NO176914B - Macrolidforbindelser, fremgangsmåte for deres fremstilling, biologisk renset kultur samt preparater inneholdende macrolidforbindelsene - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny gruppe av macrolid-forbindelser som har insekticid og miticid aktivitet, fremgangsmåte for deres fremstilling, biologisk renset kultur samt preparater inneholdende macrolidforbindelsene.

Det er et stort behov for nye insekticider og miticider fordi målorganismer hurtig utvikler motstandsevne overfor insekticider og miticider som i dag benyttes. Motstandsevne overfor insekticider i leddyr er utbredt, idet minst 400 arter er motstandsdyktige overfor ett eller flere insekticider. Utvikling av motstandsevne overfor eldre insekticider slik som DDT, karbamatene og organofosfåtene, er velkjent. Motstandsevne har imidlertid endog utviklet seg overfor noen av de nyere pyretroidinsekticidene og -miticidene. Det foreligger derfor et behov for nye insekticider og miticider.

Bekjempelsen av ektoparasitter slik som lopper, midd, bitende fluer og lignende, har lenge vært erkjent som et viktig problem i husdyravl. De tradisjonelle behandlingene for husdyr var topisk påførte insekticider slik som de berømte desinfiserende midler til sauevask. Slike behandlinger blir fremdeles utbredt benyttet. For tiden har imidlertid forskningsinnsatsen blitt rettet mot å finne forbindelser som kan administreres til dyrene, spesielt oralt, og som vil bekjempe ektoparasitter ved forgiftning av parasitten når den inntar blodet til det behandlede dyret.

Oppfinnelsen angår et nytt fermenteringsprodukt betegnet "A83543", som omfatter individuelle komponenter A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H og A83543J. A83543 og de individuelle A83543-komponentene er nyttige for bekjempelse av insekter, spesielt Lepidoptera-arter slik som Southern-hærmygg, og Diptera-arter slik som spyflue, stikkeflue og stikkmygg, og tilveiebringer således nyttige insekticide preparater som kan anvendes for redusering av populasjonen av insekter eller midd ved bruk av A83543-forbindelser.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således A83543-forbindelser, som er kjennetegnet ved formelen: hvor R er H eller en gruppe valgt fra

R1, R3, R5 og R<6> er hydrogen eller metyl; og R<4> er metyl eller etyl;

eller et syreaddisjonssalt derav når R er forskjellig fra hydrogen.

De foretrukne forbindelsene ifølge oppfinnelsen er ut fra synspunktet med lett fremstilling, de forbindelser hvor R, R1, R3, R<4>, r<5> og r<6> er til stede i en av følgende kombinasjoner .

eller et syreaddisj onssalt derav når R er forskjellig fra hydrogen.

Aminosukkere i A83543A har vært vist å være p<->D-forosamin; og det nøytrale sukkeret i A83543A er a-2,3,4-tri-0-metyl-rhamnose.

Ni A83543-komponenter har blitt karakterisert. Disse komponentene er forbindelsene med formel 1 hvor R er forskjellig fra E. De har følgende strukturer:

Aminosukkere kan fjernes fra A83543-komponentene til oppnåelse av pseudoaglykoner (forbindelser med formel 1 hvor R = H). Komponentene A, B, C og G har et felles pseudoaglykon (A83543A-pseudoaglykonet eller pseudo-A). A83543A-pseudoaglykon ble senere funnet å bli fremstilt naturlig som en A83543-komponent. Komponentene D, E, F, H og J har hver et unikt pseudoaglykon. A83543-pseudoaglykonene har følgende strukturer:

Pseudoaglykonene er nyttige som mellomprodukter, f.eks. for A83543-komponentene.

I det nedenstående oppsummeres de fysikalske og spektralegen-skapene til A83543-komponentene og pseudoaglykonene. I omtalen nedenfor er følgende forkortelser benyttet:

EI-MS: elektronsammenstøt-massespektrometri

FAB-MS: hurtigatombombardement-massespektrometri

FD-MS: feltdesorpsjon-massespektrometri

HPLC : høyydel se-vaeskekrornatograf i

IR: infrarød

NMR: kjernemagnetisk resonans

UV: ultrafiolett

Egenskaper for A83543A

Molekylvekt: 731

Empirisk formel: CzqH^NOiq

FD-MS: Se fig. 4

FAB-MS (M+l): Funnet: 732.4706;

Beregnet C41<H>66N010 = 72.4687 (se fig. 8) EI-MS: Funnet: 731.4612;

Beregnet 731.4608 (se fig. 10)

UV (EtOE) Xmaks: 243 nm (c 8,920)

IR (CEC13): v (lakton) 1713; (konjugert keton) 1657;

flere topper for C-E-vibrasjoner omkring 2940 og for C-O-vibrasjoner omkring 1060

cm-<1> (se fig. 1)

[a]g<29>: -121,8° (c 1,03, CEC13)

[a]§65: +6,8° (c 1,03, CECI3

Tabell I oppsummerer <1>E- og <13>C-NMR-data observert med A83543A (i aceton-d6).

Egenskaper for A83543B

Molekylvekt: 717

Empirisk formel: C4Q<E>53NO1Q

FAB-MS: (Se fig. 9)

Egenskaper for A833543C

Molekylvekt: 703

Empirisk formel: C39<H>61NO10

FD-MS: (Se fig. 5)

Egenskaper for A83543D

Molekylvekt: 745

Empirisk formel: C^^^^^ O^ q

UV (EtOH) Xmaks: 244 nm (c 9,910)

IR (CECI3): v (lakton) 1708; (konjugert keton) 1658;

flere topper for C-E-vibrasjoner omkring 2940 og for C-O-vibrasjoner omkring 1070

cm-<1> (se fig. 2)

[a]g<89>: -142,9° (c 1,02, CECI3)

[a]g65: -29,9° (c 1,02, CECI3 FD-MS: Se fig.6

Tabell II oppsummerer <*>E- og <13>C-NMR-data observert med A83543D (i aceton-d6).

Egenskaper for A83543E

Molekylvekt: 717

Empirisk formel: C40<H>63NO10

FAB-MS (M+l): Funnet: 718.4526;

Beregnet C4o<H>64<N>010 = 718.4530

UV (EtOH) Xmaks: 244 nm (c 8,600)

IR (KBr): (se fig. 13)

Tabell III angir <1>H- og <13>C-NMR-data observert med A83543E (i aceton-dfc).

Egenskaper for A83543F

Molekylvekt: 717

Empirisk formel: C40<H>63NO10

FAB-MS (M+l): Funnet: 718.4534;

Beregnet C40<H>64<N>010 = 718.4530

UV (EtOH) Xmaks: 243 nm (c 10,500) og 282 nm (c 109)

IR (KBr): (se fig. 14)

Tabell IV angir ^H- og <13>C-NMR-data observert med A83543F (i aceton-d^).

Egenskaper for A83543G Molekylvekt: 731

Empirisk formel: C^H^NOig FAB-MS (M+l): Funnet: 732.4661;

Beregnet C41<H>66<NO>10 = 732.4687

UV (EtOH) Xmaks: 243 nm (e 8,970)

IR (KBr): (se fig. 15)

Tabell V angir <1>H- og <13>C-NMR-data observert med A83543G (i aceton-dfc).

Egenskaper for A83543H

Molekylvekt: 717

Empirisk formel: C4q<H>53N0^q

UV (EtOH) Xmaks: 243 m (e 10.100)»*

IR (KBr): se fig. 16<*>

♦♦bestemt på en A83543H:J ( 58:42 )-blanding

Egenskaper for A83543J

Molekylvekt: 717

Empirisk formel: C40<H>63NO10

UV (EtOH) Xmaks: 243 nm (c 10.100)<*>

IR (CHCI3): se fig. 16<*>

<*>bestemt på en A83543H:J (58:42)-blanding

A83543E og J separeres fra A83543 som en blanding (H:J—for-hold = 58:42) som kan separeres ved analytisk høyydelse-vaeskekromatografi (HPLC), som beskrevet nedenfor. Strukturene som er gitt A83543H og J er basert på <1>H- og <13>C-NMR-studier av A83543 H:J-blandingen i aceton-d^. NMR-spektra ligner og ble sammenlignet med de for A83543A. Hovedendringene i H- og J-spektrene er sentrert omkring rhamnosesukkeret. Komponentene H og J har bare to 0CH3<*>er i dette sukkeret. I komponent H er H-l<*> forskjøvet ca. 0,1 S i ^-H-NMR-spekteret og 3 S i <13>C-NMR-spekteret (4,81 og 99,68, respektivt). Disse forskyvningene skyldes fraværet av metyl på metoksy ved 2'—stillingen. Forskyvningene i komponent J tilsvarer et lignende fravær av metyl på metoksy ved 3'-stillingen.

Egenskaper for A83543A- pseudoaglykon

Molekylvekt: 590

Empirisk formel: 033^909

UV (EtOH) Xmaks: 243 nm (c 10.300)

IR (CHCI3): v (lakton 1724; (konjugert keton 1652);

flere topper for C-H-vibrasjoner rundt 3017; . flere topper for C-O-vibrasjoner rundt 1140 cm-<1> (se fig. 3)

FD-MS: se fig. 7

EI-MS: se fig. 11

Egenskaper for A83543D- pseudoaglykon Molekylvekt: 604

Empirisk formel: 03^53<0>9

A83543-komponentene kan separeres fra hverandre ved bruk av følgende analytiske HPLC-systemer:

SYSTEM I

Kolonne: ODS, 3 jj, 4,5 x 50 mm (IBM) Oppløsningsmiddel: CH30H:CH3CN:H20 (2:2:1) Strømningshastighet: 1,0 ml/min.

