CZ717089A3 - Indaceno (3,2-d) oxacyklododecin-7,15-diony, způsob jejich přípravy, ektoparasiticidní prostředky a způsoby inhibice hmyzu, roztočů a hmyzích ektoparazitů - Google Patents

Description

(54) Název přihlášky vynálezu:

Indaceno (3,2-d) oxacyklododecin-7, 15-dioňy, způsob jejich přípravy, ektoparasiticidní prostředky á způsoby inhibice hmyzu, roztočů a hmyzích ektoparazitů (57) Anotace:

Řešení se týká indaceno / 3,2-d/oxacyklododecln-7,15-dionů obecného vzorce I, produkovaných nově popsanými třídami Sáccharopolyspora spinosa, a jejich adiční solí s kyselinami, které jsou použitelné jako insekticidy, zejiííciiú piotí di uhum Lepídopícra a‘Díptera.“ Jsou popsány ektopáraziticidní prostředky a neterapeutické způsoby kontroly populace hmyzích ěkťopářažitů .

TíSt

JUDr. Otakar Švorčík _ advokát ’

Hálkova 2,120 00 Praha 2

Wace^o (2>, 1 -ct) rnsacukío^oofecÍm - ¥,45~- cUtPřHj, xpn&o^b <l^e<T — pNpreVfl, ^rosťnackl^ O hrvijXU . rox^oČá g/fiUop^^²·¹^.

tCnacktá eidní - a akaricidní—prostředek—a—apůoob—přípravy—účinné

XX1-.5 •LUCJt^ 7

Oblast techniky

Vynález se týká nové skupiny makrolidových sloučenin, které mají insekticidní a akajricidní účinek.

Dosavadní stav techniky

Stále je zapotřebí vyvíjet nové insekticidy a akaricidy, neboť cílové organismy si rychle vyvíjejí resistenci vůči běžně užívaným insekticidům a akaricidům. U anthropodů je resisteňce vůči insekticidům velmi rozšířená, alespoň 400 druhů je resistentních vůči jednomu nebo více insekticidům běžně užívaným. Vývoj resisteňce vůči starším insekticidům, jako jsou DDT, karbamáty a organofosfáty, . je dobře .znám. Resisteňce se však vyvinula i vůči některým novým pyrothroidním insekticidům a akaricidům. Proto je ‘potřeba stále vyvíjet nové insekticidy a akaricidy.

Hubení ektoparasitů, jako jsou blechy, roztoči, bodalky stálové a pod, .je již dlouho důležitým problémem při chovu dobytka. Obvyklé ošetřování domácích zvířat se provádí topickou aplikací insekticidů, jako jsou známé koupele pro ovce. Tato ošetřování jsou stále velmi rozšířena. V současné době je úkolem výzkumů nalézat sloučeniny, které by se mohly_ aplikovat zvířatům, zejména orálně, a které by hubily ektoparazity, jakmile by tito požili krev. .ošetřených, zvířat.......... ........... ................

- 2 Podstata vynálezu ,Bí®/áÍ2Žeriý___yynález..._.s.e„^_-týká—nových—fe-rmentačn-í-eh-—produktů, indaceno(3,2-d)oxacyklododecin-7,15-dionů, které jsou označovány jako „A83543', a které se skládají z jednotlivých složek, označovaných jako A83543A, A83543B, A83543C, 'A83543D, A83543E,

A83543F, A83543G, A83543H a A83543J. A83543 a jednotlivé složky A83543 jsou použitelné k hubení hmyzu, zejména druhů Le1 pidoptera, jako je Prodenia eridania, a Diptera, jako jsou me sařky, bodálky stájové a moskyti, a lze z nich připravit užité né insekticidní prostředky, Čímž sa jejich použitím snižují pc pulace hmyzu nebo roztočů·

Sloučeniny A83543 podle vynálezu jsou sloučeniny obec ného vzorce I

methyl nebo ethyl, nebo aole s kyselinami těch sloučenin, kde β je jiné než vodil

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu z hlediska jejich snadné“připravy js7u ty, kd^R, ~R¹7^³7^⁴7*Ř⁵ a R⁶^majT následujioí významy:

R	R1	rS	B*	Β*	B6
(a)	Me '	H	Et	Me	Me
(b)	Me /	H	Et	Me	Me
(c)	Me	H	Et	Me	M e
Ca)	Me	Me	Et	Me	Me
<oj	Me	H	Me	Me	Me
(a)	H	H	Et	Me	Me
Cd)	Me	H	Et	Me	Me
Ca)	Me	H	Et	H	Me
Ca)	Me	H	Et	Me	H
H	Me	H	Et	Me	Me
H	Me	Me	Et	Me	Me
H	Me	H	Me	Me	Me
H	H	H	Et	Me	Me
H	Me	H	Et	H	Me
H	Me	H	Et	Me	H

- 5 nebo sole s kyselinami těch sloučenin, kde R je jiné než vodík·

Aminocukrem v A83543A je β-D-forosamin a. neutrálním cukrem v A83543A je a-2,3»4-tri-O-methylrhamnosa·

Bylo charakterizováno devět složek A83543· Tyto slož---------tjy.. jg_Ou -g-i o uc enina mi -obecného vzorce -I, kde- R j e—j iné-než- vodík . Mají následující struktury:

složka	R	R1	Β’	R4	R5	R6
A	(a)	Me	H	Et	Me	Me
B	(b)	Me	H	Et	Me	Me
C	(c)	Me		Et	. Me	Me
D	(a)	Me	Me	Et	Me	Me
E .	(a)	Me	H	Me	Me	Me
P	(a)	H	H	Et	Me	Me
. „G .		Me	H	Et	Me __	Me
Ή	(a)	Me	H	Et	H '	Me
J	(a)	Me	H	Et	Me	H

Odstraněním aminocukru ze složek A83543 ^se získají o

pseudoaglykony (sloučeniny obecného vzorce I, kde R je H). Slož-1» - a _ •V »» •D»

s e u d css-lv k on— (A 83^^34--n s e.u doÉlv« kon nebo pseudo-A). A83543/lp3eud<^lykon. byl nalezen jako přírodní produkt jako složka A83543· Složky D, Ε, P, Ha J mají specifický pseudo^Lykon. A83543 pseudo^lykony mají následující struktury í

?seudc^lykona	R1 Λ	R3	R4	R5	E6
-............................—	----————-·	...-------——	—- -
A83543A	Me	H	Et	Me	Me
A83543D	Ma	Me	Et	Me	Me
A83543E	Me	Ή	Me	Me	Me
A83543P	H.	Ή	Et	Me	Me
A83543H	Me	Η	Et	H	Me
A83543J	Me	Η	Et	Me	B 7
aR = H		► · · · ·	, .... . —.....	------Γ--.	a

Pseudoaglykóny jsou použitelné jako meziprodukty, na· příklad pro složky A83543.

Následující odstavce uvádějí souhrnně fyzikální a spektrální vlastnosti složek.A83543 a pseudoaglykonů. níže se používají následující zkratky:

EX-MSí hmotnostní spektrometrie - ozařování elektrony

PAB-MS: hmotnostní spektrometrie - ozařování rychlými atoi

PD-MS: hmotnostní spektrometrie - desorpce polem

HPLC: vysokotlaká kapalinová chromatografie

IR* infračervené spektrum (ϋία. k -UÍno&é 1/ a

NMR: nukleární magnetická resonance .

UV: ultrafialové spektrum

- 7 Charakteristiky A8354A molekulární hmotnost: 731

Bnpirický vzorec: ^σ41^Η65^θ1Ο

PD-MS: viz obr. 4

FAB-13S(lí+l) nalezeno: 732,4706$ vypočteno pro ^C4i^H66^Koio = 732,4687 (viz obr. 8)

KE-MS: nalezeno: 731,4612$ vypočteno 731»4608 (viz obr. 10)

UV (EtOH) X_Ba3J 243“om ( £ 8 9 20)“, ------------------ —~ ’

IČ (CHClj):^ (lakton) 1?13; (konjugovaný keton) 1657$ multiplety pro C-H —1 vibrace kolem 2940 a pro C-0 vibrace kolem 1060 cm (viz obr

-121,8 ⁰ (c 1,03, CHC1₃) [a]³⁶? +6,8 ⁰ (c í,03, CHCI.)

D * ^J

Tabulka I uvádí ¹H a ¹³C HlflR data naměřená u A83543A (V acetonu-dg).

Tabulka 1 ¹H a ¹³C HMŘ data A83543A v acetonu dg poloha ¹³C

1	172,02	—
2	33,83	3,07/2,45
3	48,13	2,94
4	41,65	3,48
5	:129,12	5,86
6	129,66	5,89
7	41,46	2,15
8	36,50	1,99/1,34
9	76,31*	4,31

- 8 poloha

Ifi ,14

- 37,65' 46,42 49,74 147,78 144,27 202,46

2,36/1736

0,93

2,87

7,01

16 17. IQ .	47,74 , _ 2 80,41 ..........-ΟΛ ΛΟ. .. . ..	3,30 .....3,53 .................-I - ______ -......
“A 0........h.- . -----T	JO ,33	1,51
19	21,85	1,78/1,17
20	34,45	1,50
21	76,24*	4,66
22	28,51	1,48
23	8,97	0,81
24	15,71	1,12
1*	96,34	4,81
2*	77,61	3,51
3*	81,87	3,37
4'	82,43	3,00
5'	68,03	3,48
6'	17,64	1,18
2*-OCH3	56,66 *	3,37
3*-0CH3	58,394	3,41
4*-0CH3	60,12	3,45

poloha ^l3C ^H®

1	103,45	4,45
2	31,24	X,92/1,37
3	18,14	1,84/1,52
4	65,34	2,12
5	73,35	3,56
6 .............	...........-.....1.8,87.......í__________ .....	... .1,21. .......
H(CH3)2	40,38	2,22
aněkterá měření	1 13 odvozená z H/ ^C korelace

-|r φ * ^x resonance se stejnými indexy mohou být zaměňovány·

Charakteristiky AQ3543B

Molekulární hmotnost: 717

Empirický vzorec:

fat θ$υ· β) gharakteristiky A835430

Molekulární^hmotnosť^TOJ“ _ _

Enpirický vzorec: ^q39^H6l^N010 PD-MS: (viz obr. 5)

Charakteristiky A33543D

Molekulární hmotnost: 745 Empirický vzoreo: Ο^^Η^γΝΟ^θ ”~5v7EtOH?5<max^s 244‘n® (£ 9 9Ío7^™^ ”””

- IČ (CHCl^): /0 (lakton) 1708? (konjugovaný keton) 1658? multiplety pro C-H

- 10 vibrace kolem 2940 a pro C-0 vibrace kolem 1070 cm“¹ (viz obr· 2) w?⁹ : -142,9° (c 1,02, CHC1₃)

Ca]365 _; 29,9 ° (£ 1,02, CHC1₃)

FD-MS: viz obr. 6

Tabulka II uvádí ¹H a ¹^C NMR data naměřená u A83543D (v acetonu-dg).

T a b u Ík a II a «Ο NMR data A83543D v acetonu-dg poloha ——_r3~- — ^lga-

1	172,68	—
2	34,38	3,08/2,43
3	49,01	2,90
4	42,83	3,47
5	123,27	5,54
6	137,26
6-CH3	20,81	1,74
7	44,41	2,18
8	35,61	2,01/1,45
9	76,72	4,32
10	38,64	2,37/1,37
11	47,04	1,02
12	50,05	2,78
13	148,47	7,04
14	145,19	—
15	203,16	—
16	48,47	3,30
17	81,03	3,53

poloha	13c
18	30,99	1,49
19	22,51	1,78/1,19
20	35,12	1,49
21	76,84	4,65
22	29,16	1,48
23	9,55	0,81
- /:Ť- -- - ......—....------	------- .. „—.............. ---— .	- - . ------------------- ---- . ----------
24	16,32	1,12
1*	97,11	4,85
2*	78,33	3,54
3*	82,58	3,40
4'	83,15	3,03
5'	68,71	3,50
6'	18,26	1,18
2*-0CH3	57,31*	3,40
3*-OCH3	59,02*	3,43
4*-0CH“	~ 60,71 “	3,47
1**	104,14	4,47
2**	31,96	1,94/1,39
.—#·+-------;--		, , · t,, , · · .....-Γ-
3	18,83	1,81/1,49
4	66,06	2,12
5	74,12	3,55
c** ...	________ 1 η Λ *5.
	.............. ......-/f-r*........	...... · · Jb j C.V · --
h(C83)2	40,99	2,21

®některá stanovení odvozena z ^H/13/C korelace resonance mohou být zaměňovány

Charakteristiky A83543E molekulární hmotnost: 717

Bapirický vzorec : ^θΗ^ΝΟ^θ __ _________

FAB-HS (U+l): nalezeno: 718,4526; vypočteno pro ^C4O^H64^KO1O 718,4530

UV (EtOH) λ _Bax: 244 nm (£ 8 600)

IČ spektrum (KBr) (viz obr. 13)

Tabulka III uvádí a uiB data naměřená u A83543E (v acetonu-dg).

₃ T a b u l k a - III............ .......— ,.

τΗ a 13C KUR data A83543E v acetonu-dg poloha 13C	1Ha
1	172,46	—
2	34,95	3,06/2,40
3	48,88	2,95
4	42,11	3,43
5	129,78	5,86
6	130,39	5,90
7	42,11	2,14
8	37,18	1,96/1,39
9	77,06	4,33
10	38,31	2,36/1,36
11	47,18	0,93
12	50,40	2,86
13	148,37	7,06
14	144,84	. —
15	203,09	--

poloha 1¾

16		48,05	3,34
17		81,35	3,55
18		34,98	1,62/1,48
19		22,25	1,77/1,13
20		33,73	1,50
21		72,97	4,68
22		21,61	1,12
23		—.	—
24		16,52	1,13
1*		97,11	4,83
2*		78,36	3,55
3*		82,55	3,377
4'		83,13	3,02
5'		68,72	3,50

6—...................:........ -··.........-.......1-8,26 ------------1,18

	2*-0CH3	59,01		3,43
	3*-OCH3	57,30		3,40
		-----------— g0?69—
	4 -OCH-j		3,46
	1».	104,24		4,47
Φ·.	9 9 2	32,00		1,93/1,39
	3	18,86		1,82/1,50
	4	66,06		2,12
	5	74,13		3,57
	6 .	19,42		1,21
	M(0H3>2	40,99		2,21

- 14 ^anekterá měření odvozena z ^H/¹^ korelace ^Charakter is t iky-AQ-354-3P7 — ------— ----— molekulární hmotnost; 717 Empirický vzorec; C^Hg^NOFAB-MS (M+-1): nalezeno: 718,4534? vypočteno pro ^C4O^B64^NO1O ⁼ 7!M53O

OT 243 nm(€ 10 500) a 282 nm (i 109) ...............

IČ spektrum (KBr); (viz obr. 14) . ~

Tabulka IV uvádí ^XH a ^l3C NMR data naměřená u A83543F (v acetonu-d^).

Tabulka IV a NMR data A83543P v acetonu-d^;	1Ha
poloha	13C
1	172,60	«-
2	34,50	3,06/2,42
3	48,82	2,95
4	42,46	3,45
5	129,56	5,87
6	130,39	5» 92
7	42,19	2,16
8	37,18	1,97/1,35
9	77,15	4,65
10	38,30	2,33/1,34

poloha ¹³C ¹H^a

11	46,89	0,94
12	50,34	2,84
13	148,86	7,03
14	145,73	—
15	193,68
16----------	---------------------------45,49“...... .......	3,22/2,50 -
17	74,17	3,58
18	30,74	1,52
19	22,41	1,70/1,17
20	34,45	1,51
21	77,09	4,32
22	29,05	1,48
23	9,56	0,81
1*	97,19- -	4,83
8*	78,38	3,53

3*~— ---- ——-. ..- 82,58--------. j,38

4'	83,15	3,00
5'	68,74	3,48
6*		η no
	18,25	±,lo
2*-0CH3	59,02	3,43
3*-OCH3	57,31	3,40
4*-0CHi	60,69	3,47
	100,19	4,53
2**	..........32,41	1,80/1,38
3	18,86	1,83/1,53

poloha	13(3	ljja
99 4	66,16	2,13
5	74,01	.4,01
6	19,46	1,22
H(CH3)2	41,01	2,22

^eněkterá měření odvozena z korelace

Charakteristiky A83543G molekulární hmotností 731

Empirický vzorec: Al^Hč5^N010........ —.......-.

FAB-MS (M+l): nalezeno: 732,4661; vypočteno pro ^C41^H66 ^H010 “ 732,4687

UV (EtOH)^^! 243 nu (£ 8 970)

IČ spektrum (KBr): (viz obr. 15)

Tabulka V.uvádí a NMR data naměřená u A83543G (acetonu-dg).

