PT92607B - Processo para a producao de compostos macrolidos - Google Patents

Description

O pressnts invento diz respeito a um processo para a ρ r e p a r a. ç 3 o d e c o m b i π a ç 3 e s e comp o s i ç 3 e s i n se; c t i c i d a s, a c a r i c i d a s ou ectoparasiticidas, e aos métodos de spliospéo respectivos, utilizando o produto de fermentação AS3543, compreendendo componentes principais A83543A a A83543D e componentes secundários A83543B, A83543C, AS3543E, A983543F, A83543G, AS3543H o A83543J. bsts produto a produzido por cultura de uma espécie recentemente descrita, baccharogo Ivspora ssinosa, sendo os componentes A83543 e os seus sais ds adição de ácidos (compostos A83543) úteis como i n s e c t i c i d a s , p a r t i c u 1 a r m e? n t e contra es p é c. i es L e p i d o p t e r a e Diptera. 0 composto A83543 referida apresenta a fórmula 1:

»ι ' I

eni que R é H uu uiti grupo

meti 1 o lí t í 1 o fcste invente? relaciona-se com um novo grupo de compostos macrólidos que apresentam actividade acaricida a insecticida. Existe uma premente necessidade para encontrar novos insecticidas e acaricidas visto os organismos alvo desenvolverem rápidamente resistência a insecticidas e acaricidas na prática corrente. A resistência aos insecticidas entre os artrópodes; encontra-se muito espalhada, com pelo menos 400 espécies a revelarem resistência a um ou mais insecticidas» 0 desenvolvimento de resistência a insecticidas mais antigos, tais como DDT, os carbamatos, e os organofosfatos, é bem conhecido. A resistência desenvolveu-se mesmo, contudo, em relação a alguns dos insecticidas e acaricidas piretroidss mais recentes. Existe assim uma necessidade para encontrar novos insecticidas e acaricidas.

con tru » ο υ o '.r ec t o pa r «ssí tas, ua i s c ouio pu 1 g a —, l a r r a— patos, moscas qu.e picam, etc., foi há muito reconhecido como um problema importante na criação ds animais,, Os tratamentos tradicionais para os animais domésticos eram constituídos por insecticidas aplicados tópicamente, tais como as famosas imersões para carneiros. Na verdade, esses tratamentos são ainda qrandemente utilizados. Contudo, habitualmente, a pesquisa tem sido impulsionada no sentido de encontrar compostos que possam ser administraa os aos animais, especialmente por via ora. i , os quais consiqam controlar os ectoparasitas ac? envenenarem α parasita quando este ingere o sangue do animai tratado.

Este invente; relaciona—se com um novo produto de fermentação designado por A83543, o qual é constituído por componentes individuais A83543A, AS3543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F,, Α83θ4οο,, A83543H s A83543J . A83543 e os componentes individuais de A83543 são úteis para o controlo de insectos, particularmenta da espécie Lepidoptera, tal como verme do exército do Sul, e espécie Diptera, tal como a mosca varejeira,

ίΤ)ΟΞ· insου.

a f :a. do estábulo e mosquito.

p r o p c? r ο χ ο n a η α o puiacác de ácaros usando corri postos de A33O4 mposro=

I I ·/ tfl [ l_ L·) =· «ti._l t_ 0111 E

DiTi órmulã 1:

RO

R³ ue R a H un um g?

U t i i:

(CH₃)₂N

(CH₃)NH

R , R'“R s R'~' eão hidrogénio o.; oeti 1 o3 a R,, ê metilo ou etilo;

u. um seu sal de adiçao de ácido nos compostos em qus R é dife ente de hidrogénio.

Oe compostos preferidos do invento, do ponto de vist e facilidade de oreparac^o, s§o aqueles em que R, rL· R'~\ R' estac presentes numa das combinacSes que se sequem:

R	Ri	R3	R4	R5	R6
(a)	Me	H	Et	Me	Me
(b)	Me	H	Et	Me	Me
(c)	Me	H	Et	Me	Me
(a)	Me	Me	Et	Me	Me
(a)	Me	H	Me	Me	Me
(a)	H	H	Et	Me	Me
(d)	Me	H	Et	Me	Me
(a)	Me	H	Et	H	Me
(a)	Me	H	Et	Me	H
H	Me	H	Et	Me	Me
H	Me	Me	Et	Me	Me
H	Me	H	Me	Me	Me
H	H	H	Et	Me	Me
H	Me	H	Et	H	Me
H	Me	H	Et	Me	H

ou um bbu sal de adição ds ácido nos compostos em que R é difs rente ds hidrogénio»

Verificou-se que o aminoaçucar em A83543A era a {3-B-fo rosamina; e o açúcar neutro em A83543A era ,;í-2,3,4-tri-O~;neti 1 ramnose.

—^f—·^; íi utíracterizsdos nove ccmcorien tee cs A83343,. Este cumponsntes sao os compostos com a fórmula 1 em que R é diferent os HSpresentam as estruturas ssi =,e sequem:

Componente	R	R1	R3	R4	R5	R6
A	(a)	Me	H	Et	Me	Me
B	(b)	Me	H	Et	Me	Me
C	(c)	Me	H	Et	Me	Me
D	(a)	Me	Me	Et	Me	Me
E	(a)	Me	H	Me	Me	Me
F	(a)	H	H	Et	Me	Me
G	(d)	Me	H	Et	Me	Me
H	(a)	Me	H	Et	H	Me
J	(a)	Me	H	Et	Me	H

>J amino açúcar pode		i' í' s=.‘lií‘-j'V'	'ido das	componsi· te	s da
para dar oriqem a. pseudo	ι e.n 1	iconas	(composto	s com a fó	rmu 1 a
	? B	Ί C e b	t. ê' iTi U ;Ti S	pseudoag1	112 ΰ fi
c o m' j. rr.· ι. a p s e u d o a q 1 i c o n a. A 5 31· 4 3 A	Qt	Ll p'3eL!d	o—ft /. Ver	i f icou-se	m 3.1 3
-<arde que a. pseudoaglicona Atí	_· ·_/	3A eri·.	ρ Γ O d U Z i d	a natural	iTi··’·’.” í A
c o m o u rn c o rn ρ o n ente d e A G3343,	Ds	compo	r.pnt== Γι	E, F, H	S >1
pj i_j ir- Ll '.r' iT Li iTi -3 Ll ~s IC 3. ρ 3 G LÁ d L? 3 Q 1 i C O	na	As ps	e u d aag 1 i. c	onas de A	S ~· ** A
têm as estruturas que se sequem	2
Pseudoaglicona3 R1	R3	R4	R5 R6
A83543A Me	H	Et	Me Me
A83543D Me	Me	Et	Me Me
A83543E Me	H	Me	Me Me
A83543F H	H	Et	Me Me
A83543H Me	H	Et	H Me
A83543J Me	H	Et	Me H
R — H As pseudoagliconas stíc	j L	iteis o:	amo inters	uçdiári o<- ,	p.or

ε:; emolo , d a r a ο ε c ο m ο ο η ε n t e ε d ε A tí 3 O 4 3 „

Os parágrafos que sa seguem resumem as propriedade? físicas e espectrais dos comoonentes de A83543 e das pseudoa.q 1 icon as. Nas discussões infra,, sáo usadas as abreviaturas que s> sepuem:

FAB—MS:espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido

FD-MS; espectronietria de massa de desorção de campo

CLt.P: cromatografia líquida de elevada performance

IV : i n f r a ve r me 1 ho !~'MN: ressonaricia magnética nuclear.

U V i u 11 r a v i o 1 e t a

Car a c t e r x s 11 c a s d e fli 0 3,5 4 3 A

Peso Molecular: 731

Fórmula Empírica: C ,. H, _eHU,..

e1 oo 10

FD-M3: ver l-ig. 4

FAB~MG(M+Í): Encontrados: 732.470ό; Calc.

10)

UV CEtDH) lambdamaxs 243 nm (ó 3,920),

Iv (CHC1— ): n iu (1actona) 1713; (cetona cor

1657; picos múltiplos para vibrações C-H à • 1 l ? f !’i I. ·:>

I ,!.U . J.

;v

-171,9° r - ι í)t r-q v +6,g* s 1,03, CHC1_)

C Ο Π;

cí O (Σ-

uí

ÍJ O juaaro

H e

Posi ção

Ie RMN de ι 3_C >H

1	172.02	—
2	33.83	3.07/2.45
3	48.13	2.94
4	41.65	3.48
5	129.12	5.86
6	129.66	5.89
7	41.46	2.15
8	36.50	1.99/1.34
9	76.31+	4.31
10	37.65	2.36/1.36
11	46.42	0.93
12	49.74	2.87
13	147.78	7.01
14	144.27	—
15	202.46	--
16	47.74	3.30
17	80.41	3.53
18	30.33	1.51
19	21.85	1.78/1.17
20	34.45	1.50
21	76.24+	4.66
22	28.51	1.48
23	8.97	0.81
24	15.71	1.12
1 '	96.34	4.81
2 '	77.61	3.51
3 '	81.87	3.37
4 '	82.43	3.00
5 '	68.03	3.48
6 '	17.64	1.18

Quadro Is Dados (continuação)

C de RMN de ABI

143A em Acetona-d , ,

Posição	1 3C	!ΗΗ
2'-OCH3	56.66*	3.37
3'-OCH3	58.39*	3.41
4'-OCH3	60.12	3 .45
1	103.45	4.45
2 ' '	31.24	1.92/1.37
3 ' '	18.14	1.84/1.52
4' '	65.34	2.12
5' '	73.35	3.56
6' '	18.87	1.21
N(CH3)2	40.38	2.22

2' Aloumas medições foram feitas a partir da correlação H/*/), kessonSncias com a mesma leqenda pedem ser permutados, ae^!B”5.5 5^^:ristieas de --01:.-0tf-zu •r-or Molecular: 717 Fórmu 1 a Empí r ica : C ,.-.Η, NO ,

FAErrç? (ver fig. 9)

Características de A535437

Peso Molecular: 733

Fórmula Emoírica: C-.-.H , NQ., .-.

o / O i i ç

FD-MSs (ver fig. 5)

Características de AO 3543D Peso Molecular: 745 Fórmula Empírica:

UV (EtOH) lambdama;·:: 244 nm ÍE 9,913)

XV iLHcl₇): niu (lactcna) 1708; (cetona conjuqadai

ds 29 4 Ο s c!ars. vibrações u—u à volts ds 10/0 cm

Εα3'··^8ν : -142,9° (ç 1.02, CHO

-29,9° (ç 1.02, CHC1_.)

FDOS; ver Fie» h

Posição

13_C *H

1	172.68	— —
2	34.38	3.08/2.43
3	49.01	2.90
4	42.83	3.47
5	123.27	5.54
6	137.26	—
-ch3	20.81	1.74
7	44.41	2.18
8	35.61	2.01/1.45
9	76.72	4.32
10	38.64	2.37/1.37
11	47.04	1.02
12	50.05	2.78
13	148.47	7.04
14	145.19	—
15	203.16	—
16	48.47	3.30
17	81.03	3.53
18	30.99	1.49
19	22.51	1.78/1.19
20	35.12	1.49
21	76.84	4.65
22	29.16	1.48
23	9.55	0.81
24	16.32	1.12
1'	97.11	4.85
2 '	78.33	3.54
3 '	82.58	3.40

í. O >_) n t j- ! U ri ã l-J í	lu, _ 13^
Posição	13C	iHa
4'	83.15	3.03
5’	68.71	3.50
6'	18.26	1.18
2'-OCH3	57.31*	3 .40
3'-OCH3	59.02*	3.43
4’-OCH3	60.71	3.47
1' '	104.14	4.47
2 ’ '	31.96	1.94/1.39
3 ’ '	18.83	1.81/1.49
4' '	66.06	2.12
5 ' '	74.12	3.55
6 ' '	19.42	1.20
N(CH3)2	40.99	2.21
Algumas indicaç	Ses colhidas da	1,,13,-.
$ A s r e s ε o n S n c i a s	podem ser permí	í ta.d as.

p_e5O Molecular; 717

Fórmu 1-a Em ο ί rica: C.-H,_.NU ' 4 U o _·

FAB—MS (M+ í ) : tricori tr-ados:

^C40^Hó4^NOÍO ^{= 718J4530} UV (EtOH) lambdamax: 244 n (KBr) (ver tiq« 13)

IV e ·=· li. m s o s α a o o s

C de RMN observados

(J U uad rο III r coia A&3543E (em acetona—

4 “Τ

Quadro III : Dados π s ^A’'C de RMN de A83543E ftcetona-d

Posição

3_C *H

1	172.46	—
2	34.95	3.06/2.40
3	48.88	2.95
4	42.11	3.43
5	129.78	5.86
6	130.39	5.90
7	42.11	2.14
8	37.18	1.96/1.39
9	77.06	4.33
10	38.31	2.36/1.36
11	47.18	0.93
12	50.40	2.86
13	148.37	7.06
14	144.84	—
15	203.09	—
16	48.05	3.34
17	81.35	3.55
18	34.98	1.62/1.48
19	22.25	1.77/1.13
20	33.73	1.50
21	72.97	4.68
22	21.61	1.12
23	—	—
24	16.52	1.13
1 '	97.11	4.83
2 '	78.36	3.55
3 '	82.55	3.37
4'	83.13	3.02
5'	68.72	3.50
6'	18.26	1.18

( c ο π t i η u. a. ç. a o ?

em Acetoná~d..

Posição	13C	1H3
2'-OCH3	59.01	3.43
3'-OCH3	57.30	3 .40
4'-0CH3	60.69	3 .46
1’ ’	104.24	4.47
2 ' '	32.00	1.93/1.39
3 ' ’	18.86	1.82/1.50
4' '	66.06	2.12
5 ' '	74.13	3.57
6' '	19.42	1.21
N(CH3)2	40.99	2.21

feitas alqumas med içoes o ar

-el._:

H/' p e = o M d 1 e c u 1 a r '17

Fórmula Empines; C Η , NO .