Deteksjon: UV ved 245 nm

Temperatur: romtemperatur

SYSTEM II

Kolonne: 4,6 x 100 mm, ODS

(AQ-301, S-5; YMC, Inc., Mt. Freedom,

NJ)

Oppløsningsmidler: CH3OH:CH3CN:0,05$ NH40Ac(H20) (A) 35:35:30 - pH 7,8 (B) 45:45:10 - pH 6,7

Strømningshastighet: 2,0 ml/min.

Prøvetid: 35 min.

Deteksjon: UV, 250 nm

Gradient: 10% B til 25$ B i 20 min.;

til 50$ B i 30 min.

A83543-komponentene er ikke oppløselige i vann, men er oppløselige i oppløsningsmidler slik som metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, acetonitril, aceton og 1ignende.

A83543 og individuelle komponenter slik som A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H og A83543J kan reagere til dannelse av forskjellige salter. Alle slike former av disse forbindelsene er del av foreliggende oppfinnelse. A83543-salter er nyttige f.eks. for separering og rensing av A83543. I tillegg har noen salter forbedret oppløselighet i vann.

A83543-salter fremstilles ved bruk av standard metoder for saltfremstilling. For eksempel kan A83543 nøytraliseres med en passende syre til dannelse av et syreaddisjonssalt.

Syreaddisjonssaltene er særlig nyttige. Representative egnede salter innbefatter de salter som er dannet ved standard reaksjoner med både organiske og uorganiske syrer slik som f.eks. svovelsyre, saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, ravsyre, sitronsyre, melkesyre, maleinsyre, fumarsyre, cholinsyre, pamoinsyre, slimsyre, glutaminsyre, kamfersyre, glutarsyre, glykolsyre, ftalsyre, vinsyre, maursyre, laurinsyre, stearinsyre, salicylsyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, pikrinsyre, benzosyre, kanelsyre og lignende syrer.

I omtaler med hensyn til nyttevirkning betegner angivelsen "A83543-forbindelse" fortrinnsvis en forbindelse valgt fra gruppen bestående av A83543, individuelle komponenter A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H og A83543J og deres syreaddisjonssalter.

Fermenteringsprodukt A83543 fremstilles ved dyrking av en stamme av den nye mikroorganismen Saccharopolyspora spinosa valgt fra NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 og NRRL 18539, under submerse aerobe betingelser i et egnet kulturmedium inntil en utvinnbar mengde av A83543 er produsert. Som fagfolk på området fermenteringsprosesser vil forstå, vil forholdet for komponentene i A83543 variere avhengig av fermenteringsbetingelsene som er benyttet for fremstilling derav. Generelt inneholder A83543 85-90$ A83543A, 10-15$ A83543D og mindre mengder av A83543B, C, E, F, G, H og J og A83543A-pseudoaglykon. Individuelle komponenter slik som A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543E og A83543J og A83543A-pseudoaglykon kan separeres og isoleres som beskrevet nedenfor.

Ifølge et annet aspekt angår således foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en A83543-forbindelse, som innbefatter dyrking av en Saccharopolyspora spinosa-stamme valgt fra NRRL 18395, NRRL 18357, NRRL 18538 eller NRRL 18539, eller en A83543-produserende mutant derav, i et kulturmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen, og uorganiske salter under submerse aerobe fermenteringsbetingelser inntil en utvinnbar mengde av A83543 er produsert. Individuelle komponenter kan deretter, isoleres ved i og for seg kjente teknikker.

Foreliggende oppfinnelse angår også en biologisk renset kultur, som er kjennetegnet ved at den består av mikroorganismen Saccharopolyspora spinosa valgt fra NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 eller NRRL 18539. Disse mikroorganismene er nyttige fordi de produserer A83543.

0

For hensiktsmessighetens skyld i den nedenstående omtale har stammene blitt gitt følgende betegnelser: A83543.1, A83543.3, A83543.4 og A83543.5. Kultur A83543.1 ble oppnådd ved kjemisk mutasjon av en kultur (A83543) isolert fra en jordprøve samlet fra Jomfruøyene. Kulturer A83543.3, A83543.4 og A83543.5 ble oppnådd fra derivater av A83543.1-kulturen ved kjemiske mutasjoner.

Kulturer A83543.1, A83543.3, A83543.4 og A83543.5 har blitt deponert og gjort del av forrådskultursamlingen i Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, hvorfra de er tilgjengelige under følgende aksesjonsnummere:

Taksonomiske studier av kultur A83543.1 ble utført av Frederick P. Mertz i Lilly Research Laboratories. Basert på disse studier er mikroorganismene A83543.1, A83543.3, A83543.4 og A83543.5 klassifisert som medlemmer av en ny art av slekten Saccharopolyspora, som betegnes Saccharopolyspora spinosa sp. nov. Denne klassifikasjonen er basert på direkte laboratoriesammenligninger og undersøkelse av publiserte beskrivelser av lignende arter.

Benyttede metoder

De metoder som ble benyttet var de som var anbefalt det internasjonale Streptomyces-prosjektet (ISP) for karakterisering av Streptomyces-arter (E.B. Shirling og D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966)] og de anbefalt for karakterisering av Nocardia-arter av R.E. Gordon, D.A. Barnett, J.E. Handerhan og C.H. Pang, "Nocardiacoeliaca, Nocardia autotrophica and the Nocardin Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974).

ISCC-NBS Centroid Color Charts, standard prøve nr. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) ble benyttet for å tildele fargenavn til baksiden og til lufthyfer.

Morfologi ble studert ved bruk av et optisk lysmikroskop og et avsøkende elektronmikroskop (SEM).

Isomeren av diaminopimelinsyre (DAP) og karbohydratene i hydrolysater av hele celler ble etablert ved de kromatografiske metodene til Becker et al. [B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E.Gordon og H.E. Lechevalier, "Rapid Differen-tiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Eydrolysates", Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)] og til Lechevalier og Lechevalier [M.P. Lechevalier og H. Lechevalier, "Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes", Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 435-443 (1970)].

Fosfolipider ble bestemt ved metoden til M.P. Lechevalier og H. Lechevalier [i A University Laboratory Approach, Dietz og Thayer (utgivere), Society for Industrial Microbiology Special Publication No. 6, Arlington, VA, pp. 227-233

(1980)] .

Menakinonsammensetning ble bestemt ved å følge metodene til R.M. Kroppenstedt [i Chemical Methods in Bacterial Systema-tics, M. Goodfellow og D.E. Minnikin (utgivere), 1985, pp. 173-196] og M.D. Collin (ibidl, pp. 267-285).

Motstandsevne overfor antibiotika ble målt ved anbringelse av antibiotiske sensitivitetsskriver på overflaten av kim-tilsatte ISP nr. 2 agarplater.

Stivelseshydrolyse ble bestemt ved testing med hensyn til tilstedeværelse av stivelse med jod på ISP nr. 4 (uorganiske salter-stivelse) agarplater.

Fettsyreanalyse ble foretatt ved bruk av EP 5898A Microbial Identification System [se L. Miller og T. Berger, "Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole Cell Fatty Acids", Hewlett-Packard Application Note 228-41, 8pp.

(1985 )] .

Fettsyreestere ble fremstilt fra lyofiliserte hele celler dyrket under identiske betingelser.

Hovedkomponentanalyse var to-dimensjonal og datamaskin-utviklet. Måleenheter i plottingen av hovedkomponent (vist på figur 12) er standard avvik.

Mykolsyre ble bestemt ved hjelp av metodene foreslått av Minnikin [D.E. Minnikin, I.G. Hutchinson og A.B. Caldicott, "Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria", J. Chromatography 188, 221-233 (1980)].

Kulturegenskaper

Kultur A83543.1 vokste godt på både komplekse og definerte media. Kulturen produserte luftmycelier på alle benyttede media. Luftspore-massefargen var hovedsakelig lys gulaktig-lyserød, men var hvit på en rekke av mediene.

Baksiden var gul til gulbrun. Ingen tydelig pigmentering var til stede. Et oppløselig brunt pigment ble frigjort i mediet i noen medier.

Kulturegenskapene er oppsummert i tabell VI.

Morfologiske egenskaper

Kultur A83543.1 produserte et omfattende substratmycelium som fragmenterte i væskefermentering. Ingen fragmentering ble observert da kulturen ble dyrket på agarmedia.

Hvite sirkelformede kolonier, 8-10 mm i diameter, med opphevet sentrum og gul-brun reversfarge, ble observert da kulturen ble pletert på ISP-medium 1.

Velformede lufthyfer var til stede på mesteparten av mediene. Lufthyfene ble segmentert til lange kjeder av sporer arrangert som kroker og åpne løkker. Spiraler ble også observert, men de var korte og ufullstendige.

Den generelle morfologien var Rectus-flexibilis (RA).

Lufthyfer hadde et tydelig perlelignende utseende med mange tomme rom i sporekjeden. Dette trekket demonstrerte at et sporehylster omsluttet sporekjeden. Dette sporehylsteret var dekket med meget tydelig pigger. Piggene hadde en lengde på ca. 1 pm og var avrundet på enden.

Sporeformen var avlang og hadde en gjennomsnittlig størrelse på ca. 1,1 x 1,5 jjm. Sporekjedelengden var godt over 50 sporer. Ingen sik-sak-karakteristika, sklerotia, sporangia eller motile celler ble observert.

Fysiologiske egenskaper

Kultur A83543.1 produserte syre fra de følgende karbo-hydrater: adonitol, D-arabinose, erytritol, fruktose, glukose, glycerol, mannitol, mannose, ribose og trehalose.

Kulturen produserte ikke syre fra:

L-arabinose, cellobiose, cellulose, dekstrin, dulcitol, etanol, galaktose, glykogen, insitol, inulin, laktose, maltose, melizitose, melebiose, a-metyl-D-glukosid, raffi- nose, L-rhamnose, salicin, sorbitol, L-sorbose, sukrose, xylitol eller xylose.