Tabulka V

Ha h? NMR data A83543G v acetonu-dg.
poloha	130
1	172,59
2	34,67	3,04/2,46
3	48,72	2,94
4	42,25	3,50
5	129,85	5,84

poloha ¹³C ^H⁰

6	130,26	5,89
7	42,02	2,14
8	37,12	1,95/1,34
9	76,99	4,32
10	38,28	2,36/1,36
11	47,23	0,91
12	50,43	2,87
13	148,28	7,04
14	144,61	—
.. 15	203,20	—
16	47,94	3,30
17	81,73	3,57
18	35,20	1,55
19	21,68	1,64/1,16
20	31,41	1,64/1,36
21	76,47	4,64
22	28,84	1,48
23	9,61	0,80

~ 15,29 ...... 1,18

1*			96,98		4,81
......Λ*.			o O. .		-........ -b —
--------— — ...... —	......................		--------‘1 w,			...................
3'			82,46		3,37
4*			83,05		2,29

poloha	-------130	lga
5* *	68,64	3,49 ,
6'	17,18	1,12
2*-0CHj	58,97	3,42
3*-OCH3	57,25	3,39
4*-OCH3	60,70	3,46
l	99,51	4,80
2 ' '	29,62	1,87/1,48
3	19,31	1,73
4**	62,13	2,29
5, - — - '	69,93	4,20 '
6**	18,22	1J7
N(CH3>2	43,47	2,24

^aněkterá měření odvozena z ¹H/¹³C koselace.

Charakteristiky A83543H

Molekulární hmotnost: 717

Bnpirický vzorec :

UV (BtOHi: > nax^{: 243 n}® ^{(£ 10 000)4} IČ spektrum (KBr): viz obr. 16* * stanoveno pro A83543H:J (58:42) směs

Charakteristiky A83543J

Molekulární hmotnost: 717

Bnpirický vzorec? ⁰ 40^63^10

UV (EtOH(: λ _Ββχ: 243 nm (t 10 000)*

IČ spektrum (CHCl^): viz obr. 16* stanoveno pro A83543 H:J (58:42) směs

A8354^ a J se oddělí z A83543 jako směs (H:J=58:42), kterou lze dělit kapalinovou chromatografii s vysokou rozlišovací schopností, jak je popsáno níže. Struktury stanovené jako A&3543H a J jsou založeny na ¹H a NMR studiích směsi A83543 H ! J v acetonu-dg · NMR spektra jsou si podobná a byla srovnávána.se spektry A^83543^A· Větší změny spekter u.H a J js< soustředěny kolem rharanosy. H a J mají pouze dvě OCH^ v tomto cukru. U složky H H-l*je. posunu to o 0,1<Γ v H NMR spektru a 3^_/ vtÍíMR spektru (4,81 a 99,68)· Tyto posuny jsou způsobeny nepřítomností methylu na methoxyskupině v poloze 2*. Posufly u složky odpovídají podobně nepřítomnosti methylu na methoxyskupině v poloze 3*. .....

Charakterštiky A83543A pseudoaglykohu

Molekulární hmotností 590

Empirický vzorec: σ^^θΟθ

UV (EtOH) 243 nm (1 10 300)

IČ spektrum (CHCl^): (lakton) 1724# (konjugovaný keton 1652/ multiplety pro C- H, vibrace kolem 3017# multiplety pro

C-0 v ibr a c e kole m

1140 C·.*¹ <^{vlz obr}· 3)

PD-MS: viz obr. 7 EI-MSi viz obr. 11

Charakteristiky A83543D pseud&ykonu

Molekulární hmotnosti 604

Empirický vzorec: ^σ34^Η52θ9

Složky A83543 lze navzájem rozdělit jednu od druhé použitím následujících analytických HPLC systémů:

- .20 systém i

8,50 “6715

3,92

11,47

Kolona: ODS} ’ 3 50“ mm ( IBM)

Rozpouštědlo:. CH^OHjCH^CI^^O (2:2:1)

Průtoková rychlost : 1,0 ml/min

Detekce: UV při 245 nm

Teplota: teplota místnosti složka retenční čas (min).

; ....A

-B

C

D

SYsA II

Kolonát 4,6 x 10Ó mm, ODS (AQ-301, S-5; YMO, lne., Mt. Rreedom, NJ)

Rozpouštědla: CHyHhCHyJN:0,05% NH₄OAc(H₂0) (A) 35 : 35 * 30 - pH 7,8 (B) 45:45*10 - pH 6,7

Průtoková rychlost: 2,0 mí/min

Průtoková doba: 35 min

Detěkce: UV, 250 nm

Gradient: 10 % B na 25 % B v 20 min; na 50 % B v 30 min ⁱ'+ ’ složka retenční čas (min

A

A-pseudoaglykon

B

C

D

- -E - ---------------····

F

G

H

J

22,62

7,27

12,65

10,62

25,47

- -^1^,-22 — 16,30 18,92 16,30 17,50

Systém XII

Kolona: 4,6 x 100 mm, ODS (AQ-301, S-5$ IMC, lne. Mt. Fceedom, NJ)

Rozpouštědla: CH₃0H:CH₃CN :0,05% NH₄0Ac(H₂0) 35:35:30 - pH 6,0

Průtoková rychlost : 2,0 ml/min

Doba průtoku: 10 min

Detekce: UV, 250 nm složka retenční čas (min) \ 3,42 3,42 ________________.Složlí;y_A83543-ne jsou-rozpustné-ve^-voděr-ale-jsou --rozpustné v rozpouštědlech, jako je methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, acetonitril, aceton apod.

A83543 a jednotlivé složky, jako je A83543A,

A83543B, A83543C, A83543D, A83543S, A83543F, A83543G, A83543H a A83543J mohou reagovat za vzniku různých solí. Všechny tyto forte těchto sloučenin jsou součástí tohoto- vynálezu. A83543 soli’jsou použitelné například pro oddělování.a čištění A83543. Navícněk-ter ó—soli-maj í—zlepšenou^r ozpustnostvevddě* ^í

Soli A83543 s® připravují postupy obvyklými pro přípravu solí* Například A83543 může být neutralizována příslušnou kyselinou na sůl s kyselinou.

Soli s-kyselinami jsou obbvlástě vhodné. Representativní vhodné sole zahrnují sole vzniklé standardními reakcemi s jak organickými tak s.anorganickými kyselinami, jako jsou na- B t příklad kyselina sírová, kyselina chlorovodíková, kyselina, fosforečná. kyselina octová, kyselina jantarová, kyselina citronokyaellna mléčná, kyselina maleinová/ vá,/kyselina. fumarová, kyselina cholová, kyselina jablečná,... kyselina mukonóvá, kyselina glutamová, kyselina kafrová, kyselina glutamové, kyselina glykolová, kyselina.ftalová, kyselina .. vinná, kyselina mravenčí, kyselina laurová, kyselina stearová, kyselina salicylová, kyselina methansulfonová, kyselina benzensulfonová, kyselina sorbová, kyselina pikrová, kyselina benzoové kyselina skořicová a podobné kyseliny.

- 23 V dalším popisu výraz aJ/83543 sloučenina s.výhodou znamená látku vybranou ze skupiny zahrnující A83543, jednotlivé složky A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543E, A83543G, A83543H a A83543J a jejich soli s kyselinami'

Fermentační produkt A83543 se připravuje kultivací kmene nového mikroorganismu Saceharopolyspora spinosa vybraného z KRRL 18395, NRRL 18537, HRRL 18538 a NRRL 18539 nebo z jeho mutantu produkujícího A83543 za submersních aerobních podmínek ve vhodném produkčním mediu až do vzniku dostatečného množství A83543· Jak je známo odborníkům v bboru fermentačních postupů

- poměr složek v A83543 se mění v závislosti na fermentečních podmínkách . užitých při příprav#. Obecně A83543 obsahuje asi 85-90 % A83543A, asi 10 - 15 % A83543D a menší množství A83543B, C, E, θ'

F, G, H a J a A83543A pseudcjfglykonui. Jednotlivé složky, jako je A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H a A83543J a A83543A pseudoiglykon se mohou rozdělit a izolovat postupem popsaným níže*

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy slouce, niny_ Al83543,^ k„terý„se„ vyznačuj e„tím,._že_se_ kultivuje_.kmen____„. Ssccharopolyspora spinosa vybraný ze skupiny zahrnující NERL 18395, HRRL 18357, NSRL 18538 nebo HRRL 18539 nebo jeho mutant produkující A83543 v produkčním mediu, které obsahuje asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganické sole za submersních * aerobních fermentačních podmínek až do~vytvoření dostatečného množství A83543· Jednotlivé složky se potom mohou izolovat známými způsoby*

Předložený vynález se také.týká biologicky vyčištěné —ku-l-tury-mik-roorganismu“Saccharo|oolyspora”spÍnoša”výbranáhó^ z

NRRL 18395, MRRL 18537, NERL 18538 nebo NRRL 18539 nebo jeho mutantu produkujícího A83543· Tyto mikroorganismy jsou použitelné pro přípravu A83543.

V následujících diskusích jsou kmenům dána následujíc: označení: A83543.1, A83543.3, A83543.4 a A83543-5. Kultura A8354; byla získána chemickou mutací kultury'(A83543) izolované ze vzorl

Γ půdy -sebrané z Virgin Islands. Kultury A83543-3, A83543.4· a X83'54375”’by’iy získány z derivátů kultury A83543.1 chemickými mutacemi·

Kultury A83543.1, A83543.3, A83543.| a A83543.5 byly t ženy a jsou součástí sbírky kultur v Midwest Area Northern Regior Research Center, Agricultural Research Service, United.States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria_t Illinois, 61604, kde jsou dostupné veřejnosti pod následujícími čísly:

NRRL č.	kmen č.
18395	A83543.1
18537	A83543.3
18538	A83543.4
18539	A83543.5

Taxonomickó studie kultury A83543.1 byly provedeny Rrederickem P. Mertzem z Lilly Research Laboratories* Na základě těchto studií byly mikroorganismy Α83543·1, A83543.3, A83543.4 a Α83543·5 klasifikovány jako členové nových druhů rodu Saccharc polyspora sptsxss, který je nazýván Saccharopolyspora spinosa sj nov. Tyto klasifikace jsou založeny na přímých laboratorních src navahich a zktršebnícn publikovaných popisů podobných druhů· _______ ...Použité..metody...... ............. ............, .__________

Následující metody byly doporučeny projektem International Streptomyces Project (ISP) pro charakterizaci druhů Streptomyces [Ε. B. Shirling a D. Gottlieb, Methods for Characterization of Streptomyces Species.Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966) a pro charakterizaci druhů Nocardia v článku R. E. Gordon, D. A. Barnett, J. E. Handerhan a C. H. Pang., Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica a (Nocardin Strain. Ing. J. Syst. Bacteric 24(1), 54-63 (1974)·

Pro určení barvy na spodní straně a na vzdušných hyfách byl použit standardní vzorek ISGC-NBS Centroid Color Chart:·,, standardní vzorek č. 2106 (National Bnreau oi Standarde, 1958, US. Department of Commerce, Washington, U.C.).

Morfologické studio byly prováděny světelným optickým mikroskopem a rastrovacím elektronovým mikroskopem (SEM).

Isomer diaminopimelové kyseliny _(DAP) a sacharidy ___ v hydrolysátaoh celých buněk byly stanoveny chromátografickými metodami Běckera a j., [B. Becker, Μ. P. Lechevalíer, R. E. Gordon a Η. E. Lechevalíer, Rapid Differentiation between Nocardii

-:------·.......... · · - - —---- · · -----26--------------' ...........

and Streptomyces by Paper Chromatography oř Waole-cell Hydrolysates, Appl. Μΰ^ίοΐΓΐ2,421-Ϊ23 (1964)Γ1ι Lechevaliery ÍM. P. Lechevalier a H. Lechevalier, Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes. Ing. J. Syst. Bacteriol. 20, 435-443 (1970)].

Fosfolipidy byly stanoveny postupem M.P. Lechevalier a H. Lechevalier Ev A University Laboratory Approach, Dietz aThayer (eds.), Societyfor Industrial Microbiology Speciál Publication δ. 6, Arlington, VA, str. 227-233 (1980)]

Složení menachinonu bylo stanoveno následujícími postupy: R. M. Kroppenstedt Ev Chemical Methods in Bacterial Systematics, M. Qoodfellow a D. E. Minnikin (eds.) 1985» str. 173-196] a M. D Collins (tamtéž, str. 267-285).

Resistence na antibiotika byla měřena položením kotoučků pro měření citlivosti antibiotika na povrch agarových desek naočkovaných ISP č. 2.

Hydrolýza Škrobu byla stanovena testováním přítomo ’ nosti škrobu jýdem na agarových deskách ISP Č, 4 (anorganické sole - škrob).

Analýza mastných kyselin byla provedena použitím HP5898A mikrobiologického identifikačního systému Eviz L. Hillar a T. Berger, Bacterial Identification by Oas

- 26a Chromatography of lhole Cell Fatty Acids, Hewlett-Packard Application Kote 228-41, 8pp. (1985)^ (str. 253.

Methylestery mastných kyselin byly stanoveny z lyo filisovaných celých buněk rostoucích za stejných podmínek.

Analýza základních složek byla dvojrozměrná a generovaná počítačem. Změřené jednotky v diagramu základních složek

- !>·<·

- 27 *v ___ . __ (vi’z~obrT~12) jsou standardní odchylky. V obr. U osa χ β základní složka 1, osa y = základní složka 2, □ Λ83543.1

W S. erythraea © S. hirsuta

O ^s· hirsuta subsp. kobensis

Ifykolové kyseliny hýly stanoveny metodou navršenou

-'! ........ .. .— ^1.1··.^ l&nnikinem Ed. E. Minnikin, I. G. Hutchinson a A. B. Caldlcott, Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Ifycolic Acid-Containing Bacteria,** J, Chromatography 188, 221-223 (1980).

Charakteristiky kultur

Kultura A83543. roste dobře jak na komplexu tak na definovaném mediu. Kultura produkuje vzdušné mycelium na všec použitých mediích. Barva hmoty vzdušných sporů je převážně světle žlutorůžová, ale na mnohých mediích je bílá.

Spodní strana je žlutá až žlutohnědá. Hebyla pozorována žádná zvláštní pigmentace. V některých mediích se do media uvolňoval rozpustný hnědý pigment.

Charakteristiky kultury jsou shrnuty v tabulce VI.

w

Η «4

O

(W		tw	W	Q	O	B	ω
H		H*	B	N	pr	is	φ
«4	fl>	E	Φ	fl)	H-	H*	ρ
O	CQ	pr	H	13	cf	JBx	ρ
Φ	•P	o	CQ	o	H-	cf	φ
4	fl)	CQ	O	IV	p		ch
O	4	£D	P			4	ch
H	D	1				PK	ω
1	Λ					*σ

O

P

Q) cf *4x

!>	it*	Η	Η	Η	Η	Η
Η	Η	03	01	ω	ω	03
Ο	£·	Μ	43	4#	43	43
Ο
	ί>	Β	Β	Β	Β	Β
Οΐ	ΰ	φ	Φ	φ	φ	φ
•	β>	&	Cb	Cb	Ρ*	Cb
	Η	Η-	η-	Η-	Η-	Η-
Η	σ'	Ε	Ε			Ε
-4		Β	Β	Β		Β
ΓΟ
		-4	κη	-Ρ»	V)	ΓΟ

pr ο	Cb σ	pr σ	Pb Ο	•Ρ «ί	Pb *r ο ο	ΡΤ ο	ír Ο	pr ο	Ρ* Ο	Pb Ο
Cj.	ď	Cj.	ο*	Η-	σ' ej-	Cj.	CJ.	Cj.	CJ.	σ*
£	4	Ρ	»1	Β	4 Ρ	Ρ	ρ	ρ	ρ	w
*4χ	<4χ	Μχ	<4%	Φί	<4% Μχ	<4χ	<4χ	<4χ	Μχ	<4χ

Pb

O cf cj.

L$, *4 tr o

Φ

Cb

ΗΕ

B ca cf •

cf

E3 a

ax

Ní

H

C c+

O ř

Ok &

AÚ

O *

S —J <o uo a

OK cf

H

Φ

Ní

H

E ef

O ř

OK ϋ

Ρκ

Η H e z cf cf O O σ' σ'

Ηχ Ηχ Η Η ρκ Ρκ

*0	V)	U0	00	-J	-4	\Ο <Λ	-4	CQ	cr
V)	ΙΟ	ΓΟ	ΜΟ	-4	V)	ΙΟ	4*	σ\	cf	Π)
φ	•	φ	•	Φ	Φ	φ	Φ	Φ	4	4
•Ρ	Νί	Νί	Ό	Β	•ρ	Νί	CQ	CQ	0 ρ	< 0
φ	Η	Η*	•	Φ	φ	Η	4	4	¢4
	Ε	Ε				Ε	Φί	ΟΚ		CQ
ο	cf	cf	κ	<4	ο	<+	cf	ch		•σ
κ	Ο	Ο		td	κ	Ο	f-ι	Η		ο
	σ'	σ'		4		σ'	Φ	Φ		Ρ-
	Ηχ	Ηχ				Ηχ				Ρ
	Η	Η				Η	QK	Ν<		Ηχ
	ΡΚ	ΡΚ				ΡΚ	Φ	Η
							Pb	Ε
						. .. _	.ΡΚ	cf

ο ff

OK

Ρ*

ΡΚ

pr	•Ρ	pr	Pb
ο	4<	Ο	Ο
Cj.	Η-	Cj.	σ'
Ρ	Β	Ρ	4
«4χ	ΟΚ	*4χ	<4χ
	4<
	φ

&

»ο

4<

Η*

Β ακ

4<

φ

Ρ *4χ

13	pr	pr	pr	. pr	pr	pb	Cb	Ρ*
4<	ο	ο	ο	ο	ο	Ο	Ο	Ο
Η·	CJ.	CJ.	CJ.	Cj.	Cj.	σ'	σ'	CJ.
Β	Ρ	Ρ	Ρ	Ρ	Ρ	4	4	Ρ
Φί	**	*4χ	<4χ	Μχ	*4χ	*4χ	<4χ	Μχ

Pf

GQ cf «

I?

