或淬灭剂。如果受体是荧光团,则其通常在第三仍更长波长处重新发射;如果其是发色团或淬灭剂,则其在没有发射光子的情况下释放从供体吸收的能量。在一些实施例中,检测到来自供体染料的可检测发射的变化(例如,当受体部分接近或远离时)。在一些实施例中,检测到来自受体染料的可检测发射的变化。在优选实施例中,受体染料的发射光谱不同于供体染料的发射光谱,使得来自染料的发射可以彼此区分(例如,光谱分辨的)。
在一些实施例中,供体染料与多个受体部分结合使用。在优选实施例中,供体染料与不发荧光的淬灭剂并且与受体染料结合使用,使得当供体染料靠近淬灭剂时,其的激发转移到淬灭剂而不是受体染料,并且当淬灭剂被去除时(例如,通过探针的切割),供体染料的激发转移到受体染料。在特别优选的实施例中,检测到来自受体染料的发射。参见例如,Tyagi等人,《自然生物科技(Nature Biotechnology)》18:1191(2000),所述文献通过引用并入本文中。
标记可以提供可通过荧光(例如,简单荧光、FRET、时间分辨荧光、荧光偏振等)、放射性、比色法、重量法、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性、质量或受质量(例如,MALDI飞行时间质谱仪)影响的行为的特性等检测到的信号。标记可以是带电部分(正电荷或负电荷)或可替代地可以是电中性的。标记可以包含核酸或蛋白质序列或由其组成,只要包括标记的序列是可检测的即可。
在一些实施例中,标记包括用于检测的颗粒。在优选实施例中,颗粒是磷光体颗粒。在特别优选的实施例中,磷光体颗粒是上转换磷光体颗粒(参见例如,Ostermayer,F.W.红外-可见转换磷光体的制备和性质(Preparation and properties of infrared-to-visible conversion phosphors)《金属过渡(Metall.Trans.)》752,747-755[1971])。在一些实施例中,稀土掺杂的陶瓷颗粒用作磷光体颗粒。磷光体颗粒可以通过任何适合的方法来检测,包含但不限于上转换磷光体技术(UPT),在所述UPT中,上转换磷光体将低能红外(IR)辐射转换为高能可见光。虽然本发明不限于任何特定机制,但是在一些实施例中,UPT通过多光子吸收和掺杂剂依赖性磷光的随后发射将红外光上转换成可见光。参见例如,Zarling等人于2002年6月4日发行的美国专利第6,399,397号;van De Rijke等人,《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》19(3):273-6[2001];Corstjens等人,《IEE会议论文集:纳米生物技术(IEE Proc.Nanobiotechnol.)》152(2):64[2005],每个所述文献通过全文引用的方式并入本文中。
如本文中所使用的,术语“固相载体”或“载体”是指提供另一种材料可以与其的固体或半固体结构连接的任何材料。此类材料包含光滑的载体(例如,光滑的金属、玻璃、石英、塑料、硅、晶片、碳(例如,金刚石)和陶瓷表面等)以及有纹理的和多孔的材料。此类材料还包含但不限于凝胶、橡胶、聚合物和其它非刚性材料。固相载体不必是平坦的。载体包含任何类型的形状,包含球形形状(例如,珠粒)。
如本文中所使用的,术语“珠粒”是指在溶液中时能够到处移动的小固相载体(例如,其尺寸小于溶液所位于的外壳或容器的尺寸)。在一些实施例中,当溶液没有混合时(例如,通过摇晃、热混合、涡旋),珠粒可以从溶液中沉降出来,而在其它实施例中,珠粒可以以胶体形式悬浮于溶液中。在一些实施例中,珠粒是完全或部分球形或圆柱形的。然而,珠粒不限于任何特定的三维形状。
与固相载体连接的材料可以与固相载体的任何部分连接(例如,可以与多孔固相载体材料的内部部分连接或与以其它方式非平坦的载体上的平坦部分连接,或反之亦然)。在本发明技术的优选实施例中,如核酸或蛋白质分子等生物分子与固相载体连接。生物材料在其通过化学或物理相互作用附连到固相载体时“附接”于固相载体。在一些实施例中,附接是通过共价键。但是,附接不必是共价的并且不必是永久的。在一些实施例中,附接可以通过条件的变化(例如,通过温度变化、离子变化、螯合剂的添加或去除或表面和结合的分子所暴露于的溶液条件的其它变化)来撤消或解离。
在一些实施例中,靶分子(例如,生物材料)通过“间隔子分子”或“接头基团”与固相载体连接。此类间隔子分子是具有与生物材料的第一部分连接和与固相载体的第二部分连接的分子。间隔子分子通常包含在第一部分与第二部分之间提供另外的距离的原子(例如,碳原子)链。因此,当与固相载体连接时,间隔子分子允许固相载体与生物材料之间的分离,但是与两者连接。
如本文中所使用的,术语“阵列”和“微阵列”是指包括可寻址以用于分析基因座(例如,以确定测定的结果)的多个预定义基因座的表面或容器。阵列中的基因座处的分析不限于任何特定类型的分析并且包含例如用于检测原子、分子、化学反应、光或荧光发射、抑制或指示所述基因座处的结果的改变(例如,强度或波长)的分析。预定义基因座的实例包含网格或任何其它图案,其中有待分析的基因座由其在阵列图案中的已知位置来确定。例如,在Schena,“微阵列生物芯片技术(Microarray Biochip Technology)”,马萨诸塞州纳蒂克伊顿出版(Eaton Publishing,Natick,MA),2000中对微阵列进行了总体描述。阵列的实例包含但不限于具有与表面非随机地结合的多个分子(例如,以网格或其它规则图案)的载体和包括在其中可以检测到分子或信号生成反应的多个定义的反应基因座(例如,孔)的容器。在一些实施例中,阵列包括收纳珠粒的孔的图案化分布,例如,如上文针对SIMOA技术所描述的。还参见美国专利第9,057,730号;第9,556,429号;第9,481,883号;和第9,376,677号,所述美国专利中的每一个出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。
如本文中所使用的,关于固相载体或表面上的位点使用的术语“不规则分布”是指基因座以非阵列方式在表面上或中的分布。例如,分子可以通过以下来不规则地分布在表面上:应用特定浓度的溶液,所述应用在表面上的分子之间提供了期望的近似平均距离,但是在不由表面上的任何图案或借助于应用溶液(喷墨打印)而预先定义或可寻址的位点处。在此类实施例中,表面的分析可以包括通过检测信号可能出现的任何地方来发现分子的基因座(例如,扫描整个表面以检测表面上的任何地方的荧光)。这与通过仅在预定基因座(例如,网格阵列中的点)处分析表面或容器来定位信号以确定多少(或哪种类型的)信号在网格中的每个基因座处出现相反。
如本文中所使用的,关于信号的术语“有区别的”是指可以例如通过如荧光发射波长、颜色、吸光度、质量、大小、荧光偏振性质、电荷等光谱性质或通过与另一个部分(如与化学试剂、酶、抗体等)相互作用的能力而彼此区别的信号。
如本文中所使用的,术语“核酸检测测定”是指确定关注的核酸的核苷酸组合物的任何方法。核酸检测测定包含但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性切割测定(例如,INVADER测定(美国豪洛捷有限公司(Hologic,Inc.))和例如美国专利第5,846,717号;第5,985,557号;第5,994,069号;第6,001,567号;第6,090,543号;和第6,872,816号;Lyamichev等人,《自然生物技术》17:292(1999)、Hall等人,《美国国家科学院院刊》,97:8272(2000)和美国专利第9,096,893号中所描述的,所述文献中的每一个出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中);酶错配切割方法(例如,Variagenics,美国专利第6,110,684号、第5,958,692号、第5,851,770号,通过全文引用的方式并入本文中)聚合酶链反应(PCR),上文所描述的;分支状杂交方法(例如,Chiron,美国专利第5,849,481、第5,710,264号、第5,124,246号、第5,624,802号,通过全文引用的方式并入本文中);滚环扩增(例如,美国专利第6,210,884号、第6,183,960号、第6,235,502号,通过全文引用的方式并入本文中)滚环扩增的变化,被称为“RAM扩增”(参见例如,美国5,942,391,通过全文引用的方式并入本文中);NASBA(例如,美国专利第5,409,818号,通过全文引用的方式并入本文);分子信标技术(例如,美国专利第6,150,097号,通过全文引用的方式并入本文);E-传感器技术(Motorola,美国专利第6,248,229、第6,221,583号、第6,013,170号和第6,063,573号,通过全文引用的方式并入本文中);循环探针技术(例如,美国专利第5,403,711号、第5,011,769号和第5,660,988号,通过全文引用的方式并入本文中);Dade Behring信号扩增方法(例如,美国专利第6,121,001、第6,110,677号、第5,914,230号、第5,882,867号和第5,792,614号,通过全文引用的方式并入本文中);连接酶链反应(例如,Baranay《美国国家科学院院刊》88,189-93(1991));以及夹心杂交方法(例如,美国专利第5,288,609号,所述专利通过全文引用的方式并入本文)。
在一些实施例中,扩增靶核酸(例如,通过PCR)并且使用侵入性切割测定同时检测经过扩增的核酸。在美国专利第9,096,893号中描述了被配置用于与扩增测定组合进行检测测定(例如,侵入性切割测定)的测定,所述美国专利出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。另外的扩增加上侵入性切割检测配置(被称为QuARTS方法)在例如美国专利第8,361,720号;第8,715,937号;第8,916,344号;和第9,212,392号中进行了描述,所述美国专利中的每一个出于所有目的通过引用并入本文中。如本文中所使用的,术语“侵入性切割结构”是指切割结构,所述切割结构包括:i)靶核酸;ii)上游核酸(例如,侵入性或“INVADER”寡核苷酸);和iii)下游核酸(例如,探针),其中所述上游和下游核酸退火到靶核酸的连续区域,并且其中重叠在上游核酸的3′部分与在下游核酸与靶核酸之间形成的双链体之间形成。当上游和下游核酸的一个或多个碱基相对于靶核酸碱基占据相同位置时,无论上游核酸的一个或多个重叠碱基是否与靶核酸互补,并且无论这些碱基是天然碱基还是非天然碱基,都会发生重叠。在一些实施例中,与下游双链体重叠的上游核酸的3′部分是非碱基化学部分,如芳香族环结构,例如如通过全文引用的方式并入本文中的美国专利第6,090,543号中所公开的。在一些实施例中,核酸中的一种或多种核酸可以例如通过共价键(如核酸茎环)或通过非核酸化学键(例如,多碳链)彼此附接。如本文中所使用的,术语“瓣状核酸内切酶测定”包含如上文所描述的“INVADER”侵入性切割测定和QuARTS测定。
如本文中所使用的,术语“数字PCR”,“单分子PCR”和“单分子扩增”是指被配置成提供来自单个起始分子的扩增产物或信号的PCR和其它核酸扩增方法。通常,样品例如通过连续稀释或通过划分成足够小的部分(例如,在微室或在乳液中)被分成使得每个部分或稀释度如根据泊松分布(Poisson distribution)所评估的平均具有不超过靶核酸的单个拷贝。单分子PCR的方法例如在以下专利中进行了描述:美国6,143,496(其涉及一种方法,所述方法包括:将样品分成多个腔室,使得至少一个腔室具有至少一个靶;以及扩增所述靶以确定有多少个腔室具有靶分子);美国6,391,559;(其涉及用于含有和分配流体的组合件);以及美国US 7,459,315(其涉及一种方法,所述方法将样品分成具有样品室的组合件(其中样品通过表面亲和力划分到所述腔室),然后用可固化的“正在置换的流体”密封所述腔室)。还参见美国6,440,706和美国6,753,147以及Vogelstein等人,《美国国家科学院院刊》第96卷,第9236-9241页,1999年8月。还参见美国20080254474,其描述了数字PCR与甲基化检测结合的组合。
如本文中所使用的,术语“测序”以广泛意义使用并且可以指代允许鉴定至少部分的核酸(包含但不限于至少部分的延伸产物或载体插入物)中至少一些连续核苷酸的顺序的本领域已知的任何技术。在一些实施例中,测序允许区分不同靶序列之间的序列差异。示例性测序技术包含靶向测序、单分子实时测序、基于电子显微镜的测序、晶体管介导的测序、直接测序、随机鸟枪法测序、Sanger双脱氧终止测序、靶向测序、外显子测序、全基因组测序、杂交法测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双工测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行特征标签测序、乳液PCR、较低变性温度下的共扩增-PCR(COLD-PCR)、多重PCR、可逆染料终止子测序、配对末端测序、近期测序、核酸外切酶测序、连接法测序、短读段测序、单分子测序、合成法测序、实时测序、逆向终止子测序、离子半导体测序、纳米球测序、纳米孔测序、454测序、Solexa基因组分析仪测序、miSeq(Illumina)、HiSeq 2000(Illumina)、HiSeq 2500(Illumina)、Illumina基因组分析仪(Illumina)、Ion Torrent PGMTM(生命技术公司(Life Technologies))、MinIONTM(牛津纳米孔科技公司(Oxford Nanopore Technologies))、实时SMRTTM技术(太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences))、探针-锚定连接(cPALTM)(Complete Genomics/BGI)、测序、MS-PET测序、质谱法和其组合。在一些实施例中,测序包括使用仪器检测测序产物,所述仪器例如但不限于ABI377 DNA定序器、310、3100、3100-Avant、3730或373OxI基因分析仪、ABI 3700 DNA分析仪、或应用生物系统公司(AppliedBiosystems)SOLiDTM系统(全部来自应用生物系统公司)、基因组定序器20系统(罗氏应用科学公司(Roche Applied Science))或质谱仪。在某些实施例中,测序包括乳液PCR。在某些实施例中,测序包括高通量测序技术,例如但不限于大规模并行特征标签测序(MPSS)。
如本文中所使用的,术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”关于通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的链可互换地使用。多肽可以是合成的或天然存在的,并且可以是短的(例如介于两个约30个氨基酸残基之间)或其长度可以是数百个或数千个氨基酸残基。多肽可以由20个主要的天然存在的氨基酸构成,或可以包括一种或多种非天然氨基酸(例如,在肽链主链上包括嘧啶或嘌呤碱基的肽核酸残基)或天然氨基酸的经修饰的版本(例如,在侧基的结构中经修饰的)。
如本文中所使用的,术语“抗体”(Ab)是指抗原结合免疫球蛋白并且包含单克隆抗体(mAb)和多克隆Ab。所述术语进一步包含具有与抗原结合的能力的抗体的所有经修饰的形式,例如包括免疫球蛋白结构的部分的片段抗体(fAb)。