Vekst ble observert med galaktose, maltose og mellzitose, men ingen syre ble produsert fra disse karbohydratene.

Kultur A83543.1 benyttet følgende organiske syrer som natriumsalter, acetat, butyrat, citrat, formiat, laktat, malat, propionat, pyruvat og succinat. Kulturen benyttet ikke benzoat, mukat, oksalat eller tartrat.

A83543.1 dekomponerte allantion, kalsiummalat, kasein, elastin, hippurat, hypoxantin, testosteron, L-tyrosin og urea. Den var ikke i stand til å dekomponere adenin, eskulin, guanin, stivelse eller xantin.

A83543.1 produserte katalase, fosfatase, urease og H2S. Den flytendegjorde gelatin og reduserte nitrat. Den var ikke resistent overfor lysozym og produserte ikke melanoid-pigmenter. Den hverken peptoniserte eller hydrolyserte skummet melk. A83543.1 tolererte nivåer av NaCl opp til og inkludert 11%. Den var ikke i stand til å overleve 50° C i 8 timer, men vokste ved temperaturer mellom 15 og 37°C.

A83543.1 var resistent overfor cefalotin (30 pg), penicillin G (10 enheter) og rifampin (5 pg). Den var sensitiv overfor bacitracin (10 enheter), gentamicin (10 jig), lincomycin (2 pg), neomycin (30 pg), oleandomycin (15 pg), streptomycin (10 pg), tetracyklin (30 pg), tobramycin (10 pg) og vancomycin (30 pg).

Cellevegganalyse

Hydrolyserte hele celler av A83543.1 inneholdt meso-diaminopimelinsyre. Diagnostiske sukkere i helcelleekstrakter var galaktose og arabinose. A83543.1 har således et type IV celleveggmønster og et type A sukkermønster (Lechevalier og Lechevalier, supra). Cellene inneholdt ikke mykolinsyrer. Fosfolipidbestemmelser på de hele cellene indikerte tilstedeværelsen av fosfatidylcholin og kardiolipin. Intet fos-fatidyl-etanolamin ble detektert. Således har A83543.1 et type PHI fosfolipidmønster [M.P. Lechevalier, A.E. Stern og H.A. Lechevalier, "Phospholipids in the Taxonomy of Actinomycetes", i Actinomycetes, Abl. Bakt. Suppl. 11, K-P. Schaal og G. Pulverer (utgivere), Gustav Fischer Verlag, New York, 1981].

Hoved-menakinon som ble detektert var MK-9(H4). En mindre mengde av MK-9(H(,) ble observert.

Fagutspredning

En rekke Streptomycete-, Saccharopolyspora- og Amycolatopsis-fager ble utspredd på A83543.1. Ingen plakk ble observert.

Identitet av A83543. 1

Som omtalt ovenfor har kultur AS3543.1 et type IV cellevegg-mønster og et type A helcelle-sukkermønster. Følgende tretten slekter har dette cellekjemiske mønster: Nocardia, Rhodo-coccus, Corynebacterium, Caseobacter, Mycobacterium, Faenia (Micropolyspora), Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Amycolata, Amycolatopsis og Kibdelosporangium. Disse slektene skilles fra hverandre ved tilstedeværelsen eller fraværet av mykolinsyrer, ved fettsyresammensetning og ved fosfolipid- og menakinontyper. Faenia, Pseudonocardia og Saccharopolyspora har kjemotaksono-miske egenskaper identisk med de til A83543.1, men disse slektene er forskjellig fra A83543.1 når det gjelder morfologiske og kulturegenskaper.

Slekten Faenia (Micropolyspora) har glatte sporer og korte sporekjeder som bæres på både luft- og substrathyfer. Dens lufthyfer er tynne og hvite i farge. Den er en termofil som vokser ved 60°C. A83543.1 har ingen av disse egenskapene og adskiller seg således fra Faenia.

Slekten Pseudonocardia har sporer på både luft- og substrathyfer. Den adskiller seg ved akropetal knoppdannelse og blastosporer. Den har en karakteristisk sik-sak-morfologi av hyfene. Hyfene har blitt beskrevet som leddete, men ikke-septat [se A. Henssen og D. Schafer, "Amended Description of the Genus Pseudonocardia Henssen and Description of a New Species Pseudonocarida spinosa Schafer", Int. J. Syst. Bacteriol. 21:29-34 (1971)]. Den vokser meget langsomt. Fragmentering er fraværende eller observeres sjelden. A83543.1 har ingen av disse egenskapene.

Slekten Saccharopolyspora er kjennetegnet ved et sporehylster og et tydelig perlelignende utseende av sporekjeden. Dette trekk er meget fremtredende i A83543.1. Fragmentering har også blitt observert med slekten Saccharopolyspora. Type-arten, S. hirsuta ble isolert fra sukkerrør-bagasse. Stamkulturen hvorfra A83543.1 ble oppnådd ble isolert fra en sukkerfabrikk. Siden A83543.1 har mange egenskaper til denne slekten ansees den derfor for å være en stamme av Saccharopolyspora.

Den eneste gyldige publiserte art i denne slekten Saccharopolyspora er S. erythraea og S. hirsuta. Kjente underarter er S. hirsuta subsp. taberi og S. hirsuta subsp. kobensis. A83543.1 skiller seg fra disse stammene når det gjelder enten luftmycelium og reversfarge eller i produksjon av oppløselige pigmenter.

Biokjemisk likhet ble målt ved å oppsette en tabell over likhetskoeffisienter basert på så mange biokjemiske målinger som mulig. Koeffisienten ifølge Jaccard Sj og den enkle tilpassingskoeffisienten Ssm ble benyttet [se W. Kurylowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski og T. Szulga, "Numerical Taxonomy of Streptomycetes", Polish Medical Publishers, Warsaw, 1975, s. 37].

Fettsyreanalyse av A83543.1 og de kjente Saccharopolyspora-artene viste at hver hadde både mettede og forgrenede fettsyrer. Fettsyresammensetningen til A83543.1 er lik, men ikke identisk, med den til de andre artene. Tabell VIII sammenligner fettsyresammensetningene for A83543.1 og de kjente Saccharopolyspora-artene.

Hovedkomponentanalyse av f ettsyresammensetningene vist i

tabell VIII viser tilstrekkelig spredning til å antyde at kulturene alle er forskjellige arter innen den samme slekten.

Hovedkomponentplottingen av dataene i tabell VIII er angitt på fig. 12.

Tabell IX sammenligner de fysiologiske egenskapene til A83543.1 med de til de eksisterende Saccharopolyspora-artene og underartene. De foretatte sammenligninger viser at A83543.1 adskiller seg tilstrekkelig seg tilstrekkelig fra de tidligere beskrevne arter av Saceharopolyspora til å være en ny art av Saccharopolyspora for hvilken navnet Saccharopolyspora spinosa har blitt valgt. Navnet spinosa reflekterer den piggede spore-ornamenteringen til denne arten.

A83543.3-, A83543.4- og A83543.5-stammene er tilstrekkelig like makroskopisk til A83543.1-stammen til å bli klassifisert som stammer av Saccharopolyspora spinosa. De fire stammene adskiller seg ved den mengde av A83543 som de produserer. A83543.3-stammen produserer omtrent fire ganger mer A83543 enn A83543.1-stammen; og A83543.4- og A83543.5-stammene produserer omtrent åtte til ni ganger mer enn A83543.1-stammen produserer.

Som tilfellet er med andre organismer så fortsetter egenskapene til de A83543-produserende kulturene ifølge oppfinnelsen, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 og NRRL 18539, å være utsatt for variasjon. Således kan mutanter av disse stammene oppnås ved fysikalske og kjemiske metoder som er kjent innen teknikken. For eksempel kan andre stammer oppnås ved behandling med kjemikalier slik om N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Naturlige og induserte mutanter av Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395-, NRRL 18537-, NRRL 18538- og NRRL 18539-stammer som bibeholder egenskapen med å produsere en utvinnbar mengde av A83543 utgjør en del av foreliggende oppfinnelse.

Kulturmediet som benyttes til å dyrke Saccharopolyspora spinosa-kulturene kan være et hvilket som helst av en rekke medier. For økonomisk produksjon, optimalt utbytte og lett produktisolering er imidlertid visse kulturmedier foretrukne. Således er f.eks. foretrukne karbonkilder ved fermentering i stor målestokk glukose og maltose, skjønt ribose, xylose, fruktose, galaktose, mannose, mannitol, oppløselig stivelse, potetdekstrin, metyloleat, oljer slik som soyabønneolje og lignende kan benyttes.

Foretrukne nitrogenkilder er bomullsfrømel, peptonisert melk og spaltet soyabønnemel, skjønt fiskemel, maisstøpevæske, gjærekstrakt, enzymhydrolysert kasein, storfe-ekstrakt og lignende også kan benyttes.

Blant de uorganisk næringsmiddelsaltene som kan inkorporeres i kulturmediene er de vanlige oppløselige saltene som kan gi sink, natrium, magnesium, kalsium, ammonium, klorid, karbonat, sulfat, nitrat og lignende ioner.

Vesentlige sporeelementer som er nødvendig for veksten og utviklingen av organismen bør også inkluderes i kulturmediet. Slike sporeelementer forekommer vanligvis som urenheter i andre substituenter i mediet i mengder som er tilstrekkelig til å tilfredsstille organismens vekstkrav.