-·— «4 μ

to ιυ σ\ σ* νί ν> νο ♦ . · Ρ ·

ΓΟ ΙΟ ΟΚ Ολ UJ ví ν> ιο • · · . , •Ρ 13 jet υ σ' σ' 13 13

-ρτμ—ρ-— Η

«4	Ρ>χ ΡΚ	*4
4ί	Ρ	Μ
C*	Ηχ	Η·
Ρ	Η	Ρ
Λ*	ΡΚ	IV

Μ <4 hí hJ e &

Λ* IV ď σ' t-\ Ηχ Η H PK PK

NíH

E cf

O a*

Hx

H pk σ' a

fl}

N

Cb

E

-ř

©.

B «4

O

O

H

ΗΕB

Charakteristiky kultury A83543.1 cf

B £D ©<

ř o<

ca

OK cf

H ©

ř

OK

5*x

ΕΓ Ní Ní tr o

P PK PK p 4

OK pí Ol φ< ©<

A Ρ P P· cf «4. *4x *4x <4, H

Φ

Ní

PK

OK

Cb «4.

gr

Φί

Pb *4.

CQ CQ 4 4 OK Φ< fct cf H t-> «< Φ A §· ř

Φ< OK pb Cb *4x <4x

Ní Ní Ní PK PK PK «<

o

N

E ω

ff *4»

HO

P cf

A	P	o	ď	A
A	A		A	A	H·
	oq	oq	oq	P
A	A		A	A	PT
*	4		4	4	P
pr	I	A	ω	•d	Oř CO
<				4	f
a	•d	s-	►d	o	'o
tQ —	’P- -	H-	ÍD-		A“
P*	. c+	H	ω	P·
0	P -	PT	c+	A	•d
pr	PX	P·	O	O	4<
«4		P	c	H	P·
w	<	A		A
0j	o (X	Ω	H	O H-	£
A	A	O	4
H		»	A	A	O
c+	'		Cj·	PT	O
4	o		o<	• <+
o	o	ω	A	p·	Λ3
α	4	A	ef	P	O
A	P>	J-1		o
	o P	t+ P·	A	š	ΓΟ
		9	A	o
Q		O		. ®*	- P*
O	tri	4	o	cť·	P
4	A	A -	<	Ά_	P%-
q,	4	w	A
o	P		A	tí
P	A	I—*	P	H-
«β . *	<+	VO	O	H-
	a-	cn	C	O
-W—	-.«A r-1---r	-W~		—O·—
ffi			9
4	te		o
P	ίο		p
A	P		pr
<+	(X		o
cť	A		c
w	4
te	g·
a>	P		te
P			fcd
P-	A
A
4 te			o e+
A	P		P·
P	oq		P
			O	ς
A	4	.	§
	«<5		o
A	ffi<		A
P	A		Cť
cq	x		A
·»			A
			«·
4
««.			A
A<			<
A			•
•			10

w &>

a

PT

A =5

H·

H

H

P·

0)

A

§	í>	te g	Pí P <+	B A	•d
A	ÍX	o	4		fx	o
			P·		P·	pr
			A			4
			P		li	A
						CX
						o
						i Ρ»
						cf
						A
						te
						c
te	*d	te	te		4	H
O	4<	o	o		P*	pr
CX	P·	CJ.	CJ.		A	<4
P	B	P	P		ct*
<<x	®<	«4%	<4.				k
	4<					H
	A H
	Q.		-				*
-I	vo	VO	VO	A	te
-4	VjJ	O	o	e+	A
6	e		«	4	4
‘ - T.		-· -		SK	4 -	. -i -·.=.
B	N<	oq		P	A
	... 1—1	. £4 .	M
	P	•	•		A
«4	cfr				•d
W	o		K		O
H	BX				te
	A				P
	(X				Ρ»
	px						1
							ro
							vo
*ϋ	A	te	te	4			1
4<	H	o	o	e·
H·	A	Cx	C_b	A
< B	te	P	P	e+·
A<	«4»		<4%		<
4<					N
A					(X
P					P
«4.					A<
					P
					O·
					B
	to				A
VO	cn O)	Vi	VJ		O A
•	•	•	•		H
				te	P·
•o	te	•d	•d	A	P		«
pr	Pl	•	•	4	B
•	H			4
	px	<4	«4	A
=§	M |_j.	4J
P·		B	e
«+		pr	pr
A
				4
				O
cť	N<	N<	A	N
B	PX	PX	<	*d
A	fx	&	Aí	P '
4	p	P	e+	A
O	«4%	<4%	H	ct·
f			A te		L
A<			P
(X			A<	•d
			p.	p.
			«X	<ž	3
				A
				P

Morfologické charakteristiky

Kultura A83543.I produkovala rozsáhlé povrchové mycelium, které se rozpadávalo ve fermentační kapalině· Ha agarovém mediu nebyla fragmentace provozována.

Když se kultura umístila na ISP medium 1, byly pozorová⁴ ny bílé kruhové kolonie 8 až 10 mm v průměru se zvýšeným centren ažlutohnědou barvou ňá spodnístráně. -- —..........

Ha většině medií byly přítomny dobře vytvořené vzdušné hyfy. Vzdušné hyfy se rozdělily do dlouhých řetěfeců.spor uspořádaných jako zákruty a otevřené smyčky. Byly též pozorovány spiré

......ly, avšak byly krátké a nekompletní. _

Obecná morfologie byla ^HRectus-flexibilis” (RA).

Vzdušné hyfy měly charakteristický korálkovitý vzhled 3 mnoha prázdnými místy v řetězci spor. Tento jev demonstroval, že povrch spor obsahuje řetězec spor. Povrch spor je fwkryt

...... ...... velmi charakteristickými trny. Tyto trny jsou přibližně 1 γΐηι dlouhé á na konci jsou zakulacené.

Tvar spor je protáhlý a měří průměrně přibližně 1,1 z — t ěze cspor-j-e-diouhý- pře s~5G-sp or.Ne by-lypo zor o vány žádné cik-cak charakteristiky, sklerotie, sporangie nebo pohyblivó buňky.

-..................— tk.r.4^1 -r—^-ri-- .

• Λ! qj M W V*·» w ι» »' Wl v » mm τ j/ -........ · ' ·' —^: ~ r. ..7TT%

.................. .... Kultura.—A83543.1 produkuje kyselinu z „následujících, sacharidů! adonitu, D-arabinosy, erythritu, fruktosy, glukosy, glycerinu, manitu, mannosy, ribosy a t|Írehalosy.

- -Iv

Kultura neprodukuje kyselinu_z:I-arahinosy,_cellohiosy,-celulosy, dextrinu, dulcitu, ethanolu, galaktosy, glykogenu, inosltu, inulinu, laktosy, maltosy, melizitosy, melebiosy, a-methyl-D-glukosidu, rafinosy, L-rhamaosy, salioinu, eorbitu, L-sorbosy, 'sacharosy, xylitu nebo xylosy.

Růst byl pozorován u galaktosy, maltosy.a melizitosy, avšak z těchto sacharidů nevznikla žádná ky.selina..

Kultura A83543.1 využívá následující sodné sole organic“kých:kyselih^aheťát~buťyrát7^itTát7^foffiá’t7^Íiřn’tT~maíát7^” propionát, pyruvát a sukcinát. Kultura nevyužila benzoát, galaktarát, oxalát nebo vinen·

A83543*1 rozkládá.allantoin, malát vápenatý, kasein, ela; tin, hippurát, hypoxantbia, testosteron, L-tyrosin, močovinu. Nebyla schopna rozkládat adenin, eskulin, guanin, škrob nebo xanthi

A83543.1 produkuje katalasu, fosfatasu, ureasu a HgS.

$kapalňuje želatinu a snižuje dusičnany. Není rezistentní vůči lysozynu a neprodukuje melanoidní pigmenty. Nepeptonisuje ani nehydrolysuje odstředěné mléko. A83543.1 snáší koncentraci NaCl až do a včetně 11 %. Je neschopná přežít 8 hodin 50 °C, ale roste při teplotě mezi 15 °G a 37 °C. '

A83543.I je resistentní vůči cefalothinu (30 yUg) penicilinu G (10 jednotek) a rifampinu (5 /ug) · Je citlivá vůči bacitracinu (10 jednotek), gentamicinu (10 /ug), linkomyclnu

- 32(2 yig), neonycinu (30 ^og), oleandoaycinu (15 ^ug), streptoaycinu (10 ^tg), tetracyklinu (30 yig), tobrauycinu (10 ^og) a vankoaycinu (30 ^β)*

Analýza buněčné stěny

Hydrolyzované celé buňky 183543*1 obsahují neso-diaminopioelovou kyselinu· Diagnostikovanými cukry v extraktech celých buněk byly galaktoaa a arabinosa. Tak 183543*1 né charakter buněčné stěny typu IV a charakter cukru typu 1 (Lechevalier a Lechevalier, výSe). Buňky neobsahují nykolové kyseliny·

Analýza foafolipidft celých buněk ukazuje na pfítonhostfosfatidylcholinu a kardiolipinu* Fosfatidylethanolanin nebyl detekován· Tak 183543*1 ná charakter fosfolipidu typuFlII ÍM· P* Lechevalier, 1· E. Stern a Η. 1· Lechevalier, Phbapholipids in the Taxonony of Actinonycetes, Actinonycetes, Zbl« Bakt* Suppl. 11, Κ* P* Schaal a 0. Pulverer (ede), Gustav Fischer Verlag, New York,19811.

Jako hlavní nenachinon byl detekován MK-9 (H^). Rovněž bylopozorovánoBen8ÍBnoSstvílfiC-9(H6)· —------——--—Povlaky fágů ,_Žada fágů Streptonycet, Saccharopoly spora a Anycolatopsis byla unístěna na 183543*1« Nebyly pozorovány Žádné skvrny* . - 33 Identita A83543.1

Jak bylo uvedeno výše, kultura A83543.1 ná charakter buněčné stěny typu IV a charakter cukru celé buňky typu A·

V buněčné chemii mé tento charakter 13 následujících rodů:

Koeardia, Rhodococcus, Corynehacterium, Caseobacter, Itycobacterlum, Faenia (Micropolyspora), Pseudonocardia, Saccharomo • nešpora, Saccharopolyspora, Aetiaopolyspora, Aeycolata, Amycolatopsls a Kibdělosporangiug. Tyto rody se rozlišují přítomnos ťí^hěbOepřitomnoaťí^kolo^clT^seíinT^aloŽeňím mastných Kyselin a typy fosfolipidu a menachinonu. Faenia, Pseudonocardia a Saccharopolyspora mají chemotaxonomické charakteristiky identické s A83543.1, avšak tyto fbdy se liSÍ od A83543.1 v morfologických vlastnostech a ve vlastnostech kultur.

Rod Faenia (Uicropolyspora) mé hebké spory a krátké řetězce spor, které vznikají jak na vzduěných, tak na substrátových hyfách. Jeho vzdušné hyfy jsou řídké a mají bílou barvu. Je to termofil, který roste při 60 °C. A83543.1 nemá žádnou z těchto vlastností a tak se liší od rodu Faenia·

Rod Pseudonocardia má spory jak na vzdušných, tak na substrátových hyfách* Rozlišují se akropetálními očky a blastc spory. Kají charakteristickou eik-eak morfologii hyf*Hyťý jsov popsány jako členité, ale nemající přepážky [viz A. Henasen a

D. Schafer, Amended Description of the Genus Pseudonocardia

Henssen and Description of a New Species Pseudonocardia spinos

Schafer”, Ing. J, Syst. Bacteriol· 21:29-34 (1971)1* Rostou 5 i pomalu* K fragmentaci nedochází nebo je pozorována zřídka

A83543*1 nemají žádnou z těchto vlastností*

Rod Saceharopolyspora je charakteristický obalem spor. a Metelným korálkoví tým vzhledem.řetězce spor* Tento je· je velmi význačný u A83543.1. Fragmentace byla u rodu Saceharopolyspora také pozorována* Typ třídy S. hirsuta byl izolován z vylisované cukrové třtiny* Mateřská kultura* ze které byl A83543.1 získán, pocházela z cukrovaru* Protože 183543*1 má vlastnosti tohoto rodu, je proto považován za kmen Saceharopolyspora*

Jedinýrf. publikovanými třídami rodu Saceharopolyspora jsou S. erythrea a S*. hirsuta* Známé podtřídy jsou S. hirsuta subep* taberi a 8* hirsuta aubsp* kobensis. A83543*1 se liěí od těchto kmenů buS v barvě vzduSných sporá a apodní ___ strany nebo v produkci rozpustných pigmentů*

Biochemická podobnost byla posuzována sestavením ti bulkykoeficientůipodobnbstízalóžeÉiýchhávSečhmožnýchbiochemických měřeních* Byly užity koeficient Jaccard Sj a jednoduchý přizpůsobovací koeficient S_sffl Cviz V. Kurylowicz, ^LA.’4^>aszkievic2,^K^osnicka_i--W--.Kurzathowski*aAS**Szulga Numerical Tazonosy of Streptomycetes, Follsh Medical Publishers, Varšav, 1975, str* 37l.

..... .. Tabulka VII uvádí souhrnně tyto koeficienty podobnosti

Tabulka VII

Koeficienty podobnosti A83543.1 a tříd Saccharopolyspora

kultura	------------------------	S -------------- so.......	........... Sd ,
Α83543»!		100	100
S. hirsuta subsp·	taberi	68	57
S. hirsuta subsp·	kobensis	67	. ’ ' ' 60
S· erythraea		63	54
S. hirsuta	---------------------	.....55 ...........	................... 50................

- Analýza mastných kyselin A83543«l a známých tříd Saccharopolyspora okázala, Se obě mají jak nasycené kyseliny, tak mastné kyseliny 8 rozvětveným řetězcem. Složení oastt ných kyselin A83543.1je podobné, ale ne identické s ostatními kyselinami uvedených tříd· Tabulka Vlil srovnává složení mastných kyselin A83543*! a známých tříd Saccharopoly spora· i

m κ

Ρ «

.Μ

Η

Χ>

(β

Η (Ο »4

Ο α

β α

ο

0.

ο ο

<8

8 · α
φ	!
0	. ’
9
Φ	Φ Μ
Φ	Φ
Ρ	Ο
9	Φ
Φ	0
h	Ο
•Η	ΐΜ I
0
•	1 1 i
CO

<1 (β α ρ Φ 3 α h ι •η :

Φ Λ :

rl · ' • ^w :

ΓΩ

Φ·

ΙΑ

ΓΩ γΗ

Φ Φ α φ

Μ ί I ρ

φ ·

Φ 0)

-8α φ

Μ

Ο rl Η α ·

ΓΩ *Φ ·«♦ Λ ιλ Ο ΓΩ «Η Ρ fi Φ β

α

Ή

Η

Φ α

α *φ β

4»

Φ

Φ

Μ·

ΙΑ

ΙΑ

ΓΩ

οι

rl

οι

t—

Η

Μ·

ΙΑ

C— ο

σ*

Μ

Ο

νο ι

1 ω

C-

νθ

C0

οο

Μ*

ο

α

8b

Α

•

•

Α

Α

a

8b

Α

Α

α

8b

C-

Η

σ\

οι

V0

σ\

οι

Ο

Η

Ο

•φ

C-

Η

Γ-»

rl

Η

Η

Μ·

οο

ρΗ

φ·

ιη

VO

σ\

Ο

ΓΊ

ΓΩ

t-

Φ1

ΓΩ

νο

rl 1

1

ΟΙ

Η

1

C-

Μ·

0-

00

C*

8b

α

8b

* 1

1 *

α

α

I

8b

8b

8b

Α

8b

ΙΑ

Η

ΙΑ

Φ

ΓΩ

νο

CM

Η

νο

rí

γΗ

Η

οι

rl

«0	ΓΊ	ο	ο-	ο-	VO	Ο		Η	Ρ-	rl
οο	ΓΊ	t> I	ι σν ι	ι <*>	Μ-	σ*	1	Ο	Ο	ΓΩ	ΓΩ
A	8b	*	1 ·* 1	ι α	*	8b	I	8b	8»	8b	α
c-	Η	ΙΑ	C—	ΓΩ	ΟΙ	Η		Η	ΟΙ	Η	rl
rl		ΟΙ		Η	Η					Η

8b a

	Ε-	“ΙΛ-	-Ol:—|	OV-	R-		-UY-	—*8—·		,----	IA
V0	-Μ-	Η	Ol 1	1 iť>	t-	VD	t-	CM	t»	rl
- *	8b	. *	8b	a	A	a	8»	A	8b	IA	8b
Ο	ΟΙ	rl		t-	IA	M-	H	Ol	H	A	H
	οι			rl	rl

o

O*

O

Φ

Φ

•H

Φ

ta

o

•rl

ta

i

Φ

fi

Φ

O

P

O

Φ

o

o

o

P

w

o

Φ

9

Φ

h

φ

Φ

Φ

fi

Q

α

o o

•H

Φ

•rl

P

•H

•rl

•rl

Φ

«

o

Ol

•H

fi .··

O

O

o

Η

rl

rl

O

O

rl

rl

O

H

H

IA

IA

VO

vo

e-

t-

t*

t-

t-

t-

C—

vo

00

3 ,

rl

rl

rl

rl

H

H

rl

H

H

rl

H

rl

H

φ α

•Η

Η

Φ

Φ

*Φ ►

Ο φ

Ρ φ

Λ

- 37 Analýza základních složek směsí mastných kyselin uvedená v tabulce Vlil ukazuje dostatečný rozptyl, což svědčí o tom, Že věechay kultury jsou rozdílná třídy téhož rodu* Diagram základních složek uvedených v tabulce VIII je znázorněn na obr* 12^ Vte výft .