,N0. . = 718.4530 a ν ή a i ti

UV (EtOH) 1ambdamax: 243 nm ( íV (KBr): (vsr fim 145

Posição

13_C

1	172.60	—
2	34.50	3.06/2.42
3	48.82	2.95
4	42.46	3.45
5	129.56	5.87
6	130.39	5.92
7	42.19	2.16
8	37.18	1.97/1.35
9	77.15	4.65
10	38.30	2.33/1.34
11	46.89	0.94
12	50.34	2.84
13	148.86	7.03
14	145.73	--
15	198.68	—
16	45.49	3.22/2.50
17	74.17	3.58
18	30.74	1.52
19	22.41	1.70/1.17
20	34.45	1.51
21	77.09	4.32
22	29.05	1.48
23	9.56	0.81
1'	97.19	4.83
2 '	78.38	3.53
3 1	82.58	3.38
4'	83.15	3.00
5 '	68.74	3.48
6 '	18.25	1.18

Quadro IVs fados Ή e ^L'~'C de RMN de AS3543F em Acstona-d.. (continuação)

Posi ção	13C	JHa
2’-OCH3	59.02	3.43
3 *-OCH3	57.31	3.40
4’-0CH3	60.69	3.47
1' '	100.19	4.53
2 ' '	32.41	1.80/1.38
3 ' ’	18.86	1.83/1.53
4' '	66.16	2.13
5' '	74.01	4.01
6' '	19.46	1.22
N(CH3)2	41.01	2.22
A1oumas	medições foram colhidas da correi
	Características ds AA.d5u.5A

Molecular: 731

FóriTiUla Eíípiricá:

‘rl *·_' J.’<>

FA3---M3 (M+l)! Ensontredes; 732.4661:: Ceie,,

UV (ttuH) 1ambdama;·:! 243 nm (E 8,?~y>

IV ( ΚI- ( ,··; r i i q „ 15) d Ο'Ξ-

Ο (Juadro V resume ο=· dadc com Ay35436 ísffi acstons-d , ) .

ro v: Dados ^lH e ^''C de RMN

Posição

13_C *H

ΊΝ ofc

1	172.59	--
2	34.67	3.04/2.46
3	48.72	2.94
4	42.25	3.50
5	129.85	5.84
6	130.26	5.89
7	42.02	2.14
8	37.12	1.95/1.34
9	76.99	4.32
10	38.28	2.36/1.36
11	47.23	0.91
12	50.43	2.87
13	148.28	7.04
14	144.61	--
15	203.20	--
16	47.94	3.30
17	81.73	3.57
18	35.20	1.55
19	21.68	1.64/1.16
20	31.41	1.64/1.36
21	76.47	4.64
22	28.84	1.48
23	9.61	0.80
24	15.29	1.18
1'	96.98	4.81
2'	78.23	3.52
3 ’	82.46	3.37
4 '	83.05	2.29
5'	68.64	3.49
6 '	17.18	1.12

Uuadro V: Dados He C de RMN de Atí3õ43S em Acetona—d . , (conti 5 nuação>

Posição	13C	JHa
2'-OCH3	58.97	3.42
3'-OCH3	57.25	3.39
4’-OCH3	60.70	3.46
1”	99.51	4.80
2 ' ’	29.62	1.87/1.48
3 ' 1	19.31	1.73
4' '	62.13	2.29
5' ’	69.93	4.20
6' 1	18.22	1.17
N(CH3 )2	43.47	2.24
Algumas medições foram colhidas	da correlação
	Características de	A33543H
Peso Molecular: /17
Fórmula Empírica; C, H 4y óà
UV	(EtOH) laiTibdamax: 243	nm <4 .<
IV	(KBr): ver fig. 134
dateroinado	numa mistura A83543H	iJ <53:42)
	Características de	A33543J

Peso Molecular: 717 ^έ de

Fórmula tmoírica: C,.H,^Nn .

‘ 4y aa ” i y

UV (EtOH) ].ambdamax; 243 nm (. t ΙΟ,ΙΟΟΜ: IV ¢0321^-): ver fiq„ lAx cminado nuaa mi st Lira A83343 H:J <53;; 42)

AS3P43H e J são separados de AS3o43 mietuf-q (relaçao H;; J - 58;; 42) a qual pode '- ^r omatografia líquida de elevada performance descrito infra., Aa estruturas atribuídas a AS.

e:t a forma de uma —õ~? p ci r 5 3/ A7 por < CLEP > tal caia é 543H s 3 baseiam-ss i,

na—d.. . Os espectros de RMN as se me 1 ham- se e foram c o m parados com os de AB3543A. As principais diferenças nos espectros centram-se à volta do açúcar rantnose. Os componentes de H e de J H e J tem apenas dois (JUH, s nesse açúcar. No componente H, H-í á desviado cerca de , 1 6' no espectro ti de RMN e -3 6' no

a. ue itieuxxu ιιο nieiuxi iic , n en t e J c o r r e s- ρ o n d e m a u m a a u s ã n c i metoxi na posiçSo 3 „

C de RMN

Estes desvios sSo devidos à osiçáo v . Us desvies no coopo c e t n e 1 h a n t e d o m e t i lo η o

Peso Molecular: 590

Fórmula Empírica: C-,-,Η,

UV (EtOH) lambdama;:: 243 nm (E 10.,300)

Ι. V (CHC1-.): niu. (lactona! 1724; (cetona conj ciciada 1652; oicos múltiplos para vibrações C—H á volta de v i / J Ϊ C) s i i f a i >_ 1. p 1 O S ρ a r a v ti i' 7 p <

cm ver tig.

V 1' r .1. Li . J. J.

í_: a. r a r te r í s f i c a s d a F‘ s s u c o a c I i c o n a. d e A S3543 LFfeíso Moiecu 1 ar = 004 □rrau. í

Empírica: L ._T. ,,H_c-„0_a

Solvente; CH^UH s LH,CN ; N^ÍJ (22 Taxa de Fluxo; 1,0 mL/min

Detecção: UV a 24b nm

Tempereisrss Tempersturs Ambiente

Componente

Tempo de Retenção(min>

A

B

C

D

8,50 6,15

11,47

SIS^EnA II

Coluna: 4,6 x 100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, Inc.,, Mt„ Freedom

Solventes: CH_QH: CH-P2N : 0,053 NH,OAc(H_O>

(A) 35:35:30 - pH 7,8 (B) 45:45:10 - pH 6,7

Taxa de Fluxo: 2,O mL/min Tempo utilizado: 35 min Detecção: UV, 25$ nm

Gradiente: 1 Q33 s 257. B em 20 min; s 5D7.B em 3

NJ ) min

UOiT.oonen te iem po__de Retençgn___( m in ?

A

A-pseudoaglicona

Β

C

D

E

F

G

H

J

22,62

-γ

12,65 13 , 62 25,47 19,22 16,30 18,92 16,30 17,50

SISTEMA III

Coluna: 4,6 ÍWO mm, UDb (AQ-3Ô1, S-5; YMC; Inc., Mt. Frsedooi, NJ)

Solventes: CH,OH: CH,CN: =, 057. NH.QAc(H^O)

V. ú H 2

35:35:30 - pH 6,Θ Taxa de Fluxo: 2,0 mL/nsin Tempo utilizado: 10 min Detecção; UV, 250 nm

Componentg

F

H

J

Temoo do Feten

Ds componentes de A83543 não são solúveis na água, mas são solúveis em solventes tais como metanol, etanol, dimeti1formamida. , dimetil sulfóxido, acetonitrilo, acetona, etc.

Ao3o43 os componentes individuais, tais como Atí3o4áA, AS3543B, A83543C, AS3543D, A83543E, A83543F, AS3543S, AS3543H e AS3543J podem reagir a fim de formar vários sais.. Todas essas formas destes compostos fazem parte deste invento. Os sais de A83543 são úteis, por exemplo, para a separação e purificação de A83543. Além disso, alguns sais apresentam uma melhor solubilidade na água.

Os sais de A83543 são preparados usando processos normalizados para a preparação de sais. Por exemplo, A83543 pode ser neutralizado com um ácido apropriado a fim de formar um sal d e a d i ção d e ác ido.

Us sais de adição de acido sá o particularmente úteis. •Sais apropriados representativos incluem os sais formadas; por meio da reacções norma 11z«idas é<_ídus tanto orgSuiLijs corriu inorgânicos tais como, por exemplo, ácido sulfúrico, clorídrico, fosfórico, acético, succinico, citrico, láctico, maleico, Tu.ínárico, eólico, pamoico, múcico, g lutámico, canfórico, glutárico, qlicólico, ftálico, tartárico, fórmico, laurico, esteárico, salicílico, metanessulfónico, benzenessu1fónico, sorbico, píerico, benzoico, cinãmico e ácidos afins.

Em discussões sobre a utilidade, a expressão composto A33543 indica preferencialmente um membro seleccionado de entre o qrupo que consiste em A83543, componentes individuais A83543A, A33543B , A83543C , A33543D , A83543L , A 8-10434 , A83543G , A 3 o 5 4 ο Η , e A83543J e os seus sais de adição de ácido, □ produto ide fermentação A33543 é produzido por cultura de uma estirpe de novos microorganismos 5acc harορo1vsρora spinosa seleccionados de entre NRRL 13395, NRRL 13537, NRRL 18533 e MRRL Í8539, ou um seu mutante produtor de A83543, em condiçSes aeróbicas submersas num meio de cultura apropriado até se produzir uma quantidade recuperável de A83543, Como será reconhecido pelos especialistas em processos de fermentação, a relação entre os componentes em A83543 variará, dependendo das condiçSes de fermentação usadas para a sua produção. Em geral, A83543 contem cerca de 85—90% de AS3543A, cerca de 10.15% de A83543D e quantidades menores de A33543B, C, E, F, G, H e J e pseudoag1icona de A33543A. Os componentes individuais tais como A83543A, A33543B, A83543C, A83543D, Α83543Ε, AS3543F, A33543G, A33543H, e A83543J e a pseudoag1icona de A83543A podem ser separados s isolados tal como é descrito infra.

Assim, um outro asoecto deste invento é um processo para a produção ds um composto A83543 que compreenda a cultura da estirpe Saccaropo1vspora spinosa seieccionada de entre NRRL

\ v ” 4-Z) ~~

18395, NRRL 18357, NRRL 18538 ou NRR	! 1 Hri39 Oi ! ! i ιΤι Ο ΟΙ ι (ΤΪΙ i Γ ,ϊ n Γ o
pi í- õ U Lt tl· Õ í'~ Li t? Ho-Í-OMÕ η Π Li ÍTi Ticr-LO crr Llti tU	.ra contendo fontes assimila-
veis de carbono, azoto, e sais in	oroânicos em condiçEíes de
fermentação aeróbica submersa até s	s produzir uma quantidade
r e c u o e r 3 ν ei de A 3 3 5 4 3 . 0 s c o í 11 ρ o n e n tes	individuais podem então ser
isolados por técnicas conhecidas per	iie=;-<=! uso i lua .
Este invente também se	rei a c ion a c o m uma c u11u ra
ρ u r 11 i c a d a b ι o 1 õ g i c a τt e n t e 3 o mi c r c	; o r q & n i s m o S a c o t: at r ο ρ o 1 y s ρ o r a

ou NRF’!L 13539,, uu um seu iiiutante	produtor de Atí3543. Estes
microorpanismos são úteis pelo facto	de oreduzirem A83543,
P u r m o t i ν o s d t· c u η v e η i e n c	ia nas discussões qus se

sequem, a tri buiu—se às estirões as desiqnaçoes que se seciuem:

.···. ~y ^r~ Λ T -I A VC ,·’ T T Λ Γ^-» T CT A T A _ Λ T T C ,Ί T ~ Λ _ . , 1 4- , . u- - Λ O TC V 4 _Ú _ 1 mo·.:··.j-4.j> _n j η mo-o-o-H··_· « ·_ ₅ *-t tc MbL<w‘Í··..·’ » —¹ « i-ι l. l< 1 T.U.Γ·=< «1 i Di obtida por mutação química de uma cultura <A83543) isolada a

partir de uma amostra de solo recolh	;ida nas Virgin Islands. As
ouliurao H83343.3, £,(33543.4 e A83543 .	5 foram obtidas a partir de

As culturas A83543.1, A83	“,4/p s -}-·.?ÍS4< a 4 -, ”14?v ti S
ι o )* , i; d e ρ o s J. t a d c*. s e 7 a s em ρ a r i e d a c o	lecção dos lotes de cultura
do Midwest Area Northern Regional Re	s e a r c 1't C e n ter , A q r i c u 11 u r a. 1
Research Service, United States Dspa	rtment oi Agricultura·, ISlo
Ν o r t h ijn i v e r s i t y S t e e t, F'eo r i a , I 1 1 i n	ois, 81804, a oartir da qual
elsa. sa encontras disponíveis para o	ρi;o 11c:o sob os números de
3.C SC) GLie 55 550! ’ΡίΏ ;

NRRLNo tstircs No.

13335	A83543.1
18537	A83543.3
18538	A83543..4
18539	AS3543.5

Estudos taxonóisicos forsiTi realizados por Frederick P. Nertz do Lilly Research Laboratories. Com base nestes estudos, os microorganismos A83543.1, A83543.3, A33543.4 e A83543.5 são classificados como membros de uma nova espécie do genero Saccharopo 1 yspora, que é denominada Saccharcpclyspcra spmosa sp .. nov„ Esta classificação baseia-se em comparações laboratoriais directas e exame das descrições publicadas de espécies semelhantes .

Métodos Usados

Os métodos seguidos foram os recomendados pelo InterbaÍISP) para a caracterização da Shirling and D. Gottlieb, Methods 3 „ Svst,

tionai Strsctomycss	Project
e s p é c i e S t r e p t o m y c e s	CE.	B. :
for Chsracterization	of	Str
Bactoriol. 16:313-340	(1966)1
capão da espécie Noca	rd ia po:-

:myces Spscies,

Int.

Handerhan and C. H. Pang, Nocard ia coeliaca, Nocardia au. totrop;hica , and the Nocardiπ Strain , In t J , Syst. Sacteriol. 24 ( 1 ) ,

54-63 (1974).

ISCC-NSS Centroid Color Charts. amostra padrão Mo. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) foram usados para atribuir nomes de cores ao lado reverso e às hifas aérias.

A morfologia, foi estudada usando ummicroscópio óptico s um microscópio electrónico ds varredura CSEM).

U isómero do ácido diaminopimélico (DAh) e os hidratas ds carbono eis hidrolisados das células totais foram estabelecidos pelos métodos croma Lechevalier, R. E. D i f f e r enciation de Becker Sordsn and H. between Noaardia and et al. C. Becker, M„ P. E.. Lechevalier, Rapid

Streptomyces by Paper

Chromatography of Whole—csll Hydrolysates, Appl. Microbiol. 12,

421-423 <1964)1

Lechevalier and ion in the e de Lechevalier and Lechevalier CM. P. H. Lechevalier, Chemical Composition as a ; 1 assi f ica.tion of Aerohic Actinomycetes, In t .

j .. Syst. Bacteriol. 2u, 435—443 <197O)1.

Os fosfolípidos foram determinados pelo processo de ΙΊ. PLechevalier and H. Lechevalier Cin A iJniversity Laboratory Aooroach, Dietz and Thayer <eds.), Society for Industrial Microbiology Special Publication No,. 6, Arlington, VA,, pp. 227-233 <193Θ)1.

A composição sos qu.e se seguem de R. Bacterial__Systenatics,

1935, pp. 173-1961 and menaquincna foi determinada pelos procesM. K r ο ρ ρ ε n s t e d t Cin Chemical Methods____i π

N. Goodfallcw and D- EMinnikin íeds.), M, D. Collins < i b i d . , pp. 267-235).

A resisfetcia aos antibióticos foi medida aplicando discos de sensibilidade ao antibiótico na superfície de placas de a.cí a r πο . v semeanas .

A hidrólise do amido foi determinada fazendo um teste quanto à presença de amido com iodo nas placas da agar (sais inorgSnicos-amido) No. 4 ISP.

A análise dos ácidos gordas foi realizada usando o

Sistema de Identificação Microbiano 5S9QA HP [ver L. Miller and

T. Berqer, “Bacterial Identification by 6as Chromatography of

Whole Cell Fatty Acids, Hewlett-Packard Application Note 228-41 , Spp (1935)1.

□s ésteres metílicos de ácido gordo foram produzidos a partir de células totais 1iofi1izadas feitas crescer em condições idÃn ticas„ componente principal da análise apresentou-se em duas dimensões e foi. gerado por computador, fts unidades de medição no principal componente do traçado (indicadas na Pigura 12) são desvios padrão.

Os ácidos micólicos foram determinados pelos métodospropostos por Minninkin CD.E.Minninkin, I. S. Hutchinscn and A. Β, Caldicott, Thin-Layer Cromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bactéria,” 3. Cbromatoqraphy 183, 221-233 ( 1980 1 ,

Características Cultarai s

A cultura AS3543.1 cresceu bem em ambos o complexo e meios definidos. A cultura produziu micélios aéreos em todos os meios usados. A côr da massa de esporos aérics era predominantemente rosa-amarelado, mas era branca numa série ds meios.