如本文中所使用的,关于涉及流体反应混合物的组分使用的术语“拥挤剂”和“体积排除剂”可互换地使用并且是指减少反应混合物中的可用流体体积、从而增加反应物大分子(例如,核酸、酶等)的有效浓度的化合物(通常地,聚合化合物)。拥挤试剂包含例如甘油、乙二醇、聚乙二醇、菲可(ficoll)、血清白蛋白、酪蛋白和葡聚糖。
如本文中所使用的,术语“数字测序”、“单分子测序”和“下一代测序(NGS)”可互换地使用并且是指确定单独的核酸分子的核苷酸序列。用于单独的分子测序的系统包含但不限于454FLXTM或454TITANIUMTM(罗氏(Roche))、SOLEXATM/Illumina基因组分析仪(Illumina),HELISCOPETM单分子测序仪(Helicos生物科学公司(Helicos Biosciences))和SOLIDTMDNA测序仪(生命技术公司/应用生物系统公司)仪器)以及如智能生物系统公司(Intelligent Biosystems)和太平洋生物科学公司等公司仍在开发的其它平台。还参见题为“通过数字分析进行非侵入性胎儿基因筛查”的美国专利第7,888,017号,其涉及对母体和胎儿DNA(例如,cfDNA)进行数字分析。
如本文中所使用的,术语“探针”或“杂交探针”是指无论是天然存在于经纯化的限制性消化中的还是合成地、重组地或通过PCR扩增产生的、能够至少部分地与关注的另一个寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即,核苷酸序列)。探针可以是单链的或双链的。探针可以用于检测、鉴定和分离特定序列。在一些优选实施例中,本发明中所使用的探针将用“报告分子”标记,从而可以在任何检测系统(包含但不限于酶系统(例如,ELISA以及基于酶的组织化学测定)、荧光系统、放射性系统和发光系统)中检测到。并不旨在将本发明限制于任何特定的检测系统或标记。
如本文中所使用的,术语“MIP”是指分子倒置探针(或环状捕获探针)。分子倒置探针(或环状捕获探针)是包括一对独特的多核苷酸臂、一个或多个独特的分子标签(或独特的分子标识符)和多核苷酸接头(例如,通用主链接头)的核酸分子。参见例如,图1。在一些实施例中,MIP可以包括多于一个独特的分子标签,如两个独特的分子标签、三个独特的分子标签或更多个独特的分子标签。在一些实施例中,每个MIP中的独特的多核苷酸臂位于MIP的5′和3′端处,而一个或多个独特的分子标签和多核苷酸接头位于MIP的5′和3′端内部。例如,在本公开的一些实施例中使用的MIP依次包括以下组分:第一独特的多核苷酸臂-第一独特的分子标签-多核苷酸接头-第二独特的分子标签-第二独特的多核苷酸臂。在一些实施例中,MIP是5′磷酸化的单链核酸(例如,DNA)分子。参见例如2016年7月29日提交的WO 2017/020023和2016年7月29日提交的WO 2017/020024,所述文献中的每一个出于所有目的通过引用并入本文。
独特的分子标签可以是可检测的任何标签并且可以掺入核酸(例如,多核苷酸)中或与所述核酸连接并且允许检测和/或鉴定包括标签的核酸。在一些实施例中,标签在测序期间(例如,通过聚合酶)掺入核酸中或与所述核酸附接。标签的非限制性实例包含核酸标签、核酸索引或条形码、放射性标记(例如,同位素)、金属标记、荧光标记、化学发光标记、磷光标记、荧光团淬灭剂、染料、蛋白质(例如,酶、抗体或其部分、接头、结合对的成员)等或其组合。在一些实施例中,特别是测序实施例中,标签(例如,分子标签)是核苷酸或核苷酸类似物(例如,包括核酸类似物、糖和一到三个磷酸基的核苷酸)的独特的、已知的和/或可鉴定的序列。在一些实施例中,标签是六个或更多个连续核苷酸。各种不同的激发和发射光谱可以获得许多基于荧光团的标签。任何适合的类型和/或数量的荧光团可以用作标签。在一些实施例中,在本文中所描述的方法(例如,核酸检测和/或测序方法)中使用1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、30种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、500种或更多种、1000种或更多种、10,000种或更多种、100,000种或更多种不同的标签。在一些实施例中,一种或两种类型的标签(例如,不同的荧光标记)连接到文库中的每个核酸。在一些实施例中,染色体特异性标签用于使染色体计数更快速或更有效。标记的检测和/或定量可以通过适合的方法、机器或设备来进行,所述方法、机器或设备的非限制性实例包含流式细胞仪、定量聚合酶链反应(qPCR)、凝胶电泳、发光计、荧光计、分光光度计、适合的基因芯片或微阵列分析、蛋白质印迹、质谱法、色谱法、细胞荧光分析、荧光显微术、适合的荧光或数字成像方法、共聚焦激光扫描显微镜、激光扫描细胞仪、亲和色谱法、手动分批模式分离、电场悬浮液、适合的核酸测序方法和/或核酸测序设备等和其组合。
在MIP中,独特的多核苷酸臂被设计成与基因组核酸样品中的特定靶序列(或位点)的上游和下游立即杂交。在一些实施例中,MIP包括独特的分子标签,其是随机生成的短核苷酸序列。在一些实施例中,独特的分子标签没有与位于基因组核酸片段上或基因组核酸样品中的任何序列或位点杂交。在一些实施例中,MIP中的多核苷酸接头(或主链接头)在本公开的实施例中所使用的所有MIP中是通用的。
在一些实施例中,将MIP引入到源自于测试受试者(或参考受试者)的核酸片段以执行对位于核酸样品(例如,基因组DNA)上的靶序列或位点(或对照序列或位点)的捕获。在一些实施例中,片段化通过分子倒置探针帮助捕获靶核酸。在一些实施例中,例如,当核酸样品包含游离核酸时,可能不需要片段化来通过分子倒置探针改进对靶核酸的捕获。如本文中更详细描述的,在捕获到关注的靶序列(例如,基因座)之后,可以对捕获到的靶进行酶促空位填补和连接步骤,使得靶序列的拷贝掺入类圆结构中。在一些实施例中,例如含有标记、半抗原等的核酸类似物可以掺入经填补的区段中以用于例如下游检测、纯化或其它处理步骤。在一些实施例中,可以通过延长杂交和空位填补温育时段来提高MIP对核酸片段上的靶序列的捕获效率。(参见例如,Turner E H等人,《自然方法(Nat Methods.)》2009年4月6:1-2)。
在一些实施例中,根据本公开的用于捕获靶位点或靶序列的MIP依次包括以下组分:第一靶向多核苷酸臂-第一独特的靶向分子标签-多核苷酸接头-第二独特的靶向分子标签-第二靶向多核苷酸臂。
在一些实施例中,本公开中的用于捕获对照位点或对照序列的MIP依次包括以下组分:第一对照多核苷酸臂-第一独特的对照分子标签-多核苷酸接头-第二独特的对照分子标签-第二对照多核苷酸臂。
MIP技术可以用于检测或扩增复杂混合物中的特定核酸序列。使用MIP技术的优点之一在于其高度复用的能力,这使得在含有数千个MIP的单个反应中捕获到数千个靶序列。在例如以下文献中对MIP技术的各个方面进行了描述:Hardenbol等人,“带有序列标签的分子倒置探针的多重基因分型(Multiplexed genotyping with sequence-taggedmolecular inversion probes)”《自然生物技术》21(6):673-678(2003);Hardenbol等人,“高度多重的分子倒置探针基因分型:在单管测定中对超过10,000个靶向的SNP进行基因分型(Highly multiplexed molecular inversion probe genotyping:Over 10,000targeted SNPs genotyped in a single tube assay)”《基因组研究(Genome Research)》15:269-275(2005);Burmester等人,“用于基于药物基因组学的个性化药物的DMET微阵列技术(DMET microarray technology for pharmacogenomics-based personalizedmedicine)”《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,632:99-124(2010);Sissung等人,“基因组学时代中的临床药理学和药物基因学:DMET平台(Clinicalpharmacology and pharmacogenetics in a genomics era:the DMET platform)”《药物基因组学(Pharmacogenomics)》,11(1):89-103(2010);Deeken,“昂飞公司(Affymetrix)DMET平台和药物开发中的药物基因学(The Affymetrix DMET platform andpharmacogenetics in drug development)”《分子治疗学的最新观点(Current Opinionin Molecular Therapeutics)》,11(3):260-268(2009);Wang等人,“使用分子倒置探针(MIP)微阵列来自FFPE样品中的高质量拷贝数和基因型数据(High quality copy numberand genotype data from FFPE samples using Molecular Inversion Probe(MIP)microarrays)”《BMC医学基因组学(BMC Medical Genomics)》,2:8(2009);Wang等人,“对用于确定等位基因拷贝数的分子倒置探针的性能的分析(Analysis of molecularinversion probe performance for allele copy number determination)”《基因组生物学(Genome Biology)》,8(11):R246(2007);Ji等人,“基因拷贝交替的分子倒置探针分析揭示了结肠直肠癌的不同类别(Molecular inversion probe analysis of gene copyalternations reveals distinct categories of colorectal carcinoma)”《癌症研究(Cancer Research)》,66(16):7910-7919(2006);以及Wang等人,“使用分子倒置探针(MIP)进行等位基因定量(Allele quantification using molecular inversion probes(MIP))”《核酸研究》,33(21):e183(2005),所述文献中的每一个出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。还参见美国专利第6,858,412号;第5,817,921号;第6,558,928号;第7,320,860号;第7,351,528号;第5,866,337号;第6,027,889号和第6,852,487号,所述美国专利中的每一个出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。
MIP技术先前已成功应用于其它研究领域,包含对癌症中生物标志物的新颖的鉴定和子分类。参见例如,Brewster等人,“筛查和症状检测的乳腺癌之间的拷贝数失衡和对无疾病生存期的影响(Copy number imbalances between screen-and symptom-detectedbreast cancers and impact on disease-free survival)”,《癌症预防研究(CancerPrevention Research)》,4(10):1609-1616(2011);Geiersbach等人,“在固体动脉瘤骨囊肿中通过荧光原位杂交检测到的USP6的未知配偶体和异常的SSl8重新布置(Unknownpartner for USP6 and unusual SSl8 rearrangement detected by fluorescence insitu hybridization in a solid aneurysmal bone cyst)”,《癌症基因学(CancerGenetics)》,204(4):195-202(2011);Schiffman等人,“具有CDKN2A失活的致癌性BRAF突变是小儿恶性星形细胞瘤的子集的特性(Oncogenic BRAF mutation with CDKN2Ainactivation is characteristic of a subset of pediatric malignantastrocytomas)”《癌症研究》,70(2):512-519(2010);Schiffman等人,“分子倒置探针揭示了儿童白血病中的9p21缺失和拷贝数畸变的模式(Molecular inversion probes revealpatterns of 9p21 deletion and copy number aberrations in childhood leukemia)”《癌症基因学和细胞遗传学(Cancer Genetics and Cytogenetics)》,193(1):9-18(2009);Press等人,“基因和表观基因BRCA1丢失的卵巢癌具有明显的分子异常(Ovariancarcinomas with genetic and epigenetic BRCA1 loss have distinct molecularabnormalities)”,《BMC癌症(BMC Cancer)》,8:17(2008);以及Deeken等人,“使用DMET基因分型平台对多西他赛(docetaxel)和沙利度胺(thalidomide)在患有去势抵抗前列腺癌的患者中进行药物基因学研究(A pharmacogenetic study of docetaxel and thalidomidein patients with castration-resistant prostate cancer using the DMETgenotyping platform)”《药物基因组学》,10(3):191-199(2009),所述文献中的每一个出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。