Dersom skumming er et problem, kan vanligvis små mengder (dvs. 0,2 ml/l) av et antiskummemiddel slik som polypropylen-glykol tilsettes til medier for fermentering i stor målestokk. I tilfellet for de A83543-produserende kulturene, så inhiberer imidlertid konvensjonelle skumhindrende midler A83543-produksjon. Skumming kan reguleres ved å inkludere soyaolje eller pluronic L-101 (BASF) i mediet ( 1- 3%). Ytterligere olje kan tilsettes dersom skumming utvikles.

Prosentandelen av en spesiell A83543-komponent kan varieres ved hjelp av media-endringer. Tilsetning av f.eks. valin eller isosmørsyre eller propionsyre øker prosentandelen av produsert A83543D.

For produksjon av vesentlige mengder av A83543 foretrekkes submers, aerob fermentering i omrørte bioreaktorer. Små mengder av A83543 kan oppnås ved bruk av rystekolbekultur. På grunn av tidsforsinkelsen i produksjon som vanligvis er forbundet med inokulering av store bioreaktorer med organismens sporeform, er det foretrukket å benytte et vegetativt inokulum. Det vegetative inokulum fremstilles ved inokulering av et lite volum av kulturmedium med sporeformen eller myceliefragmenter av organismen for oppnåelse av en frisk, aktivt voksende kultur av organismen.

Det vegetative inokulum overføres deretter til en større bioreaktor. Det vegetative inokulum-medium kan det være det samme som det som benyttes for større fermenteringer, men andre media er også egnet.

A83543 produseres av de A83543-produserende organismene ved dyrking ved temperaturer mellom ca. 24 og ca. 33°C. Optimale temperaturer for A83543-produksjon synes å være ca. 28-30°C.

Som vanlig i submerse aerobe kulturprosesser blir steril luft blåst inn i beholderen fra bunnen, mens mediet omrøres med konvensjonelle turbinskovler. Generelt bør lufttilførsels-hastigheten og omrøringshastigheten være tilstrekkelig til å opprettholde nivået av oppløst oksygen ved eller over 35$ og fortrinnsvis ved eller over 50$ av luftmetning med et indre beholdertrykk på 0,34 atmosfærer.

Fremstilling av A83543-komponenter kan følges under fermenteringen ved testing av ekstrakter av mediet. HPLC som benytter et system som er beskrevet i eksempel 1, er en nyttig analyse for dette formål.

Ved å følge deres produksjon under submerse, aerobe fermenteringsbetingelser, kan A83543-komponentene utvinnes fra fermenteringsmediet ved hjelp av metoder som er benyttet innen teknikken. A83543 som er produsert under fermentering av den A83543-produserende organismen forekommer i både myceliet og mediet. A83543 synes å være lipofil. Hvis således en vesentlig mengde olje anvendes i fermenteringen, så er hel buljong- eller medieekstraksjon mer effektiv. Dersom bare små mengder olje benyttes, så er hoveddelen av A83543 i myceliet. I dette tilfellet oppnås mer effektiv utvinning av A83543 ved innledningsvis å filtrere mediet for å separere buljongen fra myceliemassen (biomassen).

A83543 kan utvinnes fra biomassen ved en rekke forskjellige teknikker. En foretrukket teknikk innebærer vasking av den separererte biomassen med vann for å fjerne gjenværende buljong, blanding av biomassen med et polart oppløsnings-middel hvori A83543 er oppløselig, f.eks. metanol eller aceton, separering og konsentrering av oppløsningsmidlet, ekstraksjon av konsentratet med et ikke-polart oppløsnings-middel og/eller adsorpsjon av konsentratet på et reversfase-silisiumdioksydgeladsorpsjonsmiddel slik som RP-C8 eller RP—C18 eller en høyporøs polymer slik HP—20 og lignende.

Det aktive materialet elueres fra adsorpsjonsmidlet med et egnet oppløsningsmiddel slik som f.eks. acetonitrilrmetanol-blandinger inneholdende små mengder av THF.

A83543 kan separeres i individuelle komponenter A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H og A83543J og A83543A-pseudoaglykon ved hjelp av lignende metoder. En foretrukket separeringsmetode innebærer reversfase-silisiumdioksydgel (^g eller Cg )-kromatografi.

Alternativt kan kulturfaststoffene, inkludert mediumbestand-deler og mycelium, benyttes uten ekstraksjon eller separering, men fortrinnsvis etter fjerning av vann, som en kilde for A83543. Etter produksjon av A83543 kan f.eks. hele fermenteringsbuljongen tørkes ved lyofilisering, ved trommeltørking eller ved azeotrop destillasjon og tørking. Den tørkede buljongen kan deretter benyttes direkte, f.eks. ved å blande den direkte inn i tilførsels-forblandingen.

Insekticid og miticid aktivitet

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige for bekjempelse av insekter og midd.

Ifølge oppfinnelsen er det således tilveiebragt et insekticid eller miticid preparat, som er kjennetegnet ved at det som aktiv bestanddel innbefatter en Å83543-forbindelse som definert i hvilke som helst av de medfølgende krav 1-4, i forbindelse med en fytologisk, akseptabel bærer.

For inhibering av et insekt eller en midd foretas derfor påføring på insekt- eller middstedet av en insekt- eller middinhiberende mengde av en A83543-forbindelse.

A83543-forbindelsene viser aktivitet mot en rekke insekter og midd. Mer spesielt viser forbindelsene aktivitet mot sydstatsnattfly som er et medlem av insektordenen Lepidoptera. Andre typiske medlemmer av denne ordenen er eplevikler, knoppvikler, klesmøll. indisk maismelmøll, eikeviklere, nattfly på mais, nattfly på bomull, maispyralide, importert kålorm, kålmåler, møll, sekkspinnere, Malacosoma americanum (spinner), gresspyralide og høsthærorm.

Forbindelsene viser også aktivitet mot bomullsbladlus som er et medlem av insektordenen Homoptera. Andre medlemmer av Homoptera innbefatter sikader, plantesugere, pæresuger, eplesuger, skjoldlus, mellus og skumsikader samt en rekke andre vertsspesifikke bladlusarter.

I tillegg viser A83543-forbindelsene aktivitet mot stikkefluer, spyfluer og stikkmygg som er medlemmer av insektordenen Diptera. Et annet typisk medlem av den ordenen er vanlig husflue.

A83543-forbindelsene er nyttige for redusering av popula-sjoner av insekt og midd og anvendes i en fremgangsmåte for inhibering av en insekt- eller middpopulasjon som omfatter påføring på et insekt- eller middsted av en effektiv insekt-ener midd-inaktiverende mengde av en A83543-forbindelse.

Insekt- eller midd-"stedet" refererer til omgivelsene hvori insektene eller middene lever eller hvor deres egg befinner seg, inkludert luften som omgir dem, maten de spiser eller gjenstander som de er i kontakt med. For eksempel kan planteetende insekter eller midd bekjempes ved påføring av den aktive forbindelsen på plantedeler som insektene eller middene spiser eller hvor de oppholder seg, spesielt bladverket.

Det er også aktuelt at forbindelsene kan være nyttige for å beskytte tekstiler, papir, lagret korn eller frø ved påføring av en aktiv forbindelse på slike materialer.

Betegnelsen "inhibering av et insekt eller en midd" refererer til en minsking av antallet av levende insekter eller midd for å redusere antall levedyktige insekt- eller middegg. Graden av reduksjon som oppnås ved hjelp av en forbindelse avhenger naturligvis av påføringsgraden av forbindelsen, den spesielle forbindelse som benyttes og målinsekt- eller —middartene. Det bør benyttes i det minste en insekt-inaktiverende eller midd-inaktiverende mengde.

Betegnelsene "insekt-inaktiverende mengde" og "midd-inaktiverende mengde" er benyttet for å beskrive den mengde som er tilstrekkelig for å bevirke en målbar reduksjon i den behandlede insekt- eller middpopulasjon. Generelt anvendes en mengde i området fra 1 til 1000 ppm (eller 0,01 til 1 kg/ha) av aktiv forbindelse.

MIDD/ INSEKT- UNDERSØKELSE

A83543-forbindelsene ble testet med henblikk på miticid og insekticid aktivitet i følgende midd/insekt-undersøkelse.

Hver testforbindelse ble formulert ved oppløsning av forbindelsen i en aceton/alkohol (1:1)-blanding inneholdende 23 g "Toximul R" (sulfonat/ikke-ionisk emulgeringsmiddel-blanding) og 13 g "Toximul S" (sulfonat/ikke-ionisk emulge-ringsmiddelblanding) pr. liter. Disse blandingene ble deretter fortynnet med vann til oppnåelse av de angitte konsentrasjoner.

Flekket veksthusspinnmidd (Tetranychus urticae Koch) og bomull- eller melombladlus (Aphis gossypii Glover) ble anbragt på gresskarkimblad og fikk etablere seg på begge bladoverflater. Andre planter i den samme behandlingspotten fikk være uangrepet. Bladene ble deretter sprøytet med 5 ml testoppløsning ved anvendelse av en DeVilbiss-forstøvnings-sprøyteanordning ved 69 kPa. Begge overflatene på bladene ble dekket inntil avrenning og fikk deretter tørke i en time. To uangrepne blader ble deretter avskåret og plassert i en Petri-skål inneholdende sydstatsnattfly (Spodoptera eridania Cramer).

Ytterligere insekter ble bedømt ved anvendelse av lignende formuleringer og bedømmelsesmetoder, med de angitte unntagelser.

Etter standard eksponeringsperioder ble prosent dødelighet bestemt. Resultatene er angitt i nedenstående tabeller. Følgende forkortelser er benyttet.

Tabell XV sammenligner effektiviteten og virkningsvarigheten av A83543A-behandling med den for metomyl i utendørs potteforsøk mot sydstatsnattfly.