C lado reverso era amarelo a amarelo-acastanhado. Não se encontrava presente qualquer pigmentação distinta,, SJm pigmento castanho solúvel foi 1ibertado para o meio nalguns meios.

A s ca rac tε r í = t i c a s c u. 11 u r a i lidas no uuadro

UU.AQ ΓΟ

C £?. Γ ·5. C 16Ξ' Γ i 5 ! ·. } J ] T i_J J·- 4¾ H CX>

Micelio Aéreo _

Meio	Crescimenlo	Cor Reversa Crecsimenio	Côr	Pigmento solúvel
meio ISP 2	Abundanle	76. 1. yRr.	Abundan Le	92.	ΥDranco	Nenhum
meio ISP 3	Bom	264. 1 . Ci nzen Lo	Bom	263	• Dranco	Nenhum
me i o ISP 4	Dom	92. y Dranco	Bom	263	• Branco	Nenhum
meio ISP 5	Abundan1e	73. ρ. OY	Abundan Le	31 .	p. yRosa	1.Cas t anho
meio ISP 7	AbundanIe	77. m. yBr	Abundan re	31 .	P · Rosa	1. Cas tanho
b ΑΙΛ Agar	Abundan Le	89. ρ. Y	Abundan ce	31 .	P- Rosa	Castanho
ATCC No. 172	Abundan c o	92. y Branco	Abundan ce	31.	P· Rosa	Nenhum
Bennclts	Abundanle	92. y Branco	Abundan c e	31 .	P- Rosa	1.Castanho
Malalo do	Bom	73. p. OY	Razoável	9 . pk. Dranco	Cas tanho
calc i o Qu i Cina	P a ?. o á v e 1	‘72· y Dranco	Razoável	263.	Branco	Nenhum
C z a p e k	Bom	92· y Dranco	Bom	2o3.	Branco	Nenhum
Emerson	Abundanιc	76. 1. yBr	Abundan te	31 .	p. y Rosa	Case anho
Glucose-	□ om
Aspa rag i ti a		90. Ey. Y	Razoável	31 .	P· y Rosa	1.Castanho

Meio

Crescimento

,u i tur rlp

Côr Reversa

Micélio Aéreo Crescimento Cor

Pigmento Solúvel

Glicerol-	Abundante	7B. d. yBr	Abundante	80.	gy. yBr	d. Castanho
glicerina Nutrient	Abundante	90. gy. Y	Abundante	31.	P· y.Rosa	1. Castanho
TPOC	Abundante	90. gy. Y	Abundante	31.	p. y Rosa	Nenhum
TWAd	Razoável	93· Υ Castanho	Fraco	263	. Branco	Nenhum
YDA6	Abundante	77. m. yBr	Razoável	9.	pk. Branco	d. Castanho

HQctT' ΐ·5ί ±r~iii3 Ci ~ ctVtlct ·,τί í.uííí·:

vol.2, b.A. Waksman, The Williams and Wilkins Co., Baltimore

Agar com água corrents CGordcn., Sarnstt, Handerhan and F'ang_? u o r a) .

Agar dextrose levedura (Gordon, Barnett, Handerhan and Panq,

Carac te ris tic as Ncrfoloq ícas

A cultura de AS3543.1 produziu uíií extenso substrato de micélio que se fragmentou em fermentação líquida. Não se observou qualquer fragmentação quando a cultura cresceu em meio de agar.

Colónias circulares brancas, 8—IO mm de diâmetro oom c e n t r' o e 1 e v a d o- e cor r e v e r s a a m a r e 1 o a c a s t a n h a d o , f o r a. m o b s e r v a das quando a cultura foi. colocada numa placa com meio ISF' 1.

Encontravam-se presentes hifas aereas bem formadas na maior parte dos meios.As hifas aereas encon travam-se f ragmentadãs em longas cadeias de esporos dispostas sob a forma de ganchos e de laços abertos. Também se observaram espirais, mas estas eram curtas e incompletas.

A morfologia geral era Rectus-fle::ibilis (RA > .

As hifas aéreas apresentavam um aspecto distinlamente semelhante a pérolas, com muitos espaços vazios na cadeia de esporos. Este facto demonstrou que uma bainha de esporos encerrava a cadeia da esporos. Esta bainha cie esporos estava coberta com espinhas muito distintivas. As espinhas tinham aproximadamente 1 um de comprimento s eram arredondadas na estremidade.

U formato do médio de 1,1 1,5 _rr-.

s u p e r i o r a 5 0 e s ρ o r o s zig-zag, esc 1 erótica, s de .

esporo era oblongo e tinha um tamanho □ comprimento da cadeia ds esporos era Não se observaram características em porangios ou células dotadas de móbil idaCaracterísticas r isic;lógicas

A cultura A83543-1 produziu ácido a partir dos hidratos de carbono que se seguem: adonitol, D-arabincse, eritritol, fructoss, glucose, glicerol, manitol, manose, ribose ε trehalose.

ácido a p dulcitol 1ac tose, rafirosa, litol ou x

A cultura não produziu celobiose, celulose, dextrina, g1icogénio, inositol, inulina, melebiose, a-meti1-D-glucosido, sorbitol, L-sorbose, sucrose, xi artir de: L-arabinose , etanol, galactose ni a 11 o s e , me 1 i z i t o o e L-raíTsnose, salicina i1ose.

Qbservou-ss crescimento com galactose, mal tose e melizitose, mas não foi produzido qualquer ácido a partir destes hidratos de carbono.

A cultura A83343.1 utilizou os seguintes ácidos orgânicos sob a forma de sais de sódio: acetato, butirato, citrato, formato, lactato, ma.lato, propionato, piruvato e succinato. A cultura não usou benzoato, mucato, oxalato ou tartrata.

A23543.1 decompôs alantoina, malato de cálcio, caseína, elastina, hipurato, hipoxantina, testosterona, L-tirosina e ureia. Não foi capaz de decompor adenina, esculina, çuanina, amido ou xantina.

AB3ou3.1 ptoduziu catai ase, fosfata.se, urease e l-l.-.S. Liquefez gelatina e reduziu nitrato. Não foi resistente á lisozima a não produziu pigmentos melanoides. Hão peptonizou nem hidrclisou leite magro. A83543.1 tolerou níveis de NaCl até e ircíaindo 113. Foi incapaz cie sobreviver a durante 8 horas, mas cresceu a temperaturas entre 15* e 37*C.

AS3543 a 1 ’f O í f-fc/S i S t Ε'Π t £? è. C Ei ’f 3.1 Q c. i Π 3 ( 30 uq ) Ο£?ΓΤ i c i 1 i “ ΠG ( 1 Ό Un Xdôd&5 ) £? ΓΙ 7 Β.;Τ;p i Π i ·.□ |J.Q / » i“ 01 (10 unidades), qentamiclru ( 10 η o ) , li n r o íti i c i n 5. ( 2 u. q ) , ~± cr 4 ? d — ~ j — ; π ,-z, \ 1 Cl ΐ i ri 'i v- ...· .. , >.« ·_ ·_·..< -x. _ , j l.v ·. Λ ·.· .J. -M z a

Π t? Ο Π11. C 1 ΓΤ 3 clina (30 pg), tobramicina (1O pg > e vancomicina (30 pg>.

Células totais hidrolisadas de AS3543.1 continham ácido

	LUÍX.	d	i am
	r £	1 u 1 a	to
	U.sT»	pad	rão
	A	( Lg*c	hev
		i d O 3	mií

de meiiijrsuia Lelul· : ri i i li —.

irabinose. Assim, A83543.1 tinha >o IV e um padrão ds açúcar Tipo suora). As células não contêm

As determi

o. t_ cas· de fosfοI1pido nas células totaiu indicaram a presença de fosfatidil colina e de cardiol ipina. Não foi detectada fosfatidil padrão de fostolipido Tipo i—‘11 I Cí'1„ H. L and H. A„ Lechevalier, Phospholipids in Acti η o m y c e t e s , ¹¹ i η A c t. i η o m yc e t e s , Z b 1 . 5 a i< t

A B3543.1 ti n h a. u m ι lier, A. E. Stern t h e Ta :< ο η o m y o f Supol __ii, K. P.

Schaal and G. Fulverer (eds), Gustav t-ischer Verlag, New York,

A menaquinona principal detectada foi MK-V(H,. ) . Obser vou-se uma quantidade menor de 133--904, ).

Colocacão em Placas de Ba c ceno t agos

IJ η <„ e r to n ú m e r o d e b a c c e r ι ο τ a o o s- S t r e π + o o v c e f e ,

A85P45,1 , Não se observaram Quaisquer manchas.

Identidade de AS3543.1

Tal como foi discutido supraa cultura de £83543-1 tem um padrão de membrana celular do tipo IV e um padrão de açúcar da célula total do tipo A. Os trinta géneros que se seguem apresentam este padrão de química celular: Nocardia, R h o d o c o c c u. s , CoryrisbacteriumCasesbacter, Mycobac terium, Faenia(Micropolyspora), Fseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, ftmycolata, ftmycolatopsis e Kibdelosporanqium.Estes géneros distinauem-se pela presença ou ausência de ácidos micólicos, pela composição am ácidos gordos, a pelos tipos de fosfolípido e de men aqui nona.. Faen ia, Fseudonocardia e Saccharopolyspora possuem caracteristicas quimiotaxonómicas idênticas às de AS3543.1, mas estes géneros diferem de A83543.1 nas propriedades morfológicas e culturais.

género Faenic <·. M i c r ο ο ο I y s po r a ) tem esporos macios e cadeias curtas de esporos que se formam nas hifas tanto aéreas como do subsolo. As suas hifas aéreas são esparsas e de côr branca, é um termófilo que cresce a 60 ''u. .HtíoSs-r. nao apresenta nenhuma destas propriedades diferindo assim de Faenia.

o género Fseudonocardia tem esporos nas hifas tanto a é r e a s c o m o ci o s u t? s o 1 o . D1. s t i. n ç u e—s e ρ o r r o b e n t os a c r 6 p e t o s e ρ o r blastosporos. As hifas apresentam uma morfologia característica em ziç-zag. As hifas foram descritas como articuladas mas não saptadas [ver A. Henssen and D„ Schafsr, ftmsnded Sescription of the Genus P s e u d ο η o c a r d i a Henssen and Description of a. New Spacies

Fseudonocardia spinosa Schafsr,” Int._J„ Syst. Bacteriol.

2.1.:29-34 (1971)1. Cresce muito lentamente. A f raçmen tação está ausenta ou observa-se raramenta. A83543.1 não apresenta qualquer u. m a d e s t a s p r ο ρ r i e d a. d e s .

U pénero SacchsropolvsDora é caracterizado por uma ;.poroe e por um distintivo aspecto semelhante a pérolas da cadeia de esporos. Este aspecto é muito predominar;te? (6 (Ti » Ια Η T f“ -5. Q ííi ct Π T„ ->. Ç O f -íCTi LJthTf 5 c í_j ί-ί Ξ Ε^-!' 'vOLl CCmTí l) l| ící σ E^j f u

Sue ç ha. r o po 1 y s po r h A espécie do tipo_? S » hirsuta _? foi i sol a. da. a.

ct L. U U Ci Γ

L-UX 1. Lí r ct ci 1 _i_ i ι i partir pua. 1 so ohtovo AS3543.1 foi isolada, a. partir de? ujt níoínho dí açúcar. Como A83543.1 tem muitas propriedades deste género, é, assim, c on s i d e r a do c o m o sendo u. m a es t i r ρ e d e Sacc ha. ro o o 1 v s o o r a ,

As únicas S a c c ln a r ο ρ o 1 v s o o r a sí : péL _L ss V a 1 Id ãiTiei! u S. erythraea e S. suta subesp. taber;

puoliçadas no género h i r s- u t a. S u b e s ρ é cies subesp, kobensis. AS3P43 difere destas estirpes quer na côr reversa quer na produção cie pigmentos solúveis.

A semelhança bioquímica foi medida elaborando um quadro ue coeficiente* s-ifitx i ui^- idade tendo o ouso medICoei simples 8 [ver W. Kurylowicz,

Ξ· íTi ^z ' bioquímicas quanto possíva1.Foram usados o coeficiente de Jaccard Sj e o coeficiente de junção simpu Paszkiewicz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski and T. cal Taxonomy of Streptomycetes, Polish Medicai F'ubl ishers, u Luadro VII resume estes coeficientes de similaridade.

iJuad ro VII

Coeficiente:

ÓllTi 2

Cultur9	S sm	Sj
A83543.1	100	100
S. hirsuta subsp. taberi	68	57
S. hirsuta subsp. kobensis	67	60
S. erythraea	63	54
S. hirsuta	55	50

	A 9.n	álise dos ácidos qordos ds A83b43.í e das		c ios
conhecidas	de	d 3 3 — tί 91- O p O i V 9- p O i^ 9. Γ” £ V 9 1 O O p l_i 9 0 9 d Li *Tí p Ο 3>	sui ác	•i —í ·—
gordos tan	to =	aturados como com cadeia ramificada. A	C OÍT1 pos	ição
sm ácidos	gord	3 3 d 9 A333-4 3 .. 1 9 Ξ-9ιΓι9 1 h-9.Γί tíd π íTi-9.3 Γ:^Ο i. O	9 Π t i O 9.	.V ij Ct
□ 9.5 O Lí t Γ 9	Cá ·—.	pécies, 0 Quadro VIII contpsra as compo	' 3· Í Ç 3 O 3>	em
3r idú?> Ο ΟΓ	d O 3	d- 4 F -pir- 4 id	-3 3. Ξ L Π	aro-

Quadro VIII: Perce A.S3O4 ageiTi Jd Cljíií i. ç. dú díií ÁLldOd Goi 1 e d a s E s tir ρ e s d e 6 a c c h a. r ο ρ ο I *· ora

Ácido Gordo	Λ83543.1	S. erythraea	S. hirsuta	S. hirsuta subsp. kobensís
15:0 Iso	11.80	17.86	15.44	17.94
15:0 Anteiso	0.64	1.33	1.38	1.25
16:0 Iso	22.47	25.70	15.61	19.05
16:1 Trans 9	1 . 15	--	4.14	2.63
17:1 Iso F	7.22	7.97	- -
17:1 Iso G	--	--	3.75	6.82
17:0 Iso	17.59	13.37	26.26	19.41
17:0 Anteiso	15.30	12.46	14. 19	12.72
17:1 B	4.77	1.90		0.67
17:1 C	1.65	--	2.70	1.81
17:0	2.74	1.01	1.43	0.94
16:1 20H	1 . 27	2.07	4.74	4.85
18:1 Iso F	7.57	11.31	6.83	7.47
TBSA lOMe	1 . 15	1.34	1. 77	1 . 00
18:0a				_

³TBSA = ácido Tuberculostearico

r-. χ τ · -í — w cnictil/st- du ácidos gordos indicada para sugerir que as cultura; nertencendo ao mesnio qénef ts composiçoes de >_ _> m ρ υ η ‘= 11 <-1- ρ π ι1 _ i f j r.<. i

Quadro VIII revela suficiente dispersão

turas são todas	d- “=péciaa	d iferentes
n e r o . 0 q r s f i c o	d o c o m ρ o n en t e	principal
é ap r es en t a d o n	a Figura 12.

Quadro IX compara as caracteristicas fisiolóqicas de Ab3543.1 com as das espécies e subespécies de saccharopolvspora.

!'