MIP技术也已应用于鉴定新的药物相关生物标志物。参见例如,Caldwell等人,“CYP4F2基因变体改变所需的华法林剂量(CYP4F2 genetic variant alters requiredwarfarin dose)”《血液(Blood)》,111(8):4106-4112(2008);以及McDonald等人,“CYP4F2是维生素K1氧化酶:对V433M变体的携带者中的改变的华法林剂量的解释(CYP4F2 Is aVitamin K1 Oxidase:An Explanation for Altered Warfarin Dose in Carriers oftheV433M Variant)”《分子药理学(Molecular Pharmacology)》,75:1337-1346(2009),所述文献中的每一个出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。其它MIP应用包含药物开发和安全研究。参见例如,Mega等人,“细胞色素P-450多态性和对氯吡格雷(Clopidogrel)的反应(Cytochrome P-450 Polymorphisms and Response to Clopidogrel)”《新英格兰医学杂志(New England Journal of Medicine)》,360(4):354-362(2009);Dumaual等人,“使用昂飞靶向的基因分型系统对代谢酶和转运蛋白基因进行综合评估(Comprehensiveassessment of metabolic enzyme and transporter genes using the AffymetrixTargeted Genotyping System)”《药物基因组学》,8(3):293-305(2007);以及Daly等人,“涉及药物代谢、排泄和转运的基因的综合基因分型的多重测定(Multiplex assay forcomprehensive genotyping of genes involved in drug metabolism,excretion,andtransport)”《临床化学(Clinical Chemistry)》,53(7):1222-1230(2007),上述文献中的每一个出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。MIP技术的其它应用包含基因型和表型数据库化。参见例如,Man等人,“代谢酶和转运蛋白基因的基因变异:3个主要的东亚亚群的综合评估以及与白种人和非洲人的比较(Genetic Variation in Metabolizing Enzymeand Transporter Genes:Comprehensive Assessment in 3 Major East AsianSubpopulations with Comparison to Caucasians and Africans)”《临床药学和治疗学杂志(Journal of Clinical Pharmacology)》,50(8):929-940(2010),所述文献出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。
如本文中所使用的,术语“捕获(capture或capturing)”是指分子倒置探针与其对应的靶向位点之间的结合或杂交反应。在一些实施例中,在捕获时,环状复制子或MIP复制子产生或形成。在一些实施例中,靶向位点是缺失(例如,一个或多个外显子的部分或全部缺失)。在一些实施例中,靶MIP被设计成与靶缺失预期定位于其中的关注的天然存在的(例如,野生型)基因组区域结合或杂交。靶MIP被设计成不与表现出缺失的基因组区域结合。在这些实施例中,预期靶MIP与靶缺失位点之间的结合或杂交不发生。此种结合或杂交的不存在指示靶缺失的存在。在这些实施例中,短语“捕获靶位点”或短语“捕获靶序列”是指通过检测此种结合或杂交的不存在来检测靶缺失。
如本文中所使用的,术语“MIP复制子”或“环状复制子”是指通过捕获反应(例如,MIP与其靶向的序列之间的结合或杂交反应)生成的环状核酸分子。在一些实施例中,MIP复制子是单链环状核酸分子。在一些实施例中,靶向MIP捕获靶序列或位点或与靶序列或位点杂交。在捕获反应或杂交后,引入连接/延伸混合物以延伸和连接两个靶向多核苷酸臂之间的空位区域从而形成单链环状核苷酸分子,即,靶向MIP复制子。在一些实施例中,对照MIP捕获对照序列或位点或与对照序列或位点杂交。在捕获反应或杂交后,引入连接/延伸混合物以延伸和连接两个对照多核苷酸臂之间的空位区域从而形成单链环状核苷酸分子,即,对照MIP复制子。MIP复制子可以通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增以产生多个靶向MIP扩增子,所述多个靶向MIP扩增子是双链核酸分子。MIP复制子可特别应用于滚环扩增或RCA。RCA是一种等温核酸扩增技术,其中DNA聚合酶将单核苷酸连续添加到退火到环状模板的引物,这产生了含有数十个到数百个串联重复(与环状模板互补)的单链DNA的长连环体。参见例如,M.Ali等人“滚环扩增:化学生物学、材料科学和医学的通用工具(Rolling circleamplification:a versatile tool for chemical biology,materials science andmedicine)”《化学学会评论(Chemical Society Reviews.)》43(10):3324-3341,所述文献出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。还参见WO 2015/083002,所述专利出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。
通常在RCA中用于DNA扩增的聚合酶是Phi29、Bst和Vent外切DNA聚合酶,Phi29DNA聚合酶鉴于其优越的持续合成能力和链置换能力而是优选的。
如本文中所使用的,术语“扩增子”是指通过扩增反应(例如,PCR反应)生成的核酸。在一些实施例中,扩增子是单链核酸分子。在一些实施例中,扩增子是双链核酸分子。在一些实施例中,靶向MIP复制子使用常规技术进行扩增以产生多个靶向MIP扩增子,所述多个靶向MIP扩增子是双链核苷酸分子。在一些实施例中,对照MIP复制子使用常规技术进行扩增以产生多个对照MIP扩增子,所述多个对照MIP扩增子是双链核苷酸分子。
术语“探针寡核苷酸”或“瓣状寡核苷酸”在关于瓣状测定(例如,INVADER侵入性切割测定)使用时是指在存在侵入性寡核苷酸的情况下与靶核酸相互作用以形成切割结构的寡核苷酸。
术语“侵入性寡核苷酸”是指在与探针与靶核酸之间的杂交区域相邻的位置处与靶核酸杂交的寡核苷酸,其中侵入性寡核苷酸的3′端包括与探针与靶之间的杂交区域重叠的部分(例如,化学部分或一个或多个核苷酸)。侵入性寡核苷酸的3′末端核苷酸可以或可以不与靶中的核苷酸碱基配对。在一些实施例中,侵入性寡核苷酸在其3′端含有的序列与位于探针寡核苷酸的退火到靶链的部分的5′端处的序列基本上相同。
如本文中所使用的,“瓣状核酸内切酶”或“FEN”是指在DNA结构上充当结构特异性核酸内切酶的一类溶核酶,通常是5′端核酸酶,其中双链体在链中的被核酸的另一条链置换的一条链上含有单链5′突出端或瓣(例如,使得在单链DNA与双链DNA之间的连接处存在重叠的核苷酸)。FEN催化单链DNA和双链DNA的连接处的磷酸二酯键的水解切割,从而释放突出端或瓣。Ceska和Savers(《生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)》1998 23:331-336)以及Liu等人(《生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)》2004 73:589-615;通过全文引用的方式并入本文)对瓣状核酸内切酶进行了评论。FEN可以是单独的酶、多亚基酶,或可以作为另一种酶或蛋白质复合物(例如,DNA聚合酶)的活性存在。
瓣状核酸内切酶可以是热稳定的。例如,来自档案嗜热菌生物体的FEN-1瓣状核酸内切酶是典型热稳定的。如本文中所使用的,术语“FEN-1”是指来自真核细胞或古细菌生物体的非聚合酶瓣状核酸内切酶。参见例如,WO 02/070755以及Kaiser M.W.等人,(1999)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,274:21387,所述文献出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。
如本文中所使用的,术语“经过切割的瓣”是指单链寡核苷酸,其是瓣测定的切割产物。
术语“盒”在关于瓣切割反应使用时是指被配置成例如在瓣切割测定中形成的初级或第一切割结构中响应于瓣状或探针寡核苷酸的切割而生成可检测信号的寡核苷酸或寡核苷酸组合。在优选实施例中,盒与通过切割瓣状寡核苷酸产生的非靶切割产物杂交以形成第二重叠切割结构,使得然后可以由相同的酶(例如,FEN-1核酸内切酶)对盒进行切割。
在一些实施例中,盒是包括发夹部分(即,其中盒寡核苷酸的一个部分在反应条件下与相同寡核苷酸的第二部分杂交以形成双链体的区域)的单个寡核苷酸。在其它实施例中,盒包括至少两个寡核苷酸,所述至少两个寡核苷酸包括可以在反应条件下形成双链体的互补部分。在优选实施例中,盒包括标记,例如荧光团。在特别优选实施例中,盒包括产生FRET效应的经标记的部分。在此类实施例中,盒可以被称为“FRET盒”。参见例如,08/04/15发行的美国9,096,893,,所述专利出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。
如本文中所使用的,短语“基本上不互补”在关于探针瓣或臂使用时意味着瓣部分具有足够的不互补性能够在指定的退火条件或严格条件下选择性地不与核酸序列(例如,靶核酸或经过扩增的DNA)杂交,其涵盖术语“基本上非互补”和“完全非互补”。
如本文中所使用的,术语“信号”是指如会由标记或由测定反应中的组分或产物的作用或累积引起或提供的任何可检测效应。
如本文中所使用的,术语“检测器”是指可以将信号或效应的存在传达给用户或系统的另一个组件(例如,计算机或控制器)的系统或系统的组件,例如仪器(例如,照相机、荧光计、电荷耦接装置、闪烁计数器、固态纳米孔装置等)或反应性介质(X射线或照相机胶卷、pH指示剂等)。检测器不限于检测到的特定类型的信号并且可以是:光度系统或分光光度系统(其可以检测紫外线、可见光或红外光,包含荧光或化学发光);辐射检测系统;电荷检测系统;用于检测电子信号(例如,电流或电荷扰动)的系统;光谱系统,如核磁共振光谱、质谱或表面增强拉曼光谱;如凝胶或毛细管电泳或凝胶排阻色谱法的系统;或本领域已知的其它检测系统或其组合。
如本文中所使用的,术语“检测”是指例如在样品内定量地或定性地鉴定分析物(例如,DNA、RNA或蛋白质)。如本文中所使用的,术语“检测测定”是指出于检测样品内的分析物的目的而进行的试剂盒、测试或程序。检测测定在存在靶分析物的情况下进行时会产生可检测信号或效应并且包含但不限于与杂交、核酸切割(例如,核酸外切酶或核酸内切酶)、核酸扩增、核苷酸测序、引物延伸、核酸连接、抗原-抗体结合、一级抗体与二级抗体的相互作用和/或核酸(例如,寡核苷酸)或多肽(例如,蛋白质或小肽)的构象变化的过程结合的测定。
如本文中所使用的,术语“产前或妊娠相关疾病或病状”是指影响孕妇、胚胎或胎儿的任何疾病、病症或病状。产前或与妊娠相关病状也可以指与妊娠直接或间接相关联或直接或间接由妊娠引起的任何疾病、病症或病状。这些疾病或病状可以包含任何和所有出生缺陷、先天性病状或遗传性疾病或病状。产前或妊娠相关疾病的实例包含但不限于恒河猴症(Rhesus disease)、新生儿溶血性疾病、β-地中海贫血、性别确定、妊娠确定、遗传性孟德尔遗传性病症、染色体畸变、胎儿染色体非整倍性、胎儿染色体三体、胎儿染色体单体、8三体、13三体(帕陶综合征)、16三体、18三体(爱德华综合征)、21三体(唐氏综合征)、X染色体连锁性病症、X三体(XXX综合征)、X单体(特纳综合征(Turner syndrome))、XXY综合征、XYY综合征、XYY综合征、XXXY综合征、XXYY综合征、XYYY综合征、XXXXX综合征、XXXXY综合征、XXXYY综合征、XXYYY综合征、脆性X综合征、胎儿生长受限、囊性纤维化、血红蛋白病、胎儿死亡、胎儿酒精综合征、镰状细胞性贫血、血友病、克兰费尔特综合征(Klinefeltersyndrome)、dup(17)(p11.2p1.2)综合征、子宫内膜异位、佩梅氏病(Pelizaeus-Merzbacherdisease)、dup(22)(q11.2q11.2)综合征、猫眼综合征、猫叫综合征、沃-赫综合征(Wolf-Hirschhorn syndrome)、威廉姆斯-伯伦综合征(Williams-Beuren syndrome)、腓骨肌萎缩症、易压迫性麻痹神经病变、史密斯-马吉利综合征(Smith-Magenis syndrome)、神经纤维瘤病、阿拉吉欧综合征(Alagille syndrome)、腭心面综合征(Velocardiofacialsyndrome)、迪乔治综合征(DiGeorge syndrome)、类固醇硫酸酯酶缺乏症、普拉德-威利综合征、卡尔曼综合征(Kallmann syndrome)、具有线性皮肤缺陷的小眼畸形、肾上腺发育不全、甘油激酶缺乏症、佩梅氏病、Y上的睾丸决定因子、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、1p36缺失、苯丙酮尿症、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、肾上腺增生征、范可尼贫血、脊髓性肌萎缩症、杜氏肌营养不良、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、肌强直性营养不良、罗伯逊易位、快乐木偶综合征(Angelman syndrome)、结节性硬化症、共济失调毛细血管扩张症、开放性脊柱裂、神经管缺陷、腹壁缺陷、小于胎龄、先天性巨细胞病毒、软骨发育不全、马凡氏综合征(Marfan′s syndrome)、先天性甲状腺功能低下、先天性弓形体病、生物素酶缺乏症、半乳糖血症、枫糖尿病、高胱氨酸尿症、中链酰基Co-A脱氢酶缺乏症、结构性出生缺陷、心脏缺陷、四肢异常、内外足、先天无脑畸形、无嗅脑畸形/前脑无裂畸形、脑积水、无眼/小眼症、无耳/小耳症、大血管移位、法洛四联症、左心发育不全综合征、主动脉缩窄、无唇裂的腭裂、有或没有腭裂的唇裂、有或没有瘘管的食管闭锁/狭窄、小肠闭锁/狭窄、肛门直肠闭锁/狭窄、尿道下裂、不定性别、肾发育不全、囊性肾、轴前多指、短肢缺陷、膈疝、失明、白内障、视觉问题、听觉损失、耳聋、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、雷特综合征(Rett syndrome)、溶酶体疾病、脑瘫、自闭症、无舌、白化病、眼白化病、眼皮肤白化病、妊娠糖尿病、阿诺德-基亚里畸形(Arnold-Chiari malformation)、CHARGE综合征、先天性膈疝、短趾、无虹膜、手足裂、异色症、Dwarnian耳、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers Danlossyndrome)、大疱性表皮松解症、戈勒姆病(Gorham′s disease)、桥本氏综合征(Hashimoto′s syndrome)、胎儿水肿、张力减退、克利佩尔-费尔综合征(Klippel-Feil syndrome)、肌肉萎缩症、成骨不全症、早衰症、史-李-欧综合征(Smith Lemli Opitz symdrom)、色盲、X-连锁淋巴增殖性疾病、脐突出、腹裂、先兆子痫、子痫、未足月产、早产、流产、宫内发育迟缓、子宫外孕、妊娠剧吐、晨吐或可能成功引产。
在一些NIPT实施例中,本文中所描述的本发明技术进一步包含估计样品的胎儿分数,其中所述胎儿分数用于帮助确定来自测试受试者的基因数据是否指示非整倍性。用于测定或计算胎儿分数的方法在本领域中是已知的。
如本文中所使用的,术语“有效检测测定”是指已经示出为准确地预测靶的检测与表型(例如,医学病状)之间的关联的检测测定。有效检测测定的实例包含但不限于在检测到靶时准确地预测医学表型的时间为95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%或99.9%的检测测定。有效检测测定的其它实例包含但不限于作为分析物特异性试剂(即,如FDA条例所定义的)或体外诊断(即,由FDA批准的)合适和/或投入市场的检测测定。
