BG64911B1 - Ген на streptomyces avermitilis насочващ съотношението b2:b1 авермектините - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до полинуклеотидни молекули, включващи нуклеотидни последователности, кодиращи аveC генен продукт, които молекули могат да сеизползват за промяна на съотношението или количеството на клас 2:1 авермектини, продуцирани от култури на S. avermitilis при ферментационния процес. Изобретението се отнася и до вектори, клетки гостоприемници и мутанти на S. avermitilis, в които aveC генът е бил активиран или мутирал, така че да сепромени съотношението или количеството на клас 2:1 на продуцираните авермектини.

Description

Настоящото изобретение се отнася до състави и методи за продуциране на авермектини, и най-вече се отнася до областта на здравеопазването на животните. По-специално, настоящото изобретение се отнася до полинуклеотидни молекули, включващи нуклеотидни последователности, кодиращи aveC генен продукт, който може да се използва за модулиране на съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани чрез ферментационен процес на култури от Streptomyces avermitilis, и до състави и методи за скриниране на подобни полинуклеотидни молекули. Настоящото изобретение се отнася също така, до вектори, трансформирани клетки гостоприемници, и до нови мутантни щамове на S. avermitilis, в които aveC генът е мутирал, така че да модулира съотношението на продуцираните клас 2:1 авермектини.

Предшестващо състояние на техниката

Авермектини

Видовете Streptomyces продуцират широко разнообразие от вторични метаболити, включително авермектини, което включва серия от осем свързани 16-членни макроциклени лактони, притежаващи силна противохелминтна и инсектицидна активност. Осемте отделни, но тясно свързани съединения се отбелязват като Ala, Alb, А2а, A2b,Bia,Bib,В2аиВ2Ь. Съединенията от серия “а” се отнасят до естествения авермектин, където заместителят при С25 позицията е (S)-sec-6ynui, а “Ь” серията се отнася до тези съединения, при които заместителят при С25 позицията е изопропил. Означенията “А” и “В” се отнасят до авермектини, при които заместителят при С25 позицията е метокси и хидрокси, съответно. Номерът “1” съответства на авермектини, при които присъства двойна връзка при позиция С22,23, а номерът “2” се отнася до авермектини, притежаващи водород при позиция С22 и хидроксилна група при позиция С23. Сред свързаните авермектини, В1 тип авермектин се раз познава като притежаващ най-ефективно антипаразитно и пестицидно действие, и следователно е търговски най-предпочитания авермектин.

Авермектините и тяхното продуциране чрез аеробна ферментация на щамове от S. avermitilis се описва в US 4,310,519 и US 4,429,042. Твърди се, че биосентезата на естествени авермектини се инициира ендогенно от СоА тиоестерни аналози на изобутировата киселина и S-(+)-2-Meтил бутировата киселина.

Комбинация от двете, подобрение на щама чрез случаен мутаганез и използване на екзогенно доставени мастни киселини е довело до ефикасното производство на аналози на авермектин. Мутанти на S. avermitilis, на които липсва 2-оксо кисела дехидрогеназа с разклонена верига (мутанти с bkd недостатъчност) могат да продуцират авермектини единствено когато в процеса на ферментацията се добавят мастни киселини. Скринирането и изолирането на мутанти с дефицит на активност на 2-оксо кисела дехидрогеназа с разклонена верига (например, S. avermitilis АТСС 53567) са описани в ЕР 276103. Ферментацията на такива мутанти в присъствие на екзогенно доставени мастни киселини води до продуциране единствено на четирите авермектина, съответстващи на използваните мастни киселини. Следователно, подхранването на ферментацията на S. avermitilis (АТСС 53567) с S(+)-2-метилбутирова киселина води до продуциране на естествените авермектини Ala, А2а, Bl а и В2а; добавянето към ферментацията на изобутирова киселина води до продуциране на естествени авермектини Alb, A2b, В1 а и В2Ь; а добавянето към ферментациите на циклопентанкарбоксилна киселина води до продуцирането на четирите нови цикропентилавермектини А1, А2, В1 иВ2.

При добавяне на други мастни киселини се продуцират нови авермектини. Чрез скриниране на над 80 потенциални предшественика са идентифицирани над 60 други нови авермектини (виж например Dutton et al., 1991, J. Antibiot. 44: 357-36/; и Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Освен това, мутантите на S. avermitilis c дефицитна 5-О-метилтрансферазна активност основно продуцират единствено В аналог авермектини. Следователно, мутантите на S. avermitilis, при които липсват и двете, активност на 2-оксо кисела дехидрогеназа и 5-О-метилтрансферазна активност, продуцират единствено В авермектини, съответстващи на използваната мастна киселина за добавка към ферментацията. Така, подхранването на такива двойни мутанти с S-(+)2-метил бутирова киселина води до продуциране единствено на естествените авермектини В1 а и В2а, докато добавянето на изобутирова киселина или на циклопентанкарбоксилна киселина води до продуциране на естествени авермектини В lb и В2Ь или на новите циклопентил В1 и В2 авермектини, съответно. Прибавянето към двойно мутантния щам на циклохексан карбоксилна киселина е предпочитан метод за продуциране на важния за търговията нов авермектин, циклохексилавермектин Bl (doramectin). Изолирането и охарактеризирането на такива двойни мутанти, например S. avermitilis (АТСС 53692) е описано в ЕР 276103.

Гени, включени в биосентезата на авермектин

При много случаи, гени включени в продуцирането на вторични метаболити и гени, кодиращи определен антибиотик са открити пакетирани (clustered) заедно върху хромозомата. Такъв е случая при, например, поликетид синтетазния ген (PKS) от Streptomyces (виж Hopwood and Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37-66). Така една стратегия за клониране на гени по биосинтетичен път е била да се изолира ген за резистентност на лекарства и след това да се тестват прилежащите области на хромозомата за други гени, свързани с биосинтезата на този определен антибиотик. Друга стратегия за клониране на гени, включена в биосинтезата на важни метаболити е била комплементацията на мутанти. Например, участъци от ДНК библиотека от организъм способен да продуцира определен метаболит са въведени в непродуциращ мутант и трансформантите са скринирани за продукция на метаболита. Според това, хибридизирането на библиотека при използване на проби произлезли от други видове Streptomyces са използвани за идентифициране и клониране на гени в биосинтетичните пътища.

Гените, включени в биосинтезата на авермектин (ave гените), подобно на гените, необходими за биосинтезата на други вторични метаболити от Streptomyces (например, PKS) са открити пакетирани върху хромозомата. Голям брой гени успешно са били клонирани при из ползване на вектори да комплементират мутанти на S. avermitilis блокирани в биосинтезата на авермектин. Клонирането на такива гени е описано в US 5,252,474. Освен това, Ikeda et al., 1995, J. Antibiot. 48:582-534, описва локализацията на хромозомалната област, включваща С22,23 етапа на дехидратиране (aveC) към 4,82 kb BamHI фрагмент на S. avermitilis, така както и мутации в aveC гена, които водят до продуциране на една единствена съставка на В2а продусера. Тъй като ивермекгинът, силно антихелминтно съединение, може да се продуцира химически от авермектин В2а, такъв еднокомпонентен продусер на авермектин В2а се разглежда като изключително полезно за търговско производство на ивермекгин.

Идентифицирането на мутации в aveC гена, които опростяват сложността на продуциране на авермектин, като например, мутации, които намаляват съотношението на В2:В 1 авермектини, биха улеснили производството и пречистването на търговско значимите авермектини.

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, включваща пълната aveC ORF на S. avermitilis или негов съществен участък, чиято изолирана полинуклеотидна молекула е с липса на следващата пълна ORF, която е локализирана в посока downstream от aveC ORF in situ в хромозомата на S. avermitilis. Изолираната полинуклеотидна молекула на настоящото изобретение, за предпочитане включва нуклеотидна последователност, която е същата като aveC или е същата като нуклеотидната последователност на aveC ORF от фигура 1 (SEQ ID N0:1) или негова съществена част.

Настоящото изобретение предоставя също така полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на продукт-кодиращата последователност на aveC гена на S. avermitilis на плазмид pSE 186 (АТСС 209604), или на нуклеотидната последователност на aveC ORF представена на фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или на нейна съществена част.

Настоящото изобретение предоставя също полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, притежаващ аминокиселинна последовател3 ност, която е хомоложна на аминокиселинната последователност на продукт-кодиращата последователност на aveC гена на S. avermitilis на плазмид pSE 186 (АТСС 209604), или на аминокиселинната последователност от фигура 1 (SEQ ID NO: 2) или на нейна съществена част.

Настоящото изобретение предоставя също така, изолирана полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща генен продукт на aveC хомолог. В един предпочитан вариант за изпълнение, на настоящото изобретение, изолираната полинуклеотидна молекула включва нуклеотидна последователност, кодираща генен продукт на aveC хомолог от S. hygroscopicus, който хомоложен генен продукт включва аминокиселинната последователност на (SEQ ID N0:4) или на нейна съществена част. В един предпочитан вариант за изпълнение, изолираната полинуклеотидна молекула от настоящото изобретение, която кодира продукта на хомоложния aveC ген на S. hygroscopicus включва нуклеотидната последователност от SEQ ID N0:3 или нейна съществена част.

Настоящото изобретение предоставя също полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нуклеотидната последователност от SEQ ID N0: 3 на S. hygroscopicus. Настоящото изобретение предоставя освен това, и полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, който е хомоложен на генния продукт на гена на aveC хомолога на S. hygroscopicus, притежаващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 4.

Настоящото изобретение предоставя освен това олигонуклеотиди, които хибридизират към полинуклеотидна молекула, която притежава нуклеотидната последователност от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или SEQ ID N0: 3, или към полинуклеотидна молекула, която притежава нуклеотидна последователност, която е комплементарна на нуклеотидната последователност от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или SEQ ID N0: 3.

Настоящото изобретение предоставя също така, рекомбинантни вектори за клониране и експресионни вектори, които се използват при клониране или при експресия на полинуклеотида на настоящото изобретение, включително полинуклеотидни молекули, включващи aveC ORF на S. avermitilis или ORF на aveC хомолог. При един неограничаващ вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя плазмид pSE186 (АТСС 209604), който включва пълна ORF на aveC гена на S. avermitilis. Настоящото изобретение предоставя също трансформирани клетки гостоприемници, включващи полинуклеотидна молекула или рекомбинантен вектор на изобретението, нови щамове или клетъчни линии произлезли от тях.

Настоящото изобретение предоставя също така, рекомбинантно експресиран aveC генен продукт или генен продукт на aveC хомолог, или тяхна съществена част, която е пречистена по същество или изолирана, както и техни хомолози. Настоящото изобретение предоставя също така метод за продуциране на рекомбинантен aveC генен продукт, включващ култивиране на клетка гостоприемник, трансформирана с рекомбинантен експресионен вектор, като посоченият рекомбинантен експресионен вектор включва полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност кодираща aveC генен продукт, която полинуклеотидна молекула е в оперативна връзка с един или повече регулаторни елементи, които контролират експресията на полинуклеотидната молекула в клетката гостоприемник, при условия, водещи до продуциране на рекомбинантния aveC генен продукт или на генен продукт на aveC хомолог, и получаване от клетъчна култура на aveC генен продукт или на генен продукт на aveC хомолог.

Настоящото изобретение предоставя също така полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която иначе е същата като кодиращата последователност на aveC генния продукт на S. avermitilis на плазмид pSE (АТСС 209604) или като нуклеотидната последователност на aveC ORF на S. avermitilis, както е представена на фигура 1 (SEQ ID NO: 1), но която включва освен това една или повече мутации, така че клетките на S. avermitilis щам АТСС 53692, в който е инактивиран aveC алела от див тип, и който експресира полинуклеотидната молекула, включваща мутиралата нуклеотидна последователност продуцира друго съотношение или количество авермектини спрямо продуцираните от клетките на S. avermitilis щам АТСС 53692, които вместо това експресират единствено aveC алела от див тип. Съгласно настоящото изобретение, такива полинуклеотидни молекули могат да се използват за получаване на нови щамове S. avermitilis, които проявяват значима промяна в продуцирането на авермектин, при сравнение със същия щам, който вместо това експресира единствено aveC алела от див тип. При един предпочитан вариант за изпълнение, такива полинуклеотидни молекули се използват за получаване на щамове на S. avermitilis, които продуцират авермектини при намалено сътношение на клас 2:1 авермектини, в сравнение с тези от същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алела от див тип. При един друг предпочитан вариант за изпълнение, такива полинуклеотидни молекули се използват за получаване на нови щамове S. avermitilis, които продуцират повишени нива на авермектини, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира единствено aveC апела от див тип. В друг предпочитан вариант за изпълнение, се използват такива полинуклеотидни молекули за получаване на нови щамове на S. avermitilis, в които aveC генът е бил инактивиран.

Настоящото изобретение предоставя методи за идентифицираме на мутации на aveC ORF на S. avermitilis, способни да променят съотношението и/или количеството на продуцирания авермектин. В един предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за идентифициране на мутации на aveC ORF, способни да променят съотношението на клас 2:1 на продуцираните авермектини, включващ: (а) определяне на съотношението на клас 2:1 на авермектини продуцирани от клетки от щам на S. avermitilis, в които е инактивиран нативния aveC алел, и в които е въведена и се експресира полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност кодираща мутирал aveC генен продукт; (Ь) определяне на съотношението на клас 2:1 на продуцирани авермектини от клетки на същия щам S. avermitilis, както в етап (а), но които вместо това експресират единствено aveC алел, притежаващ нуклеотидна последователност на ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нея; и (с) сравняване на съотношението на клас 2:1 на авермектини продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (а) със съотношението на клас 2:1 на авермектини продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (Ь); така че ако клас 2:1 съотношението на продуцираните авермектини от клетките на S. avermitilis от етап (а) е различно от съотношението на клас 2:1 авермектини продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (Ь), тогава се идентифицира мутация на aveC ORF, способна да промени съотношението на клас 2:1 авермектини. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, клас 2:1 съотношението на авермектини се редуцира от мутацията.

При друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за идентифициране на мутации на aveC ORF или генетични структури, включващи aveC ORF, способни да променят количеството на продуцирани авермектини, който включва: (а) определяне на количеството авермектини продуцирани от клетки от щам на S. avermitilis, в който е инактивиран нативния aveC алел, и в които е въведена и се експресира полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност кодираща мутирал aveC генен продукт или включващи генетични структури, съдържащи нуклеотидна последователност, съдържаща aveC генен продукт; (Ь) определяне количеството на продуцирани авермектини от клетки на същия щам S. avermitilis, както в етап (а), но които вместо това експресират единствено aveC алел, притежаващ нуклеотидната последователност на ORF от фигура 1 (SEQ ID N0:1) или нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нея; и (с) сравняване на количеството на авермектини продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (а) с количеството на авермектини продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (Ь); така че количеството на продуцираните авермектини от клетките на S. avermitilis от етап (а) е различно от количеството авермектини продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (Ь), тогава се идентифицира мутация на aveC ORF или генетична структура способна да промени количеството на авермектини. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, количеството на продуцирани авермектини се увеличава чрез мутацията.

Настоящото изобретение предоставя освен това рекомбинантни вектори, които се използват за получаване на нови щамове S. avermitilis, притежаващи променена продукция на авермектин. Например, настоящото изобретение предоставя вектори, които могат да се използват като ми шени на която и да е от полинуклеотидните молекули, включващи мутиралите нуклеотидни последователности на настоящото изобретение, към сайта на aveC гена на хромозомата на S. avermitilis или за инсериране или за замяна на aveC ORF или на негова част с хомоложно рекомбиниране. Съгласно настоящото изобретение, въпреки това, полинуклеотидната молекула, включваща мутирала нуклеотидна последователност на настоящото изобретение, предоставено в настоящото, може също така да функционира за модулиране на биосинтезата на авермектин, когато се инсерира в хромозомата на S. avermitilis в сайт различен от този за aveC гена, или когато се поддържа епизомално в клетките на S. avermitilis. Така, настоящото изобретение предоставя също така, вектори, включващи полинуклеотидна молекула, съдържаща мутирала нуклеотидна последователност от настоящото изобретение, които вектори могат да се използват за инсериране на полинуклеотидната молекула в сайт на хромозомата на S. avermitilis, различен от сайта на aveC гена, или за да се поддържа епизомално. В един предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя вектори за заместване на гени, които могат да се използват за инсериране на мутирал aveC алел в хромозомата на S. avermitilis, за получаване на нов щам клетки, които продуцират авермектини в намалено съотношение на класа 2:1, в сравнение с клетките от същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип.

Настоящото изобретение предоставя също така методи за получаване на нови щамове на S. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел, и които продуцират променено съотношение и/или количества авермектини, в сравнение с клетки от същия щам S. avermitilis, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип. В един предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове на S. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел, и които продуцират променено съотношение на клас 2:1 авермектини, в сравнение със същия щам S. avermitilis, който вместо това експресира единствено aveC алел от див тип, включващи трансформиране на клетки от щам на S. avermitilis с вектор пренасящ мутирал aveC алел, който кодира генен продукт, който променя съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки от щам на S. avermitilis, който експресира мутиралия алел, в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип, и селекциониране на трансформирани клетки, които продуцират авермектини при едно променено съотношение на клас 2:1 авермектини в сравнение със съотношение на клас 2:1 продуцирано от клетки от щама, който вместо това експресира aveC алел от див тип. В един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, съотношението на клас 2:1 продуцирани авермектини се намалява в клетки на новия щам.

В друг предпочитан вариант на изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове на S. avermitilis, включващи клетки, които продуцират променени количества авермектин, включващи трансформиране на клетки от щам S. avermitilis с вектор, който пренася мутирал aveC алел или генетична структура, включваща aveC алел, експресията на който води до променено количество на авермектини продуцирани от клетки от щам на S. avermitilis, които експресират мутиралия aveC алел или генетична структура, при сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип, и селекциониране на трансформирани клетки, които продуцират авермектини при променено количество, при сравнение с количеството авермектини продуцирани от клетки от щам, който вместо това експресира единствено aveC алел от див тип. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, количеството продуцирани авермектини нараства при клетки от новия щам.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове от S. avermitilis, клетките на които включват инактивиран aveC алел, включващ трансформиране на клетки от щам на S. avermitilis, които експресират aveC алел от див тип с вектор, който инактивира aveC алела, и селекциониране на трансформираните клетки, в които е бил инактивиран aveC алела.

Настоящото изобретение предоставя също така нови щамове от S. avermitilis, включващи клетки, които са били трансформирани с която и да е от полинуклеотидните молекули или вектори, включващи мутирала нуклеотидна последователност от настоящото изобретение. При един предпочитан вариант на изпълнение, настоящото изобретение предоставя щамове на S. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел вместо, или в допълнение на aveC алела от див тип, като клетките на новия щам продуцират авермектини при едно променено съотношение на клас 2:1 в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип. При един по-предпочитан вариант за изпълнение на изобретението клетките от новия щам продуцират авермектин в намалено съотношение на клас 2:1 в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип. Такива нови щамове са полезни при продуцирането в големи мащаби на подходящите за търговската мрежа авермектини и дорамектин.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя нови щамове на S. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел или генетична структура, включваща aveC алел, вместо или в допълнение на aveC алел от див тип, което води до продуциране от клетките на променено количество на авермектини, в сравнение с количеството авермектини продуцирани от клетки от същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип. В предпочитания вариант за изпълнение, новите клетки продуцират повишено количество на авермектини.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя нови щамове на S. avermitilis, включващи клетки, в които aveC генът е бил инактивиран. Такива щамове са полезни както за различните спектри авермектини, които те продуцират, в сравнение с щама от див тип, така и за комплементарното скрининг изследване, както се описва в настоящото, за да се определи дали целенасоченият или случайният мутагенез на aveC гена засяга продуцирането на авермектин.

Настоящото изобретение предоставя, освен това, метод за получаване на авермектини, включващ култивиране на клетки от щам на S. avermitilis, които клетки експресират мутирал aveC алел, който кодира генен продукт, който променя съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на S. avermitilis, експресиращи мутиралия aveC алел, в сравнение с клетки на същия щам, които не експресират мутиралия aveC алел, а вместо това експресират единствено aveC алел от див тип, в културална среда при условия, позволяващи или индуциращи продуцирането на авермектини от него, и получаване на авермектини от културата. В един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението се намалява съотношението на клас 2:1 авермектини продуцирани от клетки експресиращи мутацията. Методът предоставя повишена ефикасност при продуцирането на авермектини с търговска стойност, като дорамектин.