Q υ. 5: d ro I X : C .a rac t er í 5 fc i c a s F i s i c I 6 π .1 r 3 ·=. D i f £> #··· e> π r i a i <

	S . hirsuta	S. hi rsuta
A83543. 1	S. erythraea	S. hirsuta	subsp. taberi	subsp. kobcus i s

Decomposição de

Adenina esculiná amido xantina alantoina +

Redução nitrato + fosfatase +

Utilização de:

benzoato mucato oxalato

Variação Temperatura ( C) 15-37 Tolerância ao NaCl Í°C) 11 Ácido produzido a partir de arabinose + celobiose dex trina galactose inositol maltose melezi tose +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+

20-42

ND* +

+ +

+ +

+ +

+ +

+

25-50 +

+ +

+ +

20-42

ND +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

ND +

ND

ND

ND

ND

20-42 +

ND +

ND

I;

iêiã d } θ fa \ - C h ·5 Γ c< c? o 1 V -

	A83543.1 S.	c ry th raea	S. hirsuta	S. hirsuta subsp. taberi	S. hirsuta subsp. kobcns i s
Acido produzido a	partir de:
melibiose		+	ND		ND
raf inose		+	+	+	+
ramnose		+	+	+	-
salicina	-		-	-	ND
sucrose		+	+	+	+
xilose				-	-
lactose			+		ND
oÇ -Me-D-Glucosido			+	+	ND
sorbi tol	—
insuline		ND	+	ND	+

ND não reali zado

As coíTiparaçõe;

feitas

indicam que

3043.1 diftere accharopolyspora anteriormente accharopolyspora olyspora suficientemente das espécies ds descritas para constituir uma nova espécie de razão pela qual foi seleccionado o nome de spinosa. 0 nome spinosa reflete a ornamentação coberta de espinhas desta espécie.

As ;es A83o41

A83548.4 e

Λ O *7· ~ .-7

43.0 são suficientemente semelhantes macrcscópicamente para a estirpe AS3543.1 ser classificada como estirpe de Saccharcpo1yspora spinosa. As quatro estirpes diferem na quantidade de A83543 que produzem. A estirpe A83543.3 produz aproximadamente quatro vezes mais A83543 do que a estirpe A83543.1; e as estirpes A83543.4 e AS3543.5 produzem uρrouj.macía.^ripsí i ce oito a nove vezes mais Jo que a produzida pela, estirpe A83543.1.

Tal como acontece com outros organismos, as características das culturas que produzem A83543 deste invento, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18333, NRRL. 18537, NRRL 18538 e NRRL. 18539, continuam a estar sujeitas a variações. Assim, podem ser obtidas ít‘íu cantes destas estirpes· por métodos Tísicos e qu cri cos conhecidos nesta técnica. Por exemplo, podem ser obtidas outras estirpes por tratamento com produtos químicos tais como N-meti1-N -nitro-N-nitrosoguanidina. Mutantes naturais s induzidos das estirpes de Sac c har ooolys uor a spinosa NRRL 18395, NRRL 13537, BRRL 18538 e NRRL 18539 que refêtn a característica de produzirem usa quantidade recuperável de A83543 fazem parte deste invento.

meia de cultura usado para fazer crescer as culturas de Sacc ha ropo 1 ysoora spir; os a pode ser qualquer um de entre um certo número de meios. Contudo, para economia na produção, rendimento óptimo e facilidade do isolamento do produto, sao preferidos certos meias de cultura. Assim, por exemplo, fontes de carbono preferidas sm fermentação em grar.ds escala são glucose e mal tose, embora também possam ser utilizados ribose, xilosa, frutose, galactoss, manose, manitol, amido solúvel, dextrina da batata, oleato de metilo, óleos tais como óleo de soja, etc.

Fontes preferidas de azoto são farinha de sementes do algodão, leite peptonizado e farinha tíe soja digerida, embora possam também ser utilizados farinha de peixe, licor de milho , extracto de levedura, etc»

Entre os sais inorgânicos nutritivos que podem ser incorporados nos meios de cultura encontram-se os sais solúveis habituais capazes de proporcionar zinco, sódio, magnésio, cálcio, amónio, cloreto, carbonato, sulfato, nitrato e iSes semelhantes.

Elementos vestigiais essenciais necessários para o crescimento e desenvolvimento do organismo devem também ser incluídos no meio de cultura. Esses elementos vestigiais ocorrem ha hi tua 1 men te como impurezas noutros substituintes dc? meio em cjuantidades suficientes para responder às necessidades para o crescimento do organismo.

Usualmente, se a formação de espuma constituir um p r o b 1 e m a , p? o d e m—s e a d i c i o n a r ρ e q lí e n a s q u a n t i d a d e s ( i s t o é , õ 2 ml/L) de um agente ariti-espuaa (tal como ρο 1 ipropi 1 eno glicol) aos meios de fermentaçáo em larga escala. Contudo, no caso cie culturas produtoras de A3354-3, os agentes anti —espuma convencionais inibem ã produção de AS3543. A formação de espuma pode ser controlada incluindo óleo de soja ou pluronic L-101 (BASF) no meio (1-.3%). 0 óleo adicional pode ser adicionado se se formar espuma„

A percentagem de um componente particular ds A83543 pode variar por meio cie alteração dos meios. Por exemplo, a adição de valina ou de ácidos iscbutírico ou propiónico aumenta a percentagem de A83543 produzido.

Para a produção de quantidades substanciais de A33543, é preferida a fermentação aeróbica submersa em biorreactores agitados. Podem ser obtidas pequenas quantidades de A83543 por meio de cultura, em frasco agitado. Devido ao atraso na produção habitualmente associado à inoculação de grandes biorreactores com a forma esporos do organismo, é preferível usar um inóculo vegeta, tivo. 0 inóculo vegeta tivo é preparado inoculando um pequeno volume de meio de cultura com a. forma, esporo ou fragmentos de micélio do organismo a fim de se obter uma. cultura. do organismo crescendo activamente, fresca. 0 inóculo vegetativo é então transferida para. um grande bioreactor. 0 meio do inóculo vegetativo pode ser igual ao usado para fermentaçSes maiores, mas também podem ser apropriados outros meios.

A83543 é produzido pelos organismos produtores de AS3543 quando feitos crescer a temperaturas variando entre cerca de 24° e cerca de 33°C„ Temperaturas óptimas para a produção de A33543 parece ser de cerca de 23-30*C.

Tal como é habitual em processos de cultura aeróbica submersa, ar estéril é feito soprar para o interior do recipiente a partir do fundo enquanto o meio é agitado com propulsores de turbina convencionais. Em geral, a taxa de arejamento e a taxa de agitação devem ser suficientes para manter o nível do oxigénio dissolvido a ou acima de 3 o';,, e de preferencia a ou acima de 333, da saturação do ar com uma pressão interna do recipiente de 3,34 atmosferas„ r u 11 u r a ,

A pTOdUÇaC durante a fermentação testando extractos do cal CLEP, usando um sistema tal como foi descrito c o n s t i t u i li. m s n s a i o lí til ρ a r a e s t a. f i n a. I i d a d e.

xemplo

A seguir à sua produção era condiçSes de fermentação aeróbica submersa, os comocTientes de A83543 podem ser recuperados a partir do meio de fermentação por métodos usados na técnica. 0 A83543 produzido durante a fermentação do organismo produtor de A83543 ocorre tanto nos micélios como no caldo de cultura. A83543 parece ser 1i pOtί1ico, Assim, se se utilizar uma quantidade substancial de óleo na fermentação, a extracção do total do caldo será mais eficiente, Se se utilizarem apenas- pequenas quantidades

d tf ó 1 tf O ,	a porç	ão principal	_i _ η τ' tr n r uti mooj4.;·	ti !	coiitra—= e nos micélios.
Cd	CH ii m -i η ι_·. i:nj.	r ec u p & r a c ã o	eficien te	de	m o o._: ‘t -ν e ι e a 11 z a. d a ρι o r
ΓΠ tf i. O d '3	unia f i. I	t. r 5. ç ão ι η ι c i	a.l do mei.o	•8 V	im de separar o caldo da
m8.ssa mi	C Θ I i 8. 1	( a b i ο ι η a. s s a )

puut; _>e,· r Kuuperaoo oa oiomassa por meio oe urna série de técnicas. Uma técnica preferida envolve a lavagem da biomassa separada, com água a fim de reraover o restante caldo, mistura da biomassa com um solvente polar em que A83543 seia solúvel, por exemplo metanol ou acetona, separação e concentração do solvente, extracção do concentrado com u.m solvente não-polar e/ou adsorção num adsorvsnte ue gel de sílica de fase reversa tal como RF'--C8 ou RP-C18 ou u.m polímero altamente poroso tal como HP-20. etc.

material activo é sluido & partir do adsorvente com um solvente apropriado tal como, por exemplo, misturas de aceto— nitrilosmetanol contendo oeguenas quantidades de THF.

A83t»43 pode ser separado nos componentes individuais

A33543A, AS3543B, A83543C, AS3543D, AS3543E, A83543F, AS3543G,

A83543H, ε AS3543J e pseudoag 1. icona de A83543A por meio de processos semelhantes. Um processo de separação preferido envolve cromatografia em gel de sílica CC,_O ou C,^) de fase reversa.

ser

Alternativamente, os sólidos da cultura, constituintes do meio e micêlio, podem ser usados sem ou separação, mas de preferência após remoção de água fonte de A83543. Por exemplo, após produção de A83543, i n c 1 u i n d o extracção como uma a t o t a 1 i dade do caldo de fermentação pode ser seca por 1iofi1ização, por secagem em tambor, ou por destilação azeotrópica e secagem. 0 caldo seco pode então ser utilizado directamente, por exemplo misturando-o directamente na pré-mistura fornecida.

Ac tiv i d ad ε ia e

Acaricida

Os; compostos deste invento são úteis para o controlo de insectos e de ácaros. 0 presente invento dirige-se, assim, a métodos para a inibição de insectos ou ácaros que compreendem a aplicação ao local do insecto ou do ácaro de uma quantidade inibidora do insecto ou ácaro de um composto de A83543.

Os compostos de A93543 revelam actividade contra um certo número de insectos e ds ácaros, nais especificamente, os compostos revelam actividade contra o verme do exército do Sul, o qual e um membro da ordem Lepidoptera dos insectos. Outros membros típicos desta ordem são a traça da maçã, vermes em cunha, traças das roupas, traça da farinha Indiana, enroladores das folhas, verme da espiga do milho, verme do casulo do algodão, furador do milho Europeu, verme das couves importadas, lagarta da couve, verme do casulo púrpura, vermes dos úberes, lagarta da tenda de campanha do tste, verme da teia de aranha da relva, e verme do exército do Outono;

Os compostos também revelam actividade contra o afídio do algodão, o qual é um membro da ordem Homoptera dos insectos. Outros membros da ordem Homoptera. incluem pulgas das folhas, pulgas das plantas, psila da pereira, agarrador da macieira, insectos escamosos, traças brancas e pulgões cuspideiros, assim como um certo número de outras espécies de afídeos específicos dos h ospede i r os.

Além disso, os compostos de A33543 revelam actividade contra, moscas dos estábulos, moscas varejeiras e mosquitos, os quais são membros da ordem Diptera dos insectos. Um outro membro típico desta ordem é a vulgar mosca doméstica.

	Os compostos de A83543 são	iiteis	par	a a	reduç ão	das
populações	de insectos e de ácaros, e s	ão usa	COS	num	método	para
a inibição	da população ds insectos ou	de áca	ros	que	consiste	na

aplicação a um local do insecto ou do ácaro de uma quantidade? ina·:tivadcra c5í:j insecto ou do ácaro eficaz de um composto de A33543.

loual dos insectos ou dos ácaros refere-se ao meio ambiente no qual os insectos ou ácaros vivem ou onde os seus ovos estáo presentes, mcluinoo o ar qus os circunda, os alimentos que comem, ou objectos com as quais entram em contacto. Por exemplo, ccs insectos ou ácaros que ingerem plantas podam ser controlados pela, aplicação do composto activo às partes da planta que são comidas ou habitadas pelos; insectos ou ácaros, particularmente a foihagem.

Considera—se que os comdostos possam também ser ú.tei' ad1 içando um composto activo a essas substâncias.

h expressão inibiçáo ds um msecro ou acaro” retere-se a uma diminuição no número de insectos ou. ácaros vivos ou. a uma diminuição no número de insectos viáveis ou ds ovos de ácaros- A e;; tensão da r e d u ç ã o r e a. 11 z a d a. ρ n i_i m compo s t. o d e o e n de, e v i d e n t e — mente, da taxa de aplicação do composto, do composto particular utilizado, e das espécies deinsectos ou. ácaros alvos. Pela menos deve ssr usada uma quantidade inactivadora do insecto ou inactiv a d o r a d o á c a r o.

As expressões quantidade inactivadora do insecto e quantidade inactivadora do ácaro são usadas para descrever a quantidade que é suficiente para causar uma redução mensurável na população de insectos ou. ácaros tratados. Geralmente è usada uma quantidade variando

000 j:n uU

0,01 a 1 kg/ha> de composto activo.

Numa apresei ι ta,ão preferida, o presente invento e dirigido a um método para a inibição de um insecto susceptível da ordem lepidoptera que compreende a aplicação a uma planta de uma quantidade inactivadora do insecto eficaz de um composto de

Atíociw de acordo cem o

Uma uutra apresentação preferida do invento é em animais que consiste na administração de uma quantidade inibidora da praga eficaz de um composto de A83543 oralmente ou p a r e n t é r i c am e n t e a α a n i m a 1 .

d i r i. g i ci a uz.pt a* r a

Ti n.-F

Tufcuii actividade acaricida e insecticida na écaros/insectos.

.or» ι j i 'ui u». à*.l ’ - ϊ.ί x· LA £*.

ite filtro oar

Cada composto do testa foi formulado dissolvendo o composto nume misturai ds acetona/aicool (1:1 ? comendo Cc* g de Toximul R (mistura su. 1 fona to/emu 1 si f icador não iónico) e 13 q ds Toxiiiiul 3 ⁿ ( ns i s tura de sul tonato/emulsif icador nao iónico) por litro. Estas misturas foram então diluídas com áqu.a para dar ori.qem as concentrações indicadas.

Ácaros de aracnídeos- com duas ma.nchas (Tetranvc hus u.rticae do aigodã u e do melão ( Αμί iis qussyμ 11 Slover) for a m i n t r o d u z i d o s em c o t i 1 e d o nes de a b ó b o r a e f o r a m d e i :< a d o s estabelecer-se em ambas as superfícies das folhas. Outras plantas no mesmo vaso de tratamento foram deixadas não infestadas. As folhas foram então pulverizadas com 5 mL da solução do teste usando um pulverizador de ato,mizacão DeVilbiss- a lé psi. Ambas as superfícies das foi nas foram, cobertas ate escoamento sendo então deixadas secar duranrte uma hera. Duas folhas não infestadas foram então excisadas e colocadas numa placa de Petri contendo verme do exército do Sul (5ρod o oter a eridania. Cramer).