如本文中所使用的,术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。在反应测定的上下文中,此类递送系统包含允许将反应试剂(例如,适当的容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如,缓冲液、用于进行测定的书面说明等)从一个位置储存、运输或递送到另一个位置的系统。例如,试剂盒包含含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个外壳(例如,盒子)。如本文中所使用的,术语“片段化试剂盒”是指包括各自含有全部试剂盒组件的子部分的两个或更多个单独容器的递送系统。容器可以一起或单独地递送给预期的接受者。例如,第一容器可以含有用于在测定中使用的酶,而第二容器含有寡核苷酸。术语“片段化试剂盒”旨在涵盖含有受《联邦食品、药品和化妆品法(Federal Food,Drug,andCosmetic Act)》第520(e)条监管的分析物特异性试剂(ASR)但不限于此的试剂盒。实际上,术语“片段化试剂盒”中包含包括各自含有全部试剂盒组件的子部分的两个或更多个单独容器的任何递送系统。相比之下,“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如,在容纳期望的组件中的每个组件的单个盒子中)含有反应测定的所有组件的递送系统。术语“试剂盒”包含片段化试剂盒和组合试剂盒两者。
如本文中所使用的,术语“信息”是指事实或数据的任何集合。关于使用一个或多个计算机系统(包含但不限于互联网)存储或处理的信息,所述术语是指呈任何格式(例如,模拟、数字、光学等)存储的任何数据。如本文中所使用的,术语“与受试者有关的信息”是指与受试者(例如,人、植物或动物)有关的事实或数据。术语“基因组信息”是指与基因组有关的信息,包含但不限于核酸序列、基因、等位基因频率、RNA表达水平、蛋白质表达、与基因型相关的表型等。“等位基因频率信息”是指与等位基因频率有关的事实或数据,包含但不限于等位基因身份、等位基因的存在与受试者(例如,人受试者)的特性之间的统计相关性、等位基因在个体或群体中的存在或不存在、等位基因存在于具有一个或多个特定特性的个体中的百分比可能性等。
如本文中所使用的,术语“测定验证信息”是指由测试结果数据的处理(例如,借助于计算机进行的处理)产生的基因组信息和/或等位基因频率信息。测定验证信息可以用于例如将特定的候选检测测定鉴定为有效检测测定。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后,官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
图1提供了适于在大规模多重捕获测定中使用的用于染色体特异性识别的分子倒置探针(MIP)的示意图。
图2提供了多重染色体特异性滚环扩增的实施例的示意图。
图3提供了使用分子信标探针用于检测的多重染色体特异性滚环扩增的实施例的示意图。
图4提供了包括使用单链连接酶(例如,CircLigaseTM热稳定RNA连接酶)使cfDNA环化以形成“天然环”用于检测的本发明技术的实施例的示意图。
图5提供了包括使cfDNA环化并且使用“金门组装(Golden Gate Assembly)”添加区段以用于检测的本发明技术的实施例的示意图(参见例如,Engler,C.、Kandzia,R.和Marillonnet,S.(2008)《公共科学图书馆:综合(PLoS One)》3,e3647)。
图6提供了包括在独特的分子倒置诱导模板上使用延伸连接使cfDNA环化的本发明技术的实施例的示意图,其中使用RCA的实施例进行检测。
图7提供了包括被延伸并且被连接以产生环状DNA分子的独特的分子倒置诱导模板的本发明技术的实施例的示意图,其中使用RCA的实施例进行检测。
图8提供了包括用作例如用于滚环扩增的模板的合成环状DNA的本发明技术的实施例的示意图,所述合成环状DNA包括用于探针结合的结合位点和用于复制的引物结合位点。
图9提供了包括使用用于检测来自RCA的产物的被配置成用于在与DNA的链杂交时进行碰撞淬灭的探针对的本发明技术的实施例的示意图。
图10提供了包括使用用于检测来自RCA的产物的被配置成用于在与DNA的链杂交时进行荧光共振能量转移(FRET)的探针对的本发明技术的实施例的示意图。
图11提供了包括使用用于检测来自RCA的产物的被配置成在与DNA的链杂交时例如使用双链体特异性核酸酶如限制酶进行切割、包括染料和淬灭剂的探针的本发明技术的实施例的示意图。
图12提供了包括使用CID的RCA、然后进行CID特异性消化和CID特异性标记的本发明技术的实施例的示意图。
图13展示了其中MIP与靶核酸例如cfDNA杂交从而留下单个核苷酸空位的实施例。空位通过延伸以掺入生物素化核苷酸来填补并且通过连接来闭合。然后,经环化MIP可以与链霉亲和素包被的表面结合。
图14示出了与固定在表面上的MIP杂交的起始子寡核苷酸的示意图。
图15示出了在存在起始子寡核苷酸的情况下一起工作以形成自组装支架的发夹寡核苷酸的示意图。
图16展示了包括多个标记例如荧光染料的自组装支架。
图17提供了根据本发明技术的实施例的侵入性切割结构的示意图。
图19提供了在瓣状核酸内切酶测定中的经过切割的瓣片段的累积的图示。
图20展示了其中经过切割的生物素化瓣使用固定化互补探针来捕获并且生物素与连接到酶(例如,β-半乳糖苷酶)的链霉亲和素反应的实施例。
图21展示了其中被设计成靶向不同染色体的MIP各自需要不同的核苷酸来延伸和连接并且其中MIP使用针对每个不同的dNTP携带不同的染料或半抗原的核苷酸以染色体特异性方式延伸和连接的本发明技术的实施例。
图22的图A、B和C展示了其中MIP含有或被修饰成含有固定化部分或与含有固定化部分的寡核苷酸杂交并且固定在表面上的本发明技术的实施例。
图23提供了滚环扩增反应的示意图。
图24A-24D提供了示出了从检查在MIP复合物中包含生物素残基对RCA信号的影响得出的结果的图。
图25A-25C提供了示出了改变溶液中的标准RCA反应中的组分的量的结果的图。
图26提供了对以所示出的百分比(w∶v)使用不同分子量的PEG对信号累积的影响进行比较的图。
图27A-27B和图28A-28B示出了在使用以不规则分散的方式与玻璃表面结合的引物进行的RCA反应中获得的结果,其中使用包括淬灭剂和荧光团的分子信标探针进行检测。
图27A示出了如实例1中所描述的APTES硅烷化板的表面的显微镜图像并且对具有或不具有PEG的RCA信号进行了比较。
图27B提供了示出了PEG对图27A中所示出的斑点的数量和荧光强度的影响的图。
图28提供了示出了20%溶液中的不同分子量的PEG对如实例1中所描述的APTES硅烷化板上的斑点的数量和荧光强度的影响的图。
图29A示出了如实例1中所描述的APTES硅烷化板的表面的显微镜图像并且针对在启动RCA反应之前杂交18小时或1小时的反应对RCA信号进行了比较。
图29B提供了比较了杂交时间和缓冲液对图29A中所示出的斑点的数量和荧光强度(面积)的影响的图。
图30提供了比较了PEG 200在具有或没有2小时杂交时间的情况下对标准RCA反应条件的影响和PEG 2000在2小时杂交的情况下对斑点的数量和荧光强度(面积)的影响的图。
图31提供了比较了PEG 200在具有或没有2小时杂交时间的情况下对在25℃下进行的标准RCA反应条件的影响和PEG 2000在2小时杂交的情况下对斑点的数量和荧光强度(面积)的影响的图。
图32提供了比较了PEG 200在具有或没有2小时杂交时间的情况下对在37℃下进行的标准RCA反应条件的影响和PEG 2000在2小时杂交的情况下对斑点的数量和荧光强度(面积)的影响的图。
图33示出了如实例1中所描述的APTES硅烷化板的表面的显微镜图像并且针对在37℃或45℃下进行的包括所指示浓度的PEG 600的反应对RCA信号进行了比较。
图34提供了在有或没有氧化石墨烯的情况下表面上的RCA分子信标产物的示意图,其中氧化石墨烯淬灭来自与表面非特异性地结合的信标的荧光背景。
图35提供了如实例1中所描述的两步RCA反应的示意图,在所述两步RCA反应中,开始滚环反应,添加分子信标和氧化石墨烯并且进一步温育RCA反应。
图36示出了如实例1中所描述的APTES硅烷化板的表面的显微镜图像并且示出了两步反应氧化石墨烯的RCA信号。
图37提供了针对按一步(无GO)或两步(有或没有GO)进行的RCA反应比较了斑点计数从而将具有100fmol靶的反应与不具有靶的反应进行了比较的图。
图38提供了用于将本发明技术的实施例应用于检测不同类型的靶分子的不同捕获复合物的示意图。
图39提供了将本发明技术应用于检测固定化抗原的示意图。
图40提供了将本发明技术应用于检测固定化抗原-抗体复合物的示意图。
具体实施方式
分子诊断的目标是在尽可能少的时间内以尽可能最少的工作量和步骤实现对分析物的准确的、灵敏的检测。实现这个的一种方式是对样品中的分析物进行多重检测,从而允许在单个反应容器或溶液中进行多个检测事件。然而,许多现有的诊断方法(包含多重反应)仍然需要许多步骤,包含增加进行反应的时间、复杂性和成本的样品制备步骤。在一些实施例中,本发明通过提供可以直接在未经纯化或未经处理的生物样品(例如,血液或血浆)中进行的测定来提供针对这些问题的解决方案。
在一些实施例中,本文中所提供的本发明技术提供了用于以在不使用测序步骤(例如,数字或“下一代”测序步骤)的情况下以数字方式(即,通过检测分子的单独拷贝)对样品或样品部分中的特定核酸或蛋白质的拷贝数进行计数的方式测试样品的经济方法。本发明技术可用于测量任何种类的样品(包含但不限于例如从受试者收集的用于诊断筛查的样品)中的靶分子(如核酸分子)。本文中所提供的本发明技术的实施例可用于例如非侵入性产前测试(NIPT)和其它基因分析。本发明技术的实施例实施了核酸提取、MIP探针设计、MIP扩增/复制和/或用于测量来自经环化MIP的信号的方法的一个或多个步骤。在优选实施例中,本发明技术提供了用于将MIP固定在表面上并且检测固定化MIP的方法。在优选实施例中,使用滚环扩增检测固定化MIP。
在优选实施例中,本发明技术的方法包括靶识别事件,通常包括靶核酸(例如,患者DNA的样品)与另一种核酸分子(例如,合成探针)的杂交。在优选实施例中,靶识别事件创建了产生独特产物(例如,已经延伸、连接和/或切割的探针寡核苷酸)、然后所述产物指示靶存在于反应中以及探针与其杂交的条件。
本文中描述了用于识别靶核酸并且产生新产物的许多不同的“前端”方法。例如,如图中的示例性实施例中所示出的,本发明技术提供了多种方式来产生经环化分子以用于“后端”检测/读出步骤(参见例如,图1-3、图13-18、图34、图35和图38-40)。本发明技术还提供了使用其它探针类型(如可以在存在靶核酸的情况下由瓣状核酸内切酶切割的探针)来用信号通知靶核酸的存在的方法(参见例如,图17-19)。这些前端实施例中每个前端实施例可以用于产生独特的分子,例如环状或经过切割的寡核苷酸。
这些独特的分子可以被配置成具有对于在下游后端检测步骤中进行捕获和/或鉴定有用的一个或多个特征。在前端反应中产生的分子和特征的实例包含具有连接的序列(例如,通过探针的3′和5′端的连接形成的完整的靶特异性序列)、具有添加的序列(例如,靶模板的经拷贝的部分)和/或带标签核苷酸(例如,与生物素、染料、淬灭剂、半抗原和/或其它部分连接的核苷酸)的经环化MIP或从瓣切割反应中释放出的产物(如单链臂)(参见例如,图17-19)。在一些实施例中,MIP在探针的部分中(例如,在探针的主链中)包括特征。
例如,在图2-3、图6-7、图9-12、图15-16、图20-21、图34、图35和图38-40中提供了用于扩增和/或检测前端的独特产物的后端分析方法的实例。
尽管通过参考特定实施例讨论了本发明技术(如某些前端靶依赖性反应与特定后端信号扩增方法和检测平台的组合(例如,图13-16的生物素掺入的MIP与无酶杂交链反应后端偶联);带有生物素标签的经过切割的瓣(如图19中的)与到表面的捕获偶联,然后与产生荧光信号的酶联探针催化地杂交(如图20中所示出的)),但是本发明不限于本文中所公开的前端方法和配置和后端方法和配置的特定组合或检测来自测定产物的信号的任何特定方法。应当理解,技术人员可以容易地使一个前端适用于与替代性的后端一起工作。例如,如图2-3、图8-7、图9-12、图21、图34、图35和图38-40中所例示的,图14的经环化MIP可以使用图20的酶联探针来捕获和检测或可以可替代地在滚环扩增测定中扩增。类似地,如图19-20中所描述的,如图19中所示出的经过切割的瓣可以使用杂交链反应来检测;并且经环化MIP或RCA扩增子可以使用如图17中所图示的侵入性切割反应来检测,等等。
进一步地,尽管参考特定靶核酸(例如,血浆中的游离DNA)讨论了本发明技术,但是本发明不限于任何特定形式的DNA或任何特定类型的核酸或任何特定类型的核酸变异。应当理解,技术人员可以容易地将本发明技术的实施例配置用于对突变、插入、缺失、单核苷酸多态性(SNP)和甲基化的表观基因变异(例如,通过分析用将未经甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶的试剂处理的DNA而产生的特定CpG二核苷酸的甲基化变异,从而产生反映靶DNA中的胞嘧啶甲基化变异的可检测的序列变异)进行检测和计数。
在一些实施例中,以多重方式进行测定。在一些实施例中,可以在允许不同基因座达到更加类似的扩增水平的条件下进行多重测定。
图1提供了分子倒置探针(MIP)的示意图。分子倒置探针含有与待检测靶核酸上的相邻或近端区域互补的第一和第二靶向多核苷酸臂,其中多核苷酸接头或“主链”使两个臂连接(参见图1)。
在存在互补靶核酸的情况下,MIP可以被环化以形成适合于检测的MIP复制子。在一些实施例中,MIP使用切口修复酶(例如,T4 DNA连接酶)简单地连接,而在一些实施例中,使探针封闭以形成环包括:将探针另外地修饰成产生可连接的切口(例如,末端之间的重叠的切割)、使用核酸聚合酶填补末端之间的空位等。
如本文中所使用的,靶位点或序列是指寻求从具有其它序列的样品中的其它核酸中分选出的核酸序列的部分或区域,其对于确定基因病症或病状的存在或不存在(例如,突变、多态性、缺失、插入、非整倍性等的存在或不存在)具有重要意义。如本文中所使用的,对照位点或序列是指具有特定对照基因的已知或正常拷贝数的位点。在一些实施例中,靶向MIP依次包括以下组分:第一靶向多核苷酸臂-第一独特的靶向分子标签-多核苷酸接头-第二独特的靶向分子标签-第二靶向多核苷酸臂。在一些实施例中,在本公开的方法中使用靶向MIP的靶群体。在靶群体中,靶向MIP中的每个靶向MIP中的几对第一和第二靶向多核苷酸臂是相同的并且与核酸中的分别侧接靶位点的第一和第二区域基本上互补。参见例如,WO2017/020023和WO 2017/020024,所述专利中的每一个通过全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中,靶向多核苷酸臂中的每个靶向多核苷酸臂的长度介于18个与35个碱基对之间。在一些实施例中,靶向多核苷酸臂中的每个靶向多核苷酸臂的长度为18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个碱基对或范围介于18个与35个碱基对之间的任何大小。在一些实施例中,对照多核苷酸臂中的每个对照多核苷酸臂的长度介于18个与35个碱基对之间。在一些实施例中,对照多核苷酸臂中的每个对照多核苷酸臂的长度为18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个碱基对或范围介于18个与35个碱基对之间的任何大小。在一些实施例中,靶向多核苷酸臂中的每个靶向多核苷酸臂的熔解温度介于57℃与63℃之间。在一些实施例中,靶向多核苷酸臂中的每个靶向多核苷酸臂的熔解温度为57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、或63℃或范围介于57℃与63℃之间的任何大小。在一些实施例中,对照多核苷酸臂中的每个对照多核苷酸臂的熔解温度介于57℃与63℃之间。在一些实施例中,对照多核苷酸臂中的每个对照多核苷酸臂的熔解温度为57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、或63℃或范围介于57℃与63℃之间的任何大小。在一些实施例中,靶向多核苷酸臂中的每个靶向多核苷酸臂的GC含量介于30%与70%之间。在一些实施例中,靶向多核苷酸臂中的每个靶向多核苷酸臂的GC含量为30-40%、或30-50%、或30-60%、或40-50%、或40-60%、或40-70%、或50-60%、或50-70%,或范围介于30%与70%之间的任何大小或介于30%与70%之间的任何具体百分比。在一些实施例中,对照多核苷酸臂中的每个对照多核苷酸臂的GC含量介于30%与70%之间。在一些实施例中,对照多核苷酸臂中的每个对照多核苷酸臂的GC含量为30-40%、或30-50%、或30-60%、或40-50%、或40-60%、或40-70%、或50-60%、或50-70%,或范围介于30%与70%之间的任何大小或介于30%与70%之间的任何具体百分比。