Настоящото изобретение предоставя освен това, метод за получаване на авермектини, който включва култивиране на клетки от щам на S. avermitilis, които клетки експресират мутирал aveC алел или генетична структура, включваща aveC алел, който води до продуциране на променено количество авермектини, продуцирани от клетки на щам S. avermitilis, експресиращи мутиралия aveC алел или генетична структура, в сравнение с клетки на същия щам, които не експресират мутиралия aveC алел или генетична структура, а вместо това експресират единствено aveC алел от див тип, в културална среда, при условия, които позволяват или индуцират продуцирането на авермектини от тях, и получаване на посочените авермектини от културата. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението се повишава количеството на авермектини продуцирани от клетките експресиращи мутацията или генетичната структура.

Настоящото изобретение предоставя, освен това, нов състав на авермектини, редуциран от щам на S. avermitilis експресиращ мутирал aveC алел от настоящото изобретение, при който авермектините се продуцират при намалено съотношение на клас 2:1, при сравнение със съотношението на клас 2:1 на авермектини продуцирани от клетки на същия щам на S. avermitilis, който не експресира мутиралия aveC алел, а вместо това експресира единствено aveC алел от див тип. Новият състав на авермектини може да присъства под формата на продуциран във ферментационната културална среда или може да се извлече от нея и може да бъде частично или цялостно пречистен от средата.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1. ДНК последователност (SEQ ID NO: 1), включваща aveC ORF на S. avermitilis и изведената аминокиселинна последователност (SEQ ID NO: 2).

Фигура 2. Плазмиден вектор pSEl 86 (АТСС 209604), включващ пълната ORF на aveC гена на S. avermitilis.

Фигура 3. Вектор pSE180 (АТСС 209605) за замяна на ген, включващ еппЕ гена на Sacc. erythraea в aveC ORF на S. avermitilis.

Фигура 4. BamHI рестрикционна карта на авермектин поликетид синтетазния генен клъстер на S. avermitilis с пет идентифицирани препокриващи се козмидни клонове (т.е. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69. Взаимосъотношението HapSE118HpSE119 също е посочено.

Фигура 5. ВЕТХ анализ на ферментационни продукти продуцирани от щамове S. avermitilis. Пикови количества се получават чрез сравнение на стандартни количества циклохексил В1. Времето за задържане на циклохексил В2 е 7,4-7,7 min; времето за задържане на циклохексил В1 е 11,9 - 12,3 min.

Фигура 5А. S. avermitilis щам SE180-11 с инактивирана aveC ORF.

Фигура 5В. S. avermitilis щам SE180-11 трансформиран с pSE186 (АТСС 209604).

Фигура 5С. S. avermitilis щам pSEl80-11 трансформиран с pSE187.

Фигура 5D. S. avermitilis щам SE180-11 трансформиран с pSEI88.

Фигура 6. Сравнение на изведените аминокиселинни последователности кодиращи aveC ORF на S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), aveC хомолог частична ORF на S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4). Валиновиятостатък c дебели букви е предполагаемия стартов сайт за протеина. Запазените остатъци са показани с главни букви за хомоложност във всичките три последователности, а в долните полета са букви за хомоложност в две от трите последователности. Аминокиселинните последователности имат приблизително 50% идентичност на последователностите.

Фигура 7. Хибридна плазмидна структура, съдържаща 564 bp BsaAI/Kpnl сайт в aveC ORF на S. avermitilis.

Подробно описание на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до идентифицирането и охарактеризирането на полинуклеотидни молекули, притежаващи нуклеотидни последователности кодиращи AveC генен продукт от Streptomyces avermitilis, конструирането на нови щамове от S. avermitilis, които могат да се използват за скриниране на мутирали AveC генни продукти за тяхното действие върху продукцията на авермектини, и до откритието, че някои мутирали AveC генни продукти могат да намаляват съотношението на В2: В1 авермектини продуцирани от S. avermitilis. Като пример, изобретението се описва в разделите по-долу, за полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е същата като AveC продукт-кодиращата последователност на плазмид pSEl 86 (АТСС 209604} на S. avermitilis, или нуклеотидната последователност на ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) и полинуклеотидни молекули, притежаващи мутирали нуклеотидни последователности, произлизащи от тях. Все пак, постановените принципи в настоящото изобретение могат аналогично да се приложат на други полинуклеотидни молекули, включително aveC хомоложни гени от видовете на Streptomyces, включително, например, S. hygroscopicus и S. griseochromogenes, измежду други.

Полинуклеотидни молекули кодиращи AveC генен продукт на S. avermitilis

Настоящото изобретение предоставя изолирани полинуклеотидни молекули, включващи пълната aveC ORF на S. avermitilis или негова съществена част, на която изолирана полинуклеотидна молекула й липсва следващата пълна ORF, която е разположена в посока downstream от aveC ORF in situ в хромозомата на S. avermitilis.

Изолираната полинуклеотидна молекула на настоящото изобретение за предпочитане включва нуклеотидна последователност, която е същата като AveC генната продукт-кодираща последователност на S. avermitilis на плазмид pSE 186 (АТСС 209604) или която е същата като нуклеотидната последователност на ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или нейна съществена част. Както се използва в настоящото, “съществена часτ’’ от една изолирана полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност кодиращата AveC генен продукт на S. avermitilis, означава изолирана полинуклеотидна молекула, включваща поне приблизително 70% от пълната ORF aveC последователност, показана на фигура 1 (SEQ ID N0:1), и която кодира функционално еквивалентен AveC генен продукт. В това съотношение, “функционално еквивалентен” AveC генен продукт се дефинира като генен продукт, който, когато се експресира в S. avermitilis щам АТСС 53692, в който нативния aveC алел е бил инактивиран, води до продуциране на същото по същество съотношение и количество на авермектини, като продуцираните от S. avermitilis щам АТСС 53692, който вместо това експресира единствено дивия тип функционален aveC алел нативен за S. avermitilis щам АТСС 53692.

Освен нуклеотидните последователности на aveC ORF, изолираната нуклеотидна молекула от настоящото изобретение може да включва също така, нуклеотидни последователности, които естествено ограничават aveC гена in situ в S. avermitilis, като тези граничещи нуклеотидни последователности показани на фигура 1 (SEQ ID N0:1).

Както се използва в настоящото, “полинуклеотидна молекула”, “полинуклеотидна последователност”, “кодираща последователност”, “отворена рамка за разчитане”, и “ORF” се отнасят към двете, ДНК и РНК молекулите, които могат да са или едноверижни или двуверижни, и които могат да се транскрибират и транслират (ДНК), или да се транслират (РНК) в AveC генен продукт или, както е описано по-долу в хомолог на AveC генен продукт, или в полипептид, който е хомоложен на AveC генен продукт или на хомоложен AveC генен продукт в подходяща клетка гостоприемник, когато се постави под контрола на подходящи регулаторни елементи. Кодиращата последователност може да включва, но без да се ограничава до, прокариотни последователности, сДНК последователности, геномни ДНК последователности и химично синтезирани ДНК и РНК последователности.

Нуклеотидната последователност показана на фигура 1 (SEQ ID N0:1) включва четири различни GTG кодона при Ьр позиции 42, 174, 177 и 180. Както е описано в раздел 9 по-долу, конструират се многобройни делеции на 5' областта на aveC ORF фигура 1 (SEQ ID N0:1), за да се подпомогне определянето кои от тези кодони биха могли да действат в aveC ORF като стартови сайтове за експресия на протеина. Деления в първия GTG сайт при Ьр 42 не премахва aveC активността. Допълнителна деления на всички GTG кодони заедно при Ьр позициите 174,177 и 180 отстранява AveC активността, което показва, че тази област е необходима за експресията на протеина. Настоящото изобретение обхваща, по този начин, различни дължини на aveC ORF, които първоначално инициират транслацията на който и да е от GTG сайтовете, локализирани при bp 174,177 и 180 Ьр, както е представено на фигура 1 (SEQ ID NO: 1) и съответните полипептиди за всеки.

Настоящото изобретение предоставя освен това, полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност хомоложна на AveC генен продукг-кодираща последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604) или на нуклеотидната последователнст на aveC ORF, представено на фигура 1 (SEQ ID N0:1) или на негова съществена част. Когато термина “хомоложен” се използва да се отнася до полинуклеотидна молекула, която е хомоложна на AveC генен продукг-кодираща последователност на S. avermitilis, тогава той означава полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност: (а) която кодира същия AveC генен продукт като AveC генен продукг-кодиращата последователност на S. avermitilis HapSE186 (АТСС 209604), или който кодира същия AveC генен продукт като нуклеотидната последователност на AveC ORF, представена на фигура 1 (SEQ ID N0:1), но която показва една или повече сайлънт промени на нуклеотидната последователност, в съответствие на разпада на генетичния код; или (б) която хибридизира към комплемента на полинуклеотидната молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която кодира аминокиселинната последователност, кодирана от AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или която кодира аминокиселинната последователност показана на фигура 1 (SEQ ID N0:2), при средно строги условия, т.е., хибридизиране към свързана-с-филтьр ДНК в 0,5 М NaHPO₄, 7% натриев додецил сулфат (SDS), 1 mM EDTA при 65°С, и промиване в 0,2 х SSC/0,1% SDS при 42°С (виж Ausubel et al., (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p.

2.10.3), и кодира функционално еквивалентен AveC генен продукт, както е дефинирано по-горе. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, хомоложната полинуклеотидна молекула хибридизира към комплемента на AveC генен продукт-кодиращата нуклеотидна последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или комплемента на нуклеотидната последователност показана на фигура 1 (SEC ID N0:1) или на нейна съществена част, при много строги условия, т.е., хибридизиране към свързана-с-филтър ДНК в 0,5 М NaHPO₄, 7% натриев додецилсулфат (SDS), 1 mM EDTA при 65°С, и промиване в 0,1 х SSC/0,1% SDS при 68°С (виж Ausubel et al., 1989, по-горе) и кодира функционално еквивалентен AveC генен продукт, както е дефиниран по-горе.

Активността на AveC гснния продукт и на неговите потенциални функционални еквивалента може да се определи чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти, както е описано в примерите по-долу. Полинуклеотидните молекули, притежаващи нуклеотидни последователности, които кодират функционални еквиваленти на AveC генния продукт на S. avermitilis включват естествено срещани в природата aveC гени, присъстващи в други щамове на S. avermitilis, aveC хомоложни гени, присъстващи в други видове на Streptomyces, и мутирали aveC алели, както естествено срещаните в природата, така и генноинженерно получени.

Настоящото изобретение предоставя освен това, полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, притежаващ аминокиселинна последователност хомоложна на аминокиселинната последователност кодирана от AveC генен продукт-кодираща нуклеотидна последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или на аминокиселинната последователност от фигура 1 (SEQ ID N0:2} или на нейна съществена част. Както се използва в настоящото, “съществена част” от аминокиселинната последователност от фигура 1 (SEQ ID N0:2) означава полипептид, съдържащ поне 70% от аминокиселинната последователност от фигура 1 (SEQ ID NO: 2), и който съставя функционално еквивалентен AveC генен продукт, както е дефинирано по-горе.

Както се използва в настоящото, за да се означат аминокиселинните последователности хомоложни на аминокиселинната последователност на AveC генен продукт от S. avermitilis терминът “хомол ожен” се отнася до полипептид кодиран от AveC ген продукт-кодиращата нуклеотидна последователност на плазмид pSEl 86 (АТСС 209604) или: притежаващ аминокиселинна последователност от фигура 1 (SEQ ID N0:2), но в която един или повече аминокиселинни остатъци са били консервативно заместени с различни аминокиселинни остатъци, когато такива консервативни замествания водят до функционално еквивалентен генен продукт, както дефинирания по-горе. Консервативни аминокиселинни замествания са добре известни от предшестващото състояние на техниката. Правилата за осъществяване на такива замествания включват описаните от Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3, измежду други такива. По-специално, консервативните аминокиселинни замествания са тези, които обикновено се състоят вътре в едно семейство аминокиселини, които са свързани по киселинност, полярност или обемността на техните странични вериги. Генетично кодираните аминокиселини обикновено се разделят на четири групи: (1) кисели = аспартат, глутамат; (2) основни = лизин, аргинин, хистидин; (3) неполярни = аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) полярни незаредени - глицин, аспаргин, глутамаг, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин се класифицират също като ароматни аминокиселини. Едно или повече замествания вътре в една определена група, например на левцина с изолевцин или валин, или на аспартат с глутамат, или на треонин със серин, или на който и да е друг аминокиселинен остатък със структурно свързан аминокиселинен остатък, например аминокиселинен остатък с подобна активност, полярност, обемност, или с подобност на някои негови комбинации, би имал незначителен ефект върху функцията на полипептида.

Настоящото изобретение предоставя също така, изолирана полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща хомоложен AveC генен продукт. Както се използва в настоящото, “хомоложен AveC генен продукт” се дефинира като генен продукт, притежаващ поне 50% идентичност на аминоки селинната последователност с един AveC генен продукт на S. avermitilis, включващ аминокиселинната последователност кодирана от AveC генен продукт-кодиращата нуклеотидна последователност на плазмид pSEl86 (АТСС 209604), или от аминокиселинната последователност показана на фигура 1 (SEQ ID N0:2). При един неограничаващ вариант за изпълнение на изобретението, хомоложен AveC генен продукт е от S. hygroscopicus (описан в ЕР заявка 0298423; депозит FFRM ВР-1901) и включва аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:4, или негова съществена част. “Съществена чест” от аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4 означава полипептид, включващ най-малко 70% от аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 4, и който съставя функционално еквивалентен хомолог на AveC генен продукт. “Функционално еквивалентен” хомолог на AveC генен продукт се дефинира като генен продукт, който, когато се експресира в S. hygroscopicus щам FFRM ВР-1901, в който е инактивиран хомолога на нативния AveC алел, това води до продуциране на по същество същото съотношение и количество на милбемицини, както продуцираните от S. hygroscopicus щам FERN ВР-1901, който експресира вместо това единствено див тип, функционален хомолог на AveC алел нативен за S. hygroscopicus щам FERM ВР-1901. При един неограничаващ вариант за изпълнение на изобретението, изолираната полинуклеотидна молекула от настоящото изобретение, която кодира S. hygroscopicus хомолог на AveC генен продукт включва нуклеотидната последователност от SEQ ID N0:3 или на негова съществена част. В този смисъл, “съществена част” от изолираната полинуклетидна молекула, включваща нуклеотидна последователност на SEQ ID N0:3 означава изолирана полинуклеотидна молекула, включваща най-малко 70% изолираната полинуклеотидна молекула от SEQ ID N0: 3 и която кодира функционално еквивалентен хомолог на AveC генен продукт, както е дефиниран непосредствено по-горе.

Настоящото изобретение предоставя освен това полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нуклеотидната последователност на S. hygroscopicus от SEQ ID N0: 3. Терминът “хомоложен”, когато се използва за полинуклео тидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на AveC хомоложен генен продукт-кодираща последователност на S. hygroscopicus от SEQ ID N0: 3 означава полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност: (а) която кодира същия генен продукт като нуклеотидната последователност от SEQ ID N0: 3 или на негова съществена част, но която включва една или повече сайлънт промени на нуклеотидната последователност, в съответствие с разпада на генетичния код; (б) която хибридизира към комплемента на полинуклеотидната молекула притежаваща нуклеотидна последователност, която кодира аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 4, при средно строги условия, т.е. хибридизиране към свързана-с-филтър ДНК в 0,5 М NaHPO₄, 7% натриев додецил сулфат (SDS), 1 mM EDTA при 65 °C, и промиване в 2 х SSC/ 0,1 % SDS при 42°С (виж Ausubel et al., по-горе), и кодира функционално еквивалентен хомолог на AveC генен продукт, както е дефинирано по-горе. При един предпочитан вариант за изпълнение на настоящото изобретение, хомоложната полинуклеотидна молекула хибридизира към комплемента на хомоложната AveC генен продукт-кодираща нуклеотидна последователност от SEQ ID N0: 3 или на негова съществена част, при много строги условия, т.е., хибридизиране към свързана-с-филтър ДНК в 0,5 М NaHPO₄, 7% натриев додецил сулфат (SDS), 1 mM EDTA при 65°С, и промиване в 2 х 0,1 SSC/0,1% SDS при 68°С (виж Ausubel et al., 1989, по-горе) и кодира функционално еквивалентен AveC хомоложен генен продукт, както е дефинирано погоре.

Настоящото изобретение предоставя също така, полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, който е хомоложен на AveC хомоложен генен продукт на S. hygroscopicus. Както се използва в настоящото, че се отнася до полипептиди, които са хомоложни на AveC хомоложен генен продукт от SEQ ID N0: 4 на S. hygroscopicus, терминът “хомоложен” означава полипептид притежаващ аминокиселинна последователност от SEQ ID N0:4, но в която един или повече аминокиселинни остатъци са били консервативно заместени и различни аминокиселинни остатъци, като такива консервативни за мествания водят до функционално еквивалентен AveC хомоложен генен продукт, както е дефинирано по-горе.

Настоящото изобретение предоставя освен това, олигонуклеотиди, които хибридизират към полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или към SEQ ID NO: 3 или към полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е комплемент на нуклеотидна последователност от фигура 1 (SEQID NO: 1) или SEQ ID N0: 3. Такива олигонуклеотиди са най-малкото с дължина 10 нуклеотида, и за предпочитане от 15 до 30 нуклеотида дължина, и хибридизират към една от горепосочените полинуклеотидни молекули при много строги условия, т.е., промиване в 6 х SSC/0,5% натриев пирофасфат при ~37°С за ~14-базови олиго, при ~48°С за ~17-базови олиго, при ~55°С за 20-базови олиго, и ~60°С за 23-базови олиго. При един вариант за изпълнение на изобретението, олигонуклеотидите са комплемснтарни на част от една от гореспоменатите молекули. Тези олигонуклеотиди се използват за многообразни цели, включително да кодират или да действат като антисенс .молекули, полезни при генното регулиране, или като праймери при амплифициране на aveC или AveC хомоложните генен продукг-кодиращи полинуклеотидни молекули.

Допълнителни AveC хомоложни гени могат да се идентифицират в други видове или щамове на Streptomyces чрез използване на полинуклеотидните молекули или олигонуклеотиди, описани в настоящото, заедно с други известни техники. Например, олигонуклеотидна молекула включваща част от нуклеотидната последователност на S. avermitilis от фигура 1 (SEQ ID N0:1) или част от нуклеотидната последователност на S. hygroscopicus от (SEQ ID N0: 3) може да се бележи по начин, по който да се определи, и да се използва за скриниране на геномна библиотека, конструирана от ДНК произлизаща от организма представляващ интерес. Строгостта на условията на хибридизиране се избира на основата на взаимосъотношението на сравнителния организъм, в този пример S. avermitilis или S. hygroscopicus, към представляващия интерес организъм. Изискванията за различна строгост на условията на хибридизиране са добре известни на специалистите в об ластта и тези условия ще варират по предвидим начин в зависимост от специфичните организми, от които произлизат и библиотеката и белязаните последователности. Такива олигонуклеотиди, за предпочитане са с поне приблизително 15 нуклеотида дължина и включват например, описаните в примерите по-долу. Амплифицирането на хомоложни гени може да се проведе при използване на тези, както и на други олигонуклеотиди, чрез прилагане на стандартни техники, като полимеразна верижна реакция (PCR), въпреки че също могат да се използват и други техники за амплифициране, известни от състоянието на техниката, например, лигазната верижна реакция.

Клонове идентифицирани като съдържащи aveC хомоложна нуклеотидна последователност могат да се тестват за тяхната способност да кодират aveC хомоложен генен продукт. За тази цел, клоновете могат да се подложат на секвенционен анализ, с цел да се идентифицира подходящата рамка на разчитане, както и сигналите за иницииране и терминация. Алтернативно или допълнително, клонираната ДНК последователност може да се инсерира в подходящ инсерционен вектор, т.е., вектор който съдържа необходимите елементи за транскрипцията и транслацията на инсерираната последователност кодираща протеина. Може да се използва която и да е от системите гостоприемник/вектор, както е описано по-долу, включително, но без да се ограничава до, бактериални системи, като плазмидни, бакгериофагни или козмидни експресионни вектори. Подходящи клетки гостоприемници, трансформирани с такива вектори, включващи потенциални aveC хомоложни кодиращи последователности могат след това да се анализират за aveC-тип активност, при използване на методи като ВЕТХ анализ на ферментационните продукти, както е описано например, в примерите по-нататък.