ι Sec tus âdlLluiidiS fui' uifi âVallâdOis Usâlldu f (j Γ íT.U 1 cíÇoOSi o p r o c e s s o s d e a v a. 1 i a c ã. o s e m e 1 h a n t t c o m a s e x c e ρ c o e s ι η α i c a o a. s .

de percentual. Us resultados são eferidos nos quadros infra. São

Τ ermo y·⁷

BW

CA

CHW

CLH

CRW

SAW

SM

Insecto/Ácaro gorgulho do casulo •afídio d o a I g od ã o verme do casulo algodão pulga da folha de milho verme da raiz do milho do Sul verme do exército do Sul Ácaro da aranha com duas manchas

Nome Científico

Arithonomus qrandis A o h i s possyo i i Heiiothis zea Da 1bu1us inaidis

Diabrotica undecimpunctata hotvardi

Sg.0d0pt.ej2a o r i. d an ia

Tetranvchus urticae

Quadro X sctividadí

Lar

TRW decem—n asc iaas

Tratamento	Dias3	Taxa(ppm)	% inibição
TopicoC	1	1.00	20.00
		5.00	100.00
		10.00	100.00
		50.00	100.00
		100.00	100.00
Dietc?	4	1.00	30.00
		5.00	100.00
		10.00	100.00
		50.00	100.00
		100.00	100.00
Ovos	6	10.00	0.00
		50.00	0.00
		100.00	30.00

Uuadro X(continuacSc)ί Ac t ivi d a de de A35545 Lontra

Larvas CBW Recém-nascidas

Tr a t amen to Dia_s

Tópico 1

Taxa (ppm) . ... - b % mibiçao

Dieta

Média dí deixada secar e infestada ⁷ <·': tópicamenrie tratari

0.50	10.00
1.00	40.00
5.00	80.00
10.00	100.00
50.00	100.00
100.00	70.00
0.50	15.00
1.00	45.00
5.00	100.00
10.00	100.00
50.00	100.00
•atamento e a	observaç!
?= testados
-3 formulado
.cie ccsm Atí3i?	43A,
c ο (η A 8 3 ri; 4 3 A	s nantid;

OVOS ris controlo serem completaraente incubados

ι.

Quadro Xis Percentacem do Controlo das Larvas	CBN
1

2 Componente				PPM
0.5	1		5		10
A	55 (d)	100	(a)	100	(a)	100	(a)
B	35 (e)	80	(c)	100	(a)	100	(a)
C	5 (g)	85	(bc)	93	(bc)	100	(a)
D	58 (d)	90	(ac)	100	(a)	100	(a)
E	28 (ef)	58	(d)	100	(a)	100	(a)
F	0 (g)	0	(g)	0	(g)	95	(ab)
G	0 (g)	0	(g)	20	(f)	80	(c)
	com a mesma.	1 s t r	a enti	re oa.ren			eme i

'_> íTS u ι ι ί V e 1 ) Método da pipeta tópica com 20 larv replicativos;

um dia entre o tratamento e a obser t?

ρ ς. ή rpy-.-j -J-	Oi as3	Taxa (pPm)	7 Inibição
Recém-nas-	Folhagem/	3	1.00	10.00
eido	Bushbeanc		5.00	40.00
			10.00	100.00
			50.00	100.00
			100.00	100.00
Recem-nas-	m · Topico	3	1.00	0.00
eido			5.00	60.00
			10.00	100.00
			50.00	100.00
			100.00	100.00
Recem-nas-	Folhagem	4	0.50	0.00
eido	Bushbean e		1.00	66.67
			5.00	100.00
			10.00	100.00
			50.00	100.00
Segundo	Tópico	1	1.00	0.00
Estádio			5.00	0.00
			10.00	0.00
			50.00	80.00
			100.00	100.00
Segundo	- . d Topico	4	1.00	0.00
Estádio			5.00	0.00
			10.00	80.00
			50.00	80.00
			100.00	100.00
Terceiro	Topico	2	1.00	0.00
Estádio			5.00	0.00
			10.00	13.33
			50.00	73.33
Terceiro	Folhagem	4	0.50	0.00
Estádio	Bushbean		1.00	0.00
			5.00	40.00
			10.00	100.00
			50.00	100.00

Iji i :on tinuac ;O í

£s.táriio Tratamento Dias³ Taxa (ppm). % inibição

2	10.00	0.00
	50.00	0.00
4	10.00	0.00
	50.00	0.00
3 Dias entre tratamento	e observação
b Média de replicações	testadas

^c Uma replicação ^d Duas replicações ⁶ Três replicações f Tratado topicamente com 1 ml de A83543A formulada

Quacíro XI

Contra BW

Tratamento

Taxa (ppm)

1.00 5.00

10.00

50.00

100.0 % Inibição³

0.00 20.00 20.00

100.00 100.00

Uma replicativa; observada 3 dias após tratam

A 835*43 Formulado (1 mL) vertido sobre insecto dul t numa μ

d ri ,“7

tstufa-i

Contra Vã.ris trsoss de? Colheitas

Colheita Praga

Taxa (ppm)

Inibição

Milho CRW 30

7.5

3.75

100

Massa SAW 250 comprida 125

62.5

31.25

15.63

7.8

3.9

1.9

100

100

100

Massa SM 250

Comprida 125

62.5 31.25

Massa CA

Comprida

100

Milho CLH 200

100

Ramagem SAW

100

12.5

100

Ramagem

SM 100

25

12.5 6.25

100

Quadro XIV (continuação); Actividade de A85b43A em nu

Colheita	Praga CA	Taxa (ppm) 100 50 25	Inibição a Θ0 40 0
Milho	CRW	6	30
		3	0

vasos ao ar livre contra, o verme d ilo do Sul

Quadre? XV: Lficácia do A83543 Contr;	a Snodootera eridsnis
	en t	estes com	Vasos ao	Livre
			Dias após Tratamento
	Taxa
Tratamento	ÍPPrc)	1	5	7	14
A83543A	63	100	88	90	5
A83543A	125	100	88	95	90
A83543A	250	100	95	100	100
A83543A	500	100	100	100	100
metomil	63	100	20	15	0
metomil	125	100	35	40	20
metomil	250	100	85	45	40
metomil	500	100	90	85	60
Nenhum	0	0	0	0	0
Nenhum	0	0	0	0	0

Resultados indicados como % mortalidade

Quadro XVI resume as CL 5Θ, as concentrações letais com- as. quais o composto ds: teste inibe õOX. do insâctã ou ácaro do teste, apresentadas pelo AS3543 em comparação com as apresentadas pelo insecticida metomil conhecido.

buadro XVI; U bõ	para AQ3b43”
	LC	50 (PPm)
Alvo	A83543	metomi1
CRW	15	6
Apídio de cereal	>250 150	5.4 71.4
SAW/Folhagem	1.3	11.4
CBW/Contacto	0.6	14.5

Taxa do verme da raiz do milho sm solo sm peso; todos as outras como côncentração da pulverização.

Os componentes ds A83543 foram activos contra as larvas do mosquito da febre amarela (Aedes aeqyd11. ) em testes larvicidss padrao do mosquito ιr; ν1 tr o, Lis Quadros XVII e XVIII resumem a actividade cios comoonentes nestes tostes.

Gy.adro XVII; Actividade In Vitro ds AS55435 s ds

A83‘o43C Contra Larvas do Mosquito d e P r .ime ir o E s t a d i g

Componente

A35545

A

B

C

Concentração Inibidora LÍÍíli na__L'!t3sLÁ!d.L2Ít

0,,016. 0,,031° 0,016 ··--, 031

Cunueiitração mais baixa que revelou lOOli ds m.ibiçãc após /4 horas ( s-íi; nl. a b - , , .

lestes em doi s ds rnicroti tu lação > 1 :··^;. ss

Uuadrc? XVIII; Actividade dos Componentes de AS3o43 vs.

Larvas de Mosquito de Quarto Estádio

Controlo Percentual¹*

Comoorier? te

A

D

C

D

AO y

As 24 horas quando tratado a 0,312 ppm ° F; e s li 11 a d o s de d o i s t e s tes

Ensaies nc Lango

AB3o4iA foi avaliado em ensaios no campo. Nestes ensaios, AS3543A revelou actividade contra o verme da couve importada e lagarta da couve sobre rebentos de bróculos e contra usa mistura de lagartas da soja (757 5 e verme do exército do Outono Í25X) sobre a soja.

Composições Insec tic. id as

Oss compostos deste invento são aplicados sob a forma de composições, as quais também fazem parte deste invento. Estas composições compreendem uma quantidade inactivadora dos insectos ou, dos acares de um composto de AL3P43 e um veículo inerte ϊ i tológicamente aceitável,, Π componente activo, isto é o composto AU3543,, pode estar presente como 1) un simples componente de Au .io43, 2) uma mistura de dois ou mais componentes, 3) a mistura A83543 separada ou 45 A33543 em conjunto com a porção seca do

C a 1 u O d e meio de fermentação no qual é produzido, isto é o fermentação seco, bruto.

As composições cu são formuiaçSas concentradas que são dispersas em água para aplicação, ou. são formulações sob a forma de poeira ou de grânulos que são aplicadas sem posterior trataraento.

As composições são preparadas de acordo com processos e fórmulas que são convencionais na técnica qúimica agrícola, mas que são novas e importantes devido à presença ds um ou mais c o m ρ o s t o s d e s t e i n v en t o .

As dispersSss em que os compostos ou material seco crú são aplicados são muito frequ.entemente suspensões ou emulsões aquosas preparadas a partir de formulações concentradas dos compostos ou r,ia teria 1 crú.. Essas f ormu 1 açSes so 1 úvei s na â.qua , que se podem suspender ou emu 1 si f cc ar ria aqu. a sao ou sólidos < li s u. a 1 m e n t e c o n h e c i d o s c o m ο ρ 6 s h u m i d i f i c á v e i s ) o u líquidos íusualmente conhecidos como concentrados emulsificáveis ou suspensões aquosas).

0;

nós humidificavei s, que podem ser comprimidos a

T i ÍH uma de de formarem grânulos dispersíveis na água, compreendem mistura íntima do composto activo, de um veículo inerte e surfactantes. A concentração do composto activo varia usualmente entre cerca de 13, de preferância 133, a cerca de 933 em peso. 0 veículo inerte έ usualmente escolhido de entre argilas atapulqite, argilas montmcri1onite, terras diatomáceas, ou os silicatos puri ficados.

ourfaotantes efccaces, compreendendo de cerca cerca de 133 do pó humidificável, são encontrados entre de iqn inas

su 1 f onatadas, os naf talenessul fonatos condensados , os naf talenes·— e su.rfactantes não iónicos tais como aciuctos de 6;; ido de etileno

Concentrados emulsi ficáveis dos compostos . _ A. _ 1 . U _? <=·. 1 U 51 ί 1 a cerca de 500 qramas por litro de líquido, equivalente a. cerca de 10» a cerca de Si*’», dissolvidos num veiculo inerte que è ou. um solvente miscível na éoua ou uma mistura de solvente orgânico náo miscível com a áqua e emulsificadores.

Solventes orgânicos úteis incluem produtos aromáticos, especialmente xilenos, e fraoçcíes do petróleo, especialmente as porçSes naftalénica e olefínica de eleva.dc' ponto de ebulição tais como nafta aromática pesada. Podem também sar usados outros solventes orgânicos, tais como os solventes terpénicos incluindo derivados da rosina, cetonas alifáti.cas tais como ciclohexanona, e a 1 c: o o i s c o m ρ 1 e χ o s t a i s c o m o 2—e t o x i e t a η o 1 .

Emu 1 -=i f içado res apropriados para concentradas emulsi.fioáveis são escolhidos a partir de surfactantes não iónicos convencionais, tais como os mencionados a π tsri ormen te .

As suspensões aquosas compreendem suscensSes de compostos insolúveis na água deste invento, dispersos num vaículo aquoso numa concentração variando entre cerca de 52. e cerca de otí/. em são preparavas por meio de moagem fina do compostos, e mistura viqorosa num veiculo consistindo em áqua s surfactantes escolhidos de entre os mesmos tipos discutidos anteriormente. Ingredientes inertes, tais como sais inorqãnicos e gomas sintéticas ou naturais, podem também ser adicionados a fim de aumentar a densidade e viscosidade do veículo aquoso. É

freauentemente mais efic t e cn ρ ο ρ r e ρ a r ando a m 1 s-1 u to tal como moinho de ar moer & misturar o compostos ao mesmo aquosa s hoísogsriisando-a num implemen, moinho de bolas, ou homoqenizador cio

Qs compostos podem também ser aplicados sob a. forma de l_ οίΤιμοΐ granulares, que são particularmente uteis para aplicações ao solo. As composições oranulares contêm usualmente de cerca de $, 5% a cerca da 10% em pesa uo composta, disperso num veículo inerte que consiste inteiramente ou em grande parte em argila ou numa substância barata semelhante.

Essas composiçoes são usual mente precara o composto num solvente apropriado e aplicando-o granular que tenha sido pré-formado com um tamanho apropriado, variando entre cerca de O,5 e 3 mm. Es podem também ser formuladas fazendo uma massa ou veículo e composto, e esmagando e secando a T tamanho de partículas granulares desejado.

H	dissolvendo
a	um veículo
de	particu 1 as
sas	c o mρo sicSes

uma pasta do i ;Ti dê O b uic? i o

Poeiras contendo os compostos são preparadas simplesmente misturando ίntimamente o composto sob uma forma em pó com um veículo agrícola apropriadamente poeirento, tal como .argila caolino, rocha vulcânica moida, etc. As poeiras podem apropriadamente conter de cerca de 13 a cerca de 10% do composto.

é igualmente prátic: razão, aplicar o composto sob o r g η i c o a p r ό o r i a d o , u. s u a 1 m en tf como os óleos para pulverizaçãc d o s n a q u imi c a a. q r í c o 1 a .

q u a n d o d e s e j ά v e 1 por qualquer torma de uma solução num solvente um óleo de petróleo suave, tal os quais são amp 1 araente utili.caIssecticidas e acáricidas são geralmente aplicados sob a forma de uma dispersão do ingrediente activo num veículo líquido, é convencional referir as taxas de aplicação em termos ds concentração do ingrediente activo no veículo. □ veículo mais a m ρ 1 amen t e u s a d o é a á. q u. a.

□s compostos do invento podem também ser aplicados sob a forma de uma composição aerosol· Nessas composições o composto activo é dissolvido ou disperso num veículo inerte, o qual é uma m i s t u r a ρ r ο ρ u 1 s o r a g e r a d o r a d ε ρ r e s s '3 o . A c o m ρ o s i ç ã o a e r o s α 1 é embalada num recipiente a partir do qual a mistura é fornecida através de uma valvula do atomização. As misturas propulsoras compreendem ou halocarbonetos com baixo ponto de ebulição, os quais podem ser misturados com solventes orgânicos, ou suspensões aquosas pressurizadas com gases inertes ou hidrocarbonatos gasosos.

A quantidade real do composto a ser aplicada aos locais de insectos e de ácaros não é de importância crítica e pode ser determinada rápidamente pelos especialistas nesta técnica tendo em vista os exemplos proporcionados. En» oeral, espera—se que concentrações ds lt ppm a 5,GOA ppm dm composto proporcionem um bom controlo. Com muitos dos compostos, serão suficientes concentrações de iyy a l.yyõ ppm. Para as colheitas dos campos, tais como soja e algodão, uma taxa de aplicação apropriada para os compostos varia entre cerca ds G,, G1 e í kg/ha., típicamente aplicada em 5-50 gal/A de formulação em spray.

sj local ao qual um composto é aplicado pode ser qualquer local habitado por um insecto ou ácaro, por exemplo, colheitas de legumes,, frutos e nogueiras, virhas e plantas ornamen tai s,

Devido à resistirem à acção veis para o contro1 c a ρ a c i d a d e ú π i c a d o s o v o s d o s a c a r o s par a tóxica, aplicações repetidas podem ser desejão de larvas recentemente emergidas, tal como acontece com outros acaricidas conhecidos,

J_ · . Ç -J _ _J f— _ J___

í. 1 V 1 ;1 -zd!. j tx‘ i L. LU t

Ch=- cuíiipoí-tu^ AB3D43 s-3.o tambôm activos contra membros los insectos da ordem Diptera.