Tabulka IX srovnává fyziologické charakteristiky 183543*1 s charakteristikami ^J existujících tříd a podtříd ~~

SáccharopoXyspora:

<0 η

Ef δ

8X α

o

Λ o

o w

*9 ϊΡ

Η •

η φ

ΙΛ <η

Ai $2

Η 3 h

Π Φ Α •3

Λ

AÍ

S

Ο

Α

Η · η α α α Α3 0 0

Λ XI * 9 Ο C0 0 AÍ

Α

Α · Α Α 0, Α 43 0 Ο

42 • 9 0 W 0 Α

Α σν (0 <**

Α4

Α . Α — ί

Ο <9

Η

Α4 «

Ο «

+ + + § + § + + + + I + I + + + + I ι + «3 £

φ ; Π Η «9

Φ ‘0

Α

Ο <μ

Α

Α

Α

Μ9 £

SA θ ο

S5 SB Φ C4 á ^rt <Μ ι ι; ι *

Α + + + m tn

Α ^Η <\Ι tI <τ»

Α .<Λ1.

Α

ΧΟ

Ο

Ν

Φ

X)

Α

Μ

Φ a

-Μ.

δ £-3- ϊ

Η 0 Α Η Ο Ο Η

Ο. Φ Α

Ο

Η

Φ

Α

Α >0

Χβ ίο

H

O

O.

et p

® « «rl

R »» EQ H O, fi JC « Φ

X) 0 ♦ 3 O ca a 44 a

p a

*4 · *rt s s s 0 0 ♦ 3 β «8 4» ' « P

R •H ca a

φ i

&

Φ co

H •

(O

M·

ΙΛ fO

4» a

I s

XJ

N

OJ a

(0 ►

Ž o

a a

Φ «0

M* + + + + + + + I + + I

I + + + + + I SS +.. + · + + + + + + + + + + + + 11 I I lil |

s*	& o	3	&	& o	>s a	>>
o	tJ	a	o	3	>>	P	0	a	β
β	0	•H	P	P	«	<rl	•H	o	O
<rt	O	R	44	•H	O	H		0	3
X»	H	P	(B	«	P	Φ	H	<rl	s
tf	H	M	H	O	H	rM	rM		a
R	Φ	Φ	«	a	Φ	Φ	Φ	a	43
a	O	*0	to	«Η	a	0	a	R	R

ealicinu pokračování tabulky IX

~Tatosrovnání jakšzují7'1β”Α83543Ϊΐ?Μ?.Τδοβίβ1βδηβ 1161 od dříve popsaných tříd Saccharopolyspora a jsou tedy novými třídami Saccharopoly spora, pro které hyl vybrán název Saccharopoly spora spinoea· Název spinosa okazuje na splnovou ornaaentaci spor tSchto tříd. Kmeny 483543.3, 483543·4 a 483543.5 jsou makroskopicky dostatečné podobné kmenu 483543.1, takže byly klasifikovány jako kmeny Saccharopolyspora spinosa· Tyto čtyři kmeny se liSÍ v množství produkovaného 483543· Kmen 483543.3 produkuje přibližné čtyřikrát více 483543 než kmen 483543.1 a kmeny 483543*4 a 483543·5 produkují přibližné osm- až devětkrát více než kmen 483543*1·

Tak jako v případě jiných organismů mohou se i charakteristiky kultur produkujících 483543 podle vynálezu Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL. 18538 a NRRL 18539 nadále obměňovat. Taklfce známými fyzikálními, a chemickými metodami připravit mutanty těchto kmenů. Například lze získat jiné kmeny reakcí s chemikáliemi, jako je N-methyl-N*-nitro-N-nltrosoguaftidin· Přírodní i uměle indukované mutanty kmenů Saccharopolyspora spinosa * NBHL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 a NRRL 18539, které si zachovávají schopnost produkovat dostatečné množství 483543 jsou součástí tohoto vynálezu·

Mediem užitým pro růst kultur Saccharopolyspora spinosa může Éýt jakékoliv médium· Určitá media jsou však preferována, a to pro ekonomii produkce, optimální výtěžek a snadnou izolaci produktu· Tak například výhodnými zdroji uhlíku při fermentaci ve velkém měřítku jsou glukosa a maltosa, i když lze též užít ribosu, xylosu, fruktosu, galaktosu, manosu, manit, rozpustný škrob, rajčatový dextrin, methyl oleát, oleje, jako je sojový olej a pod·

Výhodnými zdroji dusíku jsou moučka z bavlněných semen, peptonisované mléko a vyluhovaná moučka ze sojových bobů, jakož i rybí moučka, kukuřičný výluh, extrakt z kvasinek, enzymem hydrolysovaný kasein, extrakt z hovězího masa apod.

Matriční anorganické sole, které lze dodat do “^&Ítivačního“media7 jsou obvyklé rozpustné sole,“které^po⁸·^“ skytují ionty zinku, sodíku, hořčíku, vápníku, amonné ionty, chloridy, uhličitany, sírany, dusičnany apod·

Do kultivačního media se také dodávají nezbytné stopové prvky, které jsou nutné pro rúet a vývin organismů· Tyto stopové prvky se obvykle vyskytují jako nečistoty v ostatních slóžkáčh^media~v ^oožství~dosťatečněBHprcTpózadavky na růst organismu· - -..........-.................... ........ .

Obvykle se do fermentačního media pracujícího ve velkém měřítku mohou přidat malé množství (tj· 0,2 ml/1) protipěnícího činidla,, jako je polypropylenglykol - je-li pěnění problémem· V případě kultur produkujících A83543 vSak běžná protipěnící činidla inhibují produkci A83543. Pěněni může být kontrolováno použitím oleje ze sojových bobů nebo * Pluronic L-101 (BASF) do media (1 - 3%) · ?okračuje-li pěnění, lze přidat dalěí olej.

Procentické složeni složek A83543 se může měnit se změnami media· Například přídavkem valinu nebo isobutyrové kyseliny nebo proplonové kyseliny vzrůstá procento produkovaného A83543D.

Pro produkci podstatných množství A83543 je výhodné provádět subaerzní aerobní fermentaci v míchaných bioreaktorech· ISalá množství A83543 lze připravit kultivací I třepací láhvi· Protože doba produkce ve velkých bioreaktorech je obvykle spjata s inokulací sporami organismu, je výhodné použít mag vegetativní očko· Vegetativní očko se připraví inokult cí malého objemu kultivačního media sporami nebo myceliálními fragmenty organismu, čímž se získá Čerstvá aktivně rostoucí kultura organismu· Vegetativní očko se potom přenese do větbýt

Sího bioreaktoru. Medium s vegetativním očkem může totéž jako při větěích fermentacíeh, avšak jsou vhodná 1 jiná media·

A83543 je produkováno organismy produkujícími A83543, která rostou při teplotách mezi asi 24 °C a asi 33 °C

- 44 Optimální teplota pro produkci A83543 je asi 28 až 30 °C.

Jak je obvyklé u submersních aerobních kultivací, probublává ee nádobou ode dna sterilní vzduch, zatímco medium se míchá běžnými turbinovými čerpadly. Stupeň provzdušňování a rychlost míchání by měly obvykle být taková, aby udržovaly hladinu rozpuštěného kyslíku na nebo nad 35 %, s výhodou na nebo nad 50 %, za vnitřního tlaku v reaktoru 34,3 kPa*

Produkci složek A83543 lze během fermentace sledovat testováním extraktů živná půdy* Pro tyto ďčely lze užít HPLC za použití systému popsaného v příkladu 1·

Po provedené submersní aerobní íermentaci lze složky A83543 izolovat z fermentačního media známými způsoby*

A83543 produkované během fermentace organismu produkujícího A83543 se vyskytuje jak v myceliu tak v živné půdě* A83543 je lipofilní. Takže, použije-li se při fermentaci podstatné množství oleje, je více účinná extrakce celé živné půdy* Použi jí-li ee pouze malá množství oleje, pak větší Část A83543 je vjnyceliu. V tomto případě se účinnější izolace A83543 dosáhne tím, že se nejprve přefiltruje medium, čímž se oddělí živná půda od myceliální hmoty (biomasa).

Z biomasy lze A83543 získat různými způsoby. Výhodný způsob spočívá v promývání oddělené biomasy vodou, čímž ss odstraní zbylá živná půdě, dále ve smícháni biomasy s polárním rozpouštědlem, ve kterém je A83543 rozpustné, například

------------------------------ . -—.....- 45 -------------- ----------------------------—smethaj(noleaneboacetonem,voddělenía zhhúStěňí^ožpbuš^ tědla, v extrakci koncentrátu nepolárním rozpouštědlem a/nebo . ¹ J ’ ▼ adeorpci na silikagel a reversní fází, jako je SP-C8 nebo 5B-G18 nebo vysoce porézní polymer jako ΗΣ^-20 apod·

Aktivní materiál se eluuje z ádsorbentu vhodným rozpouštědlem jako jsou například směsi acetonitrilu s methanolqo s obsahem malých množství tetrahydrofuranu.

AĎ3543 íze rozdělit na jednotlivé složky A83543A.._

A83543B, A83543C, A83543D, A83543B, A83543F, A83543G, A83543H a A83543J a Δ83543Α pseudoaglykon podobnými technikami. Výhodná je chromatografie na silikagelu (0_χθ nebo C&) s reversní fází·

Jako zdroje A83543 lze alternativně užít pevné látky z kultury, včetně složek media a mycella, bez extrakce a rozdělování, ale výhodně po odstranění vody· Například po produkci A83543 lze celou fermentační živnou půdu vysuSit lyofilieací, vysušením v bubnu nebo azeotropickou destilací a sušením· Vysušenou živnou půdu lze potom užít přímo, například jejím přimíšením přímo do krmivových předsměsí·

Insekticidní a akaricidní účinek

Sloučeniny podle vynálezu lze použit k hubení hmyzu a roztočů· Předmětem předloženého vynálezu , je tedy také způsob inhibice hmyzu nebo roztočů, který spočívá v aplikaci inhibičních množství sloučeniny A83543 na místa, kde se hmyz a roztoči vyskytují·

Sloučeniny AS35^43 jsou áčlnné proti řadě hmyzu a roztočů. Zejména vykazují účinek proti Spodoptera eridinia, který je Členem řádu Lepidoptera. Ostatními typickými členy tohoto řádu jsou obaleč £kx jablečný, osenice polní, Šatní moli, moli z kukuřičné mouky, “leaf rollers, Heliothis zea, zaviječ kukuřičný, bělásek řepový, Trichoplusla ni, Pectinophc gossypiella, Thyridopteryx ephemerae-formia, Malacosoma americanum, “sod webworm”a. Spodoptera frugiperda.

Sloučeniny jsou také účinné proti mšici bavlníkové, která je členem hmyzu řádu Bomoptera. Ostatními členy Homoptera jsou pidikřískové, “pianthopera“, mera hrušňová, mera jablečná, červci, whiteflě^s* a pěnodějky, jakož i řada dalších tříd mšic specifických pro hostitele·

Havle sloučeniny A83543 jsou ďčinné proti bodalkám stájovým, masařkám a komárům, kteří jsou členy řádu Diptera. Dalším typickým členemtohotořádu je obyčejná mouchajdom„áci._„

Sloučeniny A83543 jsou použitelné pro snižování populací hmyzu a roztočů a používají se při způsobu inhibice populace hmyzu”a roztočů,' který spočívá”v aplikaci účinnéhomnož ství sloučeniny A83543 na místo, kde se hmyz a roztoči vyskytu jí. . . .

KLBtO, sae se Tyexyiuje ovya uew iusivti, ná prostředí, kde hmyz nebo roztoči žijí nebojede^jsou přítomna jejich vajíčka, včetně okolního vzduchu, jídla, které požírají nebo předmětů, jichž se dotýkají. Například hmyz nebo

----- — _Po_Ztoči~živícÍ~se~rostlinami rzehubiV aprikacíníčinné“rát^ na části rostlin, které hmyz nebo roztoči požírají nebo obývají, zejména listy.

Uvažuje ae i o tom, že tyto sloučeniny by mohly být také použitelné k ochraně, textilu, papíru, skladovaného obilí' nebo semen aplikací ďčinné látky na tyto látky.

Výraz inhibice hmyzu nebo roztočů** znamená snižování počtu živého hmyzu nebo roztočů nebo snižování počtu životaschopných vajíček hmyzu nebo roztočů. Rozsah snížení dosahovaný danými sloučeninami závisí samozřejmě na množství aplikovaná sloučeniny, specielní použité sloučenině a cílových třídách hmyzu nebo roztočů. Mělo by se používat alespoň množství inaktivující hmyz nebo roztoče.

Výrazy množství inaktivující hmyz** a množství inaktivující roztoče se používají pro množství, které je dostatečné, pro to, aby se dosáhlo měřitelného snížení populace ošetřeného hmyzu nebo roztočů. Obvykle se používá množství v rozmezí od asi 1 do asi 1 OOO ppm (nebo 0,01 až 1 kg/ha) účinné látky.

Výhodný» rysem předloženého vynálezu je způsob . inhibice příhodného hmyzu řádu Lepidoptera, který se vyznačuje aplikací účinného hmyz ináktivujícího množství sloučeniny A83543 podle vynálezu na rostliny.

— 48 —

Dalším výhodným rysem předloženého vynálezu je způsob inhibice bodavých much řádu Diptera u zvířat, který se vyznačuje podáváním účinného Škůdce inhibujícího množství sloučeniny A83543 orálně nebo parenterálně zvířeti·

Testy na roztoče/hmyz . .....

Sloučeniny A83543 byly testovány na akaricidní a insekticidní účinnost následujícím způsobem.

Každá testovaná sloučenina byla formulována rozpuštěním sloučeniny ve směsi aceton/alkohol (1 : 1), obsahující 23 & Tozimulu R (směs sulfonátu a neionogenniho emulgátoru) a 13 g Tozimulu S (směs sulfonátu a neionogenniho emulgátoru) na litr· Tyto směsi se potom zředí vodou za vzniku doporučovaných koncentrací·

............. Ha cotyledony tykve se nanesou svilušky snovacl (Tetranyehus urticae Koch) a bavlníkové nebo melounové mšice (Aphis goseypii Glover) a nechají se usadit na obou povrSích listů· Ostatní rostliny v témže ošetřovaném květináči se nechají nezamořené· Listy se potom postříkají 5 ml testovaného roztoku pomocí DeVilbiasova rozprašovače při tlaku 6,9 kPa.

Oba povrchy listů se pokryjí roztokem až do stečeni a potom se mechají schnout 1 hodinu. Potom se odříznou dva nezamořené listy a umístí ee do Petriho oisky obsahující Spodoptera— — eridania Craaer·

—-----Dalgí-hmyzsevyhodnocujepoažitímpodobnýchpro^ středků a vyhodnocovacích postupů s uvedenými výjimkami·

Po uplynutí standardních dob působení prostředku se vyhodnotí procento úmrtnosti· Výsledky jsou níže shrnuty v tabulkách. Následující zkratky znamenají!