Продуцирането и боравеното с полинуклеотидните молекули, описани в настоящото, се обхваща от състоянието на техниката и може да се проведе съгласно описаните рекомбинантни техники, например, Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Intrscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al., (eds.), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; and Erich (ed.), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, които са включени в настоящото за справка. Полинуклеотидни клонове кодиращи aveC генни продукти или хомолози на aveC генни продукти могат да се идентифицират при използване на който и да е известен метод от състоянието на техниката, включително, но без да се ограничава до, методите посочени в раздел 7, по-долу. Геномна ДНК библиотека може да се скринира за aveC и aveC хомолог кодиращи последователности, при използване на техники, като метода, описан в Benton and Davis, 1977, Science 196:180, за библиотеки от бактериофаги и в Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965, за плазмидни библиотеки. Полинуклеотидни молекули, включващи нуклеотидни последователности, известни, че включват aveC ORF, като настоящите, например в плазмид pSE186 (АТСС 209604) или в плазмид pSEl 19 (описан в примерите по-долу) могат да се използват като проби при тези скрининг експерименти. Алтернативно могат да се синтезират олигонуклеотидни проби, които съответстват на нуклеотидни последователности, изведени от частични или пълни аминокиселинни последователности на пречистения хомоложен aveC генен продукт.

Рекомбинантни системи

Вектори за клониране и експресия

Настоящото изобретение предоставя, освен това рекомбинантни вектори за клониране и експресионни вектори, които се използват за клониране или експресиране на полинуклеотидните молекули на настоящото изобретение, например, aveC ORF на S. avermitilis или която и да е хомоложна aveC ORF. При един неограничаващ вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя плазмид pSEl86 (АТСС 209604), който съдържа пълната ORF на aveC гена на S. avermitilis.

Цялото следващо описание, отнасящо се до aveC ORF на S. avermitilis или на полинуклеотидна молекула, включваща aveC ORF на S. avermitilis или нейна част, или генен продукт на aveC на S. avermitilis, също се отнася до aveC хомолози и aveC генни продукти, докато не е посочено обяснително или не се разбира от контекста.

Развити са голямо разнообразие от различни вектори за специфично използване в Streptomyces, включително измежду другите, фаги, плазмиди с голям брой копия, и вектор совалка Е. coli-Streptomyces, и който и да е от тях може да се използва за практическо изпълнение на настоящото изобретение. Известен брой гени за устойчивост на лекарствени средства също са били клонирани от Streptomyces, като някои от тези гени са включени във вектори, като селекционни маркери. Представени са примери за обикновено използвани вектори при Streptomyces, като сред тях се посочва и Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190.

Рекомбинантните вектори на настоящото изобретение, по-специално експресионните вектори, за предпочитане се конструират така, че кодиращата последователност за полинуклеотидната молекула на изобретението, да е оперативно свързана с един или повече регулаторни елемента, необходими за транскрипция и транслация на кодиращата последователност за продуциране на полипептида. Както се използва в настоящото, терминът “регулаторен елемент” включва, но без да се ограничава до нуклеотидни последователности, които кодират индуцирусми и неиндуцируеми промотори, енхансери, оператори и други елементи, известни от състоянието на техниката, които служат за провеждане и/или за регулиране на експресията на последователностите, кодиращи полинуклеотид. Също така, както се използва в настоящото, кодиращата последователност е в “оперативна връзка” с един или повече регулаторни елемента, когато регулаторните елементи ефективно регулират и позволяват транскрибирането на кодиращата последователност или транслацията на нейната иРНК, или и двете.

Типични плазмидни вектори, които могат да се получат с генно-инженерни методи да съдържат полинуклеотидна молекула от настоящото изобретение включват pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega), и вектора совалка pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171&5872-5881), измежду много други.

От състоянието на техниката са добре известни методи за конструиране на рекомбинан тни вектори съдържащи определени кодиращи последователности оперативно свързвани с подходящи регулаторни елементи, и тези методи могат да се използват за практическото осъществяване на изобретението. Тези методи включват in vitro рекомбинантни техники, синтетични техники и in vitro генетична рекомбинация. Виж например техническото описание в Maniatis et al., 1989, по-горе; Ausubel et al., 1989, по-горе; Sambrook et al., 1989, no-rope; Innis et al., 1995, по-горе; и Erich, 1992, no-rope.

Регулаторните елементи на тези вектори могат да се променят в тяхната дължина и специфичност. Според използваната система гостоприемник/вектор, могат да се използват които и да са от голям брой подходящи транслационни и транскрипционни елементи. Неограничаващи примери за транскрипционни регулаторни области или промотори за бактерии включват бета-gal промотор, Т7 промотор, ТАС промотор, ляв и десен ламбда-промотори, trp и lac промотори, trp-lac слети промотори и по-специално за Streptomyces, промоторите ermE, melC и tip А и др. При един вариант за изпълнение на изобретението, описан по-долу в пример 11, се генерира експресионен вектор, който съдържа клонираната aveC ORF граничеща с пълния конститутивен ermE промотор за Saccharopolyspora erythraea. Векторът се трансформира в S. avermitilis и последващият ВЕТХ анализ на ферментационния продукт показва повишен титьр на продуцирани авермектини в сравнение с продукцията на същия щам, но който вместо това експресира aveC алел от див тип.

Експресионни вектори за слят протеин могат да се използват за експрсиране на слети протеини на aveC генни продукти. Пречистеният слят протеин може да се използва за получаване на антисеруми против aveC генен продукт, за изследване на биохимичните свойства на aveC генния продукт, за проектиране на aveC слети протеини с различни биохимични активности, или за спомагане на идентифицирането или пречистването на експресиран aveC генен продукт. Възможни експресионни вектори за слети протеини включват, но без да се ограничават до вектори, съдържащи последователности, които кодират бета-гал актозидаза и trpE сливане, малтоза-свързващ протеин сливане, тутатион-8-трансфераза сливане и полихистидин сливане (пренасяща об ласт). При един друг вариант за изпълнение на изобретението, aveC генният продукт или негова част, могат да се слеят към aveC хомоложен генен продукт, или негова част може да се слее към aveC хомоложен генен продукт или негова част, произлизаща от други видове или щамове на Streptomyces, като например S. hygroscopicus или S. griseochromogenes. При един определен вариант за изпълнение на изобретението, описан в пример 12, по-долу и посочен на фигура 7, се конструира химерен плазмид, който съдържа 5 64 Ьр област на S. hygroscopicus хомоложна aveC ORF, като замества хомоложна 564 област на aveC ORF на S. avermitilis. Такива хибридни вектори мотат да бъдат трансформирани в клетки на S. avermitilis и да се тестват, за да се определи тяхното действие, например, върху съотношението на клас 2:1 продуцираните авермектини.

AveC слети протеини могат да се проектират така, че да включват област полезна за пречистването. Например, aveC-малтоза-свързващ слети протеини могат да се пречистят чрез използване на амилозна смола; а\еС-пгутатион-8трансфераза слети протеини могат да се пречистят чрез използване на глутатион-агарозни перли; и aveC-полихистидин сливане може да се пречисти чрез използване на двувалентна никелова смола. Алтернативно, антитела срещу протеин носител или пептид могат да се използват за пречистване чрез афинитетна хроматография на слетия протеин. Например, нуклеотидна последователност кодираща за епитопа мишена (цел) на моноклонално антитяло, може да се проектира в експресионния вектор за оперативно свързване с регулаторни елементи и да е разположен така, че експресираният епитоп да е слят към aveC полипептида. Например, нуклеотидна последователност кодираща FLAG™ епитоп tag (International Biotechnologies Inc.), който е хидрофилен маркерен пептид, може да се инсерира чрез стандартни техники в експресионния вектор в точка съответстваща на, например, карбоксилния край на aveC полипептида. Експресираният aveC полипептид-FLAG™ епитоп слят продукт може да се установи след това и да се пречисти афинитетно при използване на антиFLAGO антитела, намиращи се в търговската мрежа.

Също така, експресионният вектор кодиращ aveC слят протеин може да се проектира така, че да съдържа полилинкерна последователност, която кодира специфични сайтове за разцепване на протеиназа, така че експресионният aveC полипептид да може да се освободи от областта на носителя или партньора на сливане, чрез обработване със специфична протеаза. Векторът на слетия протеин, например, може да включва, измежду другите, ДНК последователност кодираща тромбин или сайтове за разцепване на фактор Ха.

Сигнална последователност в посока upstream στ, и в рамка за разчитане с, aveC ORF може да се проектира в експресионния вектор чрез известни методи за насочване на движението и секрецията на експресирания генен продукт. Неограничаващи примери за сигнални последователности включват тези на алфа-фактор, имуноглобулини, протеини на външната мембрана, пеницилиназа и Т-клетъчни рецептори, измежду другите.

За да се помогне на избора на клетки гостоприемници трансформирани или трансфектирани с вектори за клониране или експресионни вектори, от настоящото изобретение векторът може да се проектира така, че да включва също кодираща последователност за продукт на репотер ген или други селекционни маркери. Една такава кодираща последователност е за предпочитане в оперативна връзка с кодиращата последователност на регулаторния елемент, както е описано по-долу. Репортер гените, които са полезни за изобретението са добре известни от състоянието на техниката и включват тези, кодиращи зелен флуоресцентен протеин, луцифераза, ху1Е и тирозиназа, измежду другите. Нуклеотидните последователности кодиращи селекционни маркери са добре известни от състоянието на техниката и включват тези, които кодират генни продукти, придаващи устойчивост към антибиотици или антиметаболити, или които осигуряват една автотрофна необходимост. Примери за такива последователности включват тези, които кодират устойчивост към еритромицин, тиострептон или канамицин, измежду много други.

Трансформиране на клетки гостоприемници

Настоящото изобретение предоставя също така и трансформирани клетки гостоприемници, включващи полинуклеотидни молекули или рекомбинантни вектори съгласно изобретението, и нови щамове или клетъчни линии, произлизащи от тях. Клетките гостоприемници полезни за практическото изпълнение на изобретението са за предпочитане клетки на Streptomyces, въпреки че могат да се използват и други прокариотни и еукариотни клетки. Такива трансформирани клетки гостоприемници включват характерно, но без да се ограничават до, микроорганизми, като бактерии трансформирани с рекомбинантна ДНК от бактериофаги, плазмидна ДНК или ДНК от козмидни вектори, или дрожди трансформирани с рекомбинантни вектори, измежду други.

Полипептидните молекули от настоящото изобретение са предназначени да действат в клетки на Streptomyces, но могат също така да бъдат трансформирани и в други бактериални или еукариотни клетки, например, за целите на клонирането или експресията. Характерно може да се използва щам на Е. coli, като например щам ОН5алфа, предоставен от American Type Culture Collection (АТСС), Rockville, MD, USA (входящ номер No 31343), както и от търговско достъпни източници (Stratagene). Предпочитани еукариотни клетки гостоприемници включват клетки на дрожди, въпреки че могат също ефикасно да се използват също и клетки от бозайници и клетки на насекоми.

Рекомбинантният експресионен вектор на изобретението за предпочитане се трансформира в една или повече клетки гостоприемници в хомогенна по същество клетъчна култура. Експресионният вектор обикновено се въвежда в клетката гостоприемник, съгласно известните техники, като например, протопластно трансформиране, утаяване с калциев фосфат, обработване с калциев хлорид, микроинжектиране, трансфекгиране чрез контактуване с рекомбинантен вирус, трансфекция медиирана от липозоми, DEAE-декстран трансфектиране, трансдукция, конюгация или бомбардиране е микроснаряди. Селекцията на трансформантите може да се проведе по стандартни процедури, като селекция за клетки експресиращи селекционни маркери, например за устойчивост на антибиотици, асоциирани с рекомбинантни вектори, както е описано по-долу.

След като експресионният вектор е въведен в клетката гостоприемник, интегрирането и поддържането на aveC кодиращата последователност или в хромозомата на клетката гостоп риемник или епизомално, може да се потвърди чрез стандартни техники, например чрез Southern хибридизационен анализ, анализ с рестрикционни ензими, PCR анализ, включително PCR с обратна транскриптаза (rt-PCR), или чрез имунологични изследвания, за откриване на очаквания генен продукт. Клетките гостоприемници, съдържащи и/или експресиращи рекомбинантна aveC кодираща последователност могат да се идентифицират чрез който и да е от поне четири общи подхода, които са добре известни от състоянието на техниката, включително: (i) ДНКДНК, ДНК-РНК, или РНК-антисенс РНК хибридизиране; (п) откриване присъствието на функции на “маркерни” гени; (iii) изследване нивото на транскрипцията както се измерва чрез експресията на aveC-специфични РНК транскрипти в клетката гостоприемник; и (iv) откриване присъствието на зрял полипептиден продукт, както се измерва чрез имуноизследване или чрез присъствието на aveC биологична активност (например, продуциране на специфично съотношение и количества на авермектини, показателни за aveC активност; например в клетки гостоприемници на S. avermitilis).

Експресиране и охарактеризиране на рекомбинантен aveC генен продукт

След като веднъж aveC кодиращата последователност е била стабилно въведена в подходящата клетка гостоприемник, трансформираната клетка гостоприемник се размножава клонално и получените клетки могат да се развиват при условия, водещи до максимална продукция на aveC генен продукт. Такива условия характерно включват развитие на клетки до висока плътност. Когато експресионният вектор включва индуцируем промотор, подходящи условия за индуциране, като например, температурно отместване, изчерпване на хранителните съставки, добавяне на ненужни индуцери (например, аналози на въглехидрати като изопропил-бета-О-тиогалакгопиранозид (IPTG)), акумулиране на излишък на странични продукти или други подобни, се използват както е необходими за индуциране на експресията.

Когато експресираният aveC генен продукт се задържа вътре в клетката гостоприемник, клетките се събират и се лизират, а продуктът се изолира и се пречиства от лизата при условия на екстрахиране, известни от състоянието на тех никата, за да се намали разграждането на протеина, като например, при 4°С или в присъствие на инхибитори на протеаза, или и двете. Когато експресираният aveC генен продукт се секретира от клетките гостоприемници, изчерпаната хранителна среда може просто да се събира, а продуктът да се изолира от нея.

Експресираният aveC генен продукт може да бъде изолиран или съществено пречистен от клетъчните лизати или от културалната среда, както е подходящо, при използване на стандартни методи, включително, но без да се ограничава до, каквато и да е комбинация от следните методи: утаяване с амониев сулфат, фракциониране по размер, йонообменна хроматография, ВЕТХ, плътностно центрофугиране и афинитетна хроматография. Когато експресираният aveC генен продукт проявява биологична активност, нарасналата чистота на препарата може да се наблюдава при всеки етап от процеса на пречистване при използване на подходящи изследвания. Дали експресираният aveC генен продукт проявява или не биологична активност, това може да се установи на основата на, например, размера, или реактивността с едно антитяло, иначе специфично към aveC, или чрез присъствието на слят tag.

Следователно настоящото изобретение предоставя рекомбинантно експресиран aveC генен продукт на Streptomyces, включващ аминокиселинната последователност кодирана от aveC генна продукт-кодираща последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или аминокиселинната последователност от фигура 1 (SEQ ID N0: 2) или негова съществена част, и негови хомолози.

Настоящото изобретение предоставя освен това, рекомбинантно-експресиран хомолог на aveC генен продукт, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4 или нейна съществена част, и нейни хомолози.

Настоящото изобретение предоставя също, така метод за получаване на aveC генен продукт, включващ култивиране на клетки гостоприемници с трансформиран експресионен вектор, като посоченият вектор съдържа полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, кодираща aveC генен продукт, чиято полинуклеотидна молекула е оперативно свързана с един или повече регулаторни елемента, които контролират експресията на полинуклеотидната молекула в клетката гостоприемник, при условия, водещи до продуциране на рекомбинантния aveC генен продукт, и до получаване на aveC генния продукт от клетъчната култура.

Рекомбинантно експресираният aveC генен продукт на S. avermitilis се използва за много цели, включително за скриниране на съединения, които променят функциите на aveC генния продукт и следователно модулира биосинтезата на авермектин, и за изготвяне на антитела насочени срещу aveC генния продукт.

След като веднъж е бил получен aveC генния продукт с достатъчна чистота, той тогава може да бъде охарактеризиран чрез стандартни методи, включително SDS-PAGE, гелна (sizeexclusion) хроматография, аминокиселинен секвенционен анализ, биологична активност при продуциране на подходящи продукти при биосинтетичния път на авермектин и др. Например, аминокиселинната последоватлност на aveC генния продукт може да се определи при използване на стандартни техники за секвениране на пептиди. aveC генният продукт може също да се охарактеризира при използване на анализ за хидрофилност (виж например, Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824), или аналогичен софтуерен алгоритъм, за определяне на хидрофобните и хидрофилните области на aveC генния продукт. Структурният анализ може да се проведе за идентифициране на aveC генния продукт, който допуска специфични вторични структури. Биофизичните методи като кристалографски рентгеноструктурен анализ (Engstrom 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13), компютърно моделиране (Fletterick and Zoller (eds), 1986, в Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) и ядреномагнитен резонанс (NMR) могат да се използват за картиране и изучаване на местата на взаимодействие между aveC генния продукт и неговите субстрати. Получената информация от тези анализи може да се използва за избор на нови сайтове за мутация в aveC ORF, за спомагане развитието на нови щамове на S. avermitilis, притежаващи по-желани характеристики за производството на авермектин.

Конструиране и използване на aveC мутант

Настоящото изобретение осигурява полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която иначе е същата като кодиращата последователност за aveC генен продукт на S. avermitilis на плазмид pSEl86 (АТСС 209604) или нуклеотидна последователност на aveC ORF на S. avermitilis, както е представено на фигура 1 (SEQ ID NO: 1), но която включва освен това една или повече мутации, така че клетките на S. avermitilis щам АТСС 53692, в който е бил активиран aveC алела от див тип, и който експресира полинуклеотидната молекула, включваща мутиралата нуклеотидна последователност, продуцира различно съотношение или количество авермектини, отколкото се продуцира от клетки на S. avermitilis щам АТСС 53692, които вместо това експресират единствено aveC алела от див тип.

Съгласно настоящото изобретение, такива полинуклеотидни молекули могат да се използват за продуциране на нови щамове S. avermitilis, които проявяват промяна, която може да се отчете, на продукцията на авермектин, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира единствено aveC алела от див тип. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението такива полинуклеотидни молекули се използват за получаване на нови щамове S. avermitilis, които продуцират авермектини с намалено съотношение на клас 2:1 авермектини в сравнение със същия щам, който вместо това експресира единствено aveC алел от див тип. При един друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението такива полинуклеотидни молекули се използват да получаване на нови щамове от S. avermitilis, които продуцират повишени нива на авермектини в сравнение със същия щам, който вместо това експресира единствено aveC алел от див тип. При един друг вариант за изпълнение на изобретението, такива полинуклеотидни молекули се използват за продуциране на щамове на S. avermitilis, в които aveC гена е бил инактивиран.

Мутации на aveC кодиращата последователност включват които и да са мутации, които въвеждат аминокиселинни делеции, прибавяния, или замествания в aveC генния продукт, или които водят до замяна на aveC генния продукт, или каквито и да са техни комбинации, и които водят до желания резултат. Например, настоящото изобретение осигурява полинуклеотидни молекули, включващи последователност кодираща aveC генен продукт на плазмид pSE 186 (АТСС 209604), или нуклеотидната последователност на aveC ORF на S. avermitilis, както е представено на фигура 1 (SEQ ID NO: 1), но която освен това включва една или повече мутации, които кодират заместването на един аминокиселинен остатък с различен аминокиселинен остатък при избраната позиция в aveC генния продукт. При няколко неограничаващи варианта за изпълнение на изобретението, които са представени с примери по-долу, такива замествания могат да се проведат при която и да е от аминокиселинните позиции 55, 138, 139 или 230, или комбинация от тях.