Tabell XVI oppsummerer LC5Q-verdiene, de dødelige konsentra-sjonene ved hvilke testforbindelsen inhiberer 50$ av testinsekt eller -midd, vist av A83543A sammenlignet med den som vises av det kjente insekticide metomyl. A83543-komponentene var aktive mot gulfeberstikkmygg (Åedes aegypti )-larver i standard in vitro stikkmygglarvicide tester. Tabellene XVII og XVIII angir aktiviteten til komponentene i disse testene.

Feltforsøk

A83543A ble evaluert i feltforsøk. I disse forsøkene viste A83543A aktivitet mot importert kålorm og kålmåler på spirende broccoli og mot en blanding av soyabønnemålere (75$) og høsthærorm (25$) på soyabønner.

Insekticide preparater

Foreliggende forbindelser påføres i form av preparater som, som nevnt ovenfor, utgjør en del av oppfinnelsen. Disse preparatene innbefatter en insekt- eller midd-inaktiverende mengde av en A83543-forbindelse og en fytologisk akseptabel inert bærer. Den aktive komponenten, dvs. A83543-forbindelsen, kan være til stede som 1) en enkelt A83543-komponent, 2) en blanding av to eller flere komponenter, 3) den separerte A83543-blanding eller 4) A83543 sammen med den tørkede delen av fermenteringsmediet i hvilket den er produsert, dvs. som uren, tørket fermenteringsbuljong.

Preparatene er enten konsentrerte formuleringer som er dispergert i vann for påføring, eller er pulverformige eller granulære formuleringer som påføres uten ytterligere behandling.

Preparatene fremstilles ifølge metoder og formler som er konvensjonelle innen den kjemiske landbruksteknikk, men som er nye og viktige på grunn av tilstedeværelsen av en eller flere av foreliggende forbindelser.

Dispersjonene i hvilke forbindelsene eller det urene tørkede materialet anbringes er oftest vandige suspensjoner eller emulsjoner fremstilt fra konsentrerte formuleringer av forbindelsene eller råmaterialet. Slike vannoppløselige, vannsuspenderbare eller emulgerbare formuleringer er enten faste stoffer (vanligvis kjent som fuktbare pulvere) eller væsker (vanligvis kjent som emulgerbare konsentrater eller vandige suspensj oner).

Fuktbare pulvere som kan være sammenpresset til form av vanndispergerbare granuler, omfatter en intim blanding av den aktive forbindelsen, en inert bærer og overflateaktive midler. Konsentrasjonen av den aktive forbindelsen er vanligvis fra 1$, fortrinnsvis 10$, til 90 vekt-$. Den inerte bæreren velges vanligvis blant attapulgittleirene, montmorillonittleirene, diatomejordmaterialene eller de rensede silikatene.

Effektive overflateaktive midler som omfatter fra 0,5 til 10$ av det fuktbare pulveret, finnes blant de sulfonerte ligninene, de kondenserte naftalensulfonatene, naftalensulfonatene, alkylbenzensulfonatene, alkylsulfatene og ikke-ioniske overflateaktive midler slik som etylenoksydaddukter av alkylfenoler.

Emulgerbare konsentrater av forbindelsene omfatter en hensiktsmessig konsentrasjon av en forbindelse slik som fra 50 til 500 g/l væske, ekvivalent med fra 10 til 50$, oppløst i ren inert bærer som enten er et vannblandbart oppløsnings-middel eller en blanding av vannublandbart organisk oppløs-ningsmiddel og emulgeringsmidler.

Nyttige organiske oppløsningsmidler innbefatter aromater, spesielt xylenene, og petroleumfraksjonene, spesielt de høytkokende naftaleniske og olefiniske delene av petroleum slik som tung aromatisk nafta. Andre organiske oppløsnings-midler kan også benyttes, slik som de terpeniske oppløsnings-midlene innbefattende kolofoniumderivater, alifatiske ketoner slik som cykloheksanon, og komplekse alkoholer slik som 2-etoksyetanol.

Egnede emulgeringsmidler for emulgerbare konsentrater velges fra konvensjonelle ikke-ioniske overflateaktive midler slik som de som er nevnt ovenfor.

Vandige suspensjoner omfatter suspensjoner av vannuoppløse-lige forbindelser ifølge oppfinnelsen dispergert i en vandig bærer ved en konsentrasjon i området fra 5 til 50 vekt-#, suspensjoner fremstilles ved finmaling av forbindelsen og kraftig innblanding derav i en bærer som omfatter vann og overflateaktivt middel valgt fra de samme typene som er nevnt ovenfor. Inerte bestanddeler, slik som uorganiske salter og syntetiske eller naturlige gummier, kan også tilsettes for å øke densiteten og viskositeten til den vandige bæreren. Det er ofte mest effektivt å male og blande forbindelsen samtidig ved tilberedning av den vandige blandingen og homogenisering av denne i en anordning slik som en sandmølle, kulemølle eller homogenisator av stempeltypen.

Forbindelsene kan også anbringes som granulære preparater hvilket er særlig nyttig for påføringer på jordsmonnet. Granulære preparater inneholder vanligvis fra 0,5 til 10 vekt-% av forbindelsen dispergert i en inert bærer som helt eller for en stor del består av leire eller et lignende billig stoff.

Slike preparater fremstilles vanligvis ved oppløsning av forbindelsen i et egnet oppløsningsmiddel og anbringelse av dette på en granulær bærer som har blitt fordannet til den passende partikkelstørrelsen, i området fra 0,5 til 3 mm. Slike preparater kan også formuleres ved å tilberede en deig eller pasta av bæreren og forbindelsen, og foreta knusing og tørking for oppnåelse av den ønskede granulære partikkel-størrelsen.

Pulvere inneholdende forbindelsene fremstilles på enkel måte ved intim blanding av forbindelsen i pulverform med en egnet støvformet landbruksbærer, slik som kaolinleire, malt vulkanisk sten og lignende. Pulveret kan hensiktsmessig inneholde fra 1 til 10% av forbindelsen. Når det av en eller annen grunn er ønskelig, er det like praktisk å anbringe forbindelsen i form av en oppløsning i et passende organisk oppløsningsmiddel, vanligvis en mild petroleumolje, slik som sprayoljene, som er utbredt benyttet i landbrukskjemien.

Insekticider og miticider påføres vanligvis i form av en dispersjon av den aktive bestanddel i en flytende bærer. Det er konvensjonelt å referere til påføringsgrader uttrykt som konsentrasjonen av aktiv bestanddel i bæreren. Den mest utbredt benyttede bærer er vann.

Foreliggende forbindelser kan også påføres i form av et aerosolpreparat. I slike preparater er den aktive forbindelsen oppløst eller dispergert 1 en inert bærer som er en trykkutviklende drivmiddelblanding. Aerosolpreparatet emballeres i en beholder hvorfra blandingen utleveres gjennom en forstøvningsventil. Drivmiddelblandinger omfatter enten lavtkokende halogenkarboner som kan være blandet med organiske oppløsningsmidler, eller vandige suspensjoner trykksatt med inerte gasser eller gassformige hydrokarboner.

Den aktuelle mengden av forbindelse som skal påføres . på steder med insekter og midd er ikke kritisk og kan lett bestemmes av fagfolk på området i betraktning av de gitte eksempler. Generelt er konsentrasjoner fra 10 ppm til 5000 ppm av forbindelsen forventet å gi god bekjempelse. Med mange av forbindelsene vil konsentrasjoner fra 100 til 1000 ppm være tilstrekkelig. For feltavlinger slik som soyabønner og bomull er en egnet påføringsgrad for forbindelsene fra 0,01 til 1 kg/ha, typisk påført i en mengde av 19-190 liter/A av sprøyteblanding.

Stedet på hvilket en forbindelse påføres kan være et hvilket som helst sted som er besatt av insekt eller midd, f.eks. vegetabilske avlinger, frukt- og nøttetrær, vinstokker, og prydplanter.

På grunn av middeggenes unike evne til å motstå innvirkning av toksiske midler kan gjentatte påføringer være ønskelig for å bekjempe nyutklekkede larver slik tilfellet er med andre kjente acaricider.

Ektoparasitticid aktivitet

A83543-forbindelsene er også aktive mot medlemmer av insektordenen Diptera.

Tabellene XIX - XXI angir in vitro-studier med A83543A og A83543D.

I in . vivo-forsøk viste A83543-forbindelsene systemisk insekticid aktivitet i marsvin og sauer mot spyfluelarver og utviklede stikkefluer uten noen tydelige tegn på toksisitet. Representative forbindelser A83543A og A83543D har blitt testet i laboratorie- og måldyr for å bestemme aktivitets-omfanget. Følgende tester er illustrerende.

Systemisk test på marsvin

Fullt utviklede marsvin benyttes i dette testsystemet. Forbindelsene som skal testes oppløses i vandig polyvinylpyrro-lidon eller i polyetylenglykol 200 og en passende mengde av oppløsningen administreres enten oralt eller ved intraperitoneal injeksjon. Varierende doser av forbindelsen anvendes,

som angitt i de nedenstående tabeller.

Blod trekkes fra marsvinene ved 30 minutter, hvis ikke annet er angitt, og blodprøvene sentrifugeres. Dentalveker mettes med blodserumet og eksponeres deretter i Petri-skåler overfor fullt utviklede stikkefluer; spyfluelarver eksponeres i reagensrør. Etter 24 og 48 timer undersøkes insektene og antall døde opptelles. Resultatene fra testene er registrert som prosent av drepte insekter.

Systemisk test på sau

Tester utføres på sauer ved anvendelse av testmetoden beskrevet ovenfor i marsvintestbeskrivelsen. Testforbindelse administreres ved intraperitoneal eller intravenøs injeksjon eller intraruminalt; blodprøver trekkes ved 24 timer i disse testene.