Výraz	hmyz/roztoč	vědecký název
BV	květopas _ _ .______ _	Anthonomus grandis
CA.......	~mšicebavlníková“~	Aphis gossypii
CBV	Heliothis zea	Heliothis zea
CLH	Dalbulus maidis	Dalbulus maidis
CBV	Diabrotica undecimpunc-
	tata hovardi	Diabrotica undecimpunctata hovardi
SAV	Spodoptera eridania	Spodoptera eridania
SM........	sviluška snovací	Tetranychus urticae
	Tabulka	X
Účinnost A83543A proti vylíhlým larvám CBV
oáetření	dny® množství- (ppm) % inhibiceb
topické®	1 1,00	20,00

5,00 100,00 pokračování tabulky X v

oSetření..............dny® množství (ppm) % inhibice

topické®	1	10,00	100,00
		50,00		100,00
		100,00		100,00
dietad	4	1,00		30,00
		5,00		100,00
		10,00		100,00
		50,00		100,00
		100,00		100,00
vajíčka®	6	10,00		0,00
		50,00		0,00
		100,00		30,00
topické®	1	0,50		10,00
		1,00		40,00
		5,00		80,00

10,00 100,00

50,00 100,00

100,00 ..............70,00

dieta	3	0,50 1,00 5,00	15,00 45,00 100,00
		10,00	100,00
. . *** *** — -- . . . — -· - . .	' ' * ‘ - · -* “	50,00	100,00

Poznámky:

^a počet dní mezi ošetřením a pozorováním b střední hodnota dvou testů ^c ošetření 1 ml upraveného A83543A ^d dieta je povrch ošetřený A83543A, nechaný usušit a zamořený^{4 e} vajíčka topicky ošetřená A83543A a nechaná až do kompletní·? —ho-vylihnutl~kontrolníeh-vajíček-—-------------—

Tabulka XI

Procento hubení vylíhnutých larev CBW složkami A83543¹

složka			· — ·.........-		PP®		...............
----------------------	0t5		.............1	-----------—	.........-.....5	...........	.....10...
A	55	(d)	100	(a)	100	(a)	100	(a)
B	35	(e)	80	(c)	100	(a)	100	(a)
C	5	(fi)	85	(bc)	93	(bc)	100	(a)
D	58	(d)	90	(ac)	100	(a)	100	(a)
E	28	(eř)	58	(d)	100	(a)	100	(a)
F	0	(g)	0	(g)	0	Cg)	95	(ab)
.....- G .........	0	(g)	...........0	(g)	-......20	(f)	........80	(c)

1) ošetření ae stejnými písmeny v závorkách jsou obdobná při koncentraci 0,05

2) topická aplikace pipetou - 20 larev/pokus a 4 opakování; naši oSaťřanín a nnatnwtvAnfn 1 Λβη

Tabulka XII

Účinnost A83543A proti larvám SAW stadiumošetření dný^a množství (ppm)' % inhibice

vylíhlé	listy keříč- c kových fazolí 3	1,00	10,00
		5,00	40,00
		10,00	100,00
		50,00	100,00
		100,00	100,00
vylíhlé	topické^ 3	1,00	-----------0,00

5,00 60,00 •ΊΊΙ.

10,00 100,00

50,00 100,00

100,00 100,00 « vylíhlé—„listy keříč- .„ ^„......___0^50............................... . . 0>Q0......................

	kových fazolí*	1,00 5,00 -----„j.0,00 - ™ - 50,00	66,67 100,00 100,00______ 100,00
druhý	topické^ 1	1,00	0,00
instar		. ς.πο	Q,_00 0,00
		< ..... 10,00
		50,00 100,00	80,00 100,00

Tabulka XII - pokračováni

etadius	.-‘ošet‘řěníT.7- ........	dny® množství (ppm)	% inhibiceb
druhý	listy keříčko-		1,00	0,00
instar	vých fazolíd	4	5,00	0,00
			10,00	80,00
			50,00	80,00
			100,00	100,00 '
třetí	topické®	2	1,00	0,00
instar	.......	- · “ ‘ “ — ·	. . . L_ .
			5.00	....... Q~QQ——-
			10,00	w jVv 13,33
			50,00	73,33
třetí	listy keříčko-	4	0,50	0,00
instar	vých fazolí*		1,00	0,00
			5,00	40,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
pátý	topické®	2	10,00	0,00
instar
			50,00	0,00
pátý	listy keříško-	4	10,00	0,00 '
instar.	vých fazolí® ,. ....		50,00	0,00

¢1 Λ dny mezi ošetřením a pozorováním ^α dvě opakování ^b střední hodnota testů * ^tři opakování ^c jedno opakování * ošetřeno topicky 1 ml formulovaného A83543A

- 54 Tabulka XIII

Účinnost A83543A proti dospělcůn BV pSetřem/ množství (ppm) % inhibice^a topické^b 1,00 0,00

5,00 20,00

-10,00 20,00 50,00 100,00

100,00 100,00 ^a jedno opakování, pozorováno 3 dny po oSetření ^b formulovaný A83543A (1 ml) nalit na dospSlce hmyzu na-----Petriho misce

Tabulka XIV

Účinnost A83543A při skleníkových testech proti různým Škůdcům plodin

plodina	Škůdce	množství (ppm)	inhibice6
kukuřice	CRV	30	100
		15
		7,5	10
		3,75	0
tykev	................SAV.....	250	100
		________125..................	100
		62,5	100
		31,25	55
		15,63	40
		7,8	20
		3,9	20
		1,9	0

-54α- _ _ tabulka XIV = pokračováni plodina škůdce množství (ppm) inhibice*

-------tykev---- 25(T ~70

	125 62,5 31,25	40 20 0
tykev		CA	100	0
			50	0
kukuřice		CIfi	200	90
			100 7 ·	30
			50	0
keřlčková	fazole	SAW	100	100
			50	80
			25	40
			12.5	0
keříčkové	fazole	SU	100	100
			50	80
			25	30
			12,5	10
			6,25	0
tykev		CA	100	80
			50	40
			25	0
kukuřice		CRW	6	30
			.....................3......................	0

Tabulka XV srovnává účinnost a stálost ošetřeni prostředkem A83543A s methomylem při testech v květináčích prováděných venku na Spodoptera erldania·

Tabulka XV

Účinnost A83543 proti Spodoptera erldania při testech v květináčích prováděných venku —

ošetření	množství	dny po ošetření*
(ppm)	......1.....'	5	7	14
A83543A	63	100	88	90	5
A83543A	125	100	88	95	90
A83543A	250	100	...	100	100
A83543A	500	100	100	100	100
methomyl	63	100	20	15	o
methomyl	125	100	35	40	20
methomyl	- - 250—~	íoo	85	—45™·	—
methomyl	500	100	90	85	60
Žádné	0	0	0	0	0
. --------	---------------	--- —, .....„	----—	·.—— ·’—.—----	™-----
žádné	0	0	0	0	0

^a výsledky jsou v % Úmrtnosti

Tabulka Xyi_aouhrnně.uvádl_lethálni koncentrace LC 50; při kterých testovaná sloučenina inhibuje 50 % testovaného hmyzu.nebo roztočů, kterých se dosahuje ošetřením Á83543A ve srovnání s methomylem jako známým insekticidem*

Tabulka XVI LC 50 pro £83543* cílový druh ' ” LC 50 tppm)

A83543. methomyl

CRW	15	6
k^jatka csenní	/>250	5,4
SM	150	71,4
SAW/listy	1,3	11,4
CBV/kóntaktně	................0,6*'.............	14,5

a _fflnogstvř-Diabrotica undecimpunctata howardi v-půdě-hmot-— nostně; ostatní jako postřikové koncentrace*

Složky A83543 jsou účinné vůči larvám Aedes aegyptl při standardních larvicldních testech na komárech* Tabulky XVII a XVIII uvádějí souhrnně účinnosti složek při těchto tes těch.

Tabulka X711

Účinek in vitro A83543B a A83543C^roti prvnímu instaru larev komára

A83543 minimální inhiblce

A

B

............c...........

0,016, 0,031^b 0,016 0,031 ^a nejnlžěí koncentrace, která vykazuje 100% inhibici po 24 hodinách (mikroiitr-desky) ^b testy na dvou místech

Tabulka XVIII účinek složek 483543 na čtvrtý lnstar larev komárů®

I £

složka...................... procento hubení

60, 70^b

B 60

.........-......-----------------C -.........-...........60 - .....................

D 30

E 80

T 0

G...................................................0 '....... ' ' ' ,· ^a po 24 hodinách při oSetření 0,312 ppm ^b výsledky dvou testů

Polní pokusy

Účinnost 483543 byla vyhodnocována v polních pokusech· V tSchto pokusech vykazovala sloučenina 4835434 účinek proti bělásku řepnému (Pieris rapae) a Trichoplusia ni na klíčící brokolici a proti směsi sojových housenek (75 %) a Spodoptera frugiperda (25 %) na sojových bobech·

Insekticidní prostředky

----- —si ftiiXení nv-nndl A.wnálezu. se.aoliku Jí-Ve.foroě jr.-» —- — . _v ______ _ _w prostředků, které jsou také součástí vynálezu· Tyto prostředky obsahují množství 483543 inaktivujícl hmyz nebo roztoče a fytologicky přijatelný inertní nosič· Tato ďčinná složka, tj* sloučenina A83543 může být v prostředku přítomna jako:

D-jednotlivá~slOŽka~A83543r2)'8Bičsndv©u 'nebb~v'íčě složěk7

3) rozdělená AS3543 směs nebo 4) A03543 spolu s vysušenou Částí fermentačního media, ve kterém byle vyprodukována, t.j· jako surová, vysušená fermentační živná půda·

Prostředky jsou buá ve formě koncentrovaných přípravků, které se pro aplikaci dispergují ve vodě, nebo ve. formě poprašů nebo granulovaných přípravků, které se aplikují přímo bez dalšího upravování.

Prostředky se připravují podle postupů a receptů běžně užívaných v agrochemii, ale tyto prostředky jsou nové a důležité, protože obsahují jednu nebo více sloučenin podle vynálezu·

Disperze, ve kterých se sloučeniny nebo surový vysušený materiál aplikují, jsou nejčastěji vodné suspenze nebo emulze připravené z koncentrovaných přípravků sloučenin nebo surového materiálu· Tyto ve vodě rozpustné, ve vodě auspendovatelné nebo emulgovatelné přípravky jsou bučí pevné látky (obvykle jako smáčitelné prášky) nebo kapaliny (obvykle jako emulgovatelné koncentráty nebo vodné suspenze)·

Smáčitelné prášky, které mohou být slisovány do formy granulí dispergovatelných ve vodě, jsou tvořeny dokonalou směsí áčinné sloučeniny, inertního nosiče a povrchově aktivních látek· Koncentrace účinné sloučeniny.je obvykle od asi 1 %, β výhodou 10 %, do asi 90 % hmotnostních· Inertní no- 59 sič je obvykle vybrán ze. skupiny zahrnující attapulgitová hlinky, montmorillonitové hlinky, diatomické hlinky nebo čistění silikáty·

Jako účinné povrchově aktivní látky, tvořící od asi 0,5 % do asi 10 % smáčitelného prášku, lze použít sulfonováné ligniny, kondenzované naftalensulfonáty, naftalensulfonáty, alkylbenzensulfonáty, alkylsulfáty a neionogenní povrchově aktivní látky, jako jsou adu^ty ethylenoxidu a alkylfenolů.

Etaulgovatelné koncentráty sloučenin obsahují vhodnou koncentraci sloučeniny, jako například od asi.50 do asi 5ÓÓ. g/1 kapaliny, ekvivalent od asi lO % ďo asi 50.95, rozpuštěné v inertním nosiči, kterým je bu& s vodou mísitelné rozpouštědlo nebo směs s vodou nemísitelného organického rozpouštědla a emulgátorů· ' '· · '' i · “» • fÝ

Jako organická rozpouštědla lze použít aromatická rozpouštědla,-zejména xyleny,ropné frakce, zejnánavysoko-.. vroucí naftalenické a olefihické podíly ropy, jako je těžká aromatická nafta. Lze použít také ostatní organická rozpouStědlaj jako jsouterpenickározpouštšdlavčetněpryskyřič-----nýeh derivátů, alifatické ketony, jako je eyklohexanon a komplexní alkoholy, jako je 2-ethoxyethanol.

———Vhodnými™ esulgátory-pro-eaulgovatelné-koncentráty, jsou běžná neionogenní povrchově aktivní činidla, která byla již uvedena výSe, . -------------------------- . 60 -------------- · · - - ~-------------------Vodné suspenze jsoutvořepysuspenzeaijyevodS.De-____ rozpustných sloučenin podle vynálezu dispergovaných do vodného nosiče v koncentraci v rozmezí od asi 5 % do asi 50 % hmotnostních. Suspenze se připravují jemným rozemletím sloučeniny, a jejím důkladným vmícháním do nosiče tvořeného vodou a povrchově aktivními látkami uvedenými již výfie. pír zvýšení hustoty a viskosity vodného nosiče lze též přidat inertní složky, jako jsou anorganické sole a syntetické nebo přírodní gumy. Často je nejííŠlnnějSí.rozemlít,a_misit^sloučeninu-sou·-— časně s přípravou vodné směsi a homogenisací v zařízení, jako je pískový mlýn, kulový mlýn nebo pístový homogenizér.

.Sloučeniny také lze aplikovat jako granulované směsi,, které jsou obzvláště vhodné pro aplikaci na půdu. Granulované směsi obvykle obsahují od asi 0,5 56 do asi 10 % hmoto, sloučeniny dispergované v Inertním nosiči, který sestává zcela nebo z větší části z hlinky nebo podobné levné látky.

Tyto prostředky se obvykle připravují rozpuštěním sloučeniny ve vhodném rozpouštědle a její aplikací na granulovaný nosič, předem upravený na příslušnou velikost částic v ' rozmezí od asi 0,5 do 3 mm·. Tyto prostředky lze také formulovat tak, Se se připraví těsto nebo pasta nosiče a sloučeniny, ta se rozdrtí a vysuší, Čímž se získají granulované částice požadované velikosti.

Popraše s obsahem sloučenin podle vynálezu se připraví jednoduše důkladným smísením sloučeniny v práškové

- 61 formě s vhodným práškovým zemědělským nosičem, jako je kaolir hlinka, rozemletá vulkanická hornina apod. Popraše výhodně obsahují od asi 1 % do asi 10 % sloučeniny.

Je rovněž praktické, je-li to Žádoucí, aplikovat sloučeninu ve formě roztoku v příslušném organickém rozpouštědle, obvykle nedráždivého ropného oleje, jako jsou stříkácí oleje, které se běžně používají a agrochemickém průmyslu.

Insekticidy a akaricidy se obvykle aplikují ve formě disperse účinné látky v kapalném nosiči. Je výhodné udávat aplikační množství v koncentraci účinné látky v nosiči. Nejčastěji používaným nosičem je voda.

Sloučeniny podle vynálezu lze také aplikovat ve formě aerosolových prostředků. V těchto prostředcích je účinná sloučenina rozpuštěna nebo dispergována v inertním nosiči, kterým' je tlakemse uvolňující hnací směs. Aerosolový prostředek je balen v kontejneru, z něhož se směs uvolňuje rozprašovací tryskou. Hnací směsi obsahují buá. nízkovroucí halogenouhlovodíky, které se* mísí s organickými rózpouštědly, nebo stlačenými vodnými suspenzemi s inertními plyny nebo plynnými uhlovodíky.

^^Skutečnérnnožství^loučéniny^kťeřé^se^oá^^apliků- vat- namí sta, kde hmyz., nebo roztočivši jí ,_nenírozhodu jí cí a může být snadno stanoveno na základě pokusu provedeného

- 61a pracovníky pracujícími v oboru. Obecně lze předpokládat, že se dobrých výsledků dosáhne při koncentracích od 10 ppm do 5 000 ppm. U mnohých sloučenin podle vynálezu stačí koncentrace od 100 do 1000 ppm. Pro polní plodiny, jako jsou sojové boby a bavlna, je vhodné aplikační rozmezí sloučenin asi 0,01 až 1 kg/ha, .....

Jí.. 62 obvykle aplikované jako postřik v množství 47 až 470 1/ha.

Místem, na které se sloučenina aplikuje, může být jakékoliv místo, kde se hmyz nebo roztoči vyskytují, například to jsou rostlinná sklizeň, ovoce a ořešáky, vinná réva a okrasné rostliny·

Vzhledem ke specifické schopnosti vajíček roztočů přežívat toxické působení, je žádoucí provádět opakované apli kace ke zničení nově vzniklých larev, jak je to též známo u ostatních známých akaricidů·

Ektoparasiticidní účinek

Sloučeniny A83543 jsou také účinné proti Členům hmyzu řádu Diptera.

Tabulky XIX až XXI uvádějí souhrnně studie s A83543A a AS3543D in vitro.

Tabulka XIX účinek in vitro A83543A proti larvám Fhormia regina dávka (ppm)

100

100

100

100

100

- 63 dávka účinek¹ • -Xppa)- ...............................-...............

100

100

95

0,5 60

...... 0,25 ......................... 25........

¹ účinek = % úmrtnosti

Tabulka XX

Účinek in vitro A83543A proti dospělcůta bodalky stájové

dávka (ppn) ''<................	24 hodiny účinek1 s	48 hodin účinek 1
100	100	100
50	100	100
25	100	100
10	100	90
5	80	100
2	70	90
1	10	60
.....0,5 -	......... 0 .......... ........	........10........

¹ účinek = % úmrtnosti

I

ΜΙΑ m

•d o

•tí

CM fl •rt

O	O	O	O	IA	ia
o	O	o	σν	t-	<M
H	H	H

o o σν σν o IA IA CM a

«

X) o

a <3

A

O fc

P •rt ►

C ti s

ti

Μ

VO

.. ____ _ „

__

. ..

o

„ O

o

o

O-

o

o

Si „

!