Мутации на aveC кодиращите последователности се провеждат по който и да е метод от известните методи, включително чрез използване на error-prone PCR, или чрез касетен мутагенез. Например, олигонуклеотиднасочен мутагенез може да се използва, за да се промени aveC ORF последователността по определен начин, като например, въвеждане на един или повече рестрикционни сайта, или на кодон за край (терминален кодон) в определена област в aveC ORF последователността. Методи, като тези описани в US 5,605,793, които включват случайно фрагментиране, повтарящи се цикли на мутагенез, и нуклеотидио преместване, също могат да се използват за генериране на големи библиотеки на полинуклеотиди, притежаващи нуклеотидни последователности, кодиращи aveC мутации.

Целените мутации могат да се използват особено когато те служат за промяна на един или повече аминокиселинни остатъка в aveC генния продукт. Например, сравнение на изведените аминокиселинни последователности на aveC генния продукт и хомолога на aveC генния продукт от S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5), и S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4), както е показано на фигура 6, означава сайтовете на значително консервиране на аминокиселинни остатъци между тези видове. Целеният мутагенез, водещ до промяна на една или повече от тези консервативни аминокиселинни остатъци може да бъде изключително ефективен при продуцирането на нови мутанти и щамове, които проявяват промени на продукцията на авермектини

Случайният мутагенез също може да е полезен и може да се проведе чрез излагане на клетки от S. avermitilis на ултравиолетово облъчване или на Х-лъчи, или на химичен мутагенез като №метил-№-нитрозогуанидин, етил метан сулфонат, азотисти киселини или nitrogen mustards. Виж например Ausubel, 1989 по-горе, за преглед на техниките на мутагенез.

След като се генерират мутирали полинуклеотидни молекули, те се скринират, за да се определи дали те могат да модулират биосинтеза на авермектин в S. avermitilis. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, полинуклеотидна молекула, притежаваща мутирала нуклеотидна последователност се тества чрез комплементиране на щам на S. avermitilis, в който aveC гена е бил инактивиран, за да даде aveC негативна (aveC) основа. При един неограничаващ метод мутиралата полинуклеотидна молекула се прикрепя към експресионен плазмид в оперативна връзка с един или повече регулаторни елемента, който плазмид също за предпочитане включва един или повече гени за резистентност на лекарствени средства, което да направи възможна селекцията на трансформираните клетки. Този вектор след това се трансформира в aveC клетка гостоприемник при използване на известни техники, и трансформираните клетки се подбират и се култивират в подходяща ферментационна среда при условия, позволяващи или индуциращи продуциране на авермектин. Ферментационните продукти след това се анализират чрез ВЕТХ, за да се определи способността на мутиралите полинуклеотидни молекули да комплементират клетката гостоприемник. Известен брой клетки, пренасящи мутирали полинуклеотидни молекули, способни да намалят съотношението на В2:В1 авермектини, включващи pSE:188, pSE199 npSE231 са посочени чрез примери в пример 8, по-долу.

Настоящото изобретение осигурява методи за идентифициране на мутации на aveC ORF на S. avermitilis, способни да променят съотношението и/или количеството на продуцирани авермектини. При един предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за идентифициране на мутации на aveC ORF способни да променят съотношението на клас 2:1 продуцирани авермектини, включващ: (а) определяне на съотношението на клас 2:1 авермектини продуцирани от клетки от щам на S. avermitilis, в който нативният aveC алел е бил инактивиран, и в който е въведена полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща мутирал aveC генен продукт и се експресира; (б) определяне на съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на същия щам S. avermitilis, както в етап (а), но вместо това експресират единствено aveC апел, притежаващ нуклеотидната последователност на ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нея; и (в) сравняване на съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (б), така че ако съотношението на клас 2:1 авермектини продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (а) е различно от съотношението на клас 2:1 авермектини продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (б), тогава се идентифицира мутация на aveC ORF способна да промени съотношението на клас 2:1 продуцирани авермектини. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, съотношението на клас 2:1 авермектини се редуцира от мутацията.

В друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за идентифициране на мутации на aveC ORF или на генетични структури, включващи aveC ORF способни да променят количеството на продуцирани авермектини, включващ: (а) определяне количеството авермектини, продуцирани от клетки от щам на S. avermitilis, в който нативният aveC алел е бил инактивиран, и в който е въведена полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща мутирал aveC генен продукт или съдържаща генетична структура, включваща нуклеотидна последователност, кодираща aveC генен продукт и се експресира; (б) определяне количеството на авермектини, продуцирани от клетки на същия щам на S. avermitilis, както в етап (а), но който вместо това експресира единствено aveC алел, притежаващ нуклеотидната последователност на ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нея; и (в) сравняване на количеството авермектини, продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (а), в сравнение с авермектините продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (б); така че ако количеството авермектини, продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (а) е различно от количеството авермектини, продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап (б), тогава се идентифицира мутация на aveC ORF или генетична структура, способна да променя количеството на авермектини. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, количеството на продуцирани авермектини се увеличава от мутацията.

Който и да е от горепосочените методи за определяне на мутации се провежда чрез използване на ферментационна културална среда, за предпочитане с добавка на циклохексан карбоксилна киселина, въпреки че също могат да се използват други подходящи предшественици на мастни киселини, като който и да е предшественик на мастни киселини, изброени в таблица 1.

След като веднъж са били идентифицирани полинуклеотидните молекули, които модулират продуцирането на авермектин в желана посока, може да се определи локализирането на мутацията в нуклеотидната последователност. Например, полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, кодираща мутирал aveC генен продукт може да се изолира чрез PCR и да се подложи на ДНК секвенционен анализ при използване на известни методи. Чрез сравняване на ДНК последователността на мутиралия aveC алел с тази на aveC алела от див тип, могат да се определят мутацията(ите), отговорни за промяната на продукцията на авермектин. При определени, до неограничаващи, варианти за изпълнение на настоящото изобретение, aveC гениите продукти на S. avermitilis, включващи или единични аминокиселинни замествания при който и да е остатък 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (А139Т) или 230 (G230D) или двойно заместване в позиции 138 (S138T) и 139 (А 139Т), носят промяна във функцията на aveC генния продукт, така че съотношението на клас 2:1 продуцирани авермектини се променя (виж: пример 8, по-долу). В съответствие, полинуклеотидни молекули, притежаващи нуклеотидни последователности, които кодират мутирали aveC гении продукти на S. avermitilis, включващи аминокиселинни замествания при един или повече аминокиселинни остатъка 55, 138, 139 или 230, или която и да е тяхна комбинация, се обхващат от настоящото изобретение.

Настоящото изобретение предоставя също така, състави за получаване на нови щамове на

S. avermitilis, клетките на които съдържат мутирал aveC алел, който води до промяната на продукцията на авермектин. Например, настоящото изобретение предоставя рекомбинантни вектори, които могат да се използват да насочват която и да е от полинуклеотидните молекули, включващи мутирали нуклеотидни последователности от настоящото изобретение, към сайта на aveC гена на хромозомата на S. avermitilis или да инсерира или да замества aveC ORF или част от нея, чрез хомоложна рекомбинация. Съгласно настоящото изобретение, въпреки това, полинуклеотидна молекула, включваща мутирала нуклеотидна последователност от настоящото изобретение, предоставена с настоящото, може също да действа за модулиране на биосинтезата на авермектин, когато се инсерира в хромозомата на S. avermitilis в сайт, различен от aveC гена, или когато се поддържа епизомално в клетките на S. avermitilis. Следователно, настоящото изобретение предоставя, също така, вектори, съдържащи полинуклеотидна молекула, включваща мутирала нуклеотидна последователност от настоящото изобретение, който вектор може да се използва за инсериране на полинуклеотидната последователност в сайт в хромозомата на S. avermitilis, различен от aveC гена, или да се поддържа епизомално.

При един предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя вектори за заместване на гени, които могат да се използват за инсериране на мутирал aveC алел в клетки от щам S. avermitilis, чиито клетки продуцират авермектини при едно променено съотношение на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетките. Такива вектори за заместване на гени могат да се конструират чрез използване на мутирали полинуклеотидни молекули, присъстващи в експресионни вектори предоставени в настоящото, KaropSE188, pSE199 ирБЕ23, които експресионни вектори са обяснени в пример 8, по-долу.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение осигурява вектори, които могат да се използват за инсериране на мутирал aveC алел в клетки на щам от S. avermitilis, за да се генерират нови щамове от клетки, които продуцират променено съотношение на авермектини, в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират един ствено aveC алела от див тип. При един предпочитан вариант за изпълнение, количеството авермектини, продуцирани от клетките нараства. При един характерен, неограничаващ вариант за изпълнение, такива вектори включват освен това силен промотор, известен от състоянието на техниката, като например, силен конститутивен ermE промотор от Saccharopolyspora erythraea, който се разполага в посока upstream, и е в оперативна връзка с aveC ORF. Такъв вектор може да бъде плазмид pSE189, описан в пример 11 по-долу, или може да се конструира чрез използване на мутирал aveC алел от плазмид pSE 189.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя вектори за заместване на гени, които се използват за инактивиране на aveC гена при щам S. avermitilis от див тип. При един неограничаващ вариант за изпълнение на изобретението, такъв вектор за заместване на гени може да се конструира чрез използване на мутирала полинуклеотидна молекула, присъстваща в плазмид pSE 180 (АТСС 20605), което се обяснява в пример 8, по-долу (фигура 3). Настоящото изобретение предоставя освен това, вектор, включващ полинуклеотидна молекула, съдържаща се или състояща се от нуклеотидни последователности, които естествено граничат с aveC гена in situ в хромозомата на S. avermitilis, включително например, тези граничещи с нуклеотидни последователности показани на фигура 1 (SEQ ID N0:1), които могат да се използват за изстриване на S. avermitilis aveC ORF.

Настоящото изобретение предоставя също така методи за получаване на нови щамове от S. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел и продуцират променено съотношение и/или количество на авермектини, в сравнение с клетки от същия щам S. avermitilis, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип. При един предпочитан вариант за изпълнение, изобретението предоставя метод за получаване на нови щамове S. avermitilis, които включват клетки, които експресират мутирал aveC алел, и които продуцират променено съотношение на клас 2:1 на авермектини, в сравнение с клетки от същия щам S. avermitilis, които вместо това експресират единствено aveC алела от див тип, включващ трансформиране на клетки от щам от S. avermitilis с вектор, пренасящ мутирал aveC апел, който кодира генен продукт, който променя съотношение на клас 2:1 на авермектини, продуцирани от клетки от щам на S. avermitilis, експресиращ мутиралия aveC алел, в сравнение с клетки от същия щам S. avermitilis, които вместо това експресират единствено aveC алела от див тип и подбор на трансформираните клетки, които продуцират авермектини при променено съотношение на клас 2:1, в сравнение със съотношението на клас 2:1, продуцирано от клетки от щама, които вместо това експресират aveC алела от див тип. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, промененото съотношение на клас 2:1 на авермектини намалява.

При един друг предпочитан вариант за изпълнене, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове S. avermitilis, включващ клетки, които продуцират променени количества авермектин, включващ трансформиране на клетки от щам S. avermitilis с вектор, пренасящ мутирал aveC алел или генетична структура, съдържаща aveC алел, експресията на който води до изменение на количеството на авермектини, продуцирани от клетки на щам S. avermitilis, експресиращи мутиралия aveC алел или генетична структура, в сравнение с клетки от същия щам S. avermitilis, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип и селекциониране на трансформирани клетки при променено количество в сравнение с количеството на авермектини, продуцирани от клетки на щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип. В предпочитания вариант количеството на авермектини, продуцирани в трансформирани клетки нараства.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове на S. avermitilis, клетките на който включват един инактивиран aveC алел, включващ трансформиране на клетки от щам на S. avermitilis, които експресират aveC алел с вектор, който инактивира aveC алела, и селекциониране на трансформирани клетки, в които aveC алелът е бил инактивиран. При един предпочитан неограничаващ вариант, клетки от щам на S. avermitilis се трансформират с вектор заместващ гени, който пренася aveC алел, който е бил инактивиран чрез мутация или чрез заместване на част от aveC алела с хетеро ложна генна последователност, и се прави подбор на трансформирани клетки, в които нативният aveC алел на клетките е бил заместен с инактивирания aveC алел. Инактивирането на aveC алела може да се определи чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти, както е описано подолу. При един специфичен неограничаващ вариант на изобретението, описан в пример 8 подолу, aveC алелът се инактивира чрез инсериране на еппЕ гена от Saccharopolyspora erythraea в aveC ORF.

Настоящото изобретение предоставя освен това, нов щам от S. avermitilis, включващ клетки, които са трансформирани с която и да е от полинуклеотидните молекули или вектори от настоящото изобретение. При едни предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя нов щам на S. avermitilis, включващ клетки, които експресират мутирал aveC алел вместо или в допълнение на aveC алела от див тип, при което посочените клетки на новия щам продуцират авермектини при едно променено съотношение на клас 2:1 на авермектините, продуцирани от клетки на същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип. При един предпочитан вариант, промененото съотношение на клас 2:1, продуцирани от новите клетки намалява. Такива нови щамове се използват при продуцирането в широк мащаб на подходящи за търговската мрежа авермектини, като дорамектин.

Първа цел на изследването за скриниране, описано в настоящото, е да се идентифицират мутиралите алели на aveC гена, чиято експресия в S. avermitilis променя и по-специално намалява съотношението на продуцирането клас 2:1 авермектини. При един предпочитан вариант, съотношението на В2:В 1 авермектини продуцирани от клетки на новия щам S. avermitilis от настоящото изобретение, експресиращ мутирал aveC алел, който намалява съотношение на клас 2:1 на продуцираните авермектини между под 1,6:1 до приблизително 0:1, при един по-предпочитан вариант за изпълнение, съотношението е между приблизително 0,84:1 до приблизително 0:1. При описания по-долу специфичен вариант за изпълнение, новите клетки от настоящото изобретение продуцират циклохексил В2 : циклохексил В1 авермектини в съотношение под 1,6:1. При друг специфичен предпочитан вари ант, описан по-долу, новите клетки от настоящото изобретение продуцират циклохексил В2 : циклохексил В1 авермектини в съотношение от приблизително 0,94:1. При един друг специфичен предпочитан вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящото изобретение продуцират циклохексил В2 : циклохексил В1 авермектини в съотношение от приблизително 0,88:1. При друг специфичен предпочитан вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящото изобретение продуцират циклохексил В2 : циклохексил В1 авермектини в съотношение от приблизително 0,84:1.

При един друг специфичен предпочитан вариант, настоящото изобретение предоставя нов щам от S. avermitilis, включващ клетки експресиращи мутирал avcC алел, или генетична структура съдържаща aveC алел на мястото на или в допълнение на aveC алел от див тип, при което клетки на новия щам продуцират променено количество авермектини в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип. При един предпочитан вариант за изпълнение, новият щам продуцира повишено количество авермектини. При един неограничаващ вариант, генетичната структура включва силен промотор, като силния конститутивен промотор от Saccharopolyspora erythraea, в посока upstream и оперативно свързан с aveC ORF.

При един друг вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя нови щамове на S. avermitilis, включващи клетки, в които aveC гена е бил инактивиран. Такива щамове са полезни както за различните спектри на авермектини, които те продуцират в сравнение с щамовете от див тип, така и при комплементарни скрининг анализи, както са описани в настоящото, за да се определи дали целенасочен или случаен мутагенез на aveC гена влияе на продукцията на авермектини. При един специфичен вариант за изпълнение, описан по-долу, клетки гостоприемници от S. avermitilis се обработват генно инженерно да съдържат инактивиран aveC ген. Например щам SE180-11, описан в примерното описание, се генерира чрез заместване на плазмид pSE180 (АТСС 209605) (фигура 3), който се конструира, за да инактивира aveC гена на S. avermitilis чрез инсериране на ermE гена за резистентност в aveC кодиращата област.

Настоящото изобретение предоставя, освен това, рекомбинантно експресирани, мутирали генни продукти на S. avermitilis, кодирани от която и да е от горепосочените полинуклеотидни молекули на изобретението, и методи за получаването им.

Изобретението предоставя също метод за получаване на авермектини, включващ култивиране на клетки от щам на S. avermitilis, които клетки експресират мутирал aveC алел кодиращ генен продукт, който променя съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на щам от S. avermitilis експресиращ мутиралия aveC алел, в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип, в културална среда, при условия, които позволяват или индуцират продукцията на авермектини от тях, и получаване на посочените авермектини от културата. При един предпочитан вариант, съотношението на клас 2:1 на авермектини продуцирани в културата от клетки експресиращи мутиралия aveC алел намалява. Този метод предоставя повишена ефективност при продукцията на важни за търговията авермектини, като дорамектин.

Настоящото изобретение предоставя също така, метод за продуциране на авермектини, включващ култивиране на клетки от щам на S. avermitilis, които клетки експресират мутирал aveC алел или генетична структура, включваща aveC алел, което води до продуциране на променено количество на авермекгините, продуцирани от клетки на щам на S. avermitilis, който експресира мутирал aveC алел или генетична структура, в сравнение със същия щам, който не експресира мутиралия aveC алел или генетична структура, а вместо това експресира единствено aveC алел от див тип, в културалната среда при условия, които позволяват или индуцират продуцирането на авермектини от тях, и получаване на посочените авермектини от културалната среда. При един предпочитан вариант, количеството на авермекгините продуцирани в културата от клетките експресиращи мутиралия aveC алел или генетична структура нараства.

Настоящото изобретение предоставя също така нов състав от авермектини, продуциран от щам на S. avermitilis експресиращ матирал aveC алел, който кодира генен продукт, който намалява съотношението на клас 2:1 авермектини про дуцирани от клетки на щам от S. avermitilis експресиращи мутиралия aveC алел, в сравнение със клетки на същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип, при което авермекгините в новия състав се продуцират при намалено съотношение на клас 2:1 на авермектини продуцирани от клетки на същия щам от S. avermitilis, който вместо това експресира единствено aveC алел от див тип. Новият състав на авермектини може да се представи като продуциран в културална среда при ферментация с изчерпване. Новият състав на авермектини може да бъде частично или съществено пречистен от културалната течност чрез известни биохимични техники за пречистване, като утаяване с амониев сулфат, диализа, фракциониране по размер, йонообменна хроматография, ВЕТХ и други.

Използване на авермектини

Авермектините са силно активни противопаразитни средства, притежаващи изключително приложение като антихелминти средства, ектопаразитицидни средства, инсектицидни средства и акарицидни средства. Авермектинови съединения продуцирани съгласно методите на настоящото изобретение се прилагат за която и да е от тези цели. Например, авермектинови съединения, продуцирани съгласно методите на настоящото изобретение се използват за лечение на различни заболявания или състояния при човека, по-специално когато тези заболявания или състояния са причинени чрез инфектиране от паразити, както е известно от състоянието на техниката. Виж например, Ikeda and Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. По-специално, авермектиновите съединения, продуцирани съгласно настоящото изобретение са ефективни при лечение на заболявания и състояния, причинени от ектопаразити, като паразитни нематоди, които могат да инфектират хора, домашни животни, прасета, овце, пилета, коне или рогат добитък.

По-специално, авермектиновите съединения, продуцирани съгласно настоящото изобретение са полезни срещу нематоди, които инфектират хора, както и срещу тези, които инфектират различни видове животни. Такива нематоди включват гастроинтестинални паразити, като Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strodyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria и паразити, които се откриват в кръв та или в други тъкани и органи, като нишковидни червеи и екстракт на интестинални състояния от Strongyloides и Trichinella.

Авермектиновите съединения, продуцирани съгласно настоящото изобретение се използват също за третиране на ектопаразитни инфекции, включително например, заразяване на бозайници и птици с артроподи, причинено от кърлежи, червеи, въшка, бълхи, мухи месарки, хапещи насекоми, или мигриращи ларви на двукрили насекоми, които засягат добитъка и конете, сред другите.

Авермектиновите съединения, продуцирани съгласно настоящото изобретение се използват, също така като инсектициди срещу домашни вредители, като например, хлебарка, молци, бръмбари по килимите и домашни мухи измежду други, така както и насекоми вредители за складирани зърнени култури и за селскостопански растения, които вредители включват червеи, афиди, гъсеници и правокрили насекоми, като locust (прелетен скакалец), измежду други.