Resultatene fra systemiske marsvin- og sauetester ved bruk av A83543A og A83543D er angitt i tabellene XXII - XXV.

A83543A viste ikke antelmintisk aktivitet i sauer behandlet med en enkelt peritoneal eller intraruminal dose på 50 mg/kg legemsvekt, eller i mus som var eksperimentelt infisert med tarmnematoden Nematospiroides dubius, ved administrasjon oralt gjennom et enkelt magerør ved 500 mg/kg.

I in vitro-tester mot sauetarm-nematoden Haemonchus contortus drepte A83543A 30$ av ormene ved en konsentrasjon på 100 ppm.

Ektoparasitticide metoder

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes derfor også et ektoparasitticid preparat, som er kjennetegnet ved at det som en aktiv bestanddel innbefatter en A83543-forbindelse som definert i hvilket som helst av de medfølgende krav 1-4, i forbindelse med en eller flere fysiologisk akseptable, inerte bærere for denne.

For bekjempelse av en populasjon av insekt-ektoparasitter som fortærer blod fra et vertsdyr, foretas administrasjon til vertsdyret av en effektiv mengde av en A83543-forbindelse. Insekt-ektoparasitter innbefatter insekt- og middparasitter. Administrasjon til dyret kan være ad dermal, oral eller parenteral vei.

Parasittiske insekter og midd innbefatter arter som er blodsugende samt kjøttetende og er parasittiske under hele deres livscyklus eller bare i løpet av en del av deres livscyklus, slik som bare larvestadiet eller bare det fullt utvokste stadium. Representative arter innbefatter følgende:

Tabanus spp. (klegg)

Stomoxys calcitrans (stikkflue, vanlig) Simulium spp. (knott)

Haematopinus asini (hestelus)

Sarcoptes scabiei (skabbmidd)

Psoroptes equi (hestemidd)

Haematobia irritans (liten stikkflue)

Bovicola bovis (storfepelslus) Haematopinus eurysternus (storfelus, kortsnutet) Linognathus vituli (storfelus, langsnutet) Glossina spp. (tsetseflue)

Demodex bovis (storfehårsekkmidd) Boophilus microplus og B. decoloratus

Amblyomma maculatum (flått)

Amblyomma americanum (flått)

Otobius megnini

Dermacentor andersoni (flått)

Cochliomyia hominivorax ("skruemark"-flue)

Reduvius spp. (rovtege)

Culiseta inornata (stikkmygg)

Rhipicephalus appendiculatus (flått)

Rhipicephalus evertsi (flått)

Amblyomma sp. (flått)

Hyalomma sp. (flått)

Haematopinus suis (svinelus)

Tunga penetrans (sandloppe)

Linognathus ovillus (sauekropplus )

Linognathus pedalis (sauefotlus)

Melophagus ovinus (sauehusflue)

Psoroptes ovis (sauemidd)

Phaenicia sericata (gullflue)

Phormia regina (spyflue)

Cochliomyia macellaria

Phaenicia cuprina (gullflue)

Cimex lectularius (veggedyr)

Echidnophaga gallinacea (loppe)

Argas persicus (hønsehusflått)

Dermanyssus gallinae (hønsemidd)

Knemidokoptes mutans (kalkbeinsmidd) Knemidokoptes gallinae (fjærfellingsmidd)

Demodex canis (hundehårsekkmidd) Ctenocephalis canis (hundeloppe)

Dermacentor variabilis (flått)

Rhipicephalus sanguineus (kennelflått)

Foreliggende ektoparasitticide preparat kan benyttes for å beskytte dyr som holdes av økonomiske grunner og kjeledyr fra ektoparasitter. Forbindelsene kan f.eks. på nyttig måte administreres til hester, storfe, sauer, griser, geiter, hunder, katter og lignende samt eksotiske dyr slik som kameler, lamaer, hjortedyr og andre arter som vanligvis refereres til som ville dyr. Forbindelsene kan også på nyttig måte administreres til fjærfe og andre fugler slik som kalkuner, høns, ender og lignende. Preparatet anvendes fortrinnsvis på dyr som holdes av økonomiske grunner, og mest fortrinnsvis på storfe og sauer.

Mengden, timingen og måten for effektiv påføring vil variere sterkt med parasittens identitet, graden av parasitticid angrep og andre faktorer. Anvendelsen kan gjøres periodisk over hele vertens levetid eller bare for en topptid av parasittisk angrep. Generelt oppnås ektoparasittbekjempelse med topisk påføring av væskeformige formuleringer inneholdende fra 0,00005 til 95,0 % forbindelse, fortrinnsvis fra opptil 5$, og mest foretrukket opptil ca. 1$ forbindelse. Effektiv parasittbekjempelse oppnås ved administrasjons-mengder fra 5 til 100 mg/kg.

Forbindelsene påføres på dyr ved konvensjonell veterinær-praksis. Vanligvis formuleres forbindelsene til ektoparasitticide preparater som omfatter en forbindelse og en fysiologisk akseptabel bærer. Flytende preparater kan f.eks. på enkel måte sprøytes på dyrene for hvilke parasitticid bekjempelse er ønsket. Dyrene kan også behandle seg selv ved slike anordninger som ryggskrubbeinnretninger som kan inneholde den toksiske forbindelsen i et klede, f.eks., som dyret kan bevege seg mot og komme i kontakt med. Dyppetanker anvendes også for å administrere det aktive midlet til vertsdyret.

Foreliggende oppfinnelse viser systemisk ektoparasitticid aktivitet. Forbindelsene har evne til å treng gjennom vevene hos et vertsdyr til hvilket en av forbindelsene har blitt administrert. Insektparasitter som deretter fortærer blod eller annet levende vev hos vertsdyret blir dermed drept. Forbindelsene administreres på dermal, oral og perkutan måte. Foreliggende ektoparasitticide preparater kan fremstilles ved metoder som er kjent innen teknikken, f.eks. ved oppløsning av forbindelsen i et av de mange fysiologisk akseptable hjelpemidlene eller fortynningsmidlene. Oral administrasjon kan foretas ved blanding av forbindelsen i dyrenes for eller drikkevann, eller ved å administrere doseringsformer slik som tabletter, kapsler, bolus-elementer eller implantater. Perkutan administrasjon oppnås hensiktsmessig ved subkutan, intraperitoneal og intravenøs injeksjon av et injiserbart preparat.

Forbindelsene kan formuleres for oral administrasjon i de vanlige formene, slik som store doser, tabletter eller kapsler. Slike preparater krever naturligvis oralt akseptabel inert bærer. Forbindelsene kan også formuleres som en inji serbar oppløsning eller suspensjon for subkutan, dermal, intraruminal, intraperitoneal, intramuskulær eller intravenøs injeksjon. I noen anvendelser formuleres forbindelsene hensiktsmessig som en komponent i et standard dyrefor. Ved denne utførelsen er det vanlig å formulere foreliggende forbindelse først som en forblanding hvori forbindelsen dispergeres i en flytende eller partikkelformig fast bærer. Forblandingen kan inneholde fra 4,5 til 555 g/kg av forbindelse. Forblandingen blir igjen formulert til det endelige foret ved konvensjonell blanding.

Siden ektoparasittisk angrep generelt finner sted i løpet av en vesentlig del av vertsdyrets levetid, er det foretrukket å administrere forbindelsene ifølge oppfinnelsen i en form som gir vedvarende frigjøring over en tidsperiode. Konvensjonelle metoder innbefatter bruk av en matrise som fysisk inhiberer oppløsning, der matrisen er et voksholdig halvfast stoff slik som de vegetabilske voksene eller polyetylenglykol av høy molekylvekt. En bra måte å administrere forbindelsene på er ved hjelp av en bolus med langvarig virkning, slik som de beskrevet av Laby, US-patent 4.251.506 og Simpson, GB-patent 2.059.767. For en slik bolus ville forbindelsen bli inn-kapslet i en polymermatrise slik som den beskrevet av Nevin, US-patent 4.273.920. Vedvarende frigivningsvirkning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også oppnås ved bruk av et implantat slik som fra en silikonholdig gummi.

For mer fullstendig å illustrere oppfinnelsen gis følgende eksempler:

EKSEMPEL 1

A83543 HPLC- analvsemetode

Følgende analytiske HPLC-metode er nyttig for overvåking av fermenteringen for produksjon av A83543: Sentrifuger en prøve av hele buljongen, dekanter og fjern supernatanten. Tilsett tilstrekkelig metanol til biomassen til å returnere prøven til det opprinnelige volum, foreta blanding, og la blandingen henstå i et minimum på 15 minutter. Sentrifuger og filtrer supernatanten gjennom et 0,45 pm filter.

Alternativt kan hele buljongen ekstraheres med acetonitril (1:4 buljong:oppløsningsmiddel) eller aceton.

HPLC- system:

Kolonnebærermaterialet: 8-x 100-mm kolonne, silisiumdioksyd gel-4p sfærisk C^g (Nova C18, Waters) Mobil fase: CH3CN/MeOH/H20 (45/45/10) inne holdende 0,05$ ammoniumacetat

Strømningshastighet: 4 ml/min.

Detektering: UV ved 250 nm

Retensjonstider: A83543A - 3,6 - 3,7 min.

A83543D - 4,4 - 4,5 min.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av A83543 med kultur A83543. 1

A. Rysteflaske- fermentering

Kulturen Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, enten som en lyofilisert pellet eller som en suspensjon holdt i flytende nitrogen, anvendes for å inokulere et vegetativt medium som har sammensetningen A eller B (medium B er foretrukket for produksjon i stor målestokk):

Skråelementer eller plater kan fremstilles ved tilsetning av ! 2,5$ agar til vegetativt kimmedium A eller B. Det inokulerte skråelementet inkuberes ved 30° C i fra ca. 10 til 14 dager. Moden skråkultur skrapes med et sterilt verktøy for å løsne sporene og fjerne og masserere myceliematten. Omtrent lA av de således oppnådde løsnede sporene og kulturvekst anvendes for å inokulere 50 ml av et første-trinns vegetativt kimmedium. Alternativt kan første-trinnsmediet inokuleres fra en flytende nitrogenampulle.