Λ

O

σν

o

σν

vo

fc

1

H

H

o

5

B

VI

i

pH

a

a

řrí

•rt

φ

tí

•tí

O

o

O

R

o X3

£

8

8

H

ti P

1

«

M-

CM

CM

•.

i>

β

1 ,

rt

o

r

o

c

A

<*Y

•rt

H

V-

<d

43

IA

1

o

o

9

O

o

o

b

O

3

m

43

o

o

o

o

σν

IA

ti

cg

1

H

H

H

rl

fl

£>

ti

fe cg

48

•rt •d

ti

ti

A

2

E4

ti

A

m M·

c •rt

48

ia

•d

m

o

O

o

o

o

o

ia

>ti

co

43

O

o

o

o

vo

CM

ti

rH

r-1

r-t

r-l

f

· · ·** *

X»

o

CM

CM

►

fc

O

P

O

•o

•rt

a.

A

XB

ti

►

1

•rt

P

O

*d

o

o

o

o

o

o

3

ti

•rt

a

m

o

o

o

o

o

t-

IA

ti

ílO

•H

ΙΛ

43

H

r-1

rl

2ř

ř?

Φ

....

m

.......

-..T-X

.....

43

— rrt

•

cg

M

•

ti

c

ti

•H

•tí

•rt

•H

•

P

O

β

x>

cg

c

ti

40

fc

O

•ti

•rl

o

o

!

•d

c

•rt

£

o

9

O

o

9

o

6

P

O

s

43

ao

IA

m

CM

fc

rrt

!

i

>®

h

..

&

s.

' ' *' '

CM

. .........

*

.....

i

•rt

á

fc

O •o

IA

O IA <vT

IA

CM

IA CM CM H vo m ·> *> O O

O .

£ s

Φ ·Η' O 8 O ti fc 43 A O

CM

Při testech in vivo sloučeniny A83543 vykazují systemický_insekticidní účinek_na morčatech-a-ovcích protilarvám Phorpjia regina a proti dospělcům bodalky stájové s žádnými zřetelnými známkami toxicity· Representativní sloučeniny AB3543A a JL83543D byly testovány v laboratoři a na cílových živoSišíh, čímž 8e atanovil rozsah účinnosti. Následující testy jsou ilustrativní.

Systemický test na morčstecfcV tomto testu se použijí dospělci morčat· Testo^

I -“i— váné sloučeniny se rozpustí ve vodném polyvinylpyrrolidonu nebo v polyethylenglykolu 200 a příslušné množství roztoku se podá.bučí orálně nebo intraperitoneální injekcí· Použijí se různé dávky sloučeniny, jak je déle patrné z dalších tabulek·

Morčatům se odebere krev po 30 minutách, pokud není uvedeno jinak, a vzorky krve se odcentrlfugují· Zubní tampony se nasytí krevním šerem a potom se v Petriho miskách vystaví působení dospělců bodalky stájové; larvy Phornjia regina se nechají působit ve zkumavkách· Po 24 a 48 hodinách se hmyz hodnotí a spočte se počet mrtvého hmyzu· Výsledky testů se vypočtou jako procenta úmrtnosti hmyzu.

Systemický test na ovcích

Na ovcích se provádí testy stejné, jaké jsou uvedeny výše u morčat· Testovaná sloučenina se podává intraperitoneální nebo intravenosnl injekcí nebo do žaludku; vzorky krv se odeberou 24 hodin po ošetření ovcí.

65a Výsledky systemických testů u morčat a ovcí za použití sloučenin Δ83453Α a A83543D jsou shrnuty v tabulkách mi až XXV.

A83543A nevykazuje anthelaintický účinek u ovcí oSetřených jednou intraperitoneální dávkou nebo dávkou do žaludku 50 mg/kg tělesná hmotnosti nebo u myči infikovaných experimentálně intestinálním nematodem Nematospiroides dubius, který byl podán orálně jednou dávkou 500 mg/kg.

ř *·'

-ρ

p->—0--------w—

' “·-------- Ul Ul

CJ-

IUP

B- -

o Μ

S 8

fi*

s

<

o

o

o

O

o

«5.

cx

o

0

;

z>

z*x

ζ·χ

Z“X

X*

*

II

Η II

P

o

O

o

H

H

p

H

u5

σ

0>

4

w

4)

43

41

9

f*·

43 Oi

<6

O

O

SaZ

*W

b«Z

J

o

& O

Pť

σ'

řť

i

1

M

O Cl

4

P

4 Ό

B

BX

pf

j

—o—

B ~ 0<

Φ<

-o-

4—

—

— -A.

---

— - —

-— · —

——

—P— 1

P

Ρ P

4c

<

c+

0 O

Φ

•0

Φ

0

4

4

o

•d

>

0

<

ο σ'

CJ

o

M

0

Λ O

CJ.

o

0

CX

P O>

0

ui

P

P

H

«+

P

□ 0

k

B

ί

o

o

vO

53

0

0 P

o

P

sr

o

o

O

O

O

Sj

B

?

s

σ c

o o>

5

P O

ca

«*

P

i

χ

c*

0

c*

DX

0

«3

P

r*

b

O

0>

í*

BX

4

p·

O

ό

φ

CJ.

c+

CP

J

P

O

9

b·*

B

OB

<

O

P

►

O

řť

αχ

CB

0t

<n

Q

Ml

tÓ

4

αχ

ř*

SX

O-

O

O

o

O-

43 -

CX-

š

P

Ol

í

«·

0

0

«5

<*

0

. ._·. ·· -*-

a

, .T* .

.. ....

. ... .. _

... . _ ..

<

<

4<

g

1

Φ

4

1-3

f+

Φ

z

ss

SS

ss

ss

O

P

řv

K

z*x

ss

TO

II

tx

o

H

P

p

P

M

0.

w

<í

W

41

M

to

Ul

Ul

CJ

U>

P

P

B

Ρ» Q

II

II

H

H

c

Ul

o

O

o

o

o

o

8*>

Zb

Z*x

z-x

' Z^b

zs

>-x

bxz

a

P

CX

P

p

P

P

w

P

H

p

P

(S

σ

O

9

W

w

41

9

41

9

9

¢+

í+

*

S-Z

v-z

x-z

X.Z

XhZ

X*Z

\z

!

4

1«

4

0

0

0

<

P

Ό

•

fi

fi

s

s

pi

4

P

1-*

P

o

Q*

P

IO

O

δ

ro

o

00

□3

OB

s

c*

Ul

O

o

o

o

o

O

o 1

0

s

O

©<

0

í

0

Φ

i

<+

0·

i

0

P

1

B

9

P

0(

J

O

<r

P

1

\O

—4

CJ

CJ

β

c

c

O

O

O

o

o

o

O

41

o

4

•

O

:

P

í

p

SS

SS

SS

SS

ss

ss

ss

ss

o

i

Μ

Ιη vivo insekticidní účinek A83543A

LJ o

n u o »1 0 dospělcl bodalky stájová »1 o

0)

Η» σ

lj

I

H· <+ •O

He*

O

0v

H

0( o

•í ř

s

0<

H »0

H •0 lj

O	0
B<	9
0	0»
<+	0
**	O
0	σ
0
Hv

i?

<♦

IV

4* VI pp ~0 rv lj •r* vt o pi-gp- g

H· s

ro vo VI VI

ΓΌ

		ro		lj	IV		LJ
VI	o		VI	o	4>-	VI	O
sr	B	0	tr	B	P·	P*	B
	H·			H·			H·
	0			0			0

lj ví vo O O O

O 0>

. 0> O < β σ’ o o* 0 Hv ; n o*

Hv

O

Η» •

řv <+

H*

O

H·

0*

Hv £♦

O

H· £

oS o ě o o o o

IV _ -0

Ví O vi O O O

	' ·'	iř
		CO	0
	fc	LJ
O(	ί»	VI	0	I
H·	LJ	4*
0	VI	LJ	c	OV
0	4*	k-		-0
O	LJ		H
0	►·	0		1
»*			IV
H·		!>

LJ ví

4*

LJ tl

B <x f*

HH

SUP

11	II	u
P<	P·	P>
O—	o	-ο-
	<*	ο
Nt	*1	•β
φ	Φ	αχ
H	•a	Η
0	o	ο
P>	4	Ρ·
ř	P· c* O	ř
	□	α
	O 0*	9 Η

<K n

<+ . Φ*

CJ.

O <

αχ

........... ......... . ..;A .

O

Cb	Β
ο	0
4	Ο t* Φ
•d	<+
ο Ό	<1 Ρν
Ο 0. φν 0	/-χ 4
Ρν Μ •d	&
ο	Ό Ο
(V	Ο
«*	Φ
φ »1	C*
<<ν	♦d
ο	ο
0	Ρ* φ
φ φ	4 Ο
ο Ο-	0
φ	Ρ*
σ'	αχ
φ	<
4	φ
φ ϊ φ <	κ

φ	0 W	0	Η	ΙΟ	VI	VI
ť	Φ ο	Ο	Μ	VI	Ο	Ρ
	Q 0	φ	Η	Μ	Μ	Η
η	w £*	Ρ·		ro	Η	Ρ
	Φ 4	Ο	ζ“\
Η	<* Ο		Η
Η»—		*-*- ·—	~«ί_	Η	~Η-	Η
4	φ φ			S	W
	0
Μ	ο
S ο	LJ	4“	ro	W	CJ	CJ
*1	Ο	4-	VI	4“	Η	00
Β		«Φ	«Φ	«φ	4Φ	4Φ
Ρ·	\0	VI	νο	Η	σ>	ο\
Φ	i
4
Φ	•
04
Ρ·	ί
0	ο	Ο	Ο	Ο	ο	Ρ
Φ
	ο	Ο	Ο	ο	ο	6
		i. U	(Ο
	ό	ο	VI	ο	6	ο
	ό		Η	<9	Η
	ο	ο	Ο	Ο	Ρ
	ό		Η	ro		Η
	ο	Ο	VI	Ο	Ρ
ry	>			Η	Η
<ί	ό	ο	Ο	Ο	Ο	Ο
κ	ί			Η
				5	<0	Η
Ρ·	ο	ο	Ο	ο	ο	Ο
0	ί
f*
4				Η
Φ	ο	ο	Ο	Ο	ο	Ο
φ	1
0	ϊ			νΟ		19
Ο	ο	ο	Ο	Ο	Ο	Ρ
Φ
0	1
αχ				ΙΟ	19	Η
	Ο	ο	Ο	Ο	Ο	Ρ
	1 ί Ρ	ο	Ο	VD Ο	δ	8
	ό	ο	Ο	Ο	ο	Ρ
	ό I			Os	4ν	Η
	ρ	Ο	Ο	Ο	Ο
	ο	ο	Ο	Ο	Ρ	S
				VI	to	Η
	ό	ο	Ο	Ο	Ο	Ο
	ό	ο	Ο	Ο	Ρ	Ρ

Ο	H
	σκ	0
	φ	Φ
	(+	Φ
J.	4t	IV
ί	Φ	f*
^--ΐ -—	- 0-	-		------------
	Ρν	o
		P·
		P.
		0
		Pv
ρ* *d	0
*-* Β Ρ·	O
W C	<	Pi
Λ c* Ο	S
ε	: 0,	O
C	> 0	o
β	ι Ρ»	Φ		·.
<+	0
		Pv
,		•d
Ρ Ρ·		P· e>
.... φ		n oo
0	i	O V)
__	‘__:	0—VI
φ» Λ		Φ 4-
		0 CJ Í5
-ι---ΐ - ,	-	g, .		·.· ·.
ť CJ		<
; β Φ> ρ·	. .	0		1 . . , ...
	4 4 N <1
0		0 p.
f V»		0 O Φ <	1-3
	9	Φ
		< Pv
ί 0	•d	N	0	1
Φ*	4	O 0
	Ο	a »	0	Ch
Ρ»	0 Φ	4?	H	00
t1 Φ	0	0»		1
; 0	c*	φ Φ	0
	O	S 4	Φ
> Η	f	Φ o
	: 0
	4	o
	«4	0, «
Η Cb	0	Φ Φ	B
: Φ	O	0 Φ	m
0	Φ	4 B
	c*	Φ O
Φ*	Ρ»	0 0
; 19	0	Φν O 0 0
	s	O 0
	M	Φ
¢4 ο,	N	P
, Φ	C	O
! 0 Φ· GJ	O	O o 4 0 0 f+
	pv o
		4		-
		Φ c*
f ρ·		0
.· φ	- J	Φ
i 9		1
; 4*	J	19
	!	4^
		i 0
Η ρ<		O
; φ		Ρ»
; 0		P·
tt»		9'
ί VI		P·
	i	0
1		<4 P·
	1 1	f*
i		4
	-	0

H » »d k ť 11 U H íl te

O t* ©

H

C te η· te 0 O c* α 4 Ό © αχ •0 ©

Hř*

O ©

te

H «

pr © o O o te c+ © 4 c+ O 4< H © © 0

O ©

CX

H	to	VI	VI	O
M	yn	O	O	te
H	H	M	M	O
	(0	H	H	«+
z—v				4<
H	z—\	z*		©
<5	H	H	H	0
	W	w	4f	PS

σ o

te ?

B H· ©

2

Λ m H> <*' 0 te © CJ.

O te

W'	te	ro	CJ	CJ	CJ
O	te	VI	te	H	CD
«Β		w	u		w
VO	vn	VO	H	CD	σ>

** β Ρ» X o « ot) <+O * 0 te o s © PS c*

.......w &	tr.....
©	te
σ	te
—- α	- 4- ~
4	©
Φ 4 ©	X

O

O o

o

O* o o o

H

O O O

O vi o S o o o o

H o o

O o o

H

O

VO

O

S

O vO

O O O o

o o o .M------,-.-4O O O vO o o O

CJ o o o o o o

o	o	f- te : © c	1
O	8	►	1
		; o
	H		•
o	O	f CJ
		; vn
H		! B	l
O	o	fr» H·
		; g
-4	H	. .......
VI	O	t* VI
CJ	H	.· X	•0
O	O	X	4
pJ		;	O o
2	H		©
o	O	H te	0
		©	ť*
		f 0	O
Φ
O	O	* ..	ct
		H	B,
M			4
δ	ro	J'	e*
o	O	L·· te	0
		; ©..,	„o:,-..
		: 0 :	©
-4	CJ		r*
O	o	>	PS
		; ro
H
8	8	t-ι te
		í ©	»
		: σ	C
ro	H -	— t · -	O
O	O
		; c>
te	ro	í
o	o	t-i o,
		©
KS		' o	ΐ
8	8
		......' ,_te...	í
ro	to	1
VI	VI	f te
		©	i
—		...... 0..	--r---
o	o	I*

VI

Ů

Testy in vitro proti intestinálním nematodům Haemonchus contortus u ovcí ukazují/SckoncontracelOOppe' A83543A usmrtí 30 % hlístů.

Ektoparasitícidní způsoby

Předložený vynález se taká týká způsobu kontroly populace hmyzích ektoparasltů, kteří se živí krví hostitelská. ... '^Λ' ho zvířete, který spočívá v podávání účinného, množství 8lo.učeniny A83543 hostitelskému zvířeti. Hmyzími ektoparazity jsou“hmyzí parasiti~a~parasiti-řádu-Acar ina.~ Sloučeniny -lze— aplikovat zvířatům na kůži, orálně nebo parenterálně.

Parasitický hmyz a roztoči zahrnují druhy, která sají krev, jakož i masožravá, a jsou parasitičtí během celého svého životního cyklu, nebo během pouze Části svého Životního cyklu, a to buá v larválním nebo dospělém stadiu. Representativními třídami jsou:

ovád bodalka stájová muchnička veě zákoŽka svrabová prašivka veě veě veě kravská

Tabanus spp. Stomoxys calcitrans Simulium spp. Haematopinus aslni Sarcoptea scabiei Psoroptes equi Haematobia lrritans Bovicola bovis

SX

Haematopinus eurysternus veš bodalka dobytčí roztoč klíště klíště klíště klíště klíště moucha

Reduvius spp.

komár klíště klíště klíště klíště . veš- -———blecha veš —veš—— kloš ovčí prašivka ovčí moucha ______ moucha vrták moucha

Štěnice domácí

Linognathus vituli Glossina spp·

Demodex bovie Boophilus microplus a B. decoloratus Amblyomma maculatum Amblyomma americanum Otobius megnini Dermacentor andersoni Cochliosyia hominivorax Reduvius spp.

Culissta inornata Rhipicephalus appendiculatus Rhipicephalus evertsi Amblyomma sp.

Hyalomma sp·

Haematopinus ' suis~~ Tunga penetrans Haematopinue ovillus Linognathusrpsdaíis ~~ Melophagus ovinus Psoroptea ovis

- Phse ní o i a- s er-i c sts —-— .....