Животни, които могат да бъдат третирани с авермектинови съединения, продуцирани съгласно настоящото изобретение включват овце, рогат добитък, коне, сърни, кози, свине, птици, включително домашни птици и котки и кучета.

Авермектиново съединение, продуцирано съгласно настоящото изобретение, се прилага под подходяща форма за специфичното използване, като специфичните видове животни гостоприемници се третират, и се включват и паразитите или насекомите. При използване като паразитицид, едно авермектиново съединение, продуцирано съгласно настоящото изобретение може да се прилага орално под формата на капсули, болус таблетки, таблетки или проникващи течности или алтернативно, може да се прилага чрез инжектиране или като имплантант. Такива лекарствени форми се изготвят по конвенционални начини, съгласно стандартната ветеринарна практика. Следователно, капсули, таблетки или болус таблетки могат да се приготвят чрез смесване на активните съставки с фино диспергиран разтворител или носител допълнително съдържащ дезинтегриращо средство и/или свързващо средство като нишесте, лактоза, талк, магнезиев стеарат и др. Дозите могат да се приготвят чрез диспергиране на активната съставка във воден разтвор заедно с диспергиращо или омок рящо средство, и др. Инжекционни форми могат да се приготвят под формата на стерилни разтвори, които могат да съдържат други вещества, като например, достатъчно соли и/или глюкоза, за да направи разтвора изотоничен с кръвта.

Такива лекарствени форми ще варират според теглото на активната съставка, в зависимост от пациента, или вида на гостоприемника, който се подлага на лечение, тежестта и вида на инфекцията, и телесното тегло на гостоприемника. Обикновено би било задоволително за орално приложение доза активна съставка от приблизително 0,001 до 10 mg на kg от теглото на пациента или на животното, приложена като единична доза или като разделени дози за период от 1 до 5 дни. Въпреки това може да има случаи, когато са предписани по-високи или по-ниски дози, както се определя, например, от лекаря или ветеринарния лекар, на основата на клиничните симптоми.

Като алтернатива, авермектиново съединение, продуцирано съгласно настоящото изобретение може да се прилага в комбинация с животински хранителни смески, и за тази цел концентрирани хранителни добавки могат да се приготвят за смесване с обикновената животинска храна.

За използване като инсектицид, и за третиране на селскостопански вредители, авермектиново съединение, продуцирано съгласно настоящото изобретение може да се приложи като спрей, прахообразна форма, емулсия и др. подобни, съгласно стандартната селскостопанска практика.

Примери за изпълнение на изобретението

Ферментация на Streptomyces avermitilis и анализ на В2:В1 авермектини

Щамове, на които липсва 2-оксо кисела дехидрогеназа с разклонена верига и 5-О-метилтрансферазна активност, не продуцират авермектини, ако ферментационната среда не е с добавка на мастни киселини. Тези примери показват, че в такива мутанти могат да се получат голямо разнообразие от съотношения на В2 . В1 авермектини, когато биосинтезата се инициира в присъствие на различни мастни киселини.

Материали и методи

Streptomyces avermitilis АТСС 53692 се съхранява при -70°С като пълноценен бульон, приготвен в среда за посяване, състояща се от нишесте (Nadex, Laing National - 20 g: Pharmamedia (Trader’s Protein, Memphis, TN) 15 g; Ardamine pH (Yeast Products Inc.) - 5 g: калциев карбонат - 1 g. Крайният обем се довежда до 1 1 с водопроводна вода, pH се нагласява на 7,2 и средата се автоклавира при 121°С за 25 min.

ml от кафявата суспенсия от горния препарат се използват за инокулиране на колба, съдържаща 50 ml от същата среда. След 48 h инкубиране при 28°С на ротационна клатачка при 180 rpm, 2 ml от бульона се използват за инокулиране на колба, съдържаща 50 ml от продукционната среда, състояща се от нишесте - 80 нишесте; калциев карбонат- 7 g: Pharmamedia - 5 g: кисел калиев фосфат -1 g: магнезиев сулфат -1 g; глутаминова киселина - 0,6 g; железен сулфат тетрахидрат - 0,01 g; цинков сулфат - 0,001 g; магнезиев сулфат - 0,001 g. Крайният обем се довежда до 11 с водопроводна вода, pH се нагласява на 7,2 и средата се автоклавира при 121 °C за 25 min.

Различни субстрати карбоксилни киселини (виж таблица 1) се разтварят в метанол и се добавят към ферментационната среда 24 h след инокулирането, за да се получи крайна концентрация от 0,2 g/l. Ферментационната среда се инкубира в продължение на 14 дни при 28°С, след което средата се центрофугира (2,500 rpm за 2 min), а супернатантата се отстранява. Мицеларната пелета (плътна утайка) се екстрахира с ацетон (15 ml), а след това с дихлорметан (30 ml) и органичната фаза се отделя, филтрува се, след което се изпарява до сухо. Остатъкът се слага в метанол (1 ml) и се анализира чрез ВЕТХ с Hewlett-Packard 1090А устройство за течна хроматография, снабдено със сканиращ диоден детектор, регулиран на 240 nm. Използваната колона е Beckman Ultasphere С-18, 5 pm, 4,6 mm х 25 cm колона, поддържана на 40°С. 25 μΐ от горепосочения метанолов разтвор се инжектира върху колоната. Елюирането се провежда с линеен градиент на метанол-вода от 80:20 до 95:5 за 40 min при скорост 0,85 ml/min. Използват се две стандартни концентрации на циклохексил В1 за калибриране на отговора на детектора, и се измерват площите под кривата за В2 авермектини.

Резултати

На таблица 1 са показани времето за задържане при ВЕТХ, наблюдавано за В2 и В1 авермектините и съотношението на 2:1 __ ТАБЛИЦА 1

	Време на при	задържане ВЕТХ(в мин.)	Съотно щение
Субстрат	В2	В1	В2:В1
4-Т етрахидропиран карбоксилна киселина	8,1	14,5	0,25
Изобутирова киселина	10,8	18,9	0,5
3- Фуранкарбонова киселина	7,6	14,6	0,62
8-(+)-2- метилбутирова киселина	12,8	21,6	1,0
Циклохексанкарбоксилна киселина	16,9	26,0	1.6
3-Т иофенкарбоксилна киселина	8,8	16,0	1.8
Циклопентанкарбоксилна киселина	14,2	23,0	2,0
3-Т рифлуорметилбутирова киселина	10,9	18,8	3.9
2-Метилпентанова киселина	14,5	24,9	4,2
Циклохептанкарбоксилова киселина	18,6	29,0	15,0

Данните представени на таблица 1 показ- 35 ват изключително широки граници на съотношението на В 2: В1 продукта от авермектин, което сочи значителна разлика в резултатите на дехидратираната конверсия на съединенията от клас 2 в съединения от клас 1, в зависимост от вида на 40 веригата на доставената изходна мастна киселина. Това показва, че промените в съотношението на В2:В1, получени от изменението на AveC протеина може да са специфични за определени субстрати. Следователно, скринирането за му- 45 танти, проявяващи изменение в съотношението на В2 :В 1, получено с определен субстрат трябва да се извърши в присъствието на този субстрат. При следващите примери, описани по-долу, се използва циклохексанкарбоксилна киселина като 5 0 субстрат за скрининг. Въпреки това, този субстрат се използва най-вече като пример, за да се обясни потенциала, и няма за цел да ограничи приложението на настоящото изобретение.

Пример 7. Изолиране на aveC гена

В този пример се описва изолирането и охарактеризирането на област от хромозомата на Streptomyces avermitilis, която кодира aveC генния продукт. Както е показано по-долу, aveC генът се идентифицира като способен да модифицира съотношението на циклохексил-В2 към циклохексил-В1 (В2:В1) продуцирани авермектини.

Материали и методи

Култивиране на Streptomyces за изолиране на ДНК

Следващите методи се следват от култи виране на Streptomyces. Единични колонии на S. avermitilis АТСС 31272 (изолат # 2 от единични колонии) се изолират върху 1/2 сила YPD - 6 съдържащ: Difco Yeast Extract - 5 g; Difco Bactoпептон - 5 g; декстроза - 2,5 g; MOPS - 5 g; Difco Bacto arap - 15 g. Крайният обем се довежда до 1 1 с dH₂O, pH се нагласява на 7,0 и средата се автоклавира при 121 °C в продължение на 25 min.

Мицелътпрораснал в горепосочената среда се използва за инокулиране на 10 ml TSB среда (Difco Tryptic Soya Broth - 30 g, в 1 1 dH₂O, автоклавира се при 121°С в продължение на 25 min) в 25 mm х 150 mm епруветки, които се поддържат при разклащане (300 rpm) на 28°С в продължение на 48-72 h.

Изолиране на хромозомална ДНК от Streptomyces

Аликвотни части (0,25 ml или 0,5 ml) от мицел култивиран какго е посочено по-горе, се поставя в 1,5 ml центрофужни епруветки и клетките се концентрират чрез центрофугиране при 12,000 х g за 60 s. Супернатантата се отстранява и клетките се суспендират отново в 0,25 ml TSE буфер (20 ml 1.5М захароза, 2,5 ml 1 М TrisHC1, pH 8,0 2,5 ml 1 M EDTA, pH 8,0 и 75 ml dH₂O), съдържащ 2 mg/ml лизозим. Пробите се инкубират при 37°С за 20 min при разклащане, поставят се в AutoGen 540™ устройство за автоматично изолиране на нуклеинови киселини (Integrated Separation Systems, Natick, МА) и геномната ДНК се изолира при използване на Cycle 159 (специализиран софтуер), съгласно инструкциите на производителя.

Алтернативно, 5 ml от мицела се поставят в 17 mm х 100 mm епруветки, клетките се концентрират чрез центрофугиране при 3000 rpm за 5 min и супернатантата се отстранява. Клетките отново се суспендират в 1 ml TSE буфер, концентрират се чрез центрофугиране при 3000 rpm за 5 min и супернатантата се отстранява. Клетките отново се суспендират в 1 ml TSE буфер, съдържащ 2 mg/ml лизозим и се концентрират при 37°С при разклащане в продължение на 3060 min. След инкубиране се прибавя 0,5 ml 10% натриев додецил сулфат (SDS) и клетките се инкубират при 37°С до завършване на лизисния процес. Лизатьт се инкубира при 65°С за 10 min, охлажда се до стайна температура, разделя се в две епендорфови епруветки и се екстрахира с 0,5 ml фенол/хлороформ (50% фенол предвари телно уравновесен с 0,5 М Tris, pH 8,0; 50% хлороформ). Водната фаза се отстранява и се екстрахира 2 до 5 пъти с хлороформ :изоамилов алкохол (24:1). ДНК се утаява чрез прибавяне на 1/10 обема 3 М натриев ацетат, pH 4,8, като сместа се инкубира върху лед 10 min, центрофугира се при 15,000 rpm при 5°C за 10 min и утайката се премества в чиста епруветка, към която се прибавя 1 ml изопропанол. Супернатантата плюс изопропаноловата смес се инкубират след това върху лед за 20 min, центрофугират се при 15,000 rpm за 20 min при 5 °C, супернатантата се отстранява и плътната утайка от ДНК се промива 1 х 70% етанол. След изсушаване на утайката, ДНК отново се суспендира в ТЕ буфер (10 mM Tris, 1 тМ EDTA, pH 8,0).

Изолиране на плазмидна ДНК от Streptomyces

Аликвотни части (1,0 ml) от мицел, култивиран както е посочено по-горе, се поставя в 1,5 ml микроцентрофужни епруветки и клетките се концентрират чрез центрофугиране при 12,000 х g за 60 s. Супернатантата се отстранява и клетките се суспендират отново в 1,0 ml 10,3% захароза и се концентрират чрез центрофугиране при 12,000 х g за 60 s и супернатантата се отстранява. Клетките се суспендират отново в TSE буфер, съдържащ 2 mg/ml лизозим и се инкубират при 37°С за 20 min при разклащане, поставят се в AutoGen540™ устройство за автоматично изолиране на нуклеинови киселини. Плазмидна ДНК се изолира при използване на Cycle 106 (специализиран софтуер), съгласно инструкциите на производителя.

Алтернативно, 1,5 ml от мицела се поставят в 1,5 ml микроцентрофужни епруветки, клетките се концентрират чрез центрофугиране при 12,000 х g за 60 s и супернатантата се отстранява. Клетките отново се суспендират в 1,0 ml в 10,3% захароза и се концентрират чрез центрофугиране на 12,000 х g за 60 s и супернатантата се отстранява. Клетките се суспендират отново в TSE буфер, съдържащ 2 mg/1 лизозим и се концентрират при 3 7°С в продължение на 15-3 0 min. След инкубиране се прибавят 0,25 ml алкален SDS (0,3N NaOH, 2% SDS) и клетките се инкубират при 5 5 °C в продължение на 15-30 min до избистряне на разтвора. Към ДНК разтвора се добавя натриев ацетат (0,1 ml, ЗМ pH 4,8), като разтворът след това се инкубира върху лед за min. ДНК пробите се центрофугират при 14,000 rpm за 10 min при 5°С. Супернатантата се прехвърля в чиста епруветка и се добавя 0,2 ml фенол: хлороформ (50% фенол: 50% хлороформ) и внимателно се смесват. ДНК се центрофугира при 14,000 rpm за 10 min при 5°С и най-горният слой се прехвърля в чиста епруветка на Eppendorf. Прибавя се изопропанол и разтворът внимателно се разбърква, след което се инкубира 20 min при стайна температура. ДНК разтворът се центрофугира при 14,000 rpm за 15 min при 5 °C, супернатантата се прехвърля и ДНК пелетата се промива със 70% етанол, суши се и отново се суспендира в ТЕ буфер.

Изолиране на плазмидна ДНК от Е. coli

Единична трансформирана колония на Е. coli се инокулира в 5 ml среда на Luria-Bertani (LB) (Bacto-Tryptone - 10 g, Bacto-дрождев екстракт - 5 g, и NaCl - 10 g в 1 1 dH₂O, pH 7,0, автоклавира се при 121°C за 25 min и се добавят 100 pg/ml ампицилин). Културата се инкубира през цялата нощ, а аликвотна част от 1 ml се поставя в 1,5 ml микроцентрофужна епруветка. Културалните проби се поставят в устройство за автоматично изолиране на нуклеинови киселини AutoGen 540™ и плазмидната ДНК се изолира при използване на Cycle 3 (специализиран софтуер), съгласно инструкциите на производителя.

Приготвяне и трансформиране на протопласти на S. avermitilis

Единични колонии от S. avermitilis се изолират върху YPD-6 с 1/2 мощност. Мицелът се използва за инокулиране на 10 ml TSB среда в 25 mm х 150 mm епруветки, които след това се инкубират при разклащане (300 rpm) на 28°С за 48 h. 12 ml от мицелът се използва за инокулиране на 50 ml YEME-среда. YEME среда съдържа на литър: Difco Yeast Extract - 3 g; Difco Bacto-peptone - 5 g; Difco Malt Extract - 3 g; захароза - 300 g. След автоклавиране при 121 °C за 25 min се прибавя следното: 2,5 М MgCl₂ 6Н₂О (отделно автоклавиран при 121 °C в продължение на 25 min) - 2 ml; и глицин (20%) (стерилизиран през филтър) - 25 ml.

Мицелът се култивира при 30°С за 4872 h и се събира чрез центрофугиране в 50 mlова центрофужна епруветка (Falcon) при 3,000 rpm в продължение на 20 min. Супернатантата се отстранява и мицелът се суспендира отново в Р буфер, който съдържа: захароза - 205 g; K₂SO₄ 0,25 g; MgCl₂ 6H₂O - 2,02 g; H₂O - 600 ml; ΐςΡΟ₄ (0,5%) -10 ml; разтвор на елементи следи - 20 ml; СаС1₂ 2Н₂О (3,68%) -100 ml; и MES буфер (1,0 М, pH 6,5) - 10 ml. (*разтворът на елементи следи съдържа за 1: ZnCl₂ - 40 mg; FeCl₃ 6Н₂О - 200 mg; CuCl₂ 2Н₂О -10 mg; MnCl₂ 4H₂O -10 mg; Na^O, 10H₂O - 10 mg; (NH₄)₆ Mo₇0₂₄ 4H₂O -10 mg). pH се довежда до 6,5, а крайния обем до 11 и средата се филтрира топла през 0,45 микронен филтър.

Мицелът се утаява в плътна утайка при 3,000 rpm за 20 min, Супернатантата се отстранява и мицелът се суспендира отново в 20 ml Р буфер, съдържащ 2 mg/ml лизозим. Мицелът се инкубира при 35°С за 15 min при разклащане и се проверява микроскопски, за да се определи размера на образуването на протопласти. При завършване на образуването на протопласти, протопластите се центрофугират при 8,000 rpm за 10 min. Супернатантата се отстранява и протопластите се суспендират отново в 10 ml Р буфер. Протопластите се центрофугират при 8,00 rpm за 10 min, супернатантата се отстранява, протопластите отново се суспендират в 2 ml Р буфер и приблизително 1x10’ протопласти се разпределят в 2,0 ml криогенни ампули (Nalgene).

Ампула, съдържаща 1х10⁹ протопласти се центрофугира при 8,000 rpm за 10 min, супернатантата се отстранява и протопластите отново се суспендират в 0,1 ml Р буфер. Протопластите се прибавят към 5 g трансформираща ДНК, непосредствено последвано от прибавянето на 0,5 ml работен Т буфер. Основният Т буфер съдържа: PEG - 1000 (Sigma) - 25 g; захароза 2,5 g; Н₂О - 83 ml. pH се довежда до 8,8 с 1 N NaOH (стерилизира се чрез филтриране) и основният Т буфер се стерилизира чрез филтруване и се съхранява при 4°С. Работният Т буфер, изготвящ, се през деня, в който ще се ползва, е основен Т буфер - 8,3 ml; К₂РО₄ (4 тМ) - 1,0 ml; СаС1₂ 2Н₂О (5М) - 0,2 ml; и TES (1 М, pH 8) - 0,5 ml. Всяка съставна част на Т буфера самостоятелно се стерилизира чрез филтруване.

s след прибавянето на Т буфера към протопластите се прибавя също така Р буфер и протопластите се центрофугират при 8,000 rpm за 10 min. Супернатантата се отстранява и протопластите се суспендират отново в 0,1 ml Р буфер. След това протопластите се посяват върху RM 14 среда, съдържаща: захароза - 205 g;

K₂SO₄ - 0,25 g; MgCl₂ 6H₂O - 10,12 g; глюкоза 10 g; Difco Casamino Acids - 0,1 g; Difco Yeast Extract - 5 g; Difco Oatmeal Agar - 3 g; Difco Bacto Agar -22 g; dH₂O - 800 ml. Разтворът се автоклавира при 121 °C за 25 min. След автоклавирането се прибавя стерилен резерв от следното: ΐςΡΟ₄ (0.5%) -10 ml; СаС1₂ 2Н₂О (5 М) - 5 ml; MES буфер (1,0 М, pH 6,5) - 10 ml; разтвор на елементи следи (същия както по-горе) - 2 ml; майчин циклохексимид (25 mg/ml) - 40 ml; и IN NaOH - 2 ml. 25 ml RM14 среда се разделят на аликвотни части по блюдата и блюдата се сушат 24 h преди употребата.

Протопластите се инкубират при 95% влажност при 30°С за 20-24 h. За подбор на трансформанти устойчиви на тиострептон над RM14 блюдата с регенерати се разпръсква 1 ml буфер за надслояване, съдържащ 125 g на ml тиострептон. Буферът за надслояване съдържа за 100 ml: захароза - 10,3 g; Разтвор на елементи следи (същия като горепосочения) - 0,2 ml; и MES (1 М, pH 6,5) - 1 ml. Протопластите се инкубират при 95% влажност при 30°С за 7-14 дни (докато колониите устойчиви на тиострептон (Thio’) станат видими).

Трансформиране на протопласти от Streptomyces lividans

При някои случаи за трансформиране се използва S. lividans ТК64 (доставен от John Innes Institute, Norwich, UK). Методи и състави за култивиране, получаване на протопласти и трансформиране на S. lividans са описани от Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual;, John Innes Foundation, Norwickm UK, и се провеждат както е описано в настоящото. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти на S. lividans, както е описано в раздел 7.1.3 по-горе.