Os Ou.adros XIX A33543A e AO3O43D» — XXI resumem estudos in vitro com

} ~~ o f ί Π v 11 i' u d s H C 3 ·. 4 3 A

Contra Larvas

ΙΊΟ a ν .5 r o j e i r a N s o r a

Nível da Dose (ppm)	Actividade
100	100
50	100
25	100
10	100
5	100
2	100
1	95
0.5	60
0.25	25

Actividade % mortalidade

Quadro XX; Eficácia In vitro dt rnr.fr a Mncr= H

Nível da Dose (PP^)

Actividade^J 24 horas

Actividade 48 horas

100	100	100
50	100	100
25	100	100
10	100	90
5	80	100
2	70	90
1	10	60
0.5	0	10

'Actividade = % mortalidade

Qua d ro tficácia in

'itrc u£

Α83543Λ _ _A83543D

ppm	ASF	LBF	ASF	LBF
24 hr	48 hr	24 hr	48 hr	24 hr	48 hr	24 hr	48 hr
10	80	100	100	100	50	100	100	100
5	50	100	100	100	20	90	90	100
2.5	30	100	100	100	20	100	90	100
1.25	20	100	100	100	10	90	80	90
0.625	0	70	60	90	0	60	50	75
0.312	0	50	25	50	0	0	25	25

^Morta1 idade cercsntual dos insectos a. pós 24 a 48 huras. txpusi ção in vitro a amostras de soro adicionadas quimicamente.

V ” r-- mosca -dul -- <λ -ΐ o l-sLuí o

L.BF- larvas da mosca varejeira /ύΛ.

Nos tes te-s in vivo, actividade insecticida sistémica em cobaias e carneiros contra as larvas da mosca varejeira e contra a mosca adulta da estábulo sem quaisquer sinais óbvios de toxicidade. Compostos representativos AS3543A e A83543D foram ensaiados em laboratório e em animais alvo a fim de determinar o Smbito da actividade. Os· testes que se ) v- i_ e i i ij u => t o = A 8 3 ó 43 r e v e 1 a í· a ,τi sequem au . UStr ;isiámic o n a Uobaia

SSo utilizadas cobaias adultas neste teste sistémico. O s c o m ρ o s tos a se rem tes t ad os s ão d ϊ sso1v idos em p i r r o1i d on a polivinílica aquosa ou em polietilene glicol 200, e uma quantidapLJ i 1. Li i 'tldd 'J X X de apropriada da solução é administrada, quer oralmente quer injecção intraperitoneal. Sá o usadas várias doses do comp tal somo é indicado a. seguir nos quadros infra.

por saiiyue é re tirado das cobaias aos ou minutos excepto quando indicado de outro modo, e as amostras de sanque são centrifugadas. Fios dentais são saturados cora o soro sanguíneo, sendo então expostos em placas de Petri às moscas adultas de ι o u ι o ; a s 1 a r v as’ teste. Após 24 e 48 noras, os insectos sã· o numero cie mortes. Os resultados dos tes a percentagem de insectos nug são mortos.

, e conta-se j I ç:. Γ £□ f; ro uti1i zando _ '_J Li ’_í ·_! U

Cobaia. 0 composta do teste é Í Π t V 3.09 Γ Í tl O n t? 3.1 O Li Í Π t Γ 3. V Ε· Γι O S 3.

aImente; as

Os resultados dos testes sistémicos com cobaias e com carneiros usando A83'o43A e A93543D são resumidos nos Quadros XaII-XXV,

AU3543A não revelou actividade antihelmíntica em carneiros, tratados por meio de uma única dose in traperi tonea. 1 ou intraruiTiin;

mg/k

5U ratinhos infectados e>; per imen ta 1 men te oom o n em â todo intestinal 14 e m a t o s p i r o i d e s ciuoi us ãO.Tiin 1 S’

-ari:

Oo oralmente pur aieiu uma única introdução no estomaqo de 50Θ mg/kq

Sistémico em.Cobaias

Sistémico em Carneiro

mg/kg	LBF	ASF	Tox	mg/kg	LBF	ASF	Tox
10 (IP)	0	0	N	10 (IP)	0	0	N
20 (IP)	0	0	N	10 (IR,	0	0	N
30 (IP)	90	50	N	30 (IP)	80	0	N
50 (IP)	100	100	N	30 (IR)	100	30	N
50 (OR)	100	60*	N	50 (IP)	20	30	N
				50 (IR)	100	70	N
				2 X 25 (IR)	100	90	N
				1.0 (IV)	25	10	N
* amostra de	sangue de	5-hr ;	não se retirou	amostra aos 30	min.

^aActividade medida como % mortalidade IP = Intrapentonea1

ASF = mosca do estábulo adulta IR = Intraruminal

LBF = Larvas da mosca varegeira IV = Intravenoso

Tox = Toxicidade para o animal hospedeiro OR = Oral (N = Nenhum)

Quadro XXIII

Ac f. r v i d a d s* I π spr ? Atí3z

icida bistémica. de A D em Cobaias

A83543A A83543D

Dosp	Tempo sanaria	% Actividade	% LBF	Actividade ASF
(mg/kg)	Via
LBF	ASF
10	IP	30 min	0	0	0	0
		5 hr	0	0	0	0
		24 hr	0	0	0	10
20	IP	30 min	0	0
		5 hr	0	0
		24 hr	0	0
30	IP	30 min	90	50	0	0
		5 hr	50	0	0	0
		24 hr	30	0	0	0
50	IP	30 min	100	100	75	0
		5 hr	95	40	0	0
		24 hr	25	30	25	0
50	Oral	5 hr	100	60		*
		24 hr	0	0

LBF = L arvas da mosca varejeira ASF - Mosca do estábulo adulta

IP = Intrapentoneal

Quadro XXIV: tnsaio Insecticida de AS3543A no banque

U arriei ro _ « μυ·=·χç cuj □© horas in. vitro de Insectos a Amostras de Soro C o 1 h i d o a p a r t i r d o C a r n e i r o '^A

b Tratamento	Peso Inicial (kg)	Dia I.	0 Λ	35 L	min A	5 hr	Dia i	Dia 2	Dia 3	Dia L	4 A	Dia L	5 A
L	A	L	A
L	A	L	A
50x1 (IP)	38.6	0	0	0	0	10	0	10	0	20	10	20	0	10	10	10	0
50x3 (IR)	31.8	0	0	0	10	40	10	90	0	90	20	80	0	40	0	20	0
25x2 (IR)	34.1	0	0	0	20	25	10	100	10	90	20	90	0	60	0	50	0
1x1 (IV)	25.9	0	0	25	10	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Veículo Controlo	44.5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Não tratado	30.9	0	0	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0

^aL = Larva mosca varejeira A - Mosca do estábulo adulta

IP = Intraperitoneal

IR = Intraruminal

IV

Intravenosa

Quadro aXV: tnsaiu Inset. ticida de AS3543 no Sanque de Ca rpm i r n Submetido a Haemonchus contartiís - Exposição de- 4S horas in vitro de Insectos a Amostras ds Soro Colhido a partir do Carneiro¹* c

Percentagem Mortalidade Insecticida

Tratamento	Peso Inicial (kg)	L	0 Λ	35 L	min A	5 L	hr A	L	1 A	L	2 A	L	__3 A	L	6 A	L	5 A
50x1 (IP)	38.6	0	20	10	0	10	10	10	0	20	30	20	10	20	20	25	0
50x1 (IR)	31.8	0	0	0	10	75	30	100	60	100	70	100	20	60	20	25	0
25x2 (IR)	36.1	0	10	0	30	50	10	100	90	100	90	100	70	<10	30	75	30
lxl (IV)	25.9	0	0	25	10	10	20	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Veículo	66.5	0	10	0	0	0	20	0	10	0	0	0	20	0	0	0	0
Controlo
Não tratado	30.9	0	60	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0

a,

L = Larva mosca varejeira Λ = Mosca de estábulo adulta

IP = Intraperitoneal

IR = Intraruminal

IV = Intravenoso

Quantidade(mg/kg) vez e número de doses administradas Tempos pós-administração aos quais o sangue é colhido

Nos testes in vitro contra o nemátodo intestinal do carneiro Haemonchus con ter tus, AB3543A matou 3Õ% dos vermes com lí m a c ο π c e n t r a ç S o d e 1Ô ô ρ ρ m .

Métodos Ectoparasiticidas

Este invento também se relaciona, assim, com um método para o controlo de uma população de insectos. ectoparasitas que consomem sangue de um animal hospedeiro que consiste em administrar ao animal hospedeiro uma quantidade eficaz de u.m composto A S3543. 0 s i. n se c t o s e c t ο ρ a r a s i. t a s i n c 1 u e m ρ a r a s i t a s i n s e o t. o s e acarina. A administração ao animal pode ser feita pelas vias dermica, oral ou parentérica.

Os insectos e acarina parasitários incluem espécies que sugam o sangue assim como espécies que comem a carne e são parasitários durante todo o seu ciclo de vida ou apenas durante u.ma parte do seu ciclo de vida., apenas no seu. estadia larvar ou apenas no seu. estádio adulto. Espécies representativas incluem as seguintes:

rn o s c a d o c a v a 1 o	7 a b a n u. s s ρ ρ ,
mosca do estábulo	-35 L· -_J i i i ϊ_ΐ >; pp. -ol 1 1. f d f~( ‘“5
mosca negra	Simulium spp
piolho que suga o cavala	Haematooinus asini
ácaro da pele suja	Barcootes scebiei
3ΐ·_ 3 !' '-~J 0 3.	Psoroptes squi
mosca do chifre	Haematobia irritans
p I u i Η O U 3* ρ ϋ. O 3. O Q -3 Ci O	Bovicola bovís
piolho do gado de nariz curto	Haematooinus eurvsternus
piolho da cada de nariz comprido	L. i η o g n a t h u s v i t u 1 i
mosca tséts-é	G1ossina spp.
A. C 3. Γ O d O 5 f O 1 i. C U 1 Ο Ξ d O -2 j 3, d O	DeíRcde:·: bovis

carrapato	do	gado	Boochiius microplus
B. decoloratus-
carrapato	da	Costa do Golfo	Amblyomma maculatum
carrapato	do	Estado do Texas	Amblvomma americanum
carrapato	d a	ore 1 ha.	Otobius meqnini
carrapato	da	madeira

das Montanhas Rochosas

Dermacen tor andersoni mosca das partes quentes da AiTiér ica percevejo assassino ffiosquito carrapato da orelha castanho c a r r a p a t o v e r m e 1 η o A tri c a η o carrapato Africano carrapato com pernas Africano

Cooh 1 ienvia hominivorax Redu vílís spp.

Cu 1 í.seta inornatacarrapato d Rhipicephalus appendiculatus Rhipicephalus evertsi Amb 1 '/orna sρ .

Hya 1o mm a sρ.

pio 1ho	do	porco	H a e m a t o p i n u s s u i s
tunga			Tunqa penetrans
pio 1ho	do	r η} -- p q	H a e m a t o p i n u s o v i 11 u s
piolho	do	pé	Linoqnathus pedal is
mosca s	-em	asas do gado	Meloohaous ovinus

ácaro da sarna dos carnsiros «tosca verde brilhante mosca varejeira neqra mosca das partes quentes u -'ί i tt é ri z a s e o a n d a r i. a ocucó varejeira do qado percevejo da cama pulga da galinha do Sui carrapato das aves de capoeira

Fsoroptes Azútá

Rhasn ic i a seric a t a νοητόν 223.1102.

Cochliomyia mace11aria Phaen ic ia cttp r i na C i. me l_eçtul_ a r :i. u s Echidnophaqa oal 1 inace. Arqas sersicus

	das galinhas	Dermanvssus. qallinae
ácaro	da criação	r:á 5 Z: 1 d O k i j C t es CL ί 13Π S
ácaro	Q Ll tf J. tc' V -õf ci Ϊ··Β. E'dc< ΟΈ ϋίΞ'Π ΞίΉ-	knem.idokootes o a 1 I inae
acaro	dos folículos do cão	Denodev canis

pulga do cão carrapato do cão Americano carrapato castanho do cão

Ctenoceqhalis canis Dermacer;tor variabi1 is· Rhip icepha1us sanguinéus método do invento pode ser usado para a. protecção de animais da economia e domésticos em relação aos parasitas. Por exemplo, os compostos podem benéficamente ser administrados a cavalos, gado, carneiros, porcos, cabras, cães, etc., assim corno a animais exóticos tais como camelos, lamas, veados e a outras espécies que são habitualmente mencionadas como animais selvagens. Os compostos podem também ser benéficamente administrados a criação e a. outras aves, tais como perús, galinhas, patos, etc. De preferência, o método é aplicado a animais da economia, e com a maior preferência ao gado vacum e

A taxa, horário, e modo de aplicação eficaz variarão amplamente de acordo com a identidade do parasita, o grau de ataque parasiticida, e outros factores. As aplicações podem ser f e i t a. s ρ eri ó d i c a m e n t e ro, ou apenas durante Em geral, α controlo tópica, de formulações 95,õp, do composto, de durante todo o período de vida do hospedeiuma estação de pico do ataque parasítico.

dos ectoparasitas líquidas contendo preferência até 5/1, obtem-se com aplicação de cerca de O,ãããã5 a e com a maior preferência até uerca de l“í do composto. 0 controlo eficaz dos parasitas é alcançado com taxas de administração que variam entre cerca de s cerca de IÃO mg/kg„

Os compostos são aplicados aos animais hospedeiros por meio de práticas veterinárias convencionais. Lísua 1 men te,, os compostos são formulados em composições ectoparasiticidas que compreendem um composto e um veículo fisiolóqicaments aceitável, Por exemplo, composições líquidas podem ser simplesmente pulverizadas sobre os animais rios quais se deseja obter um controlo ectoparas!ticida. Os animais podem também tratar-se por meia de dispositivos tais como pneumáticos de dorso, que podem conter o composto tóxico num pano, por exemplo, os quais podem ir de encontro ao animal e contactar. São também utilizados tanques para mergulhar a fim de administrar o agente activo ao animal.

□s presentes compostos apresentam actividade ectoparasiticida sistémica. Os compostos tem a capacidade de permeação dos tecidos ds um animal hospedeiro ao qual um dos compostos foi administrado. Os parasitas insectos que consomem então sangue ou outros tecidos vivos do animal hospedeiro são assim mortos. Os compostos são administrados pelas vias dérmica, oral ou percutSn s a „

Este invento também se relaciona com composições ectoparasiticidas compreendendo um veículo inerte fisio1ógicamente aceitável e u.m composto AB3543. Estas composições podem ser preparadas pelos métodos conhecidos nesta técnica, por exemplo dissolvendo o composto num de muitos adjuvantes ou diluentes fisiológicamente aceitáveis. A administração oral pode ser realizada misturando o composto na ração animal ou na áqua para beber, ou. administrando formas de dosagem tais como comprimidos, cápsulas, bolus, ou implantes. A administração percutSnea é realizada convenientemente por injecção subcutânea, intreperitones! e intravenosa, de uma formulação injectável.