在一些实施例中,多核苷酸接头与样品或受试者的任何基因组区域基本上不互补。在一些实施例中,多核苷酸接头的长度介于30个与40个碱基对之间。在一些实施例中,多核苷酸接头的长度为30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个或39个碱基对或介于30个与40个碱基对之间的任何间隔。在一些实施例中,多核苷酸接头的熔解温度介于60℃与80℃之间。在一些实施例中,多核苷酸接头的熔解温度为60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃或介于60℃与80℃之间的任何间隔或介于60℃与80℃之间的任何具体温度。在一些实施例中,多核苷酸接头的GC含量介于40%与60%之间。在一些实施例中,多核苷酸接头的GC含量为40%、45%、50%、55%、或60%或介于40%与60%之间的任何间隔或介于40%与60%之间的任何具体百分比。
在一些实施例中,靶向MIP复制子通过以下产生:i)第一和第二靶向多核苷酸臂分别与核酸中的分别侧接靶位点的第一和第二区域杂交;以及ii)在杂交之后,使用连接/延伸混合物来延伸和连接两个靶向多核苷酸臂之间的空位区域以形成单链环状核酸分子。
在某些实施例中,本文中所描述的方法用于检测外显子的缺失或插入或重复。在一些实施例中,靶位点(或序列)是关注的基因中的缺失或插入或重复或关注的基因组区域。在一些实施例中,靶位点是关注的基因的一个或多个外显子中的缺失或插入或重复。在一些实施例中,靶向的多个外显子是连续的。在一些实施例中,靶向的多个外显子是非连续的。在一些实施例中,MIP的第一和第二靶向多核苷酸臂被设计成与基因中的缺失(或插入或重复)或缺失的(或插入的或重复的)基因组区域(例如,一个或多个外显子)或关注的基因组区域的上游和下游杂交。在一些实施例中,MIP的第一或第二靶向多核苷酸臂包括与涵盖靶缺失或重复位点(例如,外显子或部分外显子)的关注的基因的基因组区域基本上互补的序列。
环状DNA分子(如连接的MIP)是使用滚环扩增(RCA)进行扩增的适合的底物。在RCA的某些实施例中,滚环复制引物与环状核酸分子(例如,连接的MIP)或经环化cfDNA杂交。使用链置换的DNA聚合酶(例如,大肠杆菌Pol I DNA聚合酶的(Phi29)、Bst大片段和Klenow片段)延伸引物会产生含有与MIP环状分子互补的核酸序列的重复序列的长的单链DNA分子。
在一些实施例中,使用了在复制之前涉及连接操作的连接介导的滚环扩增(LM-RCA)。在连接操作中,探针与其互补的靶核酸序列(如果存在)杂交并且杂交的探针的端通过连接而连接以形成共价闭合的单链核酸。在连接之后,滚环复制引物与探针分子杂交以启动如上文所描述的滚环复制。通常,LM-RCA包括:将空心探针与目标样品混合,从而产生探针-目标样品混合物,并且在促进空心探针与靶序列之间的杂交的条件下温育探针-目标样品混合物;将连接酶与探针-目标样品混合物混合,从而产生连接混合物,并且在促进空心探针连接以形成扩增靶环(ATC,其也被称为RCA复制子)的条件下温育连接混合物。将滚环复制引物(RCRP)与连接混合物混合,从而产生引物-ATC混合物,在促进扩增靶环与滚环复制引物之间的杂交的条件下温育所述引物-ATC混合物。将DNA聚合酶与引物-ATC混合物混合,从而产生聚合酶-ATC混合物,在促进扩增靶环的复制的条件下温育所述聚合酶-ATC混合物,其中扩增靶环的复制导致形成串联序列DNA(TS-DNA)(即,含有与扩增靶环互补的序列的连环体的长链的单链DNA)。
在图2中所展示的实施例中,经环化分子A、B、C和D由对染色体13、8、21或参考染色体(如Chr.1具有特异性的MIP组成。MIP的序列包围靶向的染色体的空位互补区域,并且MIP的主链含有用于杂交将含有特异性荧光染料(FITC、ALEXA、Dylight、青色(Cyan)、若丹明(Rhodamine)染料、量子点等)的探针的独特的序列。步骤1包括将MIP与cfDNA杂交、单个碱基对延伸(或更长的延伸)以及连接,以使延伸的MIP环化。步骤2包括使经环化MIP滚环扩增,使得与荧光标记的寡核苷酸杂交所需的序列扩增。A*、B*、C*、D*是MIP序列的互补物。步骤3包括将带荧光标记探针与滚环产物杂交。在图3中所展示的实施例中,对RCA产物的检测通过分子探针而不是荧光染料标记的寡核苷酸来促进。
存在多种方式将MIP固定到表面(例如,珠粒或玻璃表面)。例如,这可以通过用包括可结合部分的经修饰的寡核苷酸引发滚环扩增来完成。用于修饰引发寡核苷酸的基团包含但不限于硫醇、氨基、叠氮化物、炔烃和生物素,使得经修饰的寡核苷酸可以使用例如如Meyer等人,“DNA介导的固定化的进展(Advances in DNA-mediated immobilization)”《化学生物学时论(Current Opinions in Chemical Biology)》18:8:8-15(2014)中所概述的适当的反应固定,所述文献出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。
荧光染料掺入的MIP的成像可以通过使用包括将MIP固定到表面(载玻片或珠粒)(例如,使用将MIP主链修饰成含有可以使用如上文和在Meyer等人(同上)中所概述的适当的反应固定的并且使用抗体进行检测的经修饰的碱基)的方法来完成。一旦固定到表面,针对掺入标签的抗体可以用于形成可以用显微镜成像的抗体-MIP复合物。在一些实施例中,抗体可以缀合以增强或扩增来自复合物的可检测信号。例如,β-半乳糖苷酶与抗体的缀合允许使用Quanterix所描述的过程在单分子阵列(“SIMOA”)中进行检测,其中将每种复合物固定在珠粒上,使得任何珠粒具有不多于一个经标记的免疫复合物,并且将珠粒分配到毫微微升大小的孔的阵列,使得每个孔最多含有一个珠粒。通过添加试卤灵β-半乳糖吡喃糖苷,固定化免疫复合物上的β-半乳糖苷酶催化产生发荧光的试卤灵。在可视化后,可以对在具有固定化的单独的免疫复合物的孔中发射的荧光进行检测和计数。参见例如,《Quanterix白皮书1.0(Quanterix Whitepaper 1.0)》,Simoa(单分子阵列)技术的科学原理(Scientific Principle of Simoa(Single Molecule Array)Technology),1-2(2013);以及《Quanterix白皮书6.0》用于蛋白质生物标志物的超灵敏多重免疫检测的SimoaTM HD-1分析仪的实际应用(Practical Application of SimoaTM HD-1 Analyzer forUltrasensitive Multiplex Immunodetection of Protein Biomarkers),1-3(2015),所述文献中的每一个出于所有目的通过引用并入本文中。在一些实施例中,抗体MIP复合物可以例如使用如Morin等人,“基于纳米孔的靶序列检测(Nanopore-Based Target SequenceDetection)”《公共科学图书馆:综合》,DOI:10.1371/journal.pone.0154426(2016)(其通过引用并入本文中)中所描述的具有用各种分子量的聚(乙二醇)标记的抗体的固态纳米孔来直接检测。
图4提供了包括使用单链连接酶(例如,CircLigaseTM热稳定RNA连接酶)使循环cfDNA(ccfDNA)环化以形成“天然环”用于检测的本发明技术的实施例的示意图。一旦创建,“环状ccfDNA”就可以使用多种不同方法(包含多种RCA方法)来检测。例如,如图5中所图示的,包括使cfDNA环化并且使用“金门组装”添加区段以用于检测的本发明技术的一个实施例(参见例如,Engler,C.,Kandzia,R.和Marillonnet,S.(2008)《公共科学图书馆:综合》3,e3647)。
图6展示了检测ccfDNA的另外的方法。在这个实施例中,如先前所描述的,对血浆样品进行处理以纯化ccfDNA(参见例如,M.Fleischhacker等人,用于分离游离血浆DNA的方法强烈影响DNA产量(Methods for isolation of cell-free plasma DNA stronglyaffect DNA yield),《临床化学学报(Clin ChimActa)》2011年11月20日;412(23-24):2085-8)。在步骤1中,将ccfDNA热变性并且用T4多核苷酸激酶对其处理以产生5′磷酸化和3′羟基端DNA片段。在热变性和T4多核苷酸激酶处理之前,可以使用另外的DNA修复(如用T4DNA聚合酶)来修复DNA。具有3′保护端的互补寡核苷酸(因此其将不会由聚合酶延伸)与ccfDNA杂交。这个互补寡核苷酸由染色体特异性区域A和C以及通用序列B组成。ccfDNA延伸并且连接以完成环状DNA分子。将经环化ccfDNA从寡核苷酸中纯化,并且通过将寡核苷酸退火到通用序列B来使用RCA。在RCA之后,将带荧光标记探针与滚环产物杂交。
图7展示了检测ccfDNA的另一种方法。如先前所描述的,对血浆样品进行处理以纯化ccfDNA。步骤1,将ccfDNA热变性。具有磷酸化的5引物保护端的互补寡核苷酸与ccfDNA杂交。这个互补寡核苷酸由染色体特异性区域A和C以及通用序列B组成。ccfDNA和互补寡核苷酸两者均延伸。然而,仅互补寡核苷酸具有5′磷酸以允许完成环状DNA分子。使用与通用序列B互补的引物通过滚环扩增来扩增经环化互补寡核苷酸。在滚环扩增后,带荧光标记探针与滚环产物杂交。
图8示出了用作用于滚环扩增的模板并且包括结合滚环引物结合位点和两个探针结合位点以及任选的结合部分(例如,生物素)的合成环状DNA的示意图。
图9提供了包括使用用于检测来自RCA的产物(例如,与图8中所示出的环状DNA相似的环状DNA)的被配置用于在与DNA的链杂交时进行碰撞淬灭的探针对的本发明技术的实施例的示意图。在这个实施例中,溶液中的带染料标记探针没有淬灭并且产生信号。与接近带有淬灭剂标签的探针的靶杂交的探针会被淬灭,从而降低荧光信号。随着RCA产物的量增加,荧光降低。
图10提供了包括使用用于检测来自RCA的产物的被配置用于在与DNA的链杂交时进行如上文所描述的荧光共振能量转移(FRET)的探针对的本发明技术的实施例的示意图。
图11提供了包括使用用于检测来自RCA的产物的被配置成在与DNA的链杂交时例如使用双链体特异性核酸酶如限制酶进行切割、包括染料和淬灭剂的探针的本发明技术的实施例的示意图。
如图12中所图示的,包括使用染色体特异性标识符序列(CID)的RCA、然后对非靶向的染色体进行CID特异性消化并且针对靶向的CID进行CID特异性标记的本发明技术的一个实施例。CID通过RCA扩增,但维持其单独的单分子身份。CID扩增增加来自单独靶分子的荧光信号。通过酶消化以及使用仅对所分析的染色体具有特异性的标记对来自没有经过分析的染色体的序列进行双重抑制。
在一些实施例中,MIP可以使用信号扩增的非酶促方法来检测。例如,在一些实施例中,MIP固定在表面上并且使用例如如由RM Dirks等人,《美国国家科学院院刊》101(43):15275-15278(2004)和美国专利第8,105,778号所描述的如“杂交链反应”(HCR)等方法来检测,所述文献中的每一个通过引用并入本文中。图13-16展示了使用HCR进行信号扩增的示例性配置。
图13展示了其中MIP与靶核酸例如cfDNA杂交从而留下单个核苷酸空位的实施例。空位通过延伸以掺入生物素化核苷酸来填补并且通过连接来闭合。然后,经环化MIP可以与如图14中所展示的链霉亲和素包被的表面结合,并且在洗去任何未结合的MIP之后,结合的MIP的主链与起始子寡核苷酸杂交。在优选实施例中,在起始子序列与主链结合序列之间包含间隔子,例如18个原子的六乙二醇间隔子。优选地,MIP结合区域的足迹被选择成具有高Tm(例如,大约79℃)以便进行稳定结合。如上文所讨论的,结合标签与生物素(如胺基、硫醇基、叠氮化物或半抗原)不同可以用于使MIP带有标签并且固定到适当反应性表面。
图15示出了在HCR中用于形成自组装支架的发夹寡核苷酸的实例。一种或两种寡核苷酸包括至少一种标记,例如荧光团。在优选实施例中,染料被定位成在组装支架中提供足够大的间隔以防止淬灭效应。例如,在一些实施例中,如图14中所示出的,染料位于发夹的相对端。如图16中所示出的,一旦反应通过与MIP主链结合的起始子寡核苷酸的杂交而启动,HCR发夹就会展开并且以长链杂交,从而产生包括大量标记的支架。
瓣状核酸内切酶反应(例如,Invader测定)可以用于对染色体进行特异性定量检测。在图17-20中展示了示例性实施例。图17示出了与染色体的靶区域杂交的侵入物寡核苷酸和探针寡核苷酸。侵入性寡核苷酸的3′端与探针寡核苷酸的与靶区域互补的区域的5′端重叠。在这个实施例中,探针寡核苷酸包括包括生物素部分的5′瓣和包括标记(例如,荧光团)的3′尾。瓣状核酸内切酶(例如,FEN-1核酸酶)识别重叠的侵入性切割结构并且以高度特异性、结构依赖性的方式切割探针,从而释放5′瓣。在优选实施例中,如图19中示意性示出的,反应等温地运行并且产生线性信号扩增,从而在一个到三个小时内提供每个靶103个到104个经过切割的探针。
在优选实施例中,如图18中所展示的,所使用的探针寡核苷酸包括在其中探针的5′瓣和3′尾彼此杂交的发夹结构。荧光团或另一个部分(例如,2,4-二硝基苯基)可以用作半抗原,使得未经过切割的探针和/或经过切割的探针的3′部分可以使用针对用于进行捕获的半抗原的抗体从反应中去除。
可以以多种方式对来自瓣状核酸内切酶反应中的经过切割的瓣进行检测。在优选实施例中,如图20中所展示的,经过切割的瓣使用固定化互补探针来捕获,并且生物素与连接到可检测部分的链霉亲和素反应。在所示出的实施例中,链霉亲和素与β-半乳糖苷酶偶联,并且荧光信号通过提供由β-半乳糖苷酶催化以产生D-半乳糖和荧光染料试卤灵的非荧光的试卤灵-β-半乳糖吡喃糖苷来生成。使用毫微微升阵列和Poisson统计来产生数字读出变型,单个杂交事件可以使用此种酶促信号扩增来检测。参见例如,DM Rissin和DR Walt,使用毫微微升阵列和Poisson统计的单个酶分子的数字浓度读出(Digital ConcentrationReadout of Single Enzyme Molecules Using Femtoliter Arrays and PoissonStatistics.)《纳米快报(Nano letters)》6(3):520-523(2006);《Quanterix白皮书1.0》,Simoa(单分子阵列)技术的科学原理,1-2(2013);《Quanterix白皮书6.0》用于蛋白质生物标志物的超灵敏多重免疫检测的SimoaTMHD-1分析仪的实际应用,1-3(2015),所述文献中的每一个出于所有目的通过引用并入本文中。在某些优选实施例中,使用了动力学读出,即,在两个时间点处从阵列收集信号。