Анализ на ферментацията на щамове от S. lividans

Мицел от S. lividans, култивиран върху YPD-6 1/2 мощност за 4-7 дни се инокулира в 1x6 инча епруветки, съдържащи 8 ml предварителна среда и 5 mm стъклени перли. Предварителната среда съдържа: разтворимо нишесте (или леко сварено нишесте или KOSO, Japan Com Starch Co., Nagoys) - 20 g/1; Pharmamedia 15 g/1; Ardamine pH - 5 g/1 (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaCO₃ - 2 g/1; 2 x bcfa (“bcfa” се отнася до мастни киселини с разклонени вериги) с крайна концентрация в средата от 50 ppm 2-(+/-)-метил бутирова киселина, 60 ppm изобутирова киселина, и 20 ppm изовалерианова киселина. pH се довежда до 7,2 и средата се автоклавира на 121°С в продължение на 25 min.

Епруветката се разклаща под ъгъл 17° при 215 грш при 29°С в продължение на 3 дни. 2 mlови аликвотни части от посевната среда се използват за инокулиранс на 300 ml-ови Erlenmayerови колби, съдържащи 25 ml производствена среда, която съдържа: нишесте (или леко сварено нишесте или KOSO) - 160 g/1; Nutrisoya (Archer Daniels Midland, Decatm, IL) - 10 g/1; Ardamine pH -10 g/1; K₂HPO₄ - 2 g/1; MgSO₄.4H₂O) - 2 g/1; FeSO₄.7H₂O - 0,02 g/1; MnCl₂ - 0,002 g/1; ZnSO₄.7H₂O - 0,002 g/1; CaCO₃ - 14 g/1; 2 x bcfa (както по-горе); и циклохексан карбоксилна киселина (СНС) (приготвена като 20% разтвор с pH 7,0) - 800 ppm. pH се довежда до 6,9 и средата се автоклавира на 121°С за 25 min.

След инокулирането колбата се инкубира при 29°С в продължение на 12 дни, при разклащане при 200 грш. След инкубиране от колбата се взима проба от 2 ml, разрежда се с 8 ml метанол, размесва се и сместа се центрофугира при 1,250 х g 10 min, за да се утаят клетъчните отломки. След това супернатантата се изследва чрез ВЕТХ при използване на Beckman Ultrashere ODS колона (25 cm χ 4,6 mm ID) при скоростна потока от 0,75 ml/mm и определяне; чрез абсорбция на 240 nm. Мобилната фаза е 865/8,9/5,1 метаиол/вода/ацетонитрил.

Изолиране на PKS гени от S. avermitilis

Приготвя се козмидна библиотека на хромозомална ДНК от S. avermitilis (АТСС 31272, SC-2) и се хибридизира с кетосинтетазна (LS) проба направено от фрагмент на поликетид синтстазния (PKS) ген на Saccharopolyspora erythraea. Подробно описание на приготвянето на козмидните библиотеки може да се открие в Sambrook et al., 1989, по-горе. Подробно описание на приготвянето на хромозомални ДНК библиотеки от Streptomyces е представено в Hopewood et al., 1985, по-горе. Козмидни клонове, съдържащи области, синтезиращи с кетосинтетаза се идентифицират чрез хибридизиране към 2,7 Kb Ndel/ Есо47Ш фрагмент от рЕХ26 (любезно предоставени от Dr. Р. Leadlay, Cambridge, UK). Приблизително 5 ng от рЕХ26 се смилат при използване на Ndel и Есо47Ш. Реакционната смес се зарежда върху 0,8% SeaPlaque GTG агарозен гел (FMC bioProducts, Rocjland, ME). 2,7 Kb Ndel/ Eco47III фрагментът се изрязва от гела след елетрофореза и от гела се получава ДНК при използване на GELase™ от Epicentre Technologies при използване на Fast Protocol. 2,7 Kb NdeI/Eco47III фрагментът се бележи с [алфа-³²РДОСТР (дезоксицитидин 5'-трифосфат, тетра (триетиламониева) сол, [алфа-³²Р]-) (NEN-Dupont, Boston, МА) при използване на BRL Nick Trandlation System (BRL Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD), при следване на инструкциите на производителя. Характерна реакция се осъществява в 0,005 ml обем. След прибавяне на 5 μΐ стоп буфер, белязаната ДНК се отделя от невключените нуклеотиди, при използване на G-25 Sephadex Quick Spin™ Colonm *Boehring Manheim), като се следват инструкциите на производителя.

Приблизително 1,800 козмидни клонове се скринират чрез колонийна хибридизация. След това клоновете се идентифицират като силно хибридизиращи към Sacc. erythraea KS проба. Култивират се колонии на Е. coli, съдържащи козмидна ДНК в LB течна среда и се изолира козмидиа ДНК от всяка култура в AutoGen 540™ устройство за автоматизирано изолиране на нуклеинови киселини при използване на Цикъл 3 (специализиран софтуер), съгласно препоръките на производителя. Картирането с рестрикционни ендонуклеази и Southern blot хибридизационният анализ показват, че пет от клоновете съдържат препокриващи се хромозомални области. Чрез анализ на препокриващите се козмиди и хибридизации (фигура 4) се конструира S. avermitilis геномна BamHI рестрикционна карта на козмидите (т.е. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69).

Идентифициране на ДНК модулираща съотношението на авермектин В2: В1 и идентифициране на aveC ORF

Следните методи се използват за тестване на субклонирани фрагменти, произлизащи от pSE66 козмиден клон за тяхната способност да модулират съотношението на авермектин В2: В1 в AveC мутанти. pSE66 (5 μβ) се смила с SacI и BamHI. Реакционната смес се зарежда върху 0,8% SeaPlaque™ GTG агарозен гел (FMC BioProducts), 2,9 kb SacI/BamHI фрагмент се изрязва от гела след електрофореза и ДНК се изолира от гела при използване на GELase™ (Epicentre Technologies) при използване на Fast

Protocol. Приблизително 5 μβ от вектора совалка pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171:5872-5881)ce смила със SacI и BamHI. Около 0,5 pg от 2,9 kb инсерта и 0,5 μβ от смления pWHM3 се смесват заедно и се инкубират през цялата нощ с 1 единица лигаза (New Efland Biolabs, Inc., Beverly, МА) при 15°C в общ обем от 20 μΐ, съгласно препоръките на производителя. След инкубиране, 5 μΐ от сместа за лигиране се инкубират при 70°С за 10 min, охлажда се до стайна температура и се използва за трансформиране на компетентни Е. coli DH алфа клетки (BRL), съгласно препоръките на производителя. Изолира се плазмидна ДНК от резистентни на ампицилин трансформанти и чрез рестрикционен анализ се потвърждава наличието на 2,9 kb Saci/BamHI инсерт. Плазмидът се означава с pSE119.

Приготвят се протопласти от S. avermitilis щам 1100-SC3 8 (Pfizer in-house strain) и се трансформират с pSEl 19, както е описано в пример 7, по-горе. Щам 1100-SC38 е мутант, който продуцира значително по-големи количества от авермектин циклохексил-В2 формата, в сравнение с циклохексил-В1 формата, когато се прибави циклохексан карбоксилна киселина (В1 :В2 от приблизително 30:1). pSE119, който се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis се изолира или от Е. coli щам GM2163 (получен от Dr. В. J. Bachmann, Curator, Е. coli Genetic Stock Center, Yale University), E. coli щам DM1 (BRL), или S. lividans TK64. Трансформанти резистентни на тиострептон от щам 1100-SC38 се изолират чрез ВЕТХ анализ на продуктите на ферментационния процес. Трансформанти на S. avermitilis щам 1100-SC38, съдържащи pSE119 продуцират едно променено съотношение на циклохексил-В2: циклохексил-В 1 от приблизително 3,7:1 (таблица 2).

След като се установи, че pSEl 19 е способен да модулира съотношението на авермектин В2:В1 в един aveC мутант, инсерираната ДНК се секвенира. Приблизително 10 μβ pSEl 19 се изолират при използване на кит за изолиране на плазмидна ДНК (Qiagen, Valencia, СА), при изпълнение препоръките на производителя и се секвенира при използване на ABI373А автоматизиран ДНК секвенатор (Perkin Elmer, Foater City, СА). Данните за последователностите се обобщават и се издават при използване на програми на Computer Group (GCG, Madisson, WI). ДНК последователността и aveC ORF са представени на фигура 1 (SEQ ID NO: 1).

Конструира се нов плазмид, означен като pSEl 18, както следва. Приблизително 5 pg от pSE66 се смилат с SphI и BamHI. Реакционната смес се зарежда върху 0,8% SeaPlaque™ GTG агарозен гел (FMC BioProducts), 2,8 kb SphI/ BamHI фрагмент се изрязва от гела след електрофореза и ДНК се извлича от гела при използване на GELase™ (Epicentre Technologies) при използване на Fast Protocol. Приблизително 0,5 pg от вектора совалка pWHM3 се смилат със SphI и BamHI. Приблизително 0,5 pg от 2,8 kb инсерта и 0,5 pg от смления pWHM3 се смесват заедно и се инкубират през цялата нощ с 1 единица лигаза (New England Biokabs) при 15°С в общ обем от 20 pl, съгласно препоръките на производителя. След инкубиране, 5 pl от сместа за лигиране се инкубира при 70°С за 10 min, охлажда се до стайна температура и се използва за трансформиране на компетентни клетки на Е. coli ОН5алфа, съгласно препоръките на производителя. Плазмидна ДНК се изолира от резистентни на ампицилин трансформанти и присъствието на 2,8 kb Sphl/BamHI инсерта се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидът се означава като pSEl 18. Инсерираната ДНК в pSEl 18 и pSEl 19 се препокрива с приблизително 838 нуклеотида (фигура 4).

Протопласти от S. avermitilis щам 1100SC38 се трансформират с pSEl 18 както по-горе. Трансформанти устойчиви на тиострептон от щам 110-SC38 се изолират и анализират чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти. Трансформанти на S. avermitilis щам 1100-SC38, съдържащи pSRl 18, нямат промени по отношение на съотношението на авермектин циклохексил-В2:авермектин циклохексил-В1 в сравнение с щам 1100-SC38 (талбица 2).

PCR амплификация на aveC ген от хромозомална ДНК от S. avermitilis ~1,2 kb фрагмент, съдържащ aveC ORF се изолира от хромозомална ДНК на S. avermitilis чрез PCR амплифициране при използване на праймери проектирани на основата на aveC нуклеотидна последователност получена по-горе. PCR праймерите се доставят от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Дясностоящият праймере:

5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO: 6);

а лявостоящият праймер е:

5-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO: 7).

PCR реакцията се провежда c Deep Vent™ полимераза (New England Biolabs) в буфер, доставен от производителя, и в присъствие на 300 pm dNTP, 10% глицерол, 200 pmol от всеки праймер, 0,1 pg матрица и 2,5 единици ензим в краен обем от 100 pl при използване на PerkinElmer Cetus thermal cycler. Термичният профил на първия цикъл е 95 °C за 5 min (етап на денатуриране), 60°С за 2 min (етап на хибридизиране) и 72°С за 2 min (етап на елонгация). Следващите 24 цикъла имат подобен термичен профил с изключение на това, че етапът на денатуриране се съкращава на 45 s, а етапът на хибридизиране се съкращава на 1 min.

PCR продуктът се подлага на електрофореза в 1 % агарозен гел и се определя ивицата на едноверижна ДНК ~1,2 kb. Тази ДНК се пречиства от гела и се лигира с 25 ng линеаризиран pCR-Blunt вектор с тъпи краища (Invitrogen) в 1:10 моларно съотношение на вектор-към-инсерт, съгласно препоръките на производителя. Сместа за лигиране се използва за трансформиране на One Shot™ Competent Е. coli клетки (Invitrogen) съгласно препоръките на производителя. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти устойчиви на ампицилин и наличието на ~1,2 КЬ инсерта се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидът се означава като PSE179.

ДНК инсертът от pSEl 79 се изолира чрез смилане с BamHI/Xbal, отделя се чрез електрофореза, пречиства се от гела и се лигира с вектор совалка pWHM3, който също се смила с BamHI/Xbal, при обща концентрация на ДНК от 1 pg при моларно съотношение 1:5 на векторкъм-инсерт. Сместа за лигиране се използва за трансформиране на компетентни Е. coli DH5алфа клетки, съгласно препоръките на производителя. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти устойчиви на ампицилин и наличието на ~1,2 КЬ инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидът; който се означава като pSE186 (фигура 2, АТСС 209604), се трансформира в Е. coli DM1, и плазмидната ДНК се изолира от трансформанти устойчиви на ампицилин.

Резултата

2,9 Kb SacI/BamHI фрагмент от pSEl 19 се определя така, че когато се трансформира в S. avermitilis щам 1100-SC38, значително променя съотношението на В2 .В 1 продуциран авермектин. 5 S. avermitilis щам 11OO-SC3 8 обикновено има съотношение на В2:В1 от около 30:1, но когато се трансформира с вектор, съдържащ 2,9 Kb SacI/ BamHI фрагмент съотношението на В2:В 1 авермектин намалява приблизително до 3,7:1. Постферментационният анализ на културите от трансформанти потвърждава присъствието на трансформираща ДНК.

2,9 Kb pSEl 19 фрагментът се секвенира и се идентифицира ~0,9 KB ORF (фигура 1) (SEQ ID NO: 1), която включва Pstl/SphI фрагмент, който предварително е бил мутиран да продуцира единствено В2 продукти (Ikeda et al., 1995, по-горе). Сравнението на тази ORF, или на нейния съответен изведен полипептид, спрямо известна база данни (GenEMBL, SWISS-PROT) не показва каквато и да е силна хомоложност с известна ДНК или белтъчни последователности.

Таблица 2 представя ферментационният анализ на S. avermitilis щам 1100-SC3 8 трансформиран с различни плазмиди.

Таблица 2

S. avermitilis щам	No.Тествани	Средно
(трансформиращ	трансформанти	съотношение
плазмид)		на В2:В1
1100-SC38 (няма)	9	30,66
1100-SC38 (pWHM3)	21	31,3
1100-SC38 (pSE119)	12	3,7
1100-SC38 (pSE118)	12	30,4
1100-SC38 (pSE185)	14	27,9

Пример 8. Конструиране на S. avermitilis AveC мутанти

Този пример описва конструирането на няколко различни S. avermitilis AveC мутанти при използване на състави и методи, описани по-горе. Общо описание на техниките за въвеждане на мутации в ген на Streptomyces е описано от Kieser and Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204:430458. По-подробно описание е представено от Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI(2):226-233, и от Stutzman-Engwall et al., 1992, J. Bacteriol. 174(1): 144-154. Тези литературни източници са включени в настоящото за справка.

Инактивиране на aveC ген на S. avermitilis

AveC мутанти, съдържащи aveC гени се конструират при използване на различни методи, описани по-долу.

При първия метод 640 bp Sphl/PstI фраг мент, вътрешен за aveC гена в pSEl 19 (плазмид, описан в пример 7 по-горе) се заменя с егшЕ гена (за устойчивост на еритромицин) от Sacc. erytraea. ermE генът се изолира от plJ4026 (предоставен от John Innes Institute, Norwick, UK; виж също Bibb etal., 1985, Gene 41:357-368) чрез смилане c рестрикционен ензим Bg/II и EcoRI, следвано от електрофореза, и се пречиства от гела. Този ~1,7 КЬ фрагмент се лигира в pGEM7Zf (Promega), който е смлян с BamHI и EcoRI, и сместа за лигиране се трансформира в Е. coli ОН5алфа клетки, съгласно препоръките на производителя. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти устойчиви на ампицилин и наличието на ~1,7 КЬ инсърта се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидьт се означава като pSE27.

pSEl 18 (описан в пример 7 по-горе) се смила със SphI и BamHI, подлага се на електрофореза, и ~2,8 kb Sphl/BamHI инсертът се пречиства от гела. pSEl 19 се смила с PstI и EcoRI, подлага се на електрофореза, и ~1,5 kb PstI/ EcoRI инсертът се пречиства от гела. Векторът совалка pWHM3 се смила с BamHI и EcoRI. pSE27 се смила с PstI и SphI, подлага се на електрофореза и ~ 1,7 kb Pstl/SphI инсертът се пречиства от гела. Всичките четири фрагмента (т.е. ~2,8 kb, ~1,5 kb, ~7,2 kb, ~1,7 kb) се лигират заедно в четирипосочно лигиране. Сместа за лигиране се трансформира в компетентни Е. coli ОН5алфа клетки, като се следват препоръките на производителя. Плазмидна ДНК се избира от трансформанти устойчиви на ампицилин, и присъствието на правилния инсърт се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Този плазмид се означава като pSE180 (фигура 3; АТСС 209605).

pSEl80 се трансформира в S. lividans ТК64 и трансформираните колонии се разпознават чрез резистентност на тиострептон и на еритромицин. pSE180 се изолира от S. lividans и се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis. Идентифицират се четири трансформанта на S. avermitilis устойчиви на тиострептон и се приготвят протопласти като се посяват при неселективни условия върху RM14 среда. След регенерирането на протопластите се скринират единични колонии за наличие на устойчивост на еритромицин и липса на устойчивост на тиострептон, което означава хромозомална интеграция на инактивирания aveC ген и загуба на свободния репликон. Идентифицира се един Erm' Thio^s транс формант и се означава като SE18 ΟΙ 1. Общата хромозомална ДНК се изолира от щам SE 180-11, смила се с рестрикционни ензими BamHI, Hindlll, PstI или SphI, разделя се чрез електрофореза върху 0,8% агарозен гел, трансформира се върху найлонови мембрани и хибридизира към ermE проба. Този анализ показва, че хромозомалното интегриране на ermE резистентния ген и едновременната делеция на 640 Ьр Pstl/SphI фрагмента се постига чрез двойно събитие на crossover. ВЕТХ анализ на ферментационните продукти от щам SE 180-11 показва, че нормални авермектини вече не се продуцират (фигура 5А).

При един втори метод за инактивиране на aveC гена, 1,7 kb ermE генът се отстранява от хромозомата на S. avermitilis щам SE180-11, при което остава 640 bp Pstl/SphI делеция в aveC гена. Конструира се плазмид за замяна на гена както следва: pSEl80 частично се смила с Xbal и се пречиства ~11,4 kb фрагмент от гела. От ивицата на -11,4 kb липсва 1,7 kb ermE ген за резистентност. След това ДНК се лигира и се трансформира в Е. coli ОН5алфа клетки. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти устойчиви на ампицилин и присъствието на правилния инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидът, който се означава като pSE184 се трансформира в Е. coli DM1 клетки и плазмид на ДНК се изолира от трансформанти устойчиви на ампицилин. Този плзмид се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis щам SE180-11. Протопластите се приготвят от трансформанти на щам SE180-11 устойчиви на тиострептон и се посяват като единични колонии върху RM14 среда. След регенерирането на протопластите се скринират единични колонии за отсъствието и на двете - устойчивост на еритромицин, както и устойчивост на тиострептон, което показва хромозомално интегриране на aveC гена и загуба на свободния репликон, съдържащ ermE гена. Идентифицира се един Erm^s Thio^s трансформант и се означава като SE184-1-13. Ферментационният анализ на SE184-1-13 има същия ферментационен профил както SE 18 0-11.

При един трети метод за инактивиране на aveC гена се въвежда рамка в хромозомалния aveC ген чрез прибавяне на две G след С в нуклеотидна позиция 471 при използване на PCR, като по този начин се създава BspEl сайт. Присъствието на проектирания BspEl сайт се използва за откриване на събития на генно заместване. PCR праймерите се конструират така, че да въвеждат рамкова мутация в aveC гена, и се доставят от Genosys Biotechnologies, Inc. Дясностоящият праймер е:

5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID N0:8), а лявостоящият праймер е:

5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 9). PCR условията са описани в пример 7 по-горе. 666 bp PCR продуктът се смила с SphI, за да даде два фрагмента от 278 Ьр и 388 Ьр, съответно. 388 Ьр фрагментът се пречиства от гела.