Phormia regina Coehliomyia macellaria Fhaenicia čupřina Cimex lectularius blecha--------klíštók

Smolík kuří roztoč roztoč roztoč blecha psí piják “piják ^psí~ —Echidnophagagallinacea__

Argaa persicus Dermanyssus gallinae Knemidokoptes mutans Knemidokoptes gallinae Demodex canis Ctenocephalis canis Dermacentor variabílis —Rhipicephalus-sanguineus—

Tento způsob podle vynálezu lze užívat k ochraně hospodářských a společenských zvířat před ektoparasity· Sloučeniny mohou být například s úspěchem podávány koňům, dobytku, ovcím, prasatům, kozám, psům, kočkám apod·, jakož i exotickým zvířatům, jako jsou velbloudi, lasy, jeleni a ostatní druhy, které jsou obvykle označovány jako divoká zvířata· Sloučeniny mohou být také s úspěchem podávány drůbeži a ostatním .ptákům, jako jsou krocani, kuřata, kachny apod· S výhodou je však způsob aplikován na hospodářská zvířata a nejvýhodněji na doby t

tek a ovce.

Mhožství, doba a způsob účinné aplikace jsou různé a mění se podle druhu parasita, stupně napadení a ostatních faktorů· Aplikace lze provádět periodicky během celé průměrné délky Života hostitele nebo pouze při vrcholném údobí útoku parasita· Obecně se kontroly parasitů dosáhne topickou aplikací kapalných přípravků obsahujících od asi 0,00005 do 95,0 %

- 73 sloučeniny s výhodou do 5 56 a nejvýhodněji do asi 1 56 sloučeniny. Účinné kontroly parasitů se dosáhne podáním množství od asi 5 do asi 100 mg/kg.

Sloučeniny se aplikují hostitelským zvířatům obvyklými veterinárními praktikami. Sloušehiny se upravují do ektoparazitieidníčh směsí, které jsou tvořeny sloučeninou a fýsiologicky přijatelným nosičem. Například kapalné prostředky lzejJ jednoduše stříkat na zvířata, u nichž je třeba ektoparasity hubit· Zvířata se také mohou ošetřovat sama takovými zařízeními, jako jsou škrabadla hřbetu, která mohou obsahovat toxickou látku a proti kterým zvířata procházejí a nebo jsou s nimi v kontaktu. £ aplikaci účinné látky hostitelskému zvířeti lze též použit ponořováci lázně.

Sloučeniny podle vynálezu vykazují systemický ektoparasiticidní účinek. Sloučeniny mají schopnost pronikat tkáněmi hostitelského zvířete, kterému byla podána jedna ze sloučenin podle vynálezu. Hmyzí parašiti, kteří konsumují krev nebo ostatní tkáně hostitelského zvířete jsou takto zabij Sloučeniny se podávají kůží, orálně nebo perkutánně.

Předložený vynález se také týká ektoparasiticidního prostředku, který se vyznačuje tím, že obsahuje fýsiologicky přijatelný inertní nosič a sloučeninu A83543. Tyto pro------------------středky lze připravovat známými způsoby, například 'rozpuštění® ~—sloučeniny^ jedné-^ebovícefysiologicky.přijatelných___________ pomocných látek nebo ředidel. Orální aplikaci lze provádět smísením sloučeniny se zvířecí potravou nebo s pitnou vodou nebo podáváním dávkových forem, jako jsou tablety, kapsle, bolusy nebo implantáty· Perkutánní aplikace se s výhodou provádí subkutánní, intraperitoneální a intravenosní injekcí Infikovatelného přípravku· . - . v _Pro orální podávání,lze 3 sloučeniny .upravovat do , ^^b^kíých^fÓremT^jako^jsdu^nálevyT^tabletynebo^kapsle^Tyto'“ prostředky ovšem vyžaduji použiti orálně přijatelných.inertních nosičů· Sloučeniny lze taká upravovat jako injikovatelné roztoky nebo suspense pro subkutánní, kožní, žaludeční, intraperitoneální, intramuskulární nebo intravenosní injekce· Při některých aplikacích se sloučeniny formulují jako jedna ^f I složka standardní potravy zvířete. Podle tohoto rysu vynálev zu se sloučenina upraví nejdříve jako premix, ve kterém je sloučenina dispergaéna v kapalném nebo v částečně pevném nosiči· Rremix může obsahovat od asi 4,40 do 551 g sloučeniny na 1 kg· Premix se formuluje do konečné potravy běžným míšením· *

Protože útok ektoparasitů obvykle trvá během pod-» statné fiásti Životního cyklu hostitelského zvířete, je výhodné podávat sloučeniny podle vynálezu v takové formě, která zajišťuje postupné uvolňováni účinné látky během delší doby. Obvykle se to provádí pomocí matrice, která fýsiologicky in75 hibuje rozpouštění, přičemž matrice je voekovitá polopevná látka,jako jaou rostlinná vosky nebo polyethylenglykol s vysokou molekulovou hmotností. Dobrou formu podávání sloučenin představuje trvale působící bolus, jako je popsáno Labym v US patentu č. 4 251 506 a Simpsonem v britském patentu č.

059 767. Pro takovýto bolus je sloučenina enkapsulována do polymerní matrice, jak je popsáno Nevinem v US patentu č.

273 920. Trvalého uvolňování sloučenin podle vynálezu lze také dosáhnout použitím implantátu, například z pryže obsahujíc! silikon.

Předložehý vynález je blíže objasněn v následujících příkladech.

Příklad 1

Zkoušení A83543 pomocí HPLC . -. _____™—~Pro^monÍ tor o vání f erm en tac epřipří pra věA83543 se použije následující analytická HPLC metoda.

Vzorek celé živné půdy ee centrifuguje, dekantuje ~a~odstraní šesupěrnatant. K biomase se přidá dostatečné množství methanolu tak, aby vzorek měl původní objem, míchá se a směs se nechá stát minimálně 15 minut. Odcentrifuguje _{_}_se.a..supernatant-9e-ndííltruje*fíltrss’C745“/jaí—

- - - -Alternativně ae může~ceráživná “půda” extrahovat aAonitrilem (1 : 4 Živná půda : rozpouštědlo) nebo acetonem.

- 76 -Hfic systém: --------------^:— — -——------.— ---------:----Kolona: kolona 8-x 100-mm, silikagel-4 ^m sférický C₁₈(Hova C18, Waters)·

Mobilní fáze: CH^CN/MeOH/H^ (45/45/10) obsahující 0,05 SB amoniumacetátu průtoková rychlost: 4 ml/min retenční časy: A83543Á - 3,6 - 3,7 min —---------Αβ3543Ρ^.4,4 - 4,5 min _____ j/eteAce: UV při 250 nm

Příklad 2 * r

Příprava A83543 s kulturou A83543.1

A· fermentace v třepací lahvi

Kultura Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, bu3 jako lyofilisované peletky nebo jako suspenze, udržovaná pod kapalným dusíkem, se použije pro naočkování vegetativního media o složení Λ nebo B (přičemž medium B je výhodné pro přípravu ve velkém měřítku):

složka množství (%)

Vegetativní medium A

í.

sojová Živná půda* extrakt z kvasnic

MgSO₄.7H₂O glukosa maltosa deionizovaná voda pH neupravováno * Baltimore Biological Laboratories

3,0

0,3

0,2

0,5

0,4 do , 1 litru

Vegetativní medium B složka množství (%) enzymem hydrolyzovaný kasein* 3,0 ' ěxtftť z kvasnic '”’ q*j“

MgS0₄.7H₂0 0,2 glukosa 1,0 deionizovaná voda do 1 litru pH 6,2, upraveno na 6,5 NaOH

HZ Amine A, Sheffield Products, P«0« Box 638 Horwich,

ΝΪ 13815

Šikmé půdy nebo desky se mohou připravit přidáním 2,5% agaru k vegetativnímu očkovacímu mediu A nebo B. HaoČkováné šikmé půdy se inkubují při 30 °C od asi 10 do 14 dnů· ——Vzrostlá-šikmá-kultura-se-seškrábne-sterilnim nožem,-čímž-------se uvolní spory a odstraní se a maceruje ae myceliální koláč· Asi jedna čtvrtina uvolněných spor a kultivační živné půdy takto připravená se použije pro naočkování 50 ml písmák prvního stadia vegetativního očkovacího media. Alternativně může být první stadium media naočkováno z ampulky s kapalným dusíkem· ..... ...... ^r ._ »^-Udržuje-li-ae kultura v kapalném dusíku, připraví se ampule použitímstejných~ objemů vegetátívní kulturyCinkubace 48 až 72 hodin, 30 °C) a suspendovaného media· Suspendované medium obsahuje laktosu (100 g), glycerin (200 ml) a deionisovanou vodu (do 1 litru).

Ampulky s kapalným dusíkem se použijí pro naočkování 100 ml vegetativního media v 500 ml Erlenmeyerových bankách (nebo 50 ml v 250 ml baňkách). Kultury se Inkubují při 30 °C po dobu 48 hodin na třepačce kroužící v kruhu (5,08 cm) při 250 otáčkách za minutu.

Inkubovaná kultura (5 % obj./obj. očko) se použije pro naočkování 100 ml produkčního media následujícího složení: ,

Produkční medium I

složka '	množství (%)
glukosa	4
rostlinný protein, částečně enzy-
maticky hydrolyzovaný*	1,5-3
moučka z bavlníkových semen**	1,0
CaCO^ (chemicky čistý nebo technický)	0,3
olej ze sojových bobŮ	1,0
voda z vodovodu do	1 litru
(před sterilisací pH upraveno na 7,0 NaOH)

* Sheftone H, Sheffield Products ** Proflo, Traders Protein, P.O. Box 8407, Memphis, TN 38108

Naočkované produkční medium se ínkubu jev5Q0al Erlenmeyerových bankách při 28 až 30 °C 6 až .8 dnů na třepač ce kroužící v kruhu (5,08 cm), při 250 otáčkách za minutu·

Fermentace' V míchaném bioreaktoru

Pro přípravu Velkého objemu očka ae 10 ml inkubovaného prvního stadia media, připraveného podle odstavce A, “použij6’přunaočkování“‘400ol~iřuhého^-staídia vegetativního '^neái⁸t, které mÓ 8tejné. 8ložení jako_prviQÍ stadiuB vegetativního media· Druhé stadium media ee inkubuje 48 hodin ve 2 1 Sirokohrdlé Erlenmeyerově baňce při 30 °C na třepačce otáčející se v kruhu (5,08 cm) při 250 otáčkách za minutu.

·—_Ιβ1Λο připf_air_eBg intubóvahé druhé “stadium vegetativního media (2 1) se použije pro naočkování 80 až 115 litrů sterilního produkčního media, připraveného postupem podle odstavce A· Je-li třeba, pro kontrolu pěnění se přidá dále olej ze sojových bohů· '

Naočkované produkční medium se nechá fermentovat ve 165 litřeSr míchaném bioreaktoru 5 až 8 dnů při teplotě '28 °C. Profukování vzduchem a rychlost mícháni v míchané ná.......... ' .... -.W.—. . III 1 I ...........Λι>Ρ—..............

době se řídí počítačem tak, aby byla udržována hladina rozpuštěného kyslíku při nebo nad 5056 nasycení ve vzduchu, r

P ř í k 1 a a 3

Izolace A83543A, B, C a D

Fermentační Živná půda (225 1) připravená podle příkladu 2, se přefiltruje (L56 Nýflo) a oddělená biomasa se promyje vodou (asi 50 1)· Biomasa se potom protřepává s methanolem (asi 100 1) po dobu asi 1 hodiny a přefiltruje se*

Methanolický filtrát se zahustí na objem asi 1 litru Koncentrát se extrahuje třikrát díethyletherem (vždy 1 litr)· Spojené etherové extrakty se zahustí na objem asi 200 ml·

Část koncentrátu (8 ml) se chromatografuje na koloně silikagelu (RP-8 Lobar, velikost Β, E.M. Science, a Di vision of E· U, Industries, lne·)·

Tento postup se opakuje celkově 12x. Přístrojové vybavení a provedení postupu preparativní chromatografie způsobem Autoprep je následující:

Kompletní HPLC systém Autoprep je tvořen třemi pumpami Rainin Rabbit HPX, jedním tlakovým modulem, jedním kolektorem frakcí Gilšoh Model 20 ϊ B HPLC, jedním detektorem absorpce ISCO-V^ a jedním počítačem Apple Macintosh Plus· Kompletní systém je uspořádán podle instrukcí daných v Dynamax HPLC Method Manager manual od Rainin Instrument Company, lne· Autoprep HPLC konfigurace využívá automat ickýsystémkprqvedení preparativních separací opakovaně za skutečně identických podmínek se skutečně identickými výsledky· Sbírání a spojování odpovídajících frakcí z vícenásobných pracovních operací zajištuje chromatograf!ckou kapacitu bez potřeby použití velké kolony·

Používají se isokraticky dvě směsi rozpouštědel (A) a (B) 3 průtokovou rychlostí 8,0 ml/min·

------Systémy-rozpouštědel - - ——------rozpouštědlo množství <!) ~

.......... & ........B.......

CH₃ÓH 95 100 • CHjCH -------------------95-----------100----------------H₂0 10 - 82 - -~---------------Isokratické směs obsahuje 60 % rozpouštědla B.

Doba průběhu každého cyklu je 28,0 minut. ELuáty z prvních 16 minut každého běhu se vylijí* Následující eluáty se sbírají vždy po 6 frakcích, 2 minuty (16 ml).

Z automaticky odebíraných frakcí ae všech 12 cyklů, vznikne 6 konečných frakcí (chromatografické řezy).

v

Přítomnost účinných sloučenin 483543 se stanovuje analysou, všech konečných frakcí na účinnost-vůči larvám korná- í rů a také analyticky pomocí HPLC.

Účinné frakce se potom spojí podle jejich účinnosti a HPLC profilů a dále se čistí za použití stejného Autoprep HPLC a rozpouštědlového systému, avšak s vysokou rozlišovací schopností, preparativní kolona 21,4 mm x 25 cm (Hainin Pynamax), naplněná silikagelem 8 ^um s reversní fází C-18. Získá se 483543, složky A, B, C a D. Faktory A a D krystalují ze směsi methanolu a vody.

FD-MS složky 483543C je zobrazeno na obr. ξ a FAB-MS složky A83543B je na obr. 9»

Příklad 4

Čištění 4835434 a D

Připraví se fermentační živná půda (10 1) postupem podle příkladu 2, odstavce A s tou výjimkou, že 1) použije se

- 83 200 ml produkčního media v 1 litrové baňce; 2) pro produkční medium se nepoužije sojový olej; a 3) inkubace se provédí t

při 30 °C po dobu 4 až 6 dnů. Živná půda se přefiltruje. Filtrát obsahující 4 jig A83543A/ml a nedetekovatelná množství A83543B, C nebo D/ml se vylije.

Biomasa se promyje vodou a extrahuje ae 1 hodinu methanolem. Extrakt (7 1) obsahuje 72 A83543A/ml a 7 ^tg

A83543D/ml.

Methanolický extrakt se zahustí na objem 5 1a přidá se pryskyřice HB-20 (150 ml, Mitsubishi Chemical Industrie

---------- Ltd, Japonsko) ve vodě (21). Směs se míchá 1 hodinu.---------Směs s pryskyřicí HP-20 se potom naplní do skleněná kolony. Původní vytékající kapalina a eluát používající methanol a vodu (1 : 1, 1 litr) nejsou účinné. Druhý eluát používající methanol a vodu (7:3,1 litr) obsahoval stopové množství A83543A. Následující eluát používájící methanol (1 litr) obsahoval aktivní A83543A a A83543D.

Methanolický eluát se zahustí a spojí 8 2 podobný-------—mifrakcemi z- o^statních zpracováníazahuatí se do sucha.Zbytek ee rozpustí v 75 ml methanolu a tetrahydrofuranu (4 : 1) a vyšráží se přidáním do 10 objemů acetonitrilu· _Směs se přefiltrujea.filtrát,se zahusti.k_suchu,

Zbytek se rozpustí v methanolu (25 ml) a nalije se na kolonu 5,5 x 90 co Sephadexu LH-20 (Pharmacia IXB

- 84 Biotechnology lne., USA), připraveného v methanolu, načež se sbírá a analysuje 12§ 25ml frakcí, použitím HPLC postupu .k popsaného v příkladu 1.

frakce obsahující požadované sloučeniny se spojí a zahustí. Zbytek se rozpustí v methanolu (10 ral) a naleje se na preparativní kolonu 41,1 m x 2$ cm naplněnou silikagélera C-18 s reversní fází 8 (Rainin Dynamax).

Kolona se upraví methanolem, acetonitrilem a .vodou ~(37,5-1-37-, 5—: -25). ~Po-aplikaci_vzorku^se„kolon3_vyví~ jí použitím 180 minutového lineárního gradientu následujících rozpouštědel:

Systém rozpouštědel rozpouštědlo množství (ml)

	A	B
CH^OH	37,5	45
CH^CM	37,5	45
HgO	25	10

Gradient probíhá od 100% A do 100%B, sbírají se 25 ml frakce.

frakce obsahující A83543A se spojí, zahustí k suchu, rozpustí v terč.butanolu (5 ml) a lyofilisují. Získá s 77θ mg čisté A83543A.