图21中所展示的实施例中,A、B、C和D由对染色体13、8、21或参考染色体(如1)具有特异性的MIP组成。包围空位的MIP的序列与靶向的染色体的区域互补并且被设计成含有单个核苷酸空位。步骤1:用与半抗原(例如荧光染料、生物素等)缀合的dNTP填补这个空位。填补空位将不同的半抗原引入靶向不同的特异性染色体中的每个特异性染色体的MIP中。例如,添加A仅完成靶向染色体21的MIP,T完成靶向染色体18的MIP,G完成靶向染色体13的MIP,并且C完成靶向参考染色体(如染色体1)的MIP。这种方法用四个独特的半抗原标记这四个不同的MIP。靶向需要特异性dNTP完成单个延伸和连接的每个染色体的MIP的池用于增加捕获事件的数量。步骤2包括将含有半抗原的MIP与对每个半抗原具有特异性的经标记的抗体一起温育。标记可以包括例如荧光染料、量子点或其它荧光颗粒。步骤3包括任选步骤:将包括半抗原靶向的一级抗体的免疫复合物暴露于针对一级抗体的经标记的二级抗体的,从而扩增荧光信号。
如图21中所展示的,在本发明技术的这个实施例中,被设计成靶向不同染色体的MIP各自需要不同的核苷酸来延伸和连接并且其中MIP使用针对每个不同的dNTP携带不同的染料的核苷酸以染色体特异性方式延伸和连接。例如,在优选实施例中,使用CY2、CY3、CY5和CY7。带有染料标签的MIP可以使用对每个不同染料(并通过延伸对待检测的每个不同染色体)具有特异性的抗体来检测。信号可以通过使用二级抗体来扩增。例如,CY2一级兔抗体与靶MIP结合并且二级山羊抗兔抗体与一级抗体结合以扩增信号等。
如上文所讨论的,许多不同的荧光标记系统可应用于本发明技术的实施例中。在一些实施例中,可以使用荧光染料(例如,荧光素、德克萨斯红、TAMRA、Cy3、Cy5),例如使其与掺入寡核苷酸或延伸产物中的核苷酸类似物连接。在一些实施例中,可以使用荧光颗粒,例如纳米颗粒、纳米晶体、量子点、二氧化硅(例如,介孔二氧化硅纳米颗粒)聚合物珠粒(例如,乳胶)。
对于对来自本文中上文所描述的本发明技术的实施例的荧光信号进行检测和定量而言存在许多选项。检测可以基于测量例如物理化学性质、电磁性质、电性质、光电性质或电化学性质或固定化分子和/或靶分子的特性。与表面上的分子的单分子检测有关的两个因素是实现足够的空间分辨率以分辨单独的分子以及将期望的单个分子与背景信号(例如,与与表面非特异性结合的探针)区分开。例如在WO2016/134191中发现用于检测单分子相关信号的示例性方法,所述专利出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中,测定被配置用于例如在SpectraMax微读板仪或其它读板仪中进行标准SBS微板检测。虽然这个方法通常需要低变化荧光(多孔,多次测量),但是这个格式可以复用并且在多个不同的荧光通道上进行读取。另外,所述格式的吞吐量非常高。
实施例还可以被配置用于在表面(例如,玻璃表面、金表面或碳(例如,金刚石)表面)上进行检测。在一些实施例中,信号检测通过用于检测电磁辐射(例如,光)的任何方法(如选自远场光学方法、近场光学方法、落射荧光光谱法、共聚焦显微镜、双光子显微镜、光学显微镜和全内反射显微镜的方法)来完成,其中靶分子用电磁辐射发射器来标记。其它显微镜的方法(如原子力显微镜(AFM)或其它扫描探针显微镜(SPM))也适用。在一些实施例中,可能没有必要对靶进行标记。可替代地,可以使用可以通过SPM检测到的标记。在一些实施例中,信号检测和/或测量包括通过使用如ImageXpress成像系统(加利福尼亚州圣何塞的美谷分子仪器公司(Molecular Devices,San Jose,CA))等成像系统和类似的系统对荧光簇计数来进行表面读取。
本发明技术的实施例可以被配置用于使用许多其它系统和仪器平台(例如,珠粒测定(例如,Luminex)、阵列杂交、NanoString nCounter单分子计数装置)进行检测。参见例如,GK Geiss等人,用颜色编码的探针对的基因表达的直接多重测量(Direct multiplexedmeasurement of gene expression with color-coded probe pairs);《自然生物技术》26(3):317-25(2008)、发布于2018年8月3日的美国专利申请2018/0066309 Al(PN Hengen等人,Nanostring技术有限公司的发明人)等。
在Luminex珠粒测定中,将针对关注的分子的用分析物特异性捕获抗体预先包被的颜色编码的珠粒添加到样品。可以在同一样品中同时检测到多种分析物。分析物特异性抗体捕获关注的分析物。添加对关注的分析物也具有特异性的生物素化检测抗体,使得抗体-抗原夹心形成。添加藻红蛋白(PE)缀合的链霉亲和素,并且在基于双激光流的检测仪器上读取珠粒。在基于双激光流的检测仪器(如Luminex 200TM或分析仪)上读取珠粒。一个激光器对珠粒进行分类并且确定要检测的分析物。第二个激光器确定PE衍生信号的量值,所述量值与结合的分析物的量成正比。
NanoString nCounter是用于在单个多重反应中对数百种不同基因进行数字定量的单分子计数装置。本发明技术与固相杂交以及自动成像和检测组合地使用分子“条形码”(所述分子“条形码”中的每个分子“条形码”用颜色编码对应于关注的基因(或其它核酸)的单个探针并且与其连接)。参见例如,Geiss等人(同上),其描述了被构建用于检测每个关注的核酸的独特的几对捕获探针和报告探针的使用。在所描述的实施例中,在单个溶液相杂交反应中将探针与核酸(例如,未分区的cfDNA)或来自样品的总RNA混合在一起。杂交导致形成由与其特异性报告探针和捕获探针结合的靶核酸构成的三分结构,并且例如通过亲和纯化去除未杂交的报告探针和捕获探针。当使用生物素固定化标签时,将杂交复合物暴露于适当的捕获表面(例如,链霉亲和素包被的表面)。在表面上捕获之后,施加的电场在溶液中在相同方向上延伸并且定向每个复合物。然后,将复合物固定处于拉长的状态并且对其进行成像。因此,可以通过由存在于报告探针上的有序荧光区段生成的颜色代码来鉴定关注的每个靶分子并且对其进行计数以对靶分子进行计数。
图22的图A、B和C展示了其中包括固定化部分或与其连接的MIP固定在表面上的本发明技术的实施例。虽然不限于用于将指示靶识别的独特特征掺入到经环化MIP分子中的任何特定实施例,但是图22的实施例是使用包括使用聚合酶复制靶核酸的一个或多个核苷酸来延伸直链MIP、然后进行连接以使延伸的探针环化的实施例来说明的。
在图22的图A中所展示的实施例中,在步骤1中,将MIP与靶DNA杂交,并且然后在存在经修饰的dNTP的情况下通过DNA聚合酶使其延伸,使得固定化部分在延伸期间掺入每个MIP中。然后,将MIP连接到自身以完成经环化探针。经修饰的dNTP可以包括但不限于包括反应性化学物质(如胺基或硫醇基)或其它可结合特征(如生物素或抗体半抗原)的dNTP。在步骤2中,在表面与MIP的固定化特征相互作用以结合MIP的条件下,将经环化MIP暴露于表面。此类表面包含但不限于衍生化或未衍生化玻璃、二氧化硅、金刚石、金、琼脂糖、塑料、铁磁材料、合金等,并且可以呈任何形式,例如载玻片、样品孔、通道、珠粒、颗粒和/或纳米颗粒,其中的任何一个都可以是多孔的或无孔的。
在图22的图B中所展示的实施例中,在步骤1中,将MIP与靶DNA杂交并且连接以环化。在所示出的实施例中,MIP通过DNA聚合酶延伸以在连接之前填补序列空位,而在其它实施例中,MIP可以被设计成以例如挂锁探针的方式在没有使用聚合步骤的情况下与靶核酸简单地杂交并且连接以环化。参见例如,M.Nilsson等人,“挂锁探针:使寡核苷酸环化以进行局部DNA检测(Padlock probes:circularizing oligonucleotides for localized DNAdetection)”.《科学(Science)》265(5181):2085-2088(1994)。在步骤2中,将环状MIP与含有如上文所描述的固定化部分(例如,反应性胺、反应性硫醇基、生物素、半抗原等)的互补寡核苷酸杂交。在步骤3中,在表面与MIP复合物的固定化特征相互作用以结合MIP复合物的条件下,将MIP和包括固定化部分的寡核苷酸的杂交MIP复合物暴露于表面。如上文所描述的,表面包含但不限于衍生化或未衍生化玻璃、二氧化硅、金刚石、金、琼脂糖、塑料、铁磁材料、合金等,并且可以呈任何形式,例如载玻片、样品孔、通道、珠粒、颗粒和/或纳米颗粒,其中的任何一个都可以是多孔的或无孔的。
在图22的图C中所展示的实施例中,在步骤1中,将含有构建到探针主链中的固定化部分的MIP与DNA杂交、通过DNA聚合酶延伸并且连接以使探针环化。如同上文所描述的图B的实施例一样,MIP可以被设计成在没有使用聚合步骤的情况下仅与靶核酸杂交并连接以环化。在步骤2中,在表面与MIP的固定化特征相互作用以结合MIP的条件下,将含有固定化部分的经环化MIP暴露于表面。如上文所描述的,表面包含但不限于衍生化或未衍生化玻璃、二氧化硅、金刚石、金、琼脂糖、塑料、铁磁材料、合金等,并且可以呈任何形式,例如载玻片、样品孔、通道、珠粒、颗粒和/或纳米颗粒,其中的任何一个都可以是多孔的或无孔的。
在图22中所展示的实施例中的每个实施例中,一旦MIP已经固定到表面,标记和/或信号扩增(例如,荧光标记和/或荧光信号扩增)以及检测就可以使用本文中所讨论的各种后端分析方法中的任何一种后端分析方法来完成。用于扩增和/或检测独特的固定化MIP产物的适合的方法包含但不限于上文所描述的NanoString nCounter技术以及图2-3、图6-7、图9-12、图15-16和图20-21中所展示的方法。在一些实施例中,标记和/或信号扩增(例如,荧光标记和/或荧光信号扩增)是在MIP已经固定到表面之前完成的。
在优选实施例中,使用被配置用于单分子可视化的后端过程。例如,如上文所描述的,Quanterix平台使用捕获具有不多于一个带标签复合物的珠粒的毫微微升大小的孔的阵列,其中来自捕获到的复合物的信号使用试卤灵-β-吡喃半乳糖苷/β-半乳糖苷酶反应产生荧光试卤灵来进行显影。阵列的可视化允许检测来自每个单独复合物的信号。在某些优选实施例中,使用了固态纳米孔装置,例如如Morin等人所描述的(参见“基于纳米孔的靶序列检测(Nanopore-Based Target Sequence Detection)”《公共科学图书馆:综合》11(5):e0154426(2016))。固态纳米孔是在将两个水性体积分离的固态薄膜中形成的纳米级开口[23]。电压钳放大器在测量通过开孔的离子电流的同时跨膜施加电压(图1a)。当捕获到单个带电荷分子如双链DNA并且通过电泳驱动其通过孔时,测量到的电流偏移以及偏移深度(δI)和持续时间用于表征事件。(Morin等人,同上)。尽管使用这个系统可单独检测到DNA,但是独特的标签(例如,不同大小的聚乙二醇(PEG))可以与高度序列特异性探针(例如,肽核酸探针,PNA)连接以向任何特定的DNA-PNA-PEG复合物给予表示在测定的前端中检测到的靶核酸的独特特征标签。
在图23中所展示的实施例中,形成了包括寡核苷酸引物和环状探针(如MIP或连接的挂锁探针)的复合物。使引物在滚环扩增反应中延伸产生含有与环状探针互补的序列的连环体的长链的单链DNA。RCA产物与具有荧光团和淬灭剂的多个分子信标探针结合。信标的杂交使淬灭剂与荧光团分离,从而允许检测到来自信标的荧光。RCA产物的累积可以通过测量指示信标在反应的时间过程中与增加的量的产物结合的荧光强度的增加来实时地监测。
反应中的积累荧光的实时定量用于检查连接的生物素部分对MIP或对引物的影响。图24A-24D示出了从检查在仅经环化MIP中(A)、在仅RCA引物中(B)、在两者(C)中以及不在两者(D)中包含生物素残基对RCA信号的影响得到的结果。在这个实验中,MIP含有以下序列:
ATGCTGCTGCTGTACTACGAGGCTAAGGCATTCTGCAAACAT-3′(经环化的)。
在以上生物素化MIP中,带框的“T”示出含有生物素的MIP中的生物素的附接位点(《集成DNA技术(Integrated DNA Technologies)》,“内部生物素dT”)。生物素化引物包括附接在末端′5′磷酸酯处的生物素(《集成DNA技术》,“5′生物素-TEG”)。根据下文在实例1中所描述的“标准滚环反应”程序,在37℃下进行滚环反应一小时。这些数据示出,生物素在经环化MIP中的存在会抑制RCA,而生物素在引物上的存在不会抑制反应。
图25A-25C示出了改变溶液中的标准RCA反应中的组分的量的结果。图25A对在每个反应中使用5个单位和25个单位的Phi29聚合酶进行了比较,并且示出了较高浓度的聚合酶在所测试的条件下一致地产生较高的信号。图25B示出了使用不同浓度的分子信标探针(“信标”)的影响;图25C将使用不同浓度的Phi29聚合酶和分子信标探针的影响与使用200μM或800μM总dNTP对标准反应的影响进行了比较。基于这些数据,对被调整成包括1000nM信标、800μM dNTP和2000nM phi 29聚合酶(80个单位)的反应进行了进一步的测试。
对添加不同浓度的PEG和使用不同大小的PEG对增强型RCA条件(E-RCA,参见下文的实例1)的影响进行了检查。图26对以所示出的百分比(w∶v)在E-RCA条件下使用不同大小的PEG(200和8000)的影响进行了比较。在针对这个实施例所测试的条件下,PEG 200在所有所测试的浓度下均提供了优越的结果,其中20%PEG 200提供了最佳结果。相比之下,PEG8000显著降低了RCA的效率。基于这些数据,对包括至少20%w∶v的PEG 200的RCA反应进行了进一步的测试。
如上文所讨论的,在表面上进行单分子检测时,优选的是,使来自任何单独的结合的分子的信号的斑点大小最小化,使得确保斑点之间的分离。对使用PEG 200对斑点大小和检测到的斑点数量的影响进行了检查。使用下文所描述的E-RCA条件在有或没有20%w∶vPEG 200的情况下进行测定,温育140分钟。在图27A-27B和图28A-28B中示出了结果。图27A示出了PEG的存在减小了斑点尺寸,从而增强了来自单独斑点的荧光信号的测量。图27B示出了PEG对图27A中所示出的斑点的数量和荧光强度的影响,并且示出了添加PEG增加了可检测斑点的数量,同时减小了所检测的斑点的大小。
对在APTES硅烷化板上进行的反应中在20%溶液中使用不同分子量的PEG对斑点计数和斑点大小的影响进行了检查。如实例1中的“表面上的一步滚环扩增”中所描述的,在APTES处理的表面上进行了反应,其中如图28中所指示的对PEG组分进行了修饰。图28示出了当所使用的PEG小于1000,优选地介于200与800之间,更优选地为600的平均分子量时,斑点数量最大化并且斑点大小最小化。
在启动RCA反应之前,对杂交时间的长度进行了检查。图29A示出了如实例1中所描述的APTES硅烷化板的表面的显微镜图像,并且针对在TBS缓冲液或RCA缓冲液中在启动RCA反应之前杂交18小时或1小时的杂交对RCA信号进行了比较。如上文所描述的,用20%PEG600进行了增强型RCA,持续140分钟。图29B提供了比较了杂交时间和缓冲液对图29A中所示出的斑点的数量和荧光强度(面积)的影响的图。这些数据示出,当杂交时间越长时,斑点的数量会显著增加。