Плазмидът за замяна на гена се конструира както следва: вектор совалка pWHM3 се смила с EcoRI и BamHI. pSE 119 се смила с BamHI и

SphI, подлага се на електрофореза и от тела се пречиства ~840 Ьр фрагмент. pSEl 19 се смила с EcoRI и XmnI, отделя се чрез електрофореза и от гела се пречиства ~ 1,7 kb фрагмент. Всичките четири фрагмента (т.е. ~7,2 kb, ~840 kb, ~1,7 kb и 388 Ьр) се лигират заедно чрез четирипосочно лигиране. Сместа за лигиране се трансформира в компетентни Е. coli ОН5алфа клетки. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти устойчиви на ампицилин, и присъствието на правилния инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ и ДНК секвенционен анализ. Този плазмид се означава като pSE 185, трансформира се в Е. coli DM 1 и се изолира плазмидна ДНК от трансформанти устойчиви на ампицилин. Този плазмид се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis щам 1100-SC38. Изолират се трансформанти от щам 1100-SC38 устойчиви на тиострептон и се анализират чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти. pSE 185 не променя значително съотношението на В2:В 1 авермектин, когато се трансформира в S. avermitilis щам 1100-SC38 (таблица 2).

pSEl 85 се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis за постигане на рамкова мутация в хромозомалния aveC ген. Протопласти се приготвят от трансформанти устойчиви на тиострептон и се посяват като единични колонии върху RM14 среда. След регенерирането на протопластите се скринират единични колони за отсъствие на устойчивост на тиострептон. Изолира се хромозомална ДНК от колонии чувствителни на тиострептон и се скринира чрез PCR за присъствието на рамкова мутация интегрирана в хромозомата. PCR праймерите се конструират на основата на aveC нуклеотидна последователност и са предоставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Дясностоящият PCR праймер е:

5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO: 10), а лявостоящият PCR праймер e:

5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO: 11) като PCR условията са същите както в пример Ί по-горе. Полученият PCR продукт 543 Ьр и, когато се смила с BspE 1 се наблюдават три фрагмента 368 Ьр, 96 Ьр и 79 Ьр, което означава хромозомално интегриране на инактивирания aveC ген и загуба на свободния репликон.

Ферментационният анализ на S. avermitilis мутанти, включващи рамковата мутация в aveC гена показва, че нормалните авермектини вече не се продуцират, и че тези мутанти имат същия ферментационен ВЕТХ профил като щамове SE180-11 и SE184-1-13. Идентифицира се един Thio^s транс формант и се означава като щам SE185-5a.

Допълнително се получава мутация в aveC гена, която променя нуклеотидна позиция 520 от G на А, което води до промяна на кодона, кодиращ триптофан (W) в позиция 116 в терминален кодон. Един щам S. avermitilis с тази мутация не продуцира нормални авермектини и има същия ферментационен профил като щамове SE180-11, SE184-1-13 и SE185-5a.

Допълнително се получават мутации в aveC гена, които променят и двете: (i) нуклеотидна позиция 970 от G на А, което води до промяна на аминокиселината в позиция 256 от глицин (G) на аспартат (D), и (ii) нуклеотидна позиция 996 от Т на С, което променя аминокиселината в позиция 275 от тирозин (Y) на хистидин (Н). Един щам S. avermitilis с тези мутации (G256D/Y275H) не продуцира нормални авермектини и има същия ферментационен профил като щамове SE180-11, SE184-1-13 и SE185-5a.

Инактивираи aveC мутант на S. avermitilis щамове SE180-ll,SE184-l-13HSE185-5aH други представени в настоящото, предоставя скрининг средство за определяне въздействието на други мутации в aveC гена. pSE186, който съдържа копие от див тип на aveC гена се трансформира в Е. coli DM 1, а плазмидна ДНК се изолира от трансформанти устойчиви на ампицилин. Тази pSE186 ДНК се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis щам SE18011. Изолират се трансформанти устойчиви на тиострептон от щам SE180-11, определя се наличието на устойчивост на еритромицин и се анализират Tio^r Erm^r трансформанти чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти. Наличието на функционалния aveC ген in trans дава възможност да се възстанови на щам SE 180-11 продуцирането на нормален авермектин (фигура 5В).

Анализ на мутации в aveC гена, които променят съотношението на клас В2:В 1

Както е описано по-горе S. avermitilis щам SE180-11, съдържащ инактивираи aveC ген се комплементира с плазмид, съдържащ функционален aveC ген (pSE186). Щам SE180-11 също се използва като щам гостоприемник за охарак теризиране на други мутации в aveC гена, както е описано по-горе.

Изолира се хромозомална ДНК от щам 1100-SC38 и се използва като матрица за PCR амплификация на aveC гена. 1,2 kb ORF се изолира чрез PCR амплифициране при използване на праймери проектирани на основата на aveC нуклеотидна последователност. Дясностоящият праймер е SEQ ID NO: 6, а лявостоящият праймер е SEQ ID NO: 7 (виж пример 7 по-горе). Условията за PCR и за субклониране са описани в пример 7. ДНК секвенционният анализ на 1,2 kb ORF показва мутация в aveC гена, която променя нуклеотидна позиция 337 от С на Т, което променя аминокиселината в позиция 55 от серии (S) на фенилалании (F). aveC генът, съдържащ S55F мутация се субклонира в pWHM3 за получаване на плазмид, който се означава като pSEl 87 и който се използва за трансформиране на протопласти на S. avermitilis щам SE18O-11. Изолират се трансформанти устойчиви на тиострептон, определя се наличието на устойчивост на еритромицин и Tio^r Erm^r се анализират чрез ВЕТХ анализ на ферметационните продукти. Присъствието на aveC ген кодиращ промяна в аминокиселинен остатък 55 (S55F) дава възможност да се възстанови нормалната продукция на авермекгин в щам SE180-11 (фигура 5С); въпреки това съотношението на циклохексил В2:циклохексил В1 е приблизително 26:1, като се сравни с щам SE18O-11 трансформиран с pSE186, който има съотношение на В2: В1 от приблизително 1,6:1 (таблица 3), което означава, че единичната мутация (S55F) модулира количеството на продуциран циклохексил В2 по отношение на циклохексил В1.

Идентифицира се друга мутация в aveC гена, която променя нуклеотидна позиция 862 от G на А, което променя аминокиселината в позиция 230 от глицин (G) на аспартат (D). Един щам S. avermitilis, притежаващ тази мутация (G230D) продуцира авермектини при съотношение на В2: В1 от приблизително 30:1.

Мутации, които намаляват съотношението на В2 : В1

Конструират се някои мутации, които намаляват количеството на продуциран циклохексил В2 по отношение на циклохексил В1 както следва.

Идентифицира се мутация в aveC гена, коя то променя нуклеотидна позиция 5 88 от G на А, което променя аминокиселината в позиция 139 от аланин (А) на треонин (Т). AveC генът съдържащ A139Т мутацията се субклонира в pWHM3, за да се получи плазмид, който се означава с pSE 188, и който се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis щам SE180-11. Изолират се трансформанти, устойчиви на тиострептон, определя се наличието на устойчивост на еритромицин и се анализизрат Thio^r Erm^r трансформанти чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти. Присъствието на мутирал aveC ген, кодиращ промяна в аминокиселинен остатък 139 (А139Т) е способно да възстанови на щам SE180-11 (фигура 5D) способността да продуцира авермектин; въпреки това съотношението на В2:В 1 е приблизително 0.94:1, което означава, че тази мутация намалява количеството на продуциран циклохексил В2 по съотношение на циклохексил В1. Резултатът е неочакван, тъй като публикуваните резултати, така както и резултатите от мутациите описани по-горе, единствено показват или инактивиране на aveC гена или увеличаване продукцията на В2 формата на авермектин по съотношение на В1 формата (таблица 3).

Тъй като А139Т мутацията променя съотношението наВ2:В1 в по-благоприятната посока към В1, конструира се мутация, която кодира треонин вместо серии в аминокиселинна позиция 138. В този случай pSE186 се смила с EcoRI и се клонира в pGEEM3Zf (Promega), който е бил смлян с EcoRI. Този плазмид, който е означен като pSE 18 6 А се смила с Apal и ΚρηΙ, ДНК фрагментите се отделят върху агарозен гел и от гела се пречистват два фрагмента от -3,8 kb и ~0,4 kb. Инсерираната ДНК от ~1,2 kb от pSE186 се използва като PCR матрица за въвеждане на промяна на една база в нуклеотидна позиция 585. PCR праймерите се конструират така, че да въвеждат мутация в нуклеотидна позиция 585 и се доставят от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Дясностоящият PCR праймер е:

5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGG CGGAAATGCCCCTGGC-GACG -3' (SEQ ID NO: 12); а лявостоящият PCR праймер e:

5-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO: 13). PCR реакцията се провежда при използване на Adventage GC геномен PCR кит (Clontech Laboratories, Palo Alto, СА) в буфер, предоставен от производителя в присъствие на

200 μΜ dMTPs, 200 pmol от всеки праймер, 50 ng ДНК матрица, 1,0 М GC-Melt и 1 единица KlcnTaq Polymerase Mix в краен обем от 50 μΐ. Термичният профил на първия цикъл е 94°С за 1 min; следван от 25 цикъла при 94°С за 30 s и 68°С за 2 min; и един цикъл при 68°С за 3 min. PCR продуктът с 295 Ьр се смила с Apal и ΚρηΙ, за да се освободи фрагмент от 294 Ьр, който се разделя чрез електрофореза и се пречиства от гела. Всичките три фрагмента (~3,8 kb, ~0,4 КВ и 254 Ьр) се лигират заедно в трипосочно лигиране. Сместа за лигиране се трансформира в компетентни Е. coli ОН5алфа клетки. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти, устойчиви на ампицилин и присъствието на правилния инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидът се означава като pSE198.

pSE198 се смила с EcoRI, клонира се в pWHM3, който е смлян с EcoRI и се трансформира в Е. coli ОН5алфа клетки. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти резистентни на ампицилин и присъствието на правилния инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ и анализ на ДНК последователността. Тази плазмидна ДНК се трансформира в Е. coli DM 1, изолира се плазмидна ДНК от трансформанти резистентни на ампицилин и присъствието на правилния инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидът, който се означава като pSE199 се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis щам SE 180-11. Изолират се трансформанти от щам SE 180-11 резистентни на тиострептон, определя се наличието на резистентност на еритромицин и се анализират Thio^r Erm^r трансформанти чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти. Присъствието на мутирал aveC ген, кодиращ промяна на аминокиселинен остатък 138 (S138T) дава възможност да се възстанови на щам SE 180-11 нормалното продуциране на авермектин; въпреки това съотношението на В2:В1 е 0,88:1, което показва, че тази мутация намалява количеството на продуциран циклохексил-В2, по отношение на циклохексил-Bl (таблица 3). Това съотношение на В2:В1 е даже пониско от съотношението 0,94:1, наблюдавано при А139Т мутацията продуцирана чрез трансформиране на щам SE180-11 с pSE188, както е описано по-горе.

Конструира се друга мутация за въвеждане на треонин в две аминокиселинни позиции 138 и 139. —1,2 kb ДНК инсерт от pSE 186 се използва като PCR матрица. PCR праймерите се конструират така, че да въвеждат мутация в нуклеотидна позиция 585и588исе доставят от Genosy s Biotechnologies, Inc. (Texas). Дясностоящият PCR прайемр е:

5-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGG CGGAAATGCCGCTGG-CGACGACC - 3’ (SEQ ID NO: 14); а лявостоящият PCR праймер e:

5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). PCR реакцията се провежда при условията описани непосредствено по-горе в този раздел. PCR продуктът с 449 Ьр се смила с Apal и ΚρηΙ, за да се освободи фрагмент от 294 Ьр, който се разделя чрез електрофореза и се пречиства от гела. pSEl86а се смила с Apal и ΚρηΙ, ДНК фрагментите се разделят върху агарозен гел, и от гела се пречистват два фрагмента от ~3,8 kb, и ~0,4 kb. Всичките три фрагмента (~3,8 kb, ~0,4 kb и 254 Ьр) се лигират заедно в трипосочно лигиране и сместа за лигиране се трансформира в компетентни Е. coli ОН5алфа клетки. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти, устойчиви на ампицилин и присъствието на правилния инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Този плазмид се означава като pSE230.

PSE230 се смила с EcoRI, клонира се в pWHM3, който е смлян с EcoRI и се трансформира в Е. coli ОН5алфа клетки.

Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти резистентни на ампицилин и присъствието на правилния инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ и анализ на ДНК последователността. Тази плазмидна ДНК се трансформира в Е. coli DM1, изолира се плазмидна ДНК от трансформанти резистентни на ампицилин и присъствието на правилния инсерт се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидът, който се означава като pSE281 се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis щам SE 180-11. Изолират се трансформанти от SE 180-11 резистентни на тиострептон, определя се наличието на резистентност на еритромицин и се анализират Thio^r Erm^r трансформанти чрез ферментация. Присъствието на двойно мутирал aveC ген, кодиращ S138T/A139T дава възможност да се възстанови на щам SE18011 нормалното продуциране на авермектин; въпреки това съотношението на В2 :В1 е 0,84:1, кое35 то показва, че тази мутация още намалява количеството на продуциран циклохексил-В2, по отношение на циклохексил-Bl (таблица 3), над продуцирането, осигурено чрез трансформиране на щам SE180-11 с pSE188 или pSEI99, както е описано по-горе.

Таблица 3

щам S. avermitilis	No.Tecr-	Относи-	Относи-	Средно
(трансформиращ	вани	телна	телна	съотно-
плазмид)	транс-	конц.	конц.	щение на
	форманти	на В2	на В1	В2:В1
SE180-11 (няма)	30	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	26	222	140	1,59
SE180-11 (pSE187)	12	283	11	26,3
SE180-11 (pSE188)	24	193	206	0,94
SE180-11 (pSE189)	18	155	171	0,88
SE180-11 (pSE231)	6	259	309	0,84

Тези резултати са първите, които показват специфични мутации в aveC гена, които водят до продуциране на повишени нива на търговски по-предпочитания клас 1 авермектини по отношение на клас 2 авермектини.

Пример 9. Конструиране на 5' делеционни мутант

Както е обяснено по-горе, нуклеотидната последователност на S. avermitilis, показана на фигура 1 (SEQ ID NO: 1) включва четири различни GTG кодони при Ьр позиции 42,174, 177 и 180, които са потенциални сайтове за начало. Този раздел описва конструирането на множествени делеции на 5' областта на aveC ORF (фигура 1; SEQ ID NO: 1), за да се улесни дефинирането на кои от тези кодони биха могли да функционират като сайтове за начало в aveC ORF за експресия на протеин.

Чрез PCR амплификация се изолират от хромозонална ДНК на S. avermitilis фрагменти от aveC гена, различно делегирани при 5' края. PCR праймерите се конструират на основата на aveC ДНК последователност и се доставят от Genosys Biotechnologies, Inc. Дясностоящите прайемри са:

5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQ ID NO: 16) (D1F1);

5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID NO: 17)(D1F2);

5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID NO: 18) (D1F3); и

5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQ ID NO: 19) (D2F2).

Лявостоящите праймери са:

5’-CATGATCGCTGAACCGA-3’ (SEQ ID NO: 20);

5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 21); и

5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID NO: 22).

PCR реакцията се провежда както е писано в пример 8 по-горе.

PCR продуктите се разделят чрез електрофореза в 1% агарозен гел и се установяват единични ДНК ивици или от~1,0 kb или от~1,1 kb. PCR продуктите се пречистват от гела и се лигират с 25 ng линеаризиран pCR2.1 вектор (Invitrogen) при 1:10 моларно отношение, като се спазват препоръките на производителя. Сместа за лигиране се използва за трансформиране на One Shot™ компетентни Е. coli клетки (Invitrogen), съгласно инструкциите на производителя. Плазмидна ДНК се изолира от трансфор- 5 манти, устойчиви на ампицилин и присъствието на инсерта се потвърждава чрез рестрикционен анализ и анализ на ДНК последователността. Плазмидите се означават като pSE190 (получен с праймер D1F1), pSE191 (получен с праймер 10 D1F2), pSE192 (получен с праймер D1F3) и pSE193 (получен с праймер D2F2).

Всяка инсерирана ДНК се смила с ВашШ/ Xbal, разделят се чрез електрофореза, пречистват се от гела и поотделно се лигират с вектор 15 совалка pWHM3, който е смлян с BamHI/Xbal, при обща концентрация на ДНК от 1 pg при моларно отношение 1:5 на вектор към инсърт. Смесите за лигиране се използват за трансформиране на компетентни Е. coli ОН5алфа клетки. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти, резистентни на ампицилин и присъствието на инсърта се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Тези плазмиди, които се означават като pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) 25 и pDE197 (D2F2) се трансформират поотделно в Е. coli щам DM1. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти резистентни на ампицилин, а присъствието на правилния инсърт се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Тази ДНК се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis щам SE180-11. Изолират се трансформанти резистентни на тиострептон от щам SE180-11, определя се наличието на резистентност на еритромицин и се анализират Thio^r Erm^r трансформанти чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти, за да се определят кои GTG сайтове са необходими за aveC експресия. Резултатите показват, че GTG кодона в позиция 42 може да се елиминира без да се засегне aveC експресията, докато pSE194, pSE195 и pSE196, на всеки от които им липсва GTG сайта в позиция 42, но които всички съдържат трите GTG сайта в позиции 174, 177 и 180, всички са спо20 собни да възстановят нормалното продуциране на авермектин, когато са трансформирани в SE180-11. Нормалното продуциране на авермектин не се възстановява, когато щам SE180-11 се трансформира с pSE197, при който липсват всичките четири от GTG сайта (таблица 4).

Таблица 4

щам S. avermitilis	No.Tecr-	Относи-	Относи-	Средно
(трансформиращ	вани	тел на	тел на	съотно-
плазмид)	транс-	конц.	конц.	щение на
	форманти	на В2	на В1	В2:В1
SE180-11 (няма)	6	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	6	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	6	241	152	1,58
SE180-11 (pSE194)	6	35	15	2,43
SE180-11 (pSE195)	6	74	38	1,97
SE180-11 (pSE196)	6	328	208	1,58
SE180-11 (pSE297)	12	0	0	0

Пример 10. Клониране на aveC хомолози от S. higroscopicus и S. griseochromogenes

Настоящото изобретение позволява да се идентифицират и да се клонират aveC хомоложни гени от други видове на Streptomyces продуциращи авермектин или милбемицин. Например, геномна ДНК от козмидна библиотека от S. 5 0 hygroscopicus (FERM BP-1901) се хибридизира с 1,2 kb aveC проба от S. avermitilis, описан погоре. Идентифицират се няколко козмидни клона, които силно хибридизират. От тези козмиди се изолира хромозонална ДНК и се идентифицира 4,9 kb ΚρηΙ фрагмент, който хибридизира с aveC пробата. Тази ДНК се секвенира и се идентифицира една ORF (SEQ ID NO: 3), която притежава значителна хомоложност с aveC ORF от

S. avermitilis. На фигура 6 е представена аминокиселинна последователност (SEQ ID NO: 4), изведена от aveC хомоложна ORF от S. hygroscopicus.

Освен това, геномна ДНК от козмидна библиотека от S. griseochromogenes хибридизира с 1,2 kb aveC проба от S. avermitilis, описан по-горе. Идентифицират се няколко козмидни клона, които силно хибридизират. От тези козмиди се изолира хромозомална ДНК и се идентифицира 5,4 kb PstI фрагмент, който хибридизира с aveC пробата. Тази ДНК се секвенира и се идентифицира ORF частичен aveC хомолог, който притежава значителна хомоложност с aveC ORF от S. avermitilis. На фигура 6 е представена изведена частична аминокиселинна последователност (SEQ ID N0: 5).

Анализът на ДНК и на аминокиселинната последователност на aveC хомолозите от S. hygroscopicus и от S. griseochromogenes показват, че тези области споделят значителна хомоложност (~50% идентичност на последователности на аминокиселинно ниво), както една към друга, така и към aveC ORF от S. avermitilis и към aveC генния продукт (фигура 6).