		Q s c o m ρ o s t o s ρ o d e m	ser-	formu1ados	para administração
V Γ Ei. 1	Sob	a s f o r m a. s u. s u a i s ,	ta i s	comο ρ o ç oes	, com o r i m i d os, ou
C et p S i-	ilas.	E s s a 'az o o i ι j p l j o e S ,	e v i d en t em e n t e ,	requerem veículos

inertes oralmente aceitáveis. Os compostos podem também ser formulados sob a forma de uma solução ou suspensão injectável, para injecção subcutânea, dérmica, intraruminal, intraperitoneal, intramuscular, ou. intravenosa. Nalgumas aplicações, os compostos

-ãu ι_ι_ιΠ Vt?i ι Iw ι teíTien te turmuladuS S-UIWO Um uoiiípo: ii'! 11& de Ltíiia f ação animal padrão. Nesta apresentação, é usual formular o presente invento primeiro como uma prémistura em que num líquido ou num veículo só lido em pode conter de cerca de 2 a 252 gramas d prémistura é por seu lado formulada na última, ração p>or meio d m i s t ii r -a c ο π v e n c ι o nal .

partículas. ft prémistura posto por libra. A

Como o ataque ectoparasítico tem lugar geralmente durante uma porção substancial do tempo de vida do animal hospedeiro, é preferível administrar os compostos, do presente invento sob uma forma que proporcione uma 1ibartacão contínua durante um certo período de tempo,. Processos convencionais incluem a utilização de uma matriz a qual inibe fisicamente a dissolução, onde a matriz é um semisólido cercso tal como ceras- veqetais ou um pol ieti leno q 1 ico i de e 1 eva.do peso mo 1 ecu lar. Uma boa maneo.ra para administrar os compostos· é por meio de u.m bolus de acção contínua, tais como os de Laby, Patente dos 2.U.A. No. 4.251.526, e Simpson, Patente Bntsmca No. 2.059.7Ó7. Para u.m tal bolus, o composto deverá ser encapsulado numa matriz polimérica tal camoa de Nevin, Patente dos E.U.A. No. 4.273.920, ft libertação contínua dos compostos do presente invento pode também ser realizada pela utilização ds u.m implante tal como uma borracha contendo silico—

A fim de ilustrar mais detalhadamente a ope ão proporcionados os exemplos que se seguem deste

Ί t

-L iJ

Método de tnsaio por CL iiiêtudu CL..EF' -3i t51 í t luO uUs s-s· 5eyUe é Útil psrs a mooitoricapão da fermentação para produção ds A83543:

Centrifugar Lima amostra do caldo total, decantar e remover o produto flutuante. Adicionar suficiente metano! è oiofflêS5a para tazer voltar a amostra ao seu volume original, misturar, e deixai·^- a mistura reooLísa.r um mínimo de quinze minutos. Centrifugar e filtrar o produto flutuante através de um f i 1t. r o d e õ ,45 u .

pode ser extraído com acetonitrilo (caldo:solvente 1:4) ou acetona

C o 1 Li n a d e 8 l< d o r ts: c o 1 u rs a. 8 -:

, ci^--! iioVc'1 ”, _,r:-ri-,,'·!/ risbr!/ n_ou * a c e t. a t o d ¢5 a ;η ó π i o .

Taxa de Fluxo: 4 mL/min Detecção: UV a coy nm Tempos de retenção: A83543A iõõ-mm , qel de síl f—: 4- — r-, I r—, Z.j'—.r-i i—.

JU LC'l Jj vJ <·_·* q rj _> , U LJ f rn i n m . ritrui

CQÍB

- -=t u ->=? Π) Γ 3 SL Ο Η O 1 l. 3 u u uuíTiu LHTi9 piiltid ílu a. o t ο I í q u i d o , è COiTi pôs 1. c A cu. escala):

•3 d tet £« cc1. t_ L_ 1~!	arc-ρο 1 vspo
ι ο ΐ i 1 i z a. d a	ou como
usada para	inocu1 ar
(o meio Ei	é preten

. ούτ'ο, quer tí meie vegetativo tendo e pretendo pare produção em grande ιάγΤ τη ι i r- ,—· r— τ· a -γ t i t — λ ι ι £l j. U v ir. bI m j ι v ϋ m

Inqrediente ij o de r r i pi Ex trac to de 1 evedu.ra MgSO,.7H^0

G1 u c o 5 s

Mal tose aq ulj esion i z a d a

Liuan tidade 3 „ Λ

4- v-r

Se,tí ajustamento do pH $ Baltimore Biological Laboratories

MEIO VEGETATIVO B .noreoií

Caseina hidrolisada oor

Mpbl.B, ^ZH,-,G Glucose li ti

ρΗ 6,2, ajustado para 6,5 com NaOH tNZ Amina A, Sheffield Products, F'.D. Box 638

Norwich, NY 13315

Planos inclinados ou placas podem ser preparados aicionando 2,53 de agar ao meio de sementeira vegetativo A ou B. □ plano inclinado inoculado é incubado a 30°C. durante cerca de lú a 14 dias. A cultura em plano inclinado madura é raspada com um utensílio estéril a fim de espalhar os esporos e remover e macerar o emaranhado micelial. Cerca de um quarto dos esporos e do crescimento em cultura assim obtido é usado para inocular 50 mL de um meio de sementeira vegetativo de primeiro estádio. A1 ternativamente, o meio de primeiro estádio pode ser inoculado a partir de u.ma ampola de azoto líquido.

Quando a cultura é mantida em azoto líquido, as ampolas são preparadas usando volumes iguais de cultura vegatativa (43-72 horas de incubação, 30''C> e meio de suspensão. 0 meio de suspensão contem lactose <ICO g), glicerol f220 mL) e água desionizada (q.b. para 1 L).

Usa· s u ma ampola de a z u t o 1 ί p u z. d o oe meio de meio durante vegetativo em frascos de trlenmeyer em frascos ds 258 mL>„ As culturas 43 hoars num agitador tendo a sua A para inocular IQy mL de 50õ n;L 50 mL são incubadas a 3€>*C rbita num círculo de duas pol ida ( 5 , dtí _ m ) β. 555 piii „ m o cl· lar

A cul. tura

10Õ mL de um incubada meio ds (inóculo 52 v/v> é usada oara produção tendo a composição que ss seque:

MEIO DE PRODUÇaO I

Ingrediente

GIucose

Proteína vegetal, parcialmante hidro1isada en2imáticamentef

Farinha ds sementes de algcdáoO CaCQ., íreagente ou qrau técnico) óleo de soja

Λ q u. a c o r r e r11 e ( pH de préesteri1izac^o ajustado para ~7 , 0 com NaOH) ÍSheftone H, Sheffield Products

SÍProflo, Traders Protein,

P.O. Box 3407, Memphis, TN 33108

O meio de produção inocul.

e incuosao em rrascos oe ti' 1 ei 1mS Ve f de 500 biL_ ¹J3, órbiÍLzt Πυ.ιΤι círculo d9 dU9S CC» i 9.d3.3 9. 250 rpil).

h firo de prcporcicria.r um nve.ior v« i -? 4 4 ,-,,- , A 9 d e i π ó c υ lo, 1 íTs L ακ meio de primeiro estádio incubado, preparado ta' são usados oara inocular 400 mL de um meio mesma composição que a do meio vegetativo de primeiro estádio, D meio de sequndo estádio é incubado num frasco de Erler.meyer de bocal amplo de 2 L durante cerca de 4tí horas a 30'''C. num agitador tendo a sua órbita num

U Φ C* 2. C- V >-7 ç t o t ί V C·- d C‘ ·“. <=> cu ί Π d O 4- zi . ncu C<3.d «uo e ij.sãuo oara iíiucui cr

produção estéril, preparado tal como é descrito na Secção A, Acrescenta-se óleo de soja adicional para controlar a formação de espuma, se necessário.

meio de produção inoculado é deixado fermentar num bioreactor agitado com 165 L durante 5 -a 8 dias a uma tempera tura de 28'^:'C. 0 fluxo do ar e a velocidade do agitador no recipiente agitado são controlados por computador a fim de manter um nível de oxigénio dissolvido a ou acima de 5C7„ de saturação de ar.

Isolamento de A83543A, 6, Seu caldo de fermentação (225 litros), preparado tal como toi descrito no Exemplo 2, foi filtrado usando um auxiliar de filtração (Hyflo 1 '4! , e a biomassa separada foi. lavada com água <^r'~' 50 L) . A biomassa foi então agitada com metanol C100 L) durante cerca de uma hora e filtrada.

filtrado de metanol foi concentrado até um volume de cerca de 1 litro, 0 concentrada foi extraido tr'ã's vezes coo éter dietílico (1 L cada.) , Ge extractos de éter combinados foram concentrados até um volume de cerca de 2õy mL..

Uma porção do concen trado (R imL) foi cromatograf ada n u ma coluna de gel. de silica ΐ Ε H—3 Lo ba r, tamanho 3 , t. M . Science, a Divisioo of Ε.M„ Industries, Inc,),

Este pzocsssa foi repetido num total de 12 veces

para realizar a cromatografia preparativa de um modo Autoprep ísuriLUi turno =s t-e-ju e:

Um sistema CL Et' Autoprep comoreende três bombas Rainin Rabbit HPX, um módulo de pressão, um colector de fracção de CLEP Modelo Gilson 20 IB, um detector de absorvencia ISCO-V** s u.m computador Apple Macintosh Plus. D sistema completo é organide acordo instruçoes dadas no manual uynamax HfuC

Method Manager da Kainin Instrument Company, Inc. A configuração _____ - “I l^— ΓΊ II Λ, . 1____u____ll - — _______ I___ . ___, x._____ _ _ ι .· . ue uutr MUuuprep ap:· esen ta a -··-s.n ._ay em de um sistema au toma C.l c α q u e p e r m i t e s e ρ a r a ç S e s ρr e ρ a r a t i v s. s par a s e r e m r e a lisa d a s d e u m modo repetitivo em condiçoes virtualmente idênticas com resultados vi *-tua 1 men te idênticos. A. recolha e a reunião das fraccões c o r re s ρ on d e ntes d s m u 111 ρ 1 o s c i c 1 o s ρ r ο ρ o r c ι o n a c a p ac i dade cromatográfica sem a necessidade de recorrer a uma coluna grande.

ode: isocrático com uma.

de f 1

Aj e (t·! são usadas de um d o 8 ,, O m L / min .

bistemas	----------- Quantidade	(ml)
Solvent e	A	B
CH30H	95	100
CH3CN	95	100
h2o	10	-

(J tempu de duração de cada, ciciu é de 2B,0 minutos. Os pi· udutui aluído·» doa 16 primeiras minutos de cada eliminadcs.Ds produtos de eluição seguintes são recolhidos em 6 fracçSes ds tempo, 2 minutos (ló mL) cada.

As fracções combinadas automáticamente de cada um das 12 ciclos resultaram em ó fracções tinais (cortes cromatográficos) .

A presença dos compostos activos de A83543 é determinada pela análise de cada fracção final em relação à actividade das larvas de mosquito s também por CLEP analítica.

As fracções activas são então combinadas de acordo com a sua actividade e com os perfis de CLEP e são posteriormente purificadas, u.sando a mesma CLEP Autoprep e o mesmo sistema solvente, mas com elevado poder de resolução, coluna preparativa

21,4 mm x 25 cm (Painin Dynamax), préembalada com gel de sílica de fase reversa C-13 8 μ, para dar origem aos componentes A, B, C e Eu Os Factores A e D cristalizam a partir de CH_,OH/H_nO.

□ PD—MS de A33543C ê indicado na figura 5; e ο ΕΑ3--Ή3 de A33543B é indicado na figura 9 dos desenhos.

EXEMPLO 4

Purificação de A35545A e D caldo de fermentação (IO L' foi preparado tal como foi descrito no Exemplo 2 Sect. A, exceptuando o facto de 1) serem usados 20Θ mL de meio de produção em frascos de 1 L; 2) ser omitido o óleo de soja no meio de produção; e 3) a incubação ser a 33° durante 4—6 dias. 0 caldo foi filtrado, 0 filtrado, contendo 4 mcg de A335-’3AZmL e sem quantidades dstectáveis de Α83Ξ43Β., C ou D/ínl , foi eliminado.

A biomassa foi lavada e extraída durante uma hora com metanol. (J extracto (7 L) continha 72' mcg ds h<b3543A/mL s 7 mcg de A83543D/mL.

extracto de metanol foi concentrado até um volume de 5 L, e adicionado a resina HP-20 ( 150 inL, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) sm água (2 L) .. Esta mistura foi agitada duran te uma hora com f faina HF'^-22 iui eiitão culuuada numa col u n a d e v i d r o » C! efluente i n i c i a 1 e o o r o d u t o e 1 u. i d o u s> a n d o metano1:água (1:1, 1 L) não eram activos. 0 segundo produto eluido usando metanol:áqua (7:3, 1 L) continha quantidades vestigiais cie A33543A. 0 produto eluido seguinte usando metanol (1 L) continha a actividade de AS3543A e de A83543D.

□ produto eluido im metanol foi concentrado e combinado com 2 fracções semelhantes a partir de outras preparações e foi concentrado até à secura. 0 resíduo foi dissolvido em 75 mí_ de metanol : THF (4: 1 } e preci.pi tado pela adição a ÍC> volumes de acetonitrilo. A mistura foi filtrada, e o filtrado foi concentrad o a t é à s e c u r a.

resíduo foi dissoivido em metanol (20 mL) a u m a c o 1 u n a 5,5 Biotschnology Jnc , ,, '90 cm de Senhadex LH—20 (Pharmacia LKb •pr η 1 hen ri o analisando 125 fracções de 2o mL., usando o

-| cp

:om Q μι ds gel

T o r 5·. m c e m ο ι n 3. ) 3 n g ί ( 1 y ΓΠ L) t? cm préernb-?. 1 e.da. in Dynamax)„

SÃ

A coluna foi condicionada em metano1:acetonitri1a:água (37,5;37,5:25). Após· aplicação da amostra, a coluna foi desenvolvida usando um gradiente linear ds ISv-min dos solventes qus se sequem:

Sistema Solvente

Quantidade (ml)

Solvente	A	B
CH3OH	37.5	45
CH3CN	37.5	45
h2o 0 gradiente foi	25 rea1i zado	10 de 100%A a 100XB, recolhendo

f rac ç Ses d e 25 mL.

As fracçSes contendo A33543A foram reunidas, concentradas até à secura, dissolvidas em t-BuOH (5 m(_ > e liofi lizadas para dar origem a 778 mg de A33543A puro.

espectro IV de A33543A em CHC1-,. é indicado na figura 1. 0 espectro FD-M3 de AS3543A é indicado na figura 4; o espectro FAB-M3 de AS3543A é indicado na figura 3 CFAB dispersante-ditiotreitol:ditioeritritol (5:1); e o espectro EI-MS de A83543A é indicado na figura 10.

Fraeções contendo A83543Q forem combinadas com fraeções contendo D a partir ds 3 separações semelhantes e foram concentradas e cromatografadas tal como foi descrito supra, usando a íiissm-ã coiuna mas solventes euferentes. h coluna, foi. condicionada em mstancl:âcetonitrilo:aqua (40:4u s20) . Os sistemas. solventes usados para desenvolver a coluna numa operação gradiente linear de 180 min foram:

Sistemas Solventes

Onantidadp (ml)

	Solvente	A	B
	CH30H	40	95
(42:	ch3cn	40	95
	h2o	20	10

Fracções contendo A83543O foram combinadas e concentraii t-BuOK (5 mL > e liofil izado para das. 0 resíduo foi disso dar oriqem a 212 mq de A83543D espectro IV de A33543D em o espectro FD-MS de A83543D é indic ίο 1.. έ· i n d i >- a do na lo na -figura 8.

•iqura

EXEMPLO 5 ;oiTiDonen tc

A83543 e a Pseudoaolicona de semelhantes aos descritos no Exemplo 2, foi tratado tal como foi descrito no Exempla 4. Fracções da coluna de Sephadex LH--20 contendo os compostos desejados foram combinados com fraccões correspondentes a partir de fermentações semeιnanLes. tomo os componentes E, F, G, H,, J e a pseudoaolicona de A são produzidos e m q u a π 11. d a d e s m u 1.1 ο ρ e q lí e π 3. e ,, e a o rι e c e e s 4. r ± a s r, u. m e r o s a s f ie r m ie n taçSee a fim de proporcionar quantidades suficientes para uma posterior purificação.