Når kulturen holdes i flytende nitrogen, fremstilles ampuller ved bruk av like volumer av vegetativ kultur (48-72 timers inkubering, 30°C) og suspensjonsmedium. Suspensjonsmediet inneholder laktose (100 g), glycerol (200 ml) og deionisert vann (q.s. til 1 1).

En ampulle med flytende nitrogen anvendes for å inokulere 100 ml vegetativt medium i 500 ml Erlenmeyer-kolber (eller 50 ml medium i 250 ml kolber). Kulturene inkuberes ved 30° C i 48 timer på en rysteanordning som dreier seg i en 5,08 cm sirkel ved 250 omdr./min.

Den inkuberte kulturen (5$ v/v inokulum) anvendes for å inokulere 100 ml av et produksjonsmedium som har følgende sammensetning:

Det inokulerte produksjonsmediet inkuberes i 500 ml Erlenmeyer-kolber ved 28-30°C i 6-8 dager i en rysteanordning som sirkulerer i•en 5 cm sirkel ved 250 omdr./min.

B. Omrørt bioreaktor- fermentering

For å tilveiebringe et større volum inokulum anvendes 10 ml inkubert første-trinnsmedium, fremstilt som beskrevet i del A, for å inokulere 400 ml av et andre-trinns vegetativt medium med samme sammensetning som det i nevnte første-trinns vegetative medium. Andre-trinnsmediet inkuberes i en 2 1 Erlenmeyer-kolbe med stor åpning i 48 timer ved 30° C i en rysteanordning som sirkulerer i en 5 cm sirkel ved 250 omdr./min.

Således fremstilt inkubert andre-trinns vegetativt medium (2 1) anvendes for å inokulere 80-115 1 sterilt produksjonsmedium, fremstilt som beskrevet i del A. Ytterligere soyaolje tilsettes for å regulere skumdannelse, dersom dette er nødvendig.

Det inokulerte produksjonsmediet får fermentere i en 165 1 omrørt bioreaktor i 5-8 dager ved en temperatur på 28°C. Luftstrømmen og omrøringshastigheten i den omrørte beholderen datastyres for å opprettholde et nivå av oppløst oksygen ved eller over 50$ luftmetning.

EKSEMPEL 3

Isolering av A83543A. B. C og D Fermenteringsmedium (225 1), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble filtrert ved bruk av et filterhjelpemiddel (1$ Hyflo), og den separerte biomassen ble vasket med vann (~ 50 1). Biomassen ble deretter omrørt med metanol (~ 100 1) i omkring en time og filtrert.

Metanolfiltratet ble konsentrert til et volum på ca. 1 1. Konsentratet ble ekstrahert tre ganger med dietyleter (1 1 hver). De kombinerte eterekstraktene ble konsentrert til et volum på ca. 200 ml.

En porsjon av konsentratet (8 ml) ble kromatografert på en silisiumdioksydgelkolonne (RP-8 Lobar, størrelse B, E.M. Science, en avdeling av E.M. Industries, Inc.).

Denne fremgangsmåten ble gjentatt i et totale av 12 omganger (cykler). Instrumentoppsettet og fremgangsmåten for utøvelse av den preparative kromatografi i en "Autoprep"-metode er beskrevet som følger: Et fullstendig "Autoprep" HPLC-system omfatter tre Rainin Rabbit HPX-pumper, en trykkmodul, en Gilson modell 10 IB HPLC-fraksjonskollektor, en ISCO-V<4->absorbansdetektor og en Apple Macintosh Plus-datamaskin. Det fullstendige systemet arrangeres ifølge instruksjoner gitt i Dynamax HPLC Method Manager-håndbok fra Rainin Instrument Company, Inc. "Autoprep"-HPLC-konfigurasjonen benytter seg av systemautomasjon for å oppnå at preparative separeringer kan foretas gjentatte ganger under praktisk talt identiske betingelser med praktisk talt identiske resultater. Oppsamling og sammenslåing av tilsvarende fraksjoner fra flere omganger gir kromatografisk kapasitet uten behov for en stor kolonne.

To oppløsningsmiddelblandinger (A) og (B) benyttes i den isokratiske måte ved en strømningshastighet på 8,0 ml/min. Den benyttede isokratiske blanding inneholder 60$ av oppløsningsmiddel B.

Kjøretiden for hver cykel er 28,0 minutter. Eluatene fra de første 16 minuttene av hver omgang kasseres. De følgende eluatene oppsamles i 6 tidsfraksjoner, 2 minutter (16 ml) hver.

De automatisk kombinerte fraksjonene fra hver av de 12 cyklene resulterte i 6 sluttfraksjoner (kromatografiske kutt).

Tilstedeværelsen av de aktive A83543-forbindelsene bestemmes ved analyse av hver sluttfraksjon med henblikk på stikkmygg-larve-aktivitet og også ved analytisk HPLC.

De aktive fraksjonene kombineres deretter ifølge deres aktivitets- og HPLC-profiler og renses ytterligere ved bruk av det samme "Autoprep"-HPLC- og oppløsningsmiddelsystemet, men med en høy oppløsning, 21,4 mm x 25 cm preparativ kolonne (Rainin Dynamax), forpakket med 8 p C-18 reversfase-silisiumdioksydgel, for oppnåelse av A83543-komponenter A, B, C og D. Faktorer A og D krystalliserer fra CH30E/H20.

FD-MS til A83543C er vist på figur 5; og FAB-MS til A83543B er vist på figur 9 i tegningene.

EKSEMPEL 4

Rensing av A83543A og D

Fermenteringsmedium (10 ml) ble tilberedt som beskrevet i eksempel 2, del A, med unntagelse for at 1) 200 ml produksjonsmedium ble benyttet i en 1 1 kolber;

2) soyaolje ble utelatt i produksjonsmediet; og

3) inkubasjon var ved 30°C i 4-6 dager.

Mediet ble filtrert. Filtratet inneholdende 4 meg A83543A/ml og ingen detekterbare mengder av A83543B, C eller D/ml, ble kassert.

Biomassen ble vasket med vann og ekstrahert en time med metanol. Ekstraktet (7 1) inneholdt 72 meg av A83543A/ml og 7 meg av A83543D/ml.

Metanolekstraktet ble konsentrert til et volum på 5 1 og tilsatt til HP-20-harpiks (150 ml, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) i vann (2 1). Denne blandingen ble omrørt i en time.

HP-20-harpiksblandingen ble deretter anbragt i en glass-kolonne. Begynnelsesutløpet og eluatet ved bruk av metanol: vann (1:1, 1 1) var ikke aktivt. Det andre eluatet ved bruk av metanol:vann (7:3, 1 1) inneholdt spormengder av A83543A. Det etterfølgende eluat ved bruk av metanol (1 1) inneholdt A83543A- og A83543D-aktiviteten.

Metanoleluatet ble konsentrert og kombinert med to lignende fraksjoner fra andre opparbeidelser og konsentrert til tørrhet. Resten ble oppløst i 75 ml metanol:TEF (4:1) og utfelt ved tilsetning til 10 volumer acetonitril. Blandingen ble filtrert og filtratet ble konsentrert til tørrhet.

Resten ble oppløst i metanol (25 ml) og påført på en 5,5-x 90-cm kolonne av LH-20 Sephadex (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., USA), preparert i metanol, under oppsamling og analysering av 125 25 ml fraksjoner ved bruk av HPLC-metoden beskrevet i eksempel 1.

Fraksjoner inneholdende de ønskede forbindelsene ble kombinert og konsentrert. Resten ble oppløst i metanol (10 ml) og anbragt på en 41,1-mm x 25-cm preparat kolonne forpakket med 8 jj C-18 reversfase-silisiumdioksydgel (Rainin Dynamax).

Kolonnen ble kondisjonert i metanol:acetonitril:vann (37,5:37,5:25). Etter prøvepåføring ble kolonnen utviklet ved bruk av en 180 min. linear gradient av følgende oppløsnings-midler:

Gradienten ble kjørt fra 100$ A til 100$ B under oppsamling av 25 ml-fraksjoner.

Fraksjoner inneholdende A83543A ble slått sammen, konsentrert til tørrhet, oppløst i t-Bu0H (5 ml) og lyofilisert til oppnåelse av 778 mg ren A83543A.

IR-spekteret til A83543A i CHC13 er vist på figur 1. FD-MS-spekteret til A83543A er vist på figur 4; FAB-MS-spekteret til A83543A er vist på figur 8 [FAB-dispergeringsmiddel-ditriotreitol:ditioerytritol (5:1); og EI-MS-spekteret til A83543A er vist på figur 10.

Fraksjoner inneholdende A83543D ble kombinert med D-holdige fraksjoner fra seks lignende separeringer og ble konsentrert og kromatografert som beskrevet ovenfor ved bruk av den samme kolonnen, men forskjellige oppløsningsmidler. Kolonnen ble kondisjonert i metanol:acetonitril:vann (40:40:20). Oppløs-ningsmiddelsystemene som ble benyttet for å utvikle kolonnen i en 180 min. lineær gradient operasjon var:

Fraksjoner inneholdende A83543D ble kombinert og konsentrert. Resten ble oppløst i t-BuOH (5 ml) og lyofilisert til oppnåelse av 212 mg A83543D.