Пример 11. Конструиране на плазмид с aveC гена след еппЕ промотора

1,2 kb aveC ORF от pSE186 се субклонира в pSE34, който е векторът совалка pWHM3, който притежава 300 bp еппЕ промотор, инсериран като KpnI/BamHI фрагмент в KpnI/BamHI сайта на pWHM3 (виж Ward et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 203:468-478). pSE186 се смила c BamHI и Hindlll, разделя се чрез електрофореза и се изолира 1,2 kb фрагмент от агарозния гел и се лигира с pSE34, който е смлян с BamHI и Hindlll. Сместа за лигиране се трансформира в компетентни Е. coli ОН5алфа клетки, съгласно инструкциите на производителя. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти, устойчиви на ампицилин и присъствието на 1,2 kb инсерта се потвърждава чрез рестрикционен анализ. Плазмидът, който се означава като pSE 189 се трансформира в Е. coli DM 1 и се изолира плазмидна ДНК от трансформанти, устойчиви на ампицилин. Протопласти на S. avermitilis щам 1100-SC38 се трансформират с pSEl 89. Изолират се трансформаити, устойчиви на тиострептон от щам 1100SE38 и се анализират чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти.

S. avermitilis щам 1100-SC38 трансформанти, съдържащи pSE 189 претърпяват промяна на съотношението на продуциран авермектин циклохексил - В2 : авермектин циклохексил - В1 (приблизително 3:1) в сравнение с щам 1100SC38 (приблизително 34:1), а общата продукция на авермектин се увеличава приблизително 2,4 пъти в сравнение с щам 1100-SC38, трансформиран с pSEl 19 (таблица 5).

pSE189 също се трансформира в протопласти на щам S. avermitilis от див тип. Изолират се трансформанти, устойчиви на тиострептон и се анализират чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти. Общото количество на авермектини, продуцирани от S. avermitilis от див тип, трансформиран с pSE189 се увеличава приблизително 2,2 пъти в сравнение с S. avermitilis от див тип, трансформиран с pSE 119 (таблица 5).

Таблица 5

щам S. avermitilis (трансформиращ плазмид)	No.Tecrвани трансформанти	Относително [В2]	Относително [В1]	Относителни общи Авермектини	Средно съотношение на В2:В1
1100-SC38	6	155	4,8	176	33,9
1100-SC38 (pSE119)	6	239	50,3	357	4,7
SE180-11 (pSE189)	16	546	166	849	з.з
див тип	6	59	42	113	1,41
див тип (PSE119)	6	248	151	481	1,64
див тип (PSE189)	5	545	345	1,071	1,58

Пример 12. Химерен плазмид, съдържащ последователности от aveC ORF от S. avermitilis и aveC хомолог от S. hygroscopicus

Конструира се хибриден плазмид означен като pSE350, който съдържа 564 bp aveC хомоложен участък от S. hygroscopicus заместващ 564 Ьр хомоложен участък от aveC ORF на S. avermitilis (фигура 7), както следва. pSE 350 се конструира при използване на BsaAI рестрикционен сайт, който се запазва при двете последова- 35 телности (aveC позиция 225), и ΚρηΙ рестрикционен сайт, който присъства в aveC гена на S. avermitilis (aveC позиция 810). ΚρηΙ сайтът се въвежда в ДНК на S. hygroscopicus чрез PCR, при използване на дясностоящ праймер 5'- 40 CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 23) и лявостоящ праймер 5'-GAACTGGTACCAGTGC СС-3' (SEQ ID NO: 24) (доставени от Genosys Biotechnologies) при използване на условия за PCR описани в пример 7, по-горе. PCR продук- 45 тът се смила с BsaAI и ΚρηΙ, фрагментите се разделят чрез електрофореза в 1% агарозен гел и от гела се изолира 564 Ьр BsaAI/ΚρηΙ фрагемнта. pSE179 (описан в пример 7 по-горе) се смила с ΚρηΙ и Hindlll, фрагментите се разделят чрез 5 0 електрофореза в 1% агарозен гел и от гела се изолира ~4,5 kb фрагмент. pSE179 се смила с Hindlll и BsaAI, фрагментите се разделят чрез електрофореза в 1% агарозен гел и от гела се 30 изолира ~0,2 kb BsaAI/Hindlll фрагемнт. Фрагментите ~4,5 kb Hindlll/Kpnl, ~0,2 kb BsaAI/ Hindlll и 564 bp BsaAI/ΚρηΙ от S. hygroscopicus се лигират заедно в трипосочно лигиране и сместа за лигиране се трансформира в компетентни Е. coll DH5 алфа клетки. Плазмидна ДНК се изолира от трансформанти, устойчиви на ампицилин и присъствието на правилния инсърт се потвърждава чрез рестрикционен анализ, при използване на ΚρηΙ и Aval. Този плазмид се смила с Hindlll и Xbal, за да се освободи 1,2 kb инсърт, който след това се лигира с pWHM3, който е смлян с Hindlll и Xbal. Сместа за лигиране се трансформира в компетентни Е. coli ОН5алфа клетки, плазмидна ДНК се изолира от трансформанти, устойчиви на ампицилин и присъствието на правилния инсърт се потвърждава чрез рестрикционен анализ при използване на Hindlll и Aval. Тази плазмидна ДНК се трансформира в Е. coli DM 1, плазмидна ДНК се изолира от трансформанти, устойчиви на ампицилин и присъс твието на правилния инсърт се потвърждава чрез рестрикционен анализ и анализ на ДНК последователността. Този плазмид се означава като pSE35O и се използва за трансформиране на протопласти от S. avermitilis щам SE18O-11. Изоли- 5 рат се трансформанти на щам SE180-11, устойчиви на тиострептон, определя се наличието на устойчивост на еритромицин и се анализират Thio^r Епп^г трансформанти чрез ВЕТХ анализ на ферментационните продукти. Резултатите показват, че S. avermitilis/S. hygroscopicus хибриден плазмид имат средно съотношение В2:В1 от приблизително 109:1 (таблица 6).

Таблица 6

щам S. avermitilis	No. Тест-	Относи-	Относи-	Средно
(трансформиращ	вани	тел на	тел на	съотно-
плазмид)	транс-	конц.	конц.	шение на
	форманти	на В2	на В1	В2:В1
SE180-11 (няма)	8	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	8	0	0	0
SE180-11 (pSE350)	16	233	2	109

Депозиране на биологични материали

Следният биологичен материал е депози- 25 ран в American Type Culture Collection (АТСС) при 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, на 29.01.1998 г. и е получил следните вхо

Входящ номер

209605

209604 дящи номера:

Плазмид

Плазмид pSE 180

Плазмид pSEl 86

Всички патенти, заявки за патент и цитирани публикации са включени в настоящото за литературна справка. 3 5

Обхвата на настоящото изобретение не се ограничава от специфичните варианти за изпълнение на изобретението, описани в настоящото, които са представени единствено за илюстриране на отделните аспекти на изобретението. В дей- 4 0 ствителност, от горните описания и прилежащите фигури ще са явни за специалистите в областта много други различни модификации, освен тези показани и описани в настоящото. Счита се, че такива модификации попадат в обхвата на при- 45 лежащите патентни претенции.

Claims (53)

1. Патентни претенции

   1. Изолирана полинуклеотидна молекула, 5 0 включваща пълната aveC отворена рамка за разчитане (ORF) от Streptomyces avermitilis или съществена част от нея, на която изолирана полинуклеотидна молекула й липсва следващата пълна ORF, която се намира в посока downstream от aveC ORF in situ в хромозомата на Streptomyces avermitilis, и чиято ORF притежава нуклеотидната последователност от фигура 1 (SEQIDNO: 1).
2. 2. Изолирана полинуклеотидна молекула съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че включва освен това нуклеотидни последователности, които обикновено ограничават aveC гена in situ в S. avermitilis.
3. 3. Изолирана полинуклеотидна молекула, която притежава нуклеотидна последователност, която е хомоложна на aveC продукткодираща нуклеотидна последователност от Streptomyces avermitilis на aveC ORF показана на фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или на нейна съществена част.
4. 4. Изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидната последователност от SEQ ID N0: 3 или нейна съществена част, или нуклеотидна последователност, хомоложна на нуклеотидната последователност от SEQ ID NO: 3.
5. 5. Олиго нуклеотидна молекула, която хибридизира към полинуклеотидната молекула от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или към SEQ ID NO: 3, или полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, комплементарна на нуклеотидната последователност от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или SEQ ID NO: 3, при много строги условия.
6. 6. Олигонуклеотидна молекула съгласно претенция 5, характеризираща се с това, че е комплементарна на нуклеотидната последователност от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или SEQ ID NO: 3, или на полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е комплементарна на нуклеотидната последователност от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или SEQ ID NO: 3.
7. 7. Рекомбинантен вектор, включващ полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, избрана от група, състояща се от нуклеотидната последователност на aveC ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или от нейна съществена част; и нуклеотидна последователност, хомоложна на продукгкодираща ORF aveC ген на S. avermitilis от фигура 1 (SEQ ID N0:1) или на нейна съществена част.
8. 8. Рекомбинантен вектор съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че включва освен това, нуклеотидна последователност, кодираща един или повече регулаторни елементи, която регулаторна елементкодираща нуклеотидна последователност е оперативно свързана с нуклеотидната последователност на полинуклеотидната молекула на вектора от претенция 7.
9. 9. Рекомбинантен вектор съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че включва освен това, нуклеотидна последователност, кодираща селекционен маркер.
10. 10. Рекомбинантен вектор съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че е плазмид pSE186 (АТСС 209604).
11. 11. Клетка гостоприемник, включваща рекомбинантен вектор съгласно претенция 9.
12. 12. Клетка гостоприемник съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че е Streptomyces avermitilis.
13. 13. Рекомбинантен вектор, включващ полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, избрана от група, състояща се от нуклеотидна последователност на SEQ ID NO: 3 или нейна съществена част; нуклеотидна последователност, хомоложна на нуклеотидна последователност от SEQ ID N0:3; и нуклеотидна последователност, която кодира поли пептид, притежаващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 4.
14. 14. Рекомбинантен вектор съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че включва освен това, нуклеотидна последователност, кодираща един или повече регулаторни елементи, която нуклеотидна последователност, кодираща регулаторни елементи, е оперативно свързана с нуклеотидната последователност от полинуклеотидната молекула на вектора от претенция 13.
15. 15. Рекомбинантен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че включва освен това нуклеотидна последователност, кодираща селекционен маркер.
16. 16. Клетка гостоприемник, включваща рекомбинантен вектор съгласно претенция 15.
17. 17. Клетка гостоприемник съгласно претенция 16, характеризираща се с това, че е Streptomyces hygroscopicus.
18. 18. Изолиран aveC генен продукт от S. avermitilis, притежаващ аминокиселинна последователност, кодирана от S. avermitilis aveC ген продукгкодираща нуклеотидна последователност на плазмид pSEl86 (АТСС 209604), или аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 2 или нейна съществена част, или неин хомоложен полипептид.
19. 19. Изолиран хомоложен aveC генен продукт от S. hygroscopicus, притежаващ аминокиселинна последователност от SEQ ID N0: 4.
20. 20. Метод за получаване на рекомбинантен aveC генен продукт, характеризиращ се с това, че се ю/лтивират клетките гостоприемници, трансформирани с рекомбинантния експресионен вектор, като посоченият рекомбинантен експресионен вектор включва полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, кодираща аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2 или нейна съществена част, която полинуклеотидна молекула е оперативно свързана с един или повече регулаторни елементи, които контролират експресията на полинуклеотидната молекула в клетката гостоприемник, при условия, водещи до продуциране на рекомбинантния AveC генен продукт, и получаване на AveC генния продукт от клетъчната култура.
21. 21. Метод за получаване на рекомбинантен aveC хомоложен генен продукт, характеризиращ се с това, че се култивират клетките гос експресионен вектор, като посоченият рекомбинантен експресионен вектор включва полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, кодираща аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 4 или нейна съществена част, която полинуклеотидна молекула е оперативно свързана с един или повече регулаторни елементи, които контролират експресията на полинуклеотидната молекула в клетката гостоприемния, при условия, водещи до продуциране нарекомбинантнияАуеС хомоложен генен продукт, и получаване на AveC хомоложния генен продукт от клетъчната култура.
22. 22. Полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която иначе е същата като кодиращата продукт последователност на aveC гена на S. avermitilis от плазмид pSE 186 (АТСС 209604) или нуклеотидната последователност на aveC ORF на S. avermitilis, както е показана на фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или неин вариант на разпада на генетичния код, но която нуклеотидна последователност включва освен това една или повече мутации, така че клетките на S. avermitilis щам АТСС 53692, в които aveC апелът от див тип е бил инактивиран и които експресират полинуклеотидната молекула, включваща мутиралата нуклеотидна последователност, продуцират намалено съотношение на циклохексил В2: циклохексил В1 авермектини, когато ферментират в присъствие на циклохексанкарбоксилна киселина, отколкото продуцират клетките на S. avermitilis щам АТСС 53692, които вместо това експресират единствено aveC алела от див тип.
23. 23. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че пониженото съотношение на циклохексил В2 : циклохексил В1 е по-малко от 1,6:1.
24. 24. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 23, характеризираща се с това, че пониженото съотношение на циклохексил В2 : циклохексил В1 е по-малко от 0,94:1.
25. 25. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 24, характеризираща се с това, че мутацията на aveC ORF на S. avermitilis от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) кодира заместване на един аминокиселинен остатък 139 от aveC генния продукт от аланин на треонин.
26. 26. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 23, характеризираща се с това, че намаленото съотношение на циклохексил В2 : циклохексил В1 е приблизително 0,88:1.
27. 27. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 26, характеризираща се с това, че мутацията на aveC ORF на S. avermitilis от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) кодира заместване на един аминокиселинен остатък 138 от aveC генния продукт от серин на треонин.
28. 28. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 23, характеризираща се с това, че намаленото съотношение на циклохексил В2: циклохексил В1 е приблизително 0,84:1.
29. 29. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 28, характеризираща се с това, че мутацията на aveC ORF на S. avermitilis от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) кодира едно първо заместване на един аминокиселинен остатък 138 от aveC генния продукт от серин на треонин и едно второ заместване на аминокиселинен остатък в позиция 139 на aveC генния продукт от аланин на треонин.
30. 30. Полинуклеотиднамолекула, включваща силен промотор, оперативно свързан с S. avermitilis aveC ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1).
31. 31. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 30, характеризираща се с това, че силният промотор е еппЕ промотор от Saccharopolyspora erythraea.
32. 32. Полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща ORF на продукткодиращ aveC ген от фигура 1 (SEQ ID NO: 1), която е била инактивирана чрез инсериране в посочената нуклеотидна последователност на хетероложна нуклеотидна последователност.
33. 33. Полинуклеотидна молекула, включваща aveC алел, който е бил инактивиран чрез делегиране на 640 bp Pstl/SphI фрагмент от aveC ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1).
34. 34. Полинуклеотидна молекула, съдържаща aveC алел, който е бил инактивиран чрез въвеждане на рамкова мутация в aveC ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1).
35. 35. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 34, характеризираща се с това, че рамковата мутация се въвежда чрез добавяне на два G нуклеотида след С нуклеотида в нуклеотидна позиция 471 върху aveC ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1).
36. 36. Полинуклеотидна молекула, включваща aveC алел, който е бил инактивиран чрез въвеждане на терминален кодон в нуклеотидна позиция, която кодира аминокиселина 116 на S. avermitilis aveC генния продукт, кодиран от aveC ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1).
37. 37. Полинуклеотидна молекула, включваща aveC алел, който е бил инактивиран чрез въвеждане на първа мутация в аминокиселинна позиция 256 на aveC генния продукт, която променя глицин на аспартат, и втора мутация в позиция 275 на aveC генния продукт, която променя тирозин на хистидин.
38. 38. Вектор за замяна на гени, съдържащ полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидни последователности, които ограничават aveC ORF in situ в хромозомата на S. avermitilis.
39. 39. Рекомбинантен вектор, съдържащ полинуклеотидната молекула от която и да е от претенциите от 22 до 3 7.
40. 40. Рекомбинантен вектор, съдържащ полинуклеотидна молекула съгласно претенция 32, характеризираща се с това, че е pSEl80 (АТСС209605).
41. 41. Клетка гостоприемник Streptomyces, включваща рекомбинантния вектор от претенция 39.
42. 42. Метод за идентифициране на мутация на aveC ORF, способни да намалят съотношението на продуцирани клас 2:1 авермекгини, характеризиращ се с това, че включва:

    а) определяне съотношението на клас 2:1 авермекгини, продуцирани от клетки на щам от S. avermitilis, в които нативният aveC алел е инактивиран, и в които е въведена и се експресира полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща мутирал aveC генен продукт;

    б) определяне съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на същия щам от S. avermitilis, както в етап а), но които вместо това експресират единствено aveC алел, притежаващ нуклеотидната последователност на ORF от фигура 1 (SEQ ID NO: 1) или негова хомоложна нуклеотидна последователност; и

    в) сраняване съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап а) към съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на S. avermitilis, от етап б); така че, ако съотношение то на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап а), е по-ниско от съотношението на клас 2:1 авермекгини, продуцирани от клетки на S. avermitilis от етап б), тогава се идентифицира мутация на aveC ORF, способна да намали съотношението на клас 2:1 авермектини
43. 43. Метод за получаване на нови щамове от S. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел, и които продуцират намалено съотношение на клас 2:1 авермектини, в сравнение с клетки от същия щам S. avermitilis, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип, характеризиращ се с това, че се трансформират клетки на щам S. avermitilis с вектор, който пренася мутирал aveC алел, кодиращ генен продукт, който намалява съотношението на клас 2:1 авермекгини, продуцирани от клетки на щам от S. avermitilis, експресиращи мутирал aveC алел, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алел от див тип, и се селекционират трансформирани клетки, продуциращи авермекгини при намалено съотношение на клас 2:1, в сравнение със съотношението на клас 2:1, продуцирани от клетки на щама, които вместо това експресират aveC алел от див тип.
44. 44. Метод за получаване на нови щамове от S. avermitilis, чиито клетки съдържат инактивиран aveC алел, характеризиращ се с това, че се трансформират клетки от щам S. avermitilis с вектор, който инактивира aveC алела, и се селекционират трансформирани клетки, в които aveC алелъте бил инактивиран.
45. 45. Метод съгласно претенция 44, характеризиращ се с това, че векторът е pSE180 (АТСС 209605).
46. 46. Щам от S. avermitilis, включващ клетки, експресиращи мутирал aveC алел, който води до продуциране от клетките на авермектин в намалено съотношение на клас 2:1, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират единствено aveC алела от див тип.
47. 47. Щам съгласно претенция 46, характеризиращ се с това, че клетките продуцират циклохексил В2:циклохексил В1 авермектини в съотношение, по-малко от 1,6:1.
48. 48. Щам съгласно претенция 46, характеризиращ се с това, че клетките продуцират циклохексил В2 : циклохексил В1 авермектини в съотношение от приблизително 0,94:1.
49. 49. Щам съгласно претенция 46, характе- ризиращ се с това, че клетките продуцират циклохексил В2: циклохексил В1 авермектини в съотношение от приблизително 0,88:1. 5
50. 50. Щам съгласно претенция 46, характеризиращ се с това, че клетките продуцират циклохексил В2: циклохексил В1 авермектини в съотношение от приблизително 0,84:1.
51. 51. Щам от S. avermitilis, включващ клетки, в които aveC генът е бил инактивиран.
52. 52. Метод за получаване на авермектини, характеризиращ се с това, че се култивират клетки на щам от S. avermitilis, които експресират мутирал aveC алел, който кодира генен продукт, 15 намаляващ съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на щам от S. avermitilis, експресиращ мутиралия aveC алел, в сравнение с клетки от същия щам, които не експресират мутиралия aveC алел, а вместо това 20 експресират единствено aveC алела от див тип, в културална среда, при условия, позволяващи или индуциращи продуцирането на авермектини и посочените авермектини се получават от културата.
53. 53. Състав на авермектини, продуцирани от клетки на щам от S. avermitilis, които експресират мутирал aveC алел, който кодира генен продукт, намаляващ съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на щам от S. avermitilis, експресиращи мутиралия aveC алел, 10 в сравнение с клетки от същия щам, които не експресират мутиралия aveC алел, а вместо това експресират единствено aveC алела от див тип, характеризиращ се с това, че се продуцира при намалено съотношение на клас 2:1, в сравнение със съотношението на клас 2:1 авермектини, продуцирани от клетки на същия щам от S. avermitilis, които не експресират мутиралия aveC алел, а вместо това експресират единствено aveC алела от див тип.