图30、31和32提供了比较了PEG 200在有或没有2小时杂交时间的情况下以及用PEG 2000替换PEG 200在具有2小时杂交的情况下对标准RCA反应条件、增强型RCA(E-RCA)条件以及具有其它变化的E-RCA条件的影响的图。每个图中的反应都在相同的温度下进行,其中在图30、31和32中,反应分别在30℃、25℃和37℃下进行。
针对每个条件对斑点的数量和荧光强度(面积)进行了评估。这些数据示出,在存在PEG 200的情况下,37℃反应温度产生高斑点计数和小斑点大小的最佳组合。还对使用较高的RCA反应温度使信标探针的浓度有所变化的影响进行了检查。在37℃或42℃下进行含有1000nM、2000nM、4000nM或8000nM分子信标探针的反应,并且所述反应示出,在较高温度下,所计数的斑点数量显著增加(数据未示出)。虽然本发明技术不限于任何特定的作用机制,但是这些数据表明在较高温度(例如,42℃或更高)下进行反应产生更多的RCA产物和更多结合的信标探针。
对在存在不同浓度的PEG 600的情况下的升高的温度的影响进行了进一步的检查。图33示出了如实例1中所描述的APTES硅烷化板的表面的显微镜图像并且针对在37℃或45℃下进行的包括所指示浓度的PEG600的反应对RCA信号进行了比较。这些数据示出,45℃反应产生了显著较高的斑点计数,并且10%到15%w∶v PEG600在45℃下产生了斑点计数和斑点大小的最佳组合。
对将氧化石墨烯添加到RCA表面结合反应的影响进行了检查。开发了如实例2中所描述的并且如图35中示意性示出的两步RCA程序。图36示出了如实例1中所描述的APTES硅烷化板的表面的显微镜图像并且示出了两步反应氧化石墨烯的RCA信号。阴性对照不含输入靶并且示出了来自分子信标探针的背景。图37提供了针对按一步(无GO)或两步(有或没有GO)进行的RCA反应比较了斑点计数从而将具有100fmol靶的反应与不具有靶的反应进行了比较的图。这些数据示出,GO的使用显著减少了无靶对照反应中的背景斑点的数量,从而提高了信号:测定中的背景结果。
实验
实例1
这个实例提供了用于分析来自如血液样品等样品的DNA例如cfDNA的工作流程的实例。
样品收集
以标准抽取量从患者收集血液。将10mL的血液储存于Streck血液收集管或替代性的含有EDTA的血液收集管中。将样品在环境温度下运输到实验室中并且如下进行处理:
·在室温下将血液在2000xg下离心20分钟,以从血液中获得血浆级分。
·将血浆转移到新的无菌的不含核酸酶的聚丙烯管中并且在3220xg下离心30分钟。
游离DNA(cfDNA)纯化
使用标准方法,例如使用MagMAX游离DNA分离试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific),目录号:A29319)将游离DNA从血浆中纯化。
测定板制备
对玻璃底微量滴定板进行处理以固定引发经环化MIP的滚环扩增的寡核苷酸。可以使用几种方法(参见例如,E.J.Devor等人,“用于使寡核苷酸与固相载体连接的策略(Strategies for Attaching Oligonucleotides to Solid Supports)”《集成DNA技术》(2005),所述文献出于所有目的通过全文引用的方式并入本文)。
1)酸预洗
对于每种方法,首先如下对玻璃底板进行酸洗:
(a)将100μL的0.5N硫酸添加到每个孔。
(b)将箔密封件添加到板。
(c)通过以300RPM旋转将板在37℃下温育2小时。
(d)去除孔内容物。
(e)用100μL分子级水洗涤孔两次。
(f)用100μL的95%乙醇洗涤孔两次。
2)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)硅烷化和链霉亲和素-生物素引物固定化:
(a)通过添加200μL99%APTES(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),目录号:440140)、500μL分子级水和9.3ml 95%乙醇来制备2%APTES。
(b)涡旋溶液并且将100μL移液到每个孔中。
(c)在室温下温育15分钟。
(d)去除孔内容物。
(e)用100μL的95%乙醇洗涤孔两次。
(f)去除最后一次的洗涤物。
(g)将板在37℃下温育24小时。
引物固定化
(h)向胺官能化玻璃板添加1纳克在100μL的Tris缓冲盐水中的链霉亲和素。
(i)在室温下温育1小时。
(j)用100μL的TBS洗涤每个孔三次。
(k)添加100μL的1μM生物素化寡核苷酸溶液。
(1)在室温下温育1小时。
(m)用100μL的TBS洗涤每个孔三次。
3)丙烯酸硅烷化和丙烯酸酯(acrydite)引物固定化
(a)通过添加400μL 99%丙烯酸硅烷(甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯;西格玛奥德里奇公司,目录号:440159)、1mL分子级水和18.6mL 100%乙醇来制备4%丙烯酸硅烷。
(b)将100μL的4%丙烯酸硅烷溶液添加到每个孔。
(c)在室温下温育15分钟。
(d)去除4%丙烯酸硅烷溶液。
(e)每次洗涤用100μL的100%乙醇洗涤每个孔四次。
(f)将板在37℃下温育24小时。
(g)通过添加以下来制备丙烯酸酯引物溶液:
(i)250μL 5x TRIS硼EDTA(TBE)缓冲液、
(ii)500μL 40%丙烯酰胺、
(iii)17.5μL 10%过硫酸铵、
(iv)5μL四甲基乙二胺(TEMED)、
(v)包括′5′丙烯酸酯(或丙烯酸-亚磷酰胺)的25μL 100μM寡核苷酸引物
(vi)1.7mL的分子级水。
(h)将25μL的丙烯酸酯引物溶液添加到每个孔并且轻轻搅拌板以覆盖孔底部。
(i)在室温下温育30分钟。
(j)用100μL 0.5 x TBE洗涤孔四次,从而丢弃前三次的洗涤物并且将最后一次的洗涤物留在孔中,然后继续进行RCA测定。
可以通过其它方法(例如,如Devor等人(同上)所描述的)来固定引物。
分子倒置探针池
探针池用于捕获DNA样品例如cfDNA样品中的特异性基因座并且产生用于滚环扩增的经环化MIP。NIPT测定通常包括分子倒置探针池。在优选实施例中,NIPT测定包括约5,000-10,000个分子倒置探针。
●产生靶向的MIP以靶向有待通过测定来研究的特征(例如,染色体13、18、21、X、Y和CHR22q11.2)。
●针对每个特征产生大约10,000个独特的MIP。
●将MIP混合在一起以产生探针池,其中每个探针具有定制浓度。
cfDNA的MIP捕获和连接
●在以下反应中,将MIP池添加到经过纯化的cfDNA。
○2μL AMP连接酶缓冲液(10x)、1μL MIP探针库、16μL的cfDNA制剂和1μL的AMP连接酶(80个单位)。
○将反应在98℃下温育2分钟并且以每分钟1度冷却直到所述反应达到45℃,然后在45℃下保持2小时。
分子信标探针
可用于本发明技术的分子信标探针的实例如下:
1)5′Alexa 405-CCTCAGGTGTGTAACTCGATCAGmGmAmGmG-dabcyl 3′
2)5′Alexa 488-CC TCA ATG CTG CTG CTG TAC TAC mGmAmG mG-dabcyl 3′
3)5′Alexa 594-CCTCAGGTGTGTAACTCGATCAGmGmAmGmG-BHQ2 3′
4)5′Alexa 647-CCTCAGCGCTGCCTATTCGAACTmGmAmGmG-BHQ2 3′
5)5′Alexa 750-CCTCAGGTGTGTAACTCGATCAGmGmAmGmG-BHQ3 3′
标准滚环扩增测定条件
○对于100μL RCA溶液,在冰上组合
■MIP探针-靶DNA制剂(例如,上文所描述的整个MIP捕获物/cfDNA制剂,大约20μL)
■10μL的10X Phi29缓冲液,最终浓度为1X
1X Phi29DNA聚合酶反应缓冲液
-50mM Tris-HCl
-10mM MgCl2
-10mM(NH4)2SO4
-4mM DTT
-(pH7.5,在25℃下)
■200μM dNTP
■5个单位的Phi29 DNA聚合酶
■100nM信标探针
■分子级水,直到100μL
○在30℃到37℃下温育,持续反应时间(例如,90到120分钟)。
增强型RCA(E-RCA)条件:
○对于100μL增强型RCA溶液,在冰上组合
■MIP探针-靶DNA制剂(例如,上文所描述的整个MIP捕获物/cfDNA制剂,大约20μL);
■10μL的10X Phi29缓冲液,最终浓度为1X
■800μM dNTP
■80个单位的Phi29 DNA聚合酶
■1000nM信标探针
■分子级水,直到100μL
○在30℃到37℃下温育,持续反应时间(例如,90到120分钟)。
在表面上的一步增强型滚环扩增
●制备滚环扩增(RCA)溶液
○对于100μL RCA溶液,在冰上组合
■MIP探针-靶DNA制剂(例如,上文所描述的整个MIP捕获物/cfDNA制剂,大约20μL);
■10μL的10X Phi29缓冲液,最终浓度为1X
1X Phi29DNA聚合酶反应缓冲液
-50mM Tris-HCl
-10mM MgCl2
-10mM(NH4)2SO4
-4mM DTT
-(pH 7.5,在25℃下)
■4μL的10mM dNTP,总dNTP最终浓度为0.4mM;
■50μL的经过过滤的30%PEG 600;
■0.5μL的100μM分子信标,最终浓度为0.5μM
■8μL的Phi29聚合酶(10个单位/μL);以及
■22.5μL的分子级水
○将溶液例如通过涡旋混合并且移液到包括结合的引物的经过处理的玻璃表面上,然后将板密封;
○在45℃下将板在带有热盖的热混合器的平底加热块上温育90分钟;
○去除孔内容物并且用100μL的1X TBS洗涤孔两次;丢弃洗涤溶液;
○添加100μL的1X TBS,并且如下文所描述的在显微镜中成像。
用IXM4显微镜(加利福尼亚州圣何塞的美谷分子仪器公司)对样品进行成像
通常使用20x、40x或60x物镜来捕获图像。
●将板放置在IXM4显微镜中并如下进行成像:
○板是自动曝光的以确保荧光强度值的宽动态范围(所使用的相机的最大范围,如16位图像)。
○将板的每个孔细分为大约100张图像。
对于高通量测定,可以使用自动显微镜。
图像分析
●如下对图像进行分析:
○在不含样品(阴性对照)的图像中确定相对荧光强度。
○通过将来自阴性对照的平均相对荧光强度乘以三来确定阈值。
○在每个通道中,对高于阈值的斑点进行计数。
一步方案的变体
拥挤试剂(例如,PEG)添加:在分子级水中制备30%溶液;用孔径为0.2μm的过滤器进行过滤。将PEG添加到RCA反应,从而调整添加到RCA的水以维持一致的体积。
信标:添加期望的浓度,从而调整添加到RCA的水以维持一致的体积。
dNTP:添加期望的浓度,从而调整添加到RCA的水以维持一致的体积。
氧化石墨烯:如实例2中所描述的,进行2步反应,从而添加氧化石墨烯和带标记探针。
实例2
在具有氧化石墨烯的表面上使用两步滚环扩增进行检测
在冰上制备滚环扩增(RCA)溶液:
○对于100μL RCA溶液(没有分子信标),组合:
■MIP探针-靶DNA制剂(例如,上文所描述的整个MIP捕获物/cfDNA制剂,大约20μL);
■10μL的10X Phi29缓冲液,最终浓度为1X[
1X Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液
-50mM Tris-HCl
-10mM MgCl2
-10mM(NH4)28O4
-4mM DTT
-(pH 7.5,在25℃下)
■4μL的10mM dNTP,总dNTP最终浓度为0.4mM;
■50μL的经过过滤的30%PEG 600;
■8μL的Phi29聚合酶(10个单位/μL);以及
■23μL的分子级水
○将溶液通过涡旋混合并且移液到的经过处理的玻璃表面上,然后将板密封;
○在45℃下将板在带有热盖的热混合器的平底加热块上温育90分钟;
○去除孔内容物并且用100μL的1X TBS洗涤孔三次;丢弃洗涤溶液;
○添加包括以下的50μL氧化石墨烯-分子信标溶液:
■5μL的10X Phi 29缓冲液,最终浓度为1X
■0.5μL的100μM分子信标,最终浓度为0.5μM
■5μL的2mg/mL氧化石墨烯溶液,最终浓度为0.2mg/mL;
■分子级水,直到50μL
○将反应在37℃下温育60分钟
○用100μL 1x TBS洗涤三次;
○用含有5%w∶v吐温20的100μL 1x TBS洗涤一次:
○用100μL的1X TBS洗涤两次;丢弃洗涤溶液;
○添加100μL的1X TBS,并且如上文所描述的在显微镜中成像。
容易显而易见的是,关于本文中的公开所提供的所公开前端靶识别系统中的每个前端靶识别系统可以被配置成生成可检测信号以用于与上文所描述的后端仪器和系统中的任何一个后端仪器和系统一起使用。
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21.B.Schweitzer等人,“带有滚环DNA扩增的免疫测定:用于超灵敏抗原检测的多功能平台(Immunoassays with rolling circle DNA amplification:A versatileplatform for ultrasensitive antigen detection)”《美国国家科学院院刊》97(18):10113-10119(2000)
22.C.Hong等人,“使用等温基因扩增和氧化石墨烯对MicroRNA进行荧光法检测(Fluorometric Detection of MicroRNA Using Isothermal Gene Amplification andGraphene Oxide)”《分析化学》88:2999-3003(2016)
23.E.J.Devor等人,“使寡核苷酸与固相载体连接的策略(trategies forAttaching Oligonucleotides to Solid Supports)”《集成DNA技术(Integrated DNATechnologies)》(2005)
24.WO 2015/083002“核酸的多重检测(Multiplex Detection of NucleicAcids)”
本申请中所引用的所有文献和类似材料,包含上述参考书目中所描述的出版物并且包含但不限于专利、专利申请、论文、书籍、专著和互联网网页,出于任何目的通过全文引用的方式明确地并入。除非另外定义,否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本文中所描述的各个实施例所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。当所并入的参考文献中的术语的定义出现与本教导中所提供的定义不同时,应以本教导中所提供的定义为准。
在不脱离所描述的本发明技术的范围和精神的情况下,所描述的本发明技术的组合物、方法和用途的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已结合特定的示例性实施例描述了本技术,但应当理解,不能将所要求保护的本发明不适当地限定为此类特定实施例。实际上,对于分子生物学、分子诊断学、核酸结构、生物化学、医学科学或相关领域的技术人员明显的、用于执行本发明的所描述的模式的各种修改都旨在落入权利要求的范围内。
序列表
<110> 普罗格尼迪公司(PROGENITY, INC.)