IR-spekteret til A83543D i CHC13 er vist på figur 2; og FD-MS-spekteret til A83543D er vist på figur 6.

EKSEMPEL 5

Isolering av A83543- komponenter E. F. G, H og J

og pseudoaglykonet av A

Fermenteringmedium (8 1), tilberedt ved bruk av metoder lik de som er beskrevet i eksempel 2, ble behandlet som beskrevet i eksempel 4. Fraksjoner fra LH-20 Sephadex-kolonnen inneholdende de ønskede forbindelsene ble kombinert med tilsvarende fraksjoner fra lignende fermenteringer. Siden komponenter E, F, G, H, J og pseudoaglykonene av A fremstilles i meget små mengder, kreves en rekke fermenteringer for å tilveiebringe tilstrekkelige mengder for ytterligere rensing.

En ansamling av underordnede faktorer fremstilt på denne måten og inneholdende ca. 1,6 g fast materiale, ble påført på en EPLC-kolonne (Ranin Dynamax) forpakket med 8 pm C-18 reversfase-silisiumdioksydgel (ODS), som beskrevet i eksempel 4. Kolonnen ble kondisjonert i CH3OH:CH3CN:H20 (75:75:50) og gradienten ble kjørt fra 100$ av oppløsningsmiddel (A) til 50$ (B): med følgende oppløsningsmiddelsystemer: under oppsamling av 25 ml fraksjoner. Følgende fraksjoner ble slått sammen:

En del av ansamling 5 (100 ml) ble konsentrert til en rest, oppløst i etanol (1 ml) og påført på en 21,4 mm x 250 mm HPLC-kolonne (Rainin Dynamax) som beskrevet i eksempel 3. Kolonnen ble kondisjonert ved bruk av oppløsningsmiddelsystem

(A) av følgende oppløsningsmiddelsystemer:

og utviklet ved bruk av en 120 minutters lineær gradient fra 100$ oppløsningsmiddel (A) til 50$ av oppløsningsmiddel (B), ved oppsamling av 15 ml fraksjoner ved 7,5 ml/min. Eluering ble fortsatt ved 50$ (B) i ytterligere 60 minutter. Følgende fraksjoner ble slått sammen:

Disse ansamlingene ble kombinert med ansamlinger fra andre kromatografiske forsøk ved bruk av lignende utgangs-materialer. De kombinerte ansamlingene ble ytterligere renset ved bruk av kolonnekromatografi som beskrevet ovenfor; avsaltet på HP-20-harpikser ved bruk av standardteknikker; og konsentrert og lyofilisert til oppnåelse av følgende komponenter:

FD-MS- og EI-MS-spektrene til A83543A-pseudoaglykon er vist på figurene 7 og 11, respektivt.

EKSEMPEL 6

Fremstilling av A83543 med kultur A83543. 3

A. Rystekolbe- fermentering

Ved bruk av metoder lik de i eksempel 2, del A, dyrkes kulturen Saccharopolyspora spinosa NRRL 18537 i rystekolber, men ved bruk av vegetativt medium C som følger:

pH 6,6, juster til 7,0 med NaOH

<*>NZ Amine A

B. Omrørt bioreaktor- fermentering

Ampuller med flytende nitrogen med kulturen fremstilles som beskrevet i eksempel 2 ved bruk av de generelle metoder i del B. En ampulle anvendes for å inokulere en første-trinns vegetativ kultur (50 ml av medium C i 250 ml kolber), som inkuberes i ca. 48-72 timer. Inkubert første-trinnskultur anvendes for å inokulere (10 ml inokulum) en andre-trinns-kultur (40 ml av medium C i 2 1-kolber) som inkuberes i ca.

48 timer. Den inkuberte andre-trinnskulturen (5 1) anvendes for å inokulere et produksjonsmedium (115 1) som har følgende sammensetning:

Det inokulerte produksjonsmediet får fermentere i en 165 1 omrørt bioreaktor i 8-10 dager eller lenger, ved en temperatur på 30"C. Nivåer for oppløst oksygen (DO) reguleres av datastyrte systemer innstilt til å opprettholde DO-nivået over 50$ luftmetning som "beskrevet i eksempel 2, del B.

EKSEMPEL 7

Fremstilling av A83543 med kultur A83543. 5

A. Rystekolbe- fermentering

Ved bruk av metoder lik de i eksempel 2, del A, dyrkes kulturen Saccharopolyspora spinosa NRRL 18539 er rystekolber ved bruk av vegetativt medium B.

B. Omrørt bioreaktor- fermentering

Ampuller med flytende nitrogen av kulturen tilberedes som beskrevet i eksempel 2 ved bruk av de generelle metodene i del B. En ampulle anvendes for å inokulere en første-trinns vegetativ kultur (50 ml av medium B i 250 ml kolber), som inkuberes i 48-72 timer. Inkubert første-trinnskultur anvendes for å inokulere (10 ml inokulum) en annen-trinns-kultur (400 ml av medium B i 2 1 kolber), som inkuberes i 48 timer. Den inkuberte andre-trinnskulturen (2 1) anvendes for å inokulere et produksjonsmedium (115 1) som har en av følgende sammensetninger:

Det inokulerte produksjonsmediet får fermentere i 165 1 omrørt bioreaktor i ca. 8-10 dager eller lenger, ved en temperatur på 30°C. DO-nivåer reguleres som beskrevet i eksempel 6.

EKSEMPEL 8

Fremstilling av A83543 med kultur A83543. 4

Ved bruk av metoder lik de i eksemplene 2 og 7, dyrkes kulturen Saccharopolyspora spinosa NRRL 18538, men ved anvendelse av vegetativt medium B og produksjonsmedium III.

EKSEMPEL 9

Fermenteringsmedium tilberedes som beskrevet i eksempel 8. A83543 separeres fra mediet som følger: 1. Tilsett et likt volum aceton til mediet og filtrer ved bruk av et keramisk filter eller filterhjelpemiddel med en

filterpresse.

2. Juster filtratmediet til pH 10.

3. Tilsett etylacetat ( Vi til Vi av volumet av mediet).

4. Utvinn etylacetatekstraktet ved avdekantering av den ublandbare vandige delen; og konsentrert etylacetatekstraktet til Vi volum ved bruk av vakuum. 5. Ekstraher den konsentrerte etylacetatoppløsningen med vandig 0,1M vinsyre ( Vi volum); og separer disse fasene. 6. Fjern det oppløselige etylacetatet fra den vandige fasen ved bruk av vakuum (ca. 5% )-inndampning. Konsentrer den vandige oppløsningen ved bruk av en operasjon med omvendt

osmose.

7. Juster den konsentrerte vandige oppløsningen til pH 10-11 med natriumhydroksyd. 8. Separer bunnfallet ved filtrering; vask med vann; og tørk under vakuum til oppnåelse av A83543.

EKSEMPEL 10

A83543A- pseudoaglykon

En prøve av A83543 inneholdende hovedsakelig komponent A (ca. 100 mg) ble oppløst i metanol (50 ml), vann (2 ml) og konsentrert EC1 (3 ml). Denne oppløsningen ble konsentrert til tørrhet ved 50"C. Resten ble behandlet to ganger med dietyleter (200 ml hver) og det uoppløselige materialet ble kassert. De kombinerte eteroppløsningene inneholdende det urene pseudoaglykon ble konsentrert til tørrhet. Resten ble oppløst i metanol (20 ml) og renset ved bruk av "Autoprep"-HPLC-systemet beskrevet i eksempel 3 til oppnåelse av 20 mg rent A83543A-pseudoaglykon.

EKSEMPEL 11

A83543D-pseudoaglykon fremstilles fra A83543D ved bruk av en fremgangsmåte lik den beskrevet i eksempel 10.

EKSEMPEL 12

Følgende formuleringer er typiske for insekticide preparater som er nyttige i foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 13

Følgende eksempelvise preparater illustrerer den type formuleringer som benyttes for utførelse av foreliggende oppfinnelse.

Claims (8)

1. A83543-forbindelse, karakterisert ved formelen: hvor R er H eller en gruppe valgt fra R1, R3, R<5> og R<k> er hydrogen eller metyl; R<4> er metyl eller etyl; eller et syreaddisjonssalt derav når R er forskjellig fra hydrogen.

2. A83543-forbindelse med formel (1) ifølge krav 1, karakterisert ved at R, R<1>, R<3>, R4, R<5> og R6 er til stede i en av de følgende kombinasjoner: eller et syreaddisjonssalt derav når R er forskjellig fra hydrogen.

3. A83543-forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R er en (a) gruppe; R<1>, Rb og R<b> = CH3; Rd = H; og R4 = etyl; eller et syreaddisjonssalt derav.

4. A83543-forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R er en (a) gruppe; R<1>, R<3>, R<5> og R<6> = CH3; og R<4> = etyl; eller et syreaddisjonssalt derav.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en A83543-forbindelse som definert i hvilke som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at man dyrker en Saccharopolyspora spinosa-stamme valgt fra NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 eller NRRL 18539, i et kulturmedium inneholdende assimilerbare kilder av karbon, nitrogen, og uorganiske salter under submerse, aerobe fermenteringsbetingelser inntil en utvinnbar mengde av A83543 er produsert.

6. Biologisk renset kultur, karakterisert ved at den består av Saccharopolyspora spinosa valgt fra NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 eller NRRL 18539.

7. Insekticid eller miticid preparat, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel innbefatter en A83543-forbindelse som definert i hvilke som helst av kravene 1-4, i forbindelse med en fytologisk, akseptabel bærer.

8. Ektoparasitticid preparat, karakterisert ved at det som en aktiv bestanddel innbefatter en A83543-forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1-4, i forbindelse med en eller flere fysiologisk, akseptable inerte bærere for denne.