Uma reunião i iproximadamen actores menore;

' e. d a d e t e m o d o e . a i so 11 d o ,, f o* j.

COffl aplicada a uma coluna para CLEP (Rainin Dynamax5 préembalada S microns de gel de sílica de fase reversa. C-1B (ODS5, tal- como foi. descrito ns Exemplo 4A coluna foi condicionada em CH-.DH; CH-yCN: Η,-,0 <75:75s5€>> , e o gradiente foi conduzido de 10QX do solvente (A) para 50% (B): coo os sistemas solventes gue se seguem:

Sistemas solvente

	Quantidade (%)
Solvente	A	B
CH30H	75	95
ch3 CN	75	95
h2o	50	10
recolhendo fracções de	25 mL. Foram	reunidaí
seguem:
!*ί’Ξ*υ Γί <?	Frserdes
1	31-44
si	45-63
~T	64-3?
4	7y—õu
cr	□1-130
b	131-160
Uma porção da	reunião 5 ^13	ri ml...) fc

f i ao C oe e q u ncenirada atá se obter' um resíduo, dissolvida em metanol (1 mL.) e aplicada a uma coluna para CL.EF¹ 21,4 mm 250 ur (Raircn Dynama;· ί , tal coro foi descrito no exemplo 3. A coluna foi condicionada usando o sistema so i vt;i J *_o \ j-* ' o os 1 ·-> isms.s XO 1 Ve, í teS que seguem;

Sistemas solventes

Solvente	A	Quantidade B	(%)
CH3OH	30		95
CH3CN	30		95
H2O(1N NH4OAC,pH5.0)	40		—
h2o	—		10
e deseηνo1 v i d a u sand0 u;u 0r ad i en t e	1 i	ne-3.	r durant	e 120 minutos a
partir de 1OO% de solvente (A) ate			se 1vent	e CB>, recolhen-
dn frarrõpc; r;e 15 mi a 7.,5 ml /min.		el	Ll i ção fo	i mantida a. 5Θ7
(B) durante o& minutos adicionais.	c —. ·.-	am	reunidas	35 fr^erS^H. que

se sequem:

Reui ι ião cr u __ x2 i·' O ÍTi 3.

tstas reuniões foram combinadas com reuniões de outras :-!r·, -, ζ. - ds partida semelhantes. As .tí I 4. ti ..

r e u n i ões comb i n a d a s f o r a m ρ o s t e r i o r men t e p u r i f i c a d a s •l. r u m a t o g r a fia de c o 1 li n a . tal ρ o m ο “ o i de s c r i t o s u ρ r a dessal inizadas sobre resinas HP-20, usando técnicas normal usando f oram tes que e seouem:

Componenta

Uuan tidads(mg) i-‘S-50 rõl eC U I 3 r S

Iva :*

E	249	717	Fig. - 13
F	4	717	Fig. 14
G	104	731	Fig. 15
Η, J	87	717	Fig . 1ó
Pseudo A	288	590	Fig. 3

ψ por espectrometriã de massa tfDisco KSr

Os espectros FD-MS e EI-IMS de pseudoag 1 icona de A83543 são indicados nas Figuras 7 e 17, respectivamente.

EXEMPLO 6

Preparação de AS3P43 com Cultura A83543.3 A. Fermentação em Frasco Aqitado

Usando processos semelhantes aos do Exemplo 2, Socçã A, a cultura de Saco harooo1yspora spinosa NREL 13537 é cultivad em frascos agitados, mas usarido meio vegetativo C como se seque:

MEIO VEGETATIVO £

Caseína hidrolisada por en Extracto de levedura MgSO„.7H„0

Θ1 u.c ose

Glicerol

A q u a d e s i ο π i 2 a d a ima;

w .. i·? n pH cj .. ó, ajustadu para 7,0 uum NaOH $N/1 Amina A

E<. Fermentação em Biorreactoi- Ag i t a d o

Ampolas de azoto líquido da cultura são preparadas tal '.orno foi descrito no txsmplo 2, usando os processos gerais do bect. t? · É usada uma ampola para inocular uma cultura vegetativa de primeiro estádio fot) mL de meio 0 em frascos de 2by mL) , a qual, e incubada durante cerca de 48—72 horas. A cultura de f ' imei.ru estádio incuciada e usada para moeu 1 ar ly mL de .1 nócu1 o..' uma cultura de segundo estádio Í4yy mL de me ico C em frascos de 2 L. 5 , a qual é incubada durante cerca de 43 horas. A cultura de segundo estádio incubada (5 L) é usada para inocular um meio ue pr ijuuçau \ 11 b u.tendo a. composição gua se segue:

MEIO DE PRGDUçaQ II

Ingrediente

Glucose

Le i te pe p ton i z ad o # Farinha de semente de algodão#*

CaCO-,

01ea to d e metilo Λ qua

Quantidade (q/L)

SO ,:;L./L q. b. 1 L # Leite peptonizado Nutriente, Sheffisld Products;

pode ser usado alimento contínuo adicional, começando no quarto dia, è taxa de 5 mg/mL/dia.

tf Proflo ípH prèastsri1ização ajustado para 7,0 com NaOH) □ meio de produção inoculado é deixado fermentar num biorrsactor agitado ds 165 L durante cerca de 3 la 10 dias, ou mais, a uma tempera tura de 3O'^:'C, Níveis de oxigénio dissolvido (DC) são regulados por sistemas computorizados regulados para manter o nível D0 acima de 50'Z da saturação do ar tal como foi descrito no Exemplo 2, Secção 3-,

Claims (7)

1. Ampolas ds azoto líquido da cu. 1 tura são preparadas tal como toi descrito no Exemplo
2. 2, usando os processos gerais do bect, fcs. é usada uma ampola pa.ra. inocular uma cultura, veqeta.tiva ^j-j — priiTjêi.ro estádio t 5Ό mL. de meio h em Trascos de ,οοίίϊ rt_) , a qual é incuba.da durante 4E^; a estádio incubada é usada para horas. A cultura, de primeiro cultura de segundo estádio /400 nL de meio b a qual é incubada durante cerca de 43 horas, estádio incubada (2 L) é usada, para inocular (!) T rs se r<<=.

   u.iTi meio de nrodução

   MEIO ΏΕ FRODUrgQ III

   Glucose £:õ

   P r o t e i n a v e g e t a 1 , ρ a r c i a I m e n t e hodrolisada enzimáticamentet 20 rarinha ds ssmentes ds algodaosã ly

   CaCO_ 5

   01 e a. t o d e nie tilo

   A g u a c o r r en t e

   30 mL/L q . b , ρ a r a 1 & Sheftone H •x· -j,- m , _ .ϋ ί _ #· 4 r }· U I 1 LJ < dH préesteri 1 i zaqão aiustac pa.ra 7,0 coo NH,,Gl-F

   MEIO DE PPGDUõSO IV

   Ingrediente

   G1ucose

   Farinha de sementes de Leite Peptonicado## Licor de Milho CãCO-, (grau técnico) Qleato de metilo Á g u a c o r r e n t e

   Luan tida.de (Percen tua 1 ?

   algodão# 3

   0,5
3. 3, q, b. para 1 L % P r o f 1 o tt Leite Peptonizado Nutriente ( pH préssteri1ização ajustado para 7,0 ccm NaOH)

   0 meio de inoculação inoculado é deixado fermentar num biorreactor agitado de 165 L durante cerca de 3 a 10 dias, ou mais, a uma temperatura de 30 *C. Níveis DO são regulados tal como foi descrito no Exemplo 6

   EXEMPLO 8

   Preparação de A33543 com Cultura A33543.4

   Usando processos semelhantes aos dos Exemplos 2 e 7, a cultura õãccharopoiysporã spincsa NRRL 13533 é cultivada mas usando meio vegst-ativo B e meio de produção ITT, “ ··-·· ry Iv; jÇj I

   Caldo ds fermentação é preparado tal como foi r<o cXE.TípIo 3, A33543 é separado do caldo como se segue:

   f i 11 r a.—s e , u s a n ri o u m f i 11 r o d e

   í.iue: i.yuêi Uí ? Γ ci ffs X C 3. O Ll Ll í •5.^;-5 L. 3! i ci <?. 3 i._i 3 Q tí au x i 1 iar de f i 11 ra— :ão com unia prensa de u itracàc

   Ajusta-se o caldo filtrado para cH 10.

   3. Adiciona-se acetato de etilo (1/4-1/2' do volume do caldo).
4. 4„ Recupera-se o extracto de acetato de etilo separando por decantação a porção aquosa não miscível; e concentra-se o extracto de acetato de etilo até 1/2 do volume por vácuo.,
5. 5. Extrai—se a solução de acetato de etilo concentrada com ácido tartárico 0,1 M (1/2 volume); e separam-se as fases.
6. 6. Remove-se o acetato de etilo solúvel da fase aouosa

   V tzí {.J oJ Γ ci tj. ct L_^! o >.J L·· aquosa, usando uma operação de osmose reversí

   10-11 com hidróxido de sódio.

   com ;eca-se sob vácuo para dar oriqem a hB3c

   EXEMPLO 10

   Pseudoaq 1 ic on a de At’35

   Uma aínustra de í-ajoosc. cuuÍsndo pr mc .i pal «ei; te cumpuneii te A (ca 100 mq) foi dissolvida em metanol (50 mí_ > , áaua (2 mb.) —

   solução foi. concentrada até a. secura o duas vezes coai éter dietílico- (2©©

   HCl concentrado (3 mL). Es s. 5©‘-'tJ. Li resíduo foi trai mL cada), e o material insolúvel foi eliminado. As soluções de? é t e r o o m b i n a d a s c on ten d o a ρ s e u cl o a g 11 c o n a c r u a τ o r a m o o n c e n t r a d a s até à secura. 0 resíduo foi dissolvida (em metanol (2© mL) e purificado, usando o sistema CLEF'—AUT CPR Eh' descrito no Exemplo 3, para dar origem a 2© mg de pseudoag1icona de AS3543A pura.

   pvcwipt n ii

   A pseu.doa.glicona de A33543D é preparada a oartir de usando um pr o semeinante ao descrito r íO Exemplo 10.

   EXEMPLO 12 hsí Tormulaçoes oue se sepuem sao típicas das composi· ções insecticidas úteis neste invento.

   A. Suspensão Aouosa

   Tergitol TI1N-6 ísurfatants não iónico) 1 , ©% Zeosyl 2©© (sílica) 1 , ©X AF-i©© (agente antiespuma à base de silício) ©, 2% Solução de xantan (2*/. > 1©.©X eti1eneóxido nonilfenol)

   A83543D

   Exxon 200 (solvente naftaleno)

   Toximul H” (mistura surfactante nãc< iónica,·⁷ iónica)

   Toximul D (mistura surfactante não iónica/' ιόηica)

   12,43

   As composições seguintes que s ρ é c i e de f o r m υ. 1 ac 3 e s u s a d a s c a r a en te iη ven to .

   em de exemplo ilustram prática do método· do

   A. Prémistura Alimentar

   Λ □ Τ σ Λ -T f\ i-iZjy (_ a s o a d e a r r o s Oleo m ι n e r a ι. i e v e

   - fl

   Alimen tar a u. i. _i e · ú t

   Farinha de Alfalfa Argila em pó Molassos gnsão

   S a 1 n a f t a 1 e n e s = u 1 f o n a t c iiurTactants ηí Sílica fumada

   D . Su 1 u ç ã o b a t~ a M e ra υ. 1 h a r i-1 O ~i

   Vtí'·.

   Surfactante não iórtico Prορilene glicol Ánua

   Suspensão para Mergulhar μ- ro Ter η r*>

   H O _·> J 4 ·_’ b

   Ó 1£? C) ffi i Π & r 8.1 1 B v f?

   U-npilsne glicol bUS =-·=?.G 1 Π 1 Ç?C 0 I ^; (·“Q Γ> 2 I ΗΓ: íp π ] i C f‘ 1

   A 63343 L· 3 ΟΧ

   Pol ivinilpirroliuor<a 2

   Ãqua 68

   LM INDICAçõEi (d) •τι a i s

   V S 1, s .

   S I fí» í ·- U 1 D'

   R , R e R ± hi d é imeti lo ou etilo; que R é diferente de ou diluentes para e o gén io ou metilo;

   ou um seu sal fito logicamente h i d r og èn io; a ssoc i. a. d o o om um o u. se fim íitologicamente aceitáocessc para a icida de acordo do por o composto A33543 com «Ti Cf preparação de uma formulação com a reivindicação 1, caraca. fórmula 1 ser tal que R, R¹ , numa das combinações que se

   SÇ?G U. BíP Z

   R Ri R³ R⁴ R⁵ R⁶ (a) Me H Et Me Me (b) Me H Et Me Me (c) Me H Et Me Me (a) Me Me Et Me Me (a) Me H Me Me Me (a) H H Et Me Me (d) Me H Et Me Me (a) Me H Et H Me (a) Me H Et Me H H Me H Et Me Me H Me Me Et Me Me H Me H Me Me Me H H H Et Me Me H Me H Et H Me H Me H Et Me H

   cu u® seu sal de adição de ácidos quando R é diferente de hidrod é ιτ i o ,

   32, - Processo para a preparação de uma formulação insecticida ou acaricida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, carac ton zado por o oompoato AS3543 eer em u·-.· R ·- um grupo ; a > ; R, R~ e R''' ----- CH,; R'“' - H; e R*⁷ = etilo.

   - Prooeeeo para a preparação de uma formulação insecticida ou acaricida cie acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou z, c a r ac t a r i z a. d o por o zompooCo Ay3i43 ser um em que:

   - . 1 3 ã á _ ρ

   H e um grupo- s: . H ' , R , R~ s R' ~ OH.,; e R ' - etilo: ou um e„·.

   sal de adição de ucidoe,,

   5ã. - Método para a inibição de insectos ou ácaros, caracterizado por compreender a aplicação ao local do insecto ou ácaro de uma quantidade eficaz de um composto A83543, ou de um seu sal -fitologicamente aceitável, tal como foi definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo a taxa de aplicação de desde cerca de 1 até cerca de IQéô ppm (ou 0,ôl até 1 kg/ha)..

   6e. - Processo para a preparação de uma formulação ectoparasiticida, caracterizado por se incluir na referida composição, como um ingrediente activo, de O,OOOOo a 95% em peso de um composto A83543 com a fórmula Σ tal como foi definido na reivindicação 1 ou um seu sal fisiologicamente aceitável, associado com un ou mais veículos ou diluentes para esse fim fisiologicamente a c e i t á v e i s ,
7. 7d. - Método para o controlo de uma população de insectos ectoparasitas que consomem sangue de um anima. 1 hospedeiro, carac tanzado por compreender a e.dm in i soracão ao animai hospedeiro de uma quantidade eficaz de um composto AS3543, ou de um seu sai fisiológicamente aceitável, tal como foi definido na reivindicação 1, sendo a taxa de administração de desde cerca de 5 até cerca de 1 / ú mg/kg.

   Gê. Processo para a produção de um composto A83543 com a fórmula I tal como foi definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender a cultura de uma estirpe Saccharooo1yspora soinoaa se 1 ecoionada de entra NRRL NbRL 18537, NRRL 18538 ou NRRL 18339, ou um seu mutante produtor de κό3543, num meio de cultura contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos em condições de fermentação aeróbioa submersa até se produzir uma quantidade recuperável do 383543.