<120> 用于对核酸分子进行计数的方法、系统和组合物
<130> PRGNY-36313/WO-1/ORD
<150> US 62/660,699
<151> 2018-04-20
<150> US 62/651,676
<151> 2018-04-02
<160> 7
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
agtctaggat tcggcgtggg ttaaggtggc ttccttggcc gaagtgcggg gaccgc 56
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 序列是环状的,其中位置1连接到位置100
<400> 2
ccttcgactt caagagacca tgagttgtgc ggtccccgca cttcggccaa ggaagccacc 60
atcatcagta gtgtgatggc agcctagcac gggcattagc 100
<210> 3
<400> 3
000
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtttcatcag atcctaagcc gcacaattgg gtgcggctta ggatctga 48
<210> 5
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
agtctaggat tcggcgtggg ttaacacgcc gaatcctaga ctactttgat ctaggattcg 60
gcgtgggtta aggtggcttc cttggccgaa gtgcggggac cgc 103
<210> 6
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
ttaacccacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtgtt aacccacgcc 60
gaatcctaga ctcaaagtag tctaggattc ggcgtg 96
<210> 7
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
agtctaggat tcggcgtggg ttaacacgcc gaatcctaga ctactttgag tctaggattc 60
ggcgtgggtt aaggtggctt ccttggccga agtgcgggga cccc 104
Claims (127)
1.一种用于对固相载体上的靶分子进行计数的方法,所述方法包括:
a)形成包括与经环化核酸探针杂交的寡核苷酸引物的至少一个复合物,其中所述引物与固相载体结合;
b)在包括以下的过程中检测所述至少一个复合物的形成:
i)在滚环扩增(RCA)反应中使所述复合物中的所述引物延伸以形成RCA产物;
ii)使多个带标记探针与所述RCA产物杂交;以及
iii)检测经过杂交的带标记探针;
其中经过杂交的带标记探针指示所述靶分子在所述固相载体上的存在。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述固相载体包括硅烷化表面。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述硅烷化表面包括玻璃。
4.一种用于对固相载体上的靶分子进行计数的方法,所述方法包括:
a)提供包括以下中的至少一个的硅烷化表面:
-丙烯酸基;
-反应性胺基;
b)在玻璃表面上形成多个复合物,所述多个复合物包括以下中的至少一个:
-RCA产物,所述RCA产物包括多个经过杂交的带标记探针;
-双链支架产物,所述双链支架产物包括多个连环化带标记支架寡核苷酸;
其中复合物的形成指示靶分子在所述玻璃表面上的存在,并且其中形成所述多个复合物包括使所述玻璃表面暴露于包括氧化石墨烯的溶液;以及
c)对所述多个复合物进行计数。
5.根据权利要求4所述的方法,所述硅烷化表面是玻璃。
6.根据权利要求1或权利要求4所述的方法,其中所述硅烷化表面包括用3-氨基丙基三乙氧基硅烷或甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯处理的表面。
7.根据权利要求1或权利要求4所述的方法,其中所述固相载体包括测定板,优选地玻璃底测定板中的表面。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述测定板是多孔测定板,优选地微量滴定板。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述引物与所述固相载体直接结合,优选地与所述固相载体共价连接。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述引物包括生物素部分并且所述固相载体包括亲和素,优选地链霉亲和素。
11.根据权利要求1或权利要求4所述的方法,其中一个或多个复合物包括与抗原或半抗原结合的抗体。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述复合物包括与所述固相载体直接结合的抗原或半抗原。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述抗原或半抗原与所述固相载体共价连接。
14.根据权利要求1或权利要求4所述的方法,其中形成所述复合物或所述多个复合物包括使所述固相载体暴露于包括拥挤剂的溶液。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述拥挤剂包括聚乙二醇(PEG),优选至少2%到10%(w:v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述PEG的平均分子量介于200与8000之间,优选地介于200与1000之间,优选地介于400与800之间,优选地为600。
17.根据权利要求1所述的方法,其包括使所述固相载体暴露于包括氧化石墨烯的溶液的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法,其中在步骤b)iii)之前使所述固相载体暴露于氧化石墨烯。
19.根据权利要求17所述的方法,其中在步骤b)ii)之前使所述固相载体暴露于氧化石墨烯。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶分子包括核酸。
21.根据权利要求4所述的方法,其中所述靶分子包括核酸。
22.根据权利要求20或21所述的方法,其中所述核酸包括来自受试者的样品,优选地血液或血液产物样品的DNA。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述DNA是来自血液或血液产物样品的游离DNA。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述游离DNA包括来自母体血液样品的胎儿DNA。
25.根据权利要求1或权利要求4所述的方法,其中形成RCA产物包括在反应混合物中使引物在经环化核酸探针上延伸,所述反应混合物包括:
-每μL Phi29 DNA聚合酶至少0.2个单位,优选地每μL至少0.8个单位;
-至少400μM,优选地至少600μM,更优选地至少800μM总dNTP。
26.根据权利要求25所述的方法,其中使带标记探针与所述RCA产物杂交包括在进一步包括超过100nM分子信标探针的反应混合物中形成所述RCA产物,优选地所述反应混合物中有至少1000nM分子信标探针。
27.根据权利要求25所述的方法,其中形成包括多个经过杂交的带标记探针的RCA产物包括在进一步包括超过100nM分子信标探针的反应混合物中形成所述RCA产物,优选地所述反应混合物中有至少1000nM分子信标探针。
28.根据权利要求25所述的方法,其中所述反应混合物进一步包括PEG,优选至少2%到10%(w:v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述PEG的平均分子量介于200与8000之间,优选地介于200与1000之间,优选地介于400与800之间,优选地为600。
30.根据权利要求1、4和25中任一项所述的方法,其中与带标记探针杂交的多个RCA产物以分散的方式固定在所述固相载体上,其中所述多个RCA产物中的至少一部分能够通过检测标记来单独地检测。
31.根据权利要求30所述的方法,其中RCA产物的所述分散是不规则的。
32.根据权利要求30所述的方法,其中RCA产物的所述分散呈可寻址阵列。
33.根据权利要求30所述的方法,其中所述复合物包括至少一个多肽。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述至少一个多肽包括抗体。
35.根据权利要求30所述的方法,其中所述复合物包括选自半抗原、凝集素和脂质的至少一个可特异性结合分子。
36.根据权利要求1、4和25中任一项所述的方法,其中至少一个带标记探针包括荧光标记。
37.根据权利要求1、4和25中任一项所述的方法,其中至少一个带标记探针包括淬灭剂部分。
38.根据权利要求1、4和25中任一项所述的方法,其中至少一个带标记探针包括荧光团和淬灭剂部分。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述至少一个带标记探针是分子信标探针。
40.根据权利要求1、4和25中任一项所述的方法,其中多个RCA产物与全部包括同一标记的带标记探针杂交。
41.根据权利要求1、4和25中任一项所述的方法,其中多个RCA产物与包括两个或更多个不同标记的带标记探针杂交。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述两个或更多个不同标记包括两种或更多种不同荧光染料。
43.根据权利要求1、4和25中任一项所述的方法,其中所述检测或计数包括检测荧光。
44.根据权利要求43所述的方法,其中检测荧光包括荧光显微术。
45.根据权利要求1、4和25中任一项所述的方法,其中形成RCA产物包括在至少37℃,优选地至少42℃,优选地至少45℃下温育所述反应混合物。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述反应混合物包括PEG,优选至少2%到10%(w:v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。
47.根据权利要求4、17到19和25中任一项所述的方法,其中在所述检测或计数之前用包括去污剂的溶液来洗涤暴露于包括氧化石墨烯的溶液的所述固相载体或所述玻璃表面。
48.根据权利要求47所述的方法,其中所述去污剂包括吐温(Tween)20。
49.一种组合物,其包括硅烷化表面和反应混合物,所述硅烷化表面与各自包括与经环化核酸探针杂交的寡核苷酸引物的多个复合物结合,其中所述引物与固相载体结合,所述反应混合物包括
-每μL Phi29 DNA聚合酶至少0.2个单位,优选地每μL至少0.8个单位;
-缓冲液;
-至少400μM,优选地至少600μM,更优选地至少800μM总dNTP;
-PEG,优选至少2%到10%(w:v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。
50.根据权利要求49所述的组合物,其中所述PEG的平均分子量介于200 与8000之间,优选地介于200与1000之间,优选地介于400与800之间,优选地为600。
51.根据权利要求49所述的组合物,其中所述反应混合物进一步包括至少100nM分子信标探针,优选地至少1000nM分子信标探针。
52.根据权利要求49到51中任一项所述的组合物,其中所述引物以不规则分散的方式与所述固相载体结合。
53.根据权利要求49到51中任一项所述的组合物,其中所述引物呈可寻址阵列与所述固相载体结合。
54.根据权利要求49所述的组合物,其中所述引物与所述固相载体共价连接。
55.根据权利要求49所述的组合物,其中所述引物包括生物素部分并且所述固相载体包括亲和素,优选地链霉亲和素。
56.根据权利要求49所述的组合物,其中所述复合物包括与抗原或半抗原结合的抗体。
57.根据权利要求49所述的组合物,其中所述复合物包括与所述固相载体直接结合的抗原或半抗原。
58.根据权利要求57所述的组合物,其中所述抗原或半抗原与所述固相载体共价连接。
59.根据权利要求49所述的组合物,其中所述复合物包括至少一个多肽。
60.根据权利要求59所述的组合物,其中所述至少一个多肽包括抗体。
61.根据权利要求49所述的组合物,其中所述复合物包括选自半抗原、凝集素和脂质的至少一个可特异性结合分子。
62.一种组合物,其包括硅烷化表面和溶液,所述硅烷化表面与各自包括RCA产物的多个复合物结合,所述RCA产物包括多个经过杂交的带标记探针,所述溶液包括氧化石墨烯。
63.根据权利要求62所述的组合物,其中所述硅烷化表面是玻璃。
64.根据权利要求62所述的组合物,其中所述硅烷化表面包括用3-氨基丙基三乙氧基硅烷或甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯处理的表面。
65.根据权利要求62所述的组合物,其中所述包括氧化石墨烯的溶液进一步包括分子信标探针,优选地超过100nM分子信标探针,优选至少1000nM分子信标探针。
66.根据权利要求62所述的组合物,其中所述包括氧化石墨烯的溶液包括缓冲溶液,所述缓冲溶液包括MgCl2。
67.根据权利要求66所述的组合物,其中包括MgCl2的缓冲液是Phi29 DNA聚合酶缓冲液。
68.根据权利要求1到4中任一项所述的方法,其中所述固相载体包括测定板,优选地玻璃底测定板中的表面。
69.根据权利要求68所述的方法,其中所述测定板是多孔测定板,优选地微量滴定板。
70.根据权利要求1到3和68到69中任一项所述的方法,其中所述引物与所述固相载体直接结合,优选地与所述固相载体共价连接。
71.根据权利要求13和68到70中任一项所述的方法,其中所述引物包括生物素部分并且所述固相载体包括亲和素,优选地链霉亲和素。
72.权利要求1到4和68到71中任一项,其中一个或多个复合物包括与抗原或半抗原结合的抗体。
73.根据权利要求72所述的方法,其中所述复合物包括与所述固相载体直接结合的抗原或半抗原。
74.根据权利要求73所述的方法,其中所述抗原或半抗原与所述固相载体共价连接。
75.根据权利要求1到4和68到74中任一项所述的方法,其中形成所述复合物或所述多个复合物包括使所述固相载体暴露于包括拥挤剂的溶液。
76.根据权利要求75所述的方法,其中所述拥挤剂包括聚乙二醇(PEG),优选至少2%到10%(w:v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。
77.根据权利要求76所述的方法,其中所述PEG的平均分子量介于200与8000之间,优选地介于200与1000之间,优选地介于400与800之间,优选地为600。
78.根据权利要求1到3和68到77中任一项所述的方法,其包括使所述固相载体暴露于包括氧化石墨烯的溶液的步骤。
79.根据权利要求78所述的方法,其中在步骤b)iii)之前使所述固相载体暴露于氧化石墨烯。
80.根据权利要求78所述的方法,其中在步骤b)ii)之前使所述固相载体暴露于氧化石墨烯。
81.根据权利要求1到4和68到80中任一项所述的方法,其中一个或多个靶分子包括核酸。
82.根据权利要求81所述的方法,其中所述核酸包括来自受试者的样品,优选地血液或血液产物样品的DNA。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述DNA是来自血液或血液产物样品的游离DNA。
84.根据权利要求83所述的方法,其中所述游离DNA包括来自母体血液样品的胎儿DNA。
85.根据权利要求1到4和68到84中任一项所述的方法,其中形成RCA产物包括在反应混合物中使引物在经环化核酸探针上延伸,所述反应混合物包括:
-每μL Phi29 DNA聚合酶至少0.2个单位,优选地每μL至少0.8个单位;
-至少400μM,优选地至少600μM,更优选地至少800μM总dNTP。
86.根据权利要求85所述的方法,其中使带标记探针与所述RCA产物杂交包括在进一步包括超过100nM分子信标探针的反应混合物中形成所述RCA产物,优选地所述反应混合物中有至少1000nM分子信标探针。
87.根据权利要求85或86所述的方法,其中形成包括多个经过杂交的带标记探针的RCA产物包括在进一步包括超过100nM分子信标探针的反应混合物中形成所述RCA产物,优选地所述反应混合物中有至少1000nM分子信标探针。
88.根据权利要求85到87中任一项所述的方法,其中所述反应混合物进一步包括PEG,优选至少2%到10%(w:v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。
89.根据权利要求88所述的方法,其中所述PEG的平均分子量介于200与8000之间,优选地介于200与1000之间,优选地介于400与800之间,优选地为600。
90.根据权利要求1到4和68到89中任一项所述的方法,其中与带标记探针杂交的多个RCA产物以分散的方式固定在所述固相载体上,其中所述多个RCA产物中的至少一部分能够通过检测标记来单独地检测。
91.根据权利要求90所述的方法,其中RCA产物的所述分散是不规则的。
92.根据权利要求90所述的方法,其中RCA产物的所述分散呈可寻址阵列。
93.根据权利要求90到92中任一项所述的方法,其中所述复合物包括至少一个多肽。
94.根据权利要求93所述的方法,其中所述至少一个多肽包括抗体。
95.根据权利要求90到94中任一项所述的方法,其中所述复合物包括选自半抗原、凝集素和脂质的至少一个可特异性结合分子。
96.根据权利要求1到4和68到95中任一项所述的方法,其中至少一个带标记探针包括荧光标记。
97.根据权利要求1到4和68到96中任一项所述的方法,其中至少一个带标记探针包括淬灭剂部分。
98.根据权利要求1到4和68到97中任一项所述的方法,其中至少一个带标记探针包括荧光团和淬灭剂部分。
99.根据权利要求98所述的方法,其中所述至少一个带标记探针是分子信标探针。
100.根据权利要求1到4和68到99中任一项所述的方法,其中多个RCA产物与全部包括同一标记的带标记探针杂交。
101.根据权利要求1到4和68到100中任一项所述的方法,其中多个RCA产物与包括两个或更多个不同标记的带标记探针杂交。
102.根据权利要求101所述的方法,其中所述两个或更多个不同标记包括两种或更多种不同荧光染料。
103.根据权利要求1到4和68到102中任一项所述的方法,其中所述检测或计数包括检测荧光。
104.根据权利要求103所述的方法,其中检测荧光包括荧光显微术。
105.根据权利要求1到4和68到104中任一项所述的方法,其中形成RCA产物包括在至少37℃,优选地至少42℃,优选地至少45℃下温育所述反应混合物。
106.根据权利要求105所述的方法,其中所述反应混合物包括PEG,优选至少2%到10%(w:v),优选地至少12%,优选地至少14%,优选地至少16%,优选地至少18%到20%PEG。
107.根据权利要求78到106中任一项所述的方法,其中在所述检测或计数之前用包括去污剂的溶液来洗涤暴露于包括氧化石墨烯的溶液的所述固相载体或所述玻璃表面。
108.根据权利要求107所述的方法,其中所述去污剂包括吐温20。
109.根据权利要求49或权利要求50所述的组合物,其中所述反应混合物进一步包括至少100nM分子信标探针,优选地至少1000nM分子信标探针。
110.根据权利要求49和109中任一项所述的组合物,其中所述引物与所述固相载体共价连接。
111.根据权利要求49和109到110中任一项所述的组合物,其中所述引物包括生物素部分并且所述固相载体包括亲和素,优选地链霉亲和素。
112.根据权利要求49和109到111中任一项所述的组合物,其中所述复合物包括与抗原或半抗原结合的抗体。
113.根据权利要求49和109到112中任一项所述的组合物,其中所述复合物包括与所述固相载体直接结合的抗原或半抗原。
114.根据权利要求49和109到113中任一项所述的组合物,其中所述抗原或半抗原与所述固相载体共价连接。
115.根据权利要求49和109到114中任一项所述的组合物,其中所述复合物包括至少一个多肽。
116.根据权利要求49和109到115中任一项所述的组合物,其中所述至少一个多肽包括抗体。
117.根据权利要求49和109到116中任一项所述的组合物,其中所述复合物包括选自半抗原、凝集素和脂质的至少一个可特异性结合分子。
118.根据权利要求62或63所述的组合物,其中所述硅烷化表面包括用3-氨基丙基三乙氧基硅烷或甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯处理的表面。
119.根据权利要求62、63和118中任一项所述的组合物,其中所述包括氧化石墨烯的溶液进一步包括分子信标探针,优选地超过100nM分子信标探针,优选至少1000nM分子信标探针。
120.根据权利要求62到63和118到119所述的组合物,其中所述包括氧化石墨烯的溶液包括缓冲溶液,所述缓冲溶液包括MgCl2。
121.根据权利要求120所述的组合物,其中包括MgCl2的缓冲液是Phi29DNA聚合酶缓冲液。
122.根据权利要求1到48和68到108中任一项所述的方法,其包括出于诊断目的进行检测或计数。
123.根据权利要求123所述的方法,其中诊断目的包括检测非整倍性。
124.根据权利要求123所述的方法,其中在所述非整倍性中的是在母体血液样品中检测到的胎儿非整倍性。
125.根据权利要求123或124所述的方法,其中检测非整倍性包括对来自母体血液样品的cfDNA分子进行检测或计数。
126.根据权利要求125所述的方法,其中所述来自母体血液样品的cfDNA包括母体DNA和胎儿DNA。
127.根据权利要求126所述的方法,其中母体DNA和胎儿DNA由同一MIP探针在单个反应混合物中检测到。
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