IČ spektrum A83543A v CHClj je uvedeno na obr. 1. FD-MS spektrum A83543A je uvedeno na obr. 4j FAB-MS spektrum A83543A je uvedeno na obr. 8 ÍFAB dispersant dithiothreitol:

:dithioerythritol (5 : 1)# a EI-MS spektrum A83543A je uvedeno na obři 10.

Frakce obsahující A83543D se spojí s frakcemi obsahujícími složku D z 6 podobných zpracování a zahustí a chromatografují, jak je popsáno výše, za použití stejné kolo ny, avšak s jinými rozpouštědly.

Kolona se upraví methanolem, acetonitrilem a vodou (40 : 40 : 20). Pro vyvíjení kolony 180 minutovým lineár ním gradientem se použijí tyto rozpouštědlové systémy:

Systémy rozpouštědel rozpouštědlo množství (ml}

A B

CH^GH 40 95 ____C-H^CM 40 95............................

HgO 20 10

Frakce obsahující A83543D se spojí a zahustí. Zbytek- serozpustí™v^térc.butaňólú ^“mrreTiýofílíšacT s¥ získá 212 mg A83543D.

IČ spektrum A83543D v CHCl^ je uvedeno na obr. 2#

-a^PIí-MS^spsktrum^ASj^^jD^áé -uveaeůo^ha^obř. 67

-- —------------ — —..-— -86--____.___ ____________... .--_____ ______—________________P_ řJ..t,lad. $________________

Izolace složek A83543 B, F, G, H a J a pseudc^lykonu A

Fermentační živná půda (8^), připravená podobným postupem, jak je popsán v příkladu 2, se zpracuje postupem popsaným v příkladu 4* Frakce z kolony Sephadexu LH-2O obsahující požadované sloučeniny se spojí s odpovídajícími frakcemi z podobných fermentací. Protože složky E, F, G, H,

J Λ pseudoaglykon Á vznikají ve velmi malých množstvích, je třeba provést řadu fermentací, aby se získala dostatečná množství pro další čištění.

Spojené menší frakce, připravené tímto způsobem a obsahující přibližně 1,6 g pevného materiálu, se aplikuje na HPLC kolonu (Bainin Dýnamax) naplněnou silikagelem C-18 s reversní fází - 8 /an (ODS), jak je popsáno v příkladu 4. Kolona se upraví methanolem, acetonitrilem a vodou (75*75*50) a gradient proběhne od 100 % rozpouštědla A do 50 % Bj systémy rozpouštědel jsou následující:

Systémy rozpouštědel množství (%)

rozpouštědlo	A	B
CHýJH	75	95
OHjCN	75	95
HgO	50	10

Sbírají se 25 ml frakce. Následující frakce se spojí:

spojení	frakce
1	31 - 44
2	45 - 63
3	64 - 69
4	70-80
5	81 - 130
6	131 - 160

část spojení 5 (100 ml) se zahustí a zbytek se rozpustí v. methanolu--(1-ml-)--a-nal-i je se na HPLC kolonu 21γ4 mm x 25Ο mm (Rainin Lynamax), jak je popsáno v příkladu 3. Kolona se upraví systémem rozpouštědel A z následujících systémů rozpouštědel:

>r f -4 -t “

Systémy rozpouštědel

rozpouštědlo“'“	~ množství (%)'
A	B- ·
CH3OH 30	95
CHýJN ------30	95
H2O(1N NH40AC,pH5,0)
40	—
«2W 10

a vyvíjí se 120 minutovým lineárním gradientem ze 100% rozpouštědla A do 50% rozpouštědla B, sbírají se při průtoku rychlostí 7,Jí ml/min 15 ml frakce. Eluce pokračuje __;___________Při §0% B dalších_60 minut .

Následující frakce se spojí:

spojení frakce složka

37 Ρ

38 - 48 Ε

-3 _ 5²-⁶3 B,G ~ 65 - 70 H,J

Tyto spojené^frakce se spojíoštatnimi^spo’je~ nými frakcemi z ostatních chromatografických průběhů za použití podobných výchozích látek. Spojené frakce se dále čistí použitím chromatografické kolony, jak je popsáno výšej zbaví se solí na pryskyřici HP-20 běžnými technikami a zahustí se a lyofilisací se získají následující složky:

složka množství (mg) mol. hmotnost IR* **..

E	249	717	obr. 13
F	4	717	obr. 14
G	- 104	731	obr. 15
H,J	87	717	obr. 16
psěudo A	288	590	obr. 3

hmotovou spektrometrií ** KBr disky

FD-MS a ΚΕ-MS spektra A83543A pseudoaglykonu jsou uvedena v obr. 7 a 11.

¹ . i .

ř .··-'/

Příklad 6

Příprava A83543 s kulturou A83543.3

A. Fermentace v třepací láhví

Použitím postupu podle příkladu 2, odstavec A se v txepacích bankách kultivuje kultura Saccharopolyspora spinosa NRHL 18537, ale za použití vegetativního media C následujícího složení:

- Vegetativní medium C- - ------ -

složka	množství
enzymem hydrolyzovaný kasein *	30,0 g
extrakt z kvasnic	3,0 g
MgSO4«7H2O.................-................	—0,2~g_
glukosa	10,0 g
glycerin	20
de ionizovaná”vodar~	- ¢0--1--litru~

pH 6,6 upraveno na 7,0 NaOH * NZ Amine A

B. Fermentace v míchaném bioreaktoru

Ampulky„s kulturou v kapalném dusíku se připraví postupem podle příkladu 2 za použití obecných postupů podle odstavce B. Jedna ampulka se použije pro naočkování prvního etadia*vegetativní^kultury (50mlmedia~C v^250 ml~ baňkách)7— /

která se inkubuje asi 48 až 72 hodin.Idkubovaná kultura prvniho stadia se použije pro naočkování (10 ml očko) druhého sta dia kultury (400 ml media G ve 2 1 baňkách), která se inkubuje asi 48 hodin· Inkubovaná kultura druhého stadia (5 1) se po- , užije pro naočkování produkčního media (115 1) následujícího složení:

.............Produkční medium II ... .........

složka množství (g/1) glukosa 80 peptonizované mléko* 20 moučka z bavlníkových s emen**

CaCO₃ 5 methyloleát 30 ml/1 voda z vodovodu doplnit do 1 litru * výživné peptonisované mléko, Sheffield Products; navíc stálá potrava, počínaje Čtvrtým dnem v množství 5 mg/ml/den ϋ ·

Proflo (před sterilizací pH upraveno na 7,0 NaOH).

Naočkované produkční medium se nechá fermentovat ovém ve 165 litrsxh míchaném bioreaktoru asi 8 až 10 dnů nebo déle při teplotě 30 °C. Hladina rozpuštěného kyslíku (DO)

- 91 se reguluje počítačem tak, aby se udržovala hladina DO nad 50 % nasycení vzduchu, jako, je popsáno v příkladu 2, odstavec B.

P,ř í k 1 a d 7

Příprava A83543 s kulturou A83543.5

A. Fermentace v třepacích lahvích

Podle postupu popsaného v příkladu 2, odstavci A se v třepacích lahvích kultivuje kultura Saccharopolyspora spinosa NRRL 18539 za použití vegetativního media B. “

B. Fermentace v míchaném bioreaktoru

Ampulky s kulturou v kapalném dusíku se připraví postupem podle příkladu 2 za pouStí obecných postupů popsaných v odstavci B. Jedna ampulka se použije pro naočkování prvního stadia vegetativní kultury (50 ml media B ve 250 ml baňkách), která se inkubuje 48 až 72 hodin. Inkubovaná kultura prvního stadia se použije pro naočkování (10 ml očko) druhého stadia kultury (400 ml media B ve 21itrových baňkách), která se inkubuje asi 48 hodin. Inkubovaná kultura druhého stadia (21) se použije pro naočkování produkčního media (115 1) následujícího složení:

-92Produkční medium III složka množství (g/1) glukosa 80 rostlinný protein, částečně hydrolyzovaný enzymaticky* 20 moučka z bavlníkových semen** 1G caco₃ 5

í. · ...· methyloleát · 30 ml/1 —--Sheftone H ** Proflo (před sterilisací pH upraveno na 7,0 NH^OH)

Produkční medium IV složka množství (procenta)

glukosa	8
moučka z bavlníkových semen*	3
peptonizovane mléko**	2
kukuřičný výluh	1
CaCOj (technický)	0,5
methyloleát	3,0
voda z vodovodu doplnit do	1 litru

Prorlo ** Výživné peptonisované mléko (před sterilisací pH upraveno na 7,0 NaOH)

- 93 Naočkované produkční medium se nechá fermentovat ve 165 1 míchaném bioreaktoru asi 8 až 10 dnů nebo déle při teplotě 30 °C. Hladiny DO sé regulují jako v příkladu 6.

Příklad 8

Příprava A83543 s kulturou A83543*4 p®HŽ±fcíncqa

Použitím postupů podle příkladů 2 a 7 se kultivuje kultura Saccharopolyspora spinosa NRRL 18538 použitím vegetativního media 8 a produkčního media lil·

Příklad 9

Fermentační živná půda se připraví podle příkladu 8. A83543 se oddělí ze živné půdy následujícím způsobem:

1. K Živné půdě se přidá stejný objem acetonu a přefiltruje se za použití keramického filtru nebo tlakového filtračního zařízení · __. ........_ ___ _____

2· Upraví se pH filtrátu živné půdy na hodnotu 10·

3. Přidá se ethylacetát (1/4 až 1/2 objemu živné ____. __________ t _ _ _ půdy)·

4· Získá se ethylacetátový extrakt oddekantováním podílu nemísitelného s vodou a ten se zahustí ve vakuu na po5, Zahuštěný ethylacetátový roztok se extrahuje vodným O,1M roztokem kyseliny vinné (1/2 objemu) a fáze se rozdělí.

- 94 6. Rozpustný ethylacetát se odstraní z vodné fáze odpařením ve vakuu (asi 5%). Vodný roztok se zahustí pomocí reversní osmosy.

7· Upraví se pH koncentrovaného vodného roztoku na 10 až 11 hydroxidem sodným.

Θ· Filtrací se oddělí sraženina; promyje se vodou; . vysušením ve vakuu se získá A83543.

mr Frsra 10

A83543fljpseudoaglykon

Vzorek A83543 obsahující převážně složku A (asi

100 mg) se rozpustí v methanolu (50 ml), vodě (2 ml) a koncentrované HC1 (3 ml). Tento roztok se zahustí do sucha při * 50 °C. Zbytek se zpracuje dvakrát diethyletherem (vždy 200 ml) a nerozpustná látka se vyhodí. Spojené etherové roztoky obsahující surový pseudoaglykon se zahustí do sucha. Zbytek se rozpustí v methanolu (20 ml) a vyčistí za použití HPLC systému Autoprep podle příkladu 3. Získá se 20 mg čistého A83543A pseudoaglykonů.

Příklad 11

A83543U pseudoaglykon se připraví z A83543D použitím postupu podle příkladu 10.

- 95 Příklad 12

Typickými insekticidními prostředky podle vynále zu jsou následující přípravky:

A. Vodné suspense

A-83543A 12,5%

Tergitol TMK-6 (neionogenní povrchově aktivní látka) 1,0%

Zeosyl 200 (kysličník křemičitý) 1,0%

AT-100” (protipěnicí činidlo na bázi silikonu) 0,2% xanthanový roztok (2%) ---------- --------- ’ 10,0%^_ ” Mak on 10 (10 molů ethylenoxidu na nonylfenolu - povrchově aktivní látka) 9,0% voda z vodovodu 66,3 %

B. Emulgovatelný koncentrát

A83543D -------—------------------ ------------- —......——— 12,4%

Exxon 200 (naftalenové rozpouštědlo) 83,6 %

Toximul H (směs neionogenních a anionaktivních povrchově Aktivní ch lát ekj ₂~p~%

Toximul D (směs neionogenních a anionaktivních povrchově aktivních látek) 2,0 %

---------------—Dále jsou uvedeny -pří klady - směsí—prakt icky použitelných a obsahujících látky podle vynálezu:

_______- 96 - ..

A. Krmivový premix

A83543A 10 % rýžové slupky 85 lehký minerální olej t 5

B. Krmivový premix

A83543E 25 % moučka z vojtěšky 60 práškovaná hlinka 5 melasa 10

..... C, Suspense ......>-· .............

A83543A ~ '' ~30lS naftalensulfonát 5 neionogenní povrchově aktivní látka 5 • *·^·· pálený kysličník křemičitý 1 voda 59

D. Kapací roztok

Claims (9)

1. A83543A 20 % neionogenní povrchově aktivní látka 0,8 propylenglykol 15 voda 64,2

   E. Kapací roztok

   A83543B 10 neionogenní povrchově aktivní látka 1 lehký minerální olej 89

   F« Injekční roztok

   A83543A 15 % propylenglykol 85

   - 97 g, Injekční suspense )

   A83543C 25 % propylenglykol 15 voda 60

   ....... .............. H. Injekční suspense ......

   A83543D 30 % polyvinylpyrrolidon 2 voda 68 ve kterém

   R znamená atom vodíku nebo skupinu vybranou, ze souboru (CHafeN (CHgJNH-KpHg

   R¹, R³, R⁵ a R⁶ znamenají atom vodíku nebo methylovou skupinu;

   R⁴ znamená methylovou nebo ethylovou skupinu;

   nebo jejxkfytologicky přijatelný sůl, pokud R je různý od atomu vodí ku j;, |p^p-ř-±padč-spolu-s 4^°-ίιη nobe-—více-fytologiclcy -.·

   - 99 v CT pť4^-aLulRj!^ntrci5^m/ nobe-ř^flidipgfi p£rč tor 4θ t/^^rc·
2. 2. Indaceno (3,2-d) oxacyklododecin-7,15-dion^ podle nároku l,l/kde substituenty R, r\ R³, R⁴, R⁵ a R⁶ .jsou v jedné z následujících kombinaci:

   R R¹ R^J - R R⁶ (a) Me H Et Me Me (b) ' Me H Et Me Me - (c)· -Me H ...... Et ' Me Me (a) Me Me Et Me Me (a) . Me H Me Me Mé (a) H H Et Me Me íd) Me H Et Me Me (a) Me H Et H Me (a) Me H Et Me H -----.....H- -..... --------_Me---------- - H ------------_Et------------ Me Me H Me Me Et Me Me H Me H Me Me Me H H H Et Me Me H Me H Et H Me H Me H Et Me, H

   nebo jejíkadični sůl s.kyselinou pokud R neznamená atom vodíku.
3. 3. Indaceno(3,2-d)oxacyklododecin-7,15-dion lobecného vzorce li J^podle nároku 1 nebo fy ve kterém R je skupina označená (a); R¹, R⁵ a R⁶ znamenají methylovou skupinu, R³ znamená atom vodíku a R⁴___ znamená ethylovou skupinu.

   «
4. 4.- Indaceno (3,2-d) oxacyklododecin-7,15-dion /obecného vzorce 1/ i ___ ^l—---“ — ’ ^J

   J/podle nároku 1 nebo ^), ve kterém R je skupina označená (a); .R^l,

   Ř^J, R^J a R” znamenají methylovou skupinu a R⁴ znamená ethylovou skupinunebo její adiční _sůl_s. kyselinou...______________________________________
5. 5. Způsob inhibice hmyzu nebo roztočů, vyznačující se tím, že se na místa, kde se hmyz nebo roztoči vyskytují, aplikuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce I podle kteréhokoli z nároků

   -1001 až 4, nebo její fytologicky přijatelné soli.

   ——
6. 6 i—Ekt opa r as iticidní- pros t řede k , -vyznačují cí/se-tím,—že—j a ko * účinnou látku obsahuje od 0,00005 do 95 _f % hmotw. sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 spolu ^> s jedním nebo více fyziologicky přijatelnými inertními nosiči nebo ředidly.
7. 7. Způsob neterapeutické kontroly populace hmyzích ektoparaz.itů, kteří se živí krví hostitelského zvířete, vyznačující se tím, že se hostitelskému zvířeti podá účinné množství sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 nebo její fyziologicky přijatelné soli.
8. 8 7“ Způsób^prí pravjTs róucénihý^dbecrteho“ vzorcS“ I^podTe^Kt erěhokóTi z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se kultivuje kmen Saccharopolyspora spinosa, vybraný Z NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 nebo NRRL 18539 nebo mútant, produkující sloučeninu obecného vzorce I v kultivačním mediu, obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku .a anorganických solí za submersních aerobních fermentačních podmínek až do vzniku izolovatelného množství sloučeniny obecného vzorce I.
9. 9. Biologicky čistá kultura Saccharopolyspora spinosa, vybraná z _r NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 nebo NRRL 18539 nebo její mutant, produkující sloučeninu obecného vzorce I.

   Zastupuje:

   dr. Otakar Švorčík o

   o ^·

   CM — N

   Č.J.

   0 12 8 2 2

   ĎOÍÍ& 1 ' 1 5. III 9 0 ! * l úřad | “PRO VYNÁLLZY j A OBJEVY ' : PŘÍL.

   ( ____J